專利名稱：固定化β-甘露聚糖酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及液體咖啡萃出物中所含的半乳甘露聚糖的一種水解方法。
美國專利2802920公開了咖啡萃出物中所含的半乳甘露聚糖的水解方法，水解時使用β-甘露聚糖酶制劑，以便防止這種萃出物在冷凍過程中形成凝膠。
Food Review，8/9，37-39(1984)公開了β-甘露聚糖酶的工業(yè)用途，即降低液體咖啡萃出物的粘度，使得有可能將其濃縮成高含量的干物質。
但是，β-甘露聚糖酶的這種工業(yè)用途具有一定的缺點。例如，由于這種酶只使用一次，因而被浪費掉。在成品中存在這種酶也是所不希望的。
本發(fā)明旨在彌補先有技術的這些缺點。
為此目的，在本發(fā)明的液體咖啡中的半乳甘露聚糖的水解方法中，該萃出物是在20-80℃用固定化β-甘露聚糖酶進行水解的。
β-甘露聚糖酶較好是通過共價鍵連接固定在基質上或通過吸附在基質上的β-甘露聚糖酶的聚合作用而達到固定化。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)點是達到了節(jié)省酶的目的。
另一個優(yōu)點是β-甘露聚糖酶不會從基質上鹽析出來。
再一個優(yōu)點是可以在不會產生細菌污染的溫度下操作。
本發(fā)明的一個令人驚奇的優(yōu)點是β-甘露聚糖酶通過共價鍵連接在基質上后或在吸附于基質上的分子聚合之后不會失去活性，類似地，固定化β-甘露聚糖酶的酶活性對時間而言是相對恒定的。
最后，本發(fā)明還有一個優(yōu)點，即咖啡萃出物既可以在攪拌槽罐式反應器中進行，也可以在包括固定化β-甘露聚糖酶的固定床或流化床的反應器中進行，不必考慮咖啡萃出物的粘度。
在下面的敘述中“攪拌槽罐式反應器”一詞意指含有處于懸浮狀態(tài)的固定化β-甘露聚糖酶的、進行機械攪拌的系統(tǒng)。
類似地“固定化β-甘露聚糖酶的固定床”一詞應理解為固定在緊密裝填在適用于連續(xù)加工液體咖啡萃出物的反應器中的基質上或基質中的β-甘露聚糖酶。
“固定化β-甘露聚糖酶的流化床”一詞應理解為固定在裝填但并非緊密裝填在適用于連續(xù)加工液體咖啡萃出物的反應器中的基質上的β-甘露聚糖酶。然后，咖啡萃出物從底部到頂部的循環(huán)流動使基質顆粒處于懸浮狀態(tài)。這種類型的反應器稱為“流動床反應器”，特別有利于加工含有懸浮狀固體物質的介質。
“二聚甘露糖(manobiose)”和“梣糖”這兩個術語分別指甘露糖的二聚體和三聚體，而術語“甘露糖類”(mannosaccharide)應理解為至少兩種甘露糖的聚合物。
β-甘露聚糖酶的單位定義為在pH5及30℃條件下每分鐘從角豆樹膠釋放出來的相當于1微摩爾甘露糖的還原蔗糖的量。
因此，為了實施本發(fā)明，β-甘露聚糖酶例如可通過共價鍵連接固定在常用基質的表面上，或者也可以通過事先吸附在常用基質表面上的β-甘露聚糖酶的聚合作用而達到固定化。
然后例如可用這些固定化的酶將液體咖啡萃出物在40-70℃的溫度下進行水解。
為此目的，較好是使用細菌或霉菌β-甘露聚糖酶，特別是從Aspergillus niger中提取的β-甘露聚糖酶，例如特別是以Gamanase商標(丹麥，NOVO-NORDISK公司)銷售的，經純化的Aspergillus niger β-甘露聚糖酶。
此外，可讓萃取液濾過裝填有經研磨烘烤過的咖啡萃取槽來獲得液體咖啡萃出物。這種萃取方法可以逆流方式進行，即可在壓力下在150-180℃的溫度下，把水引入到裝有經研磨烘烤過的最大限度耗盡的咖啡料的萃取槽中，而該咖啡料已在其底部經過N次萃取。然后使從該萃取槽出來的液體萃出物通過裝有已經使用過(N-1)次的咖啡料的萃取槽中，如此直至液體萃出物通過裝填有經研磨烘烤的新鮮咖啡的萃取槽為止。最后使用的萃出物來自溫度約為100℃的最后一個萃取槽。因此可以分成由裝有最大限度耗盡的咖啡的萃取槽構成的加壓段，和由裝有最小限度耗盡的咖啡的萃取槽構成的常壓段。
也可讓萃取液濾過裝填有經研磨烘烤的咖啡的加壓段萃取槽來獲得液體咖啡萃出物。這種方法稱為“分裂提取”，在其余的敘述部分中也將使用這一術語。在該方法中使用兩種萃取液，萃取槽分成加壓段和常壓段，每段用其自己的萃取液進行萃取。裝在常壓段中的咖啡是在適中的溫度和壓力條件下用第一種萃取液進行萃取的，而裝在加壓段中的咖啡是在高得多的溫度和壓力的條件下用第二種萃取液進行萃取的。因此必然會產生兩種不同的液體萃出物，例如從加壓段出來的萃出物經部分蒸發(fā)后可以互相合并，然后用常規(guī)方法制成粉末。
因此，在本發(fā)明中尤其可以使用從研磨烘烤的咖啡的分裂提取工藝的加壓段中得到的萃出物，然后才將其進行部分蒸發(fā)。
因此，較好是使用例如從EP 0 538 512所公開的加壓段得到的萃出物。
按照本發(fā)明，所述基質可以是多孔基質，例如尤其是孔徑為20-200毫微米的多孔基質。
具體說，多孔基質可以選自粒狀的硅石、玻璃、丙烯酸類聚合物，尤其是牌號為Eupergit-C的丙烯酸類聚合物(德國，Rhm公司)，和酚醛聚合物，尤其是牌號為Duolite的酚醛樹脂(美國，Supelco公司)，例如特別是DuoliteS-761牌號的樹脂。
β-甘露聚糖酶較好是通過共價鍵連接固定在丙烯酸類聚合物Eupergit-C的表面上。該聚合物具有環(huán)氧乙烯基團，其環(huán)氧環(huán)可以固定β-甘露聚糖酶。因此每克Eupergit-C可以固定例如至少1900單位的β-甘露聚糖酶。
多種β-甘露聚糖酶較好是通過吸附在酚醛樹脂Duolite顆粒表面上的β-甘露聚糖酶的聚合作用來固定。例如可以用戊二醛作為聚合劑。
在本發(fā)明的第一個優(yōu)選的具體實施方案中，咖啡萃出液是用β-甘露聚糖酶的槽罐式反應器中進行水解的，所述β-甘露聚糖酶是由共價鍵連接固定在基質上的或由吸附在基質上的β-甘露聚糖酶的聚合而固定的。該系統(tǒng)可以以半連續(xù)方式，按如下三步自動進行操作。在該第一個方案中，將待處理的咖啡萃出物裝入到槽罐中，然后進行水解，同時進行機械攪拌，經過預定的時間后將槽罐放空。在槽罐下部配置一個過濾器就可以保留反應器中的酶。該過濾器能截留住例如直徑大于40微米的所有顆粒。
從這種水解方法，可以看出，通過共價鍵連接而固定在基質上的β-甘露聚糖酶具有良好的穩(wěn)定性，因為在至少500次連續(xù)循環(huán)水解咖啡萃出物后其酶活性能保留60％以上。
本發(fā)明的第二個優(yōu)選的具體實施方案中，液體咖啡萃出物是在含有β-甘露聚糖酶的固定床反應器中進行連續(xù)水解的，所述β-甘露聚糖酶是由共價鍵連接固定在基質上的或由吸附在基質上的β-甘露聚糖酶的聚合而固定的。當以這種方式使用時，該固定化β-甘露聚糖酶能保持良好的穩(wěn)定性，因為在20小時以上的連續(xù)水解后其酶活性能保留80％以上。
在本發(fā)明的第三個優(yōu)選具體實施方案中，液體咖啡萃出物是在含有由共價鍵連接固定在基質上的β-甘露聚糖酶的流化床反應器中進行連續(xù)水解的。
下列實例說明本發(fā)明的方法。在這些實例中使用了以Gamanase商標銷售的β-甘露聚糖酶，這種酶的比活性為65000單位/每克蛋白質，在其中的一些實例中用可溶性咖啡在蒸餾水中的2％混合物或從角豆樹膠中制取的半乳甘露聚糖溶液作為標準基質，這很好地說明了由咖啡萃出物所得到的結果。
在列舉這些實例之前先說明一下萃出物的色譜分析及附圖。
高效薄層色譜法(HPTLC)液體咖啡萃出物中存在的寡糖可用色譜法進行定性和定量測定，而無需將該萃出物進行初步純化。因此這種方法可用于各種不同的測試中，例如半乳甘露聚糖水解的酶動力學研究和水解后咖啡萃出物中殘留酶活性的測定等。
為此，在HPTLC色譜中使用了硅膠片“硅膠60”(Merck 5631/5641)。沉積出80微克當量的干咖啡萃出物，用由比例為30/35/11的氯仿、乙酸和水組成的溶劑進行三次連續(xù)顯色。用由4ml苯胺、4克二苯胺、200ml丙酮和30ml 85％磷酸組成的藥劑使該硅膠片在110℃暴露30分鐘。
然后就可以定性測定萃出物中所存在的寡糖，例如游離的甘露糖、二聚甘露糖、梣糖和聚合度低于8的其它甘露糖類。
通過比較硅膠片上相應于萃出物中寡糖的色斑和以已知濃度沉積在硅膠片上相應于這種寡糖的色斑的密度，也可以測定萃出物中各種寡糖的含量。當萃出物中只剩下二聚甘露糖和梣糖時就可以認為半乳甘露聚糖達到100％的水解，因為上述兩種甘露糖是酶無法再將其分解的最終反應產物。


圖1(1a和1b)說明半乳甘露聚糖在裝有固定在DuoliteS-761上的β-甘露聚糖酶的固定床反應器中的水解情況。圖1a說明水解百分率與停留時間的關系，圖1b說明酶的相對活性與時間的關系。
圖2(2a和2b)說明半乳甘露聚糖在裝有固定在二氧化硅珠上的β-甘露聚糖酶的固定床反應器中的水解情況。圖2a說明水解百分率與停留時間的關系，圖2b說明酶的相對活性與時間的關系。
圖3(3a和3b)說明半乳甘露聚糖在裝有固定在Eupergit-C上的β-甘露聚糖酶的固定床反應器中的水解情況。圖3a說明水解百分率與停留時間的關系，圖3b說明酶的相對活性與時間的關系。
圖4說明咖啡萃出物在流動床中被固定在Eupergit-C上的β-甘露聚糖酶水解的情況。圖中曲線說明水解百分率與標準化停留時間的關系。
圖5說明咖啡萃出物在攪拌槽罐中被固定在Eupergit-C上的β-甘露聚糖酶水解的情況。圖中曲線說明所產生的甘露糖類的百分率與水解循環(huán)次數的關系。
實例1按下述方法通過吸附和聚合將β-甘露聚糖酶固定在酚醛聚合物中。
使用孔徑約60毫微米的樹脂DuoliteS-761(美國Supelco公司)。將該樹脂過篩，得到0.2-0.4毫米的顆粒，用0.5N NaOH處理1小時，然后水洗，再用0.25N HCl處理30分鐘，最后用蒸餾水洗滌至pH4。將25ml由5ml Gamanase和20ml 0.1M pH＝6的磷酸鈉緩沖液組成的溶液加入到5克上述經處理過的樹脂中，在徐徐攪拌下于22℃讓Gamanase吸附在該樹脂上達12小時之久。然后用蒸餾水洗滌該制劑，所吸附的酶用2.5％的戊二醛溶液在22℃聚合3小時，然后用蒸餾水最后洗滌該制劑。
另外，將3克角豆樹膠加入到1升0.1M pH為5的乙酸鹽緩沖液中并加熱至80℃，由此制得半乳甘露聚糖溶液，其中可溶部分用于進行下述測試。
于是可以在普通的固定床反應器中測定固定化的酶。該反應器包括一個管狀玻璃殼體和兩個尼龍過濾器(70微米)，保持殼體各端的水平表面。將該反應器浸沒在30℃的水浴中，用普通蠕動泵將半乳甘露聚糖溶液泵入該反應器中，在通過該反應器之前先加熱至30℃。
在第一種情況下，半乳甘露聚糖溶液以各種不同速度泵入反應器中。然后用習用方法測定洗脫液中還原糖的量隨萃出物在反應器中的停留時間(RT)不同而變化的情況。然后測定半乳甘露聚糖的水解百分率與萃出物在反應器中的停留時間的函數關系?？梢哉J為，當所生成的還原糖的量等于用未固定的Gamanase進行單獨試驗使基質全部水解時所得到的還原糖的量時，就算達到了100％的水解率。結果示于圖1a中。
在第二種情況下，半乳甘露聚糖溶液被迫連續(xù)通入到反應器中，為此目的選定一個能提供在實驗開始時水解率小于100％的停留時間(RT)。然后定期測定洗脫液中還原糖的量?？梢钥闯?，該量隨時間而減少，可能是由于酶活性的損失。正是由于這個原因，可以通過比較所得到的還原糖的量與實驗開始時所存在的還原糖量來測定酶的相對活性(％)與時間的函數關系。結果示于圖1b。
下表說明基質的一些特性。

實例2通過共價鍵連接使β-甘露聚糖酶固定在直徑為0.1-0.3毫米，孔徑約60毫微米的二氧化硅珠X-030 LS(Sepracor，法國)上，方法如下。
用H.H.Weetall在“Method of Silanisation in anaqueous medium”(Methods in Enz.，44 135-148，1976)中所公開的方法先使二氧化硅珠與γ-氨基丙基三乙氧基硅烷偶聯(lián)。5克二氧化硅珠用50ml 2.5％戊二醛在0.1M pH＝7的磷酸鈉緩沖液中的溶液在真空下處理1小時，接著在常壓下處理2小時。然后依次用蒸餾水、0.5M NaCl溶液和0.1M pH＝6的磷酸鈉緩沖液洗滌上述處理過的顆粒。然后在該活化基質中加入25ml含有5mlGamanase和20ml pH＝6的磷酸鈉緩沖液的溶液，然后在4℃令其在氦氣氛中反應12小時。最后依次用蒸餾水和0.1M pH＝6的磷酸鈉緩沖液充分洗滌這些硅膠珠。
然后按實例1的相同方法在固定床反應器中測試上述制劑。于是測得了半乳甘露聚糖的水解百分率與基質在反應器中的停留時間的函數關系(圖2a)，以及酶的相對活性與時間的函數關系(圖2b)。
下表說明所用基質的一些特性。

實例3通過共價鍵連接使β-甘露聚糖酶固定在含有反應性環(huán)氧乙烷基團，孔徑為約35毫微米的Eupergit-C丙烯酸類聚合物珠上(德國，Rhm)，其方法如下。
將37.5ml由7.5ml Gamanase和30ml 0.5M pH＝7的磷酸鉀緩沖溶液組成的溶液加入到5克Eupergit-C中，在輕輕攪拌下令其在室溫下反應48小時。然后用pH＝7的0.5M磷酸鉀緩沖溶液洗滌所得制劑。
再按實例1所述的相同方法在固定床反應器中對該制劑進行測試。于是可測定半乳甘露聚糖的水解百分率與該基質在反應器中的停留時間的函數關系(圖3a)以及酶的相對活性與時間的函數關系(圖3b)可以看出，在該基質上酶的穩(wěn)定性特別好，因為經16小時連續(xù)水解后該固定化β-甘露聚糖酶能保持其酶活性80％以上。
還可以看出，在整個過程中在洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)這種酶從基質上鹽析出來。當將該洗脫液在30℃保溫數小時并測定還原糖含量變化時，未發(fā)現(xiàn)有任何改變。
下表說明所用基質的一些特性。

實例4通過共價鍵連接將酶固定在5克具有約70毫微米確定孔徑并含有氨丙基基團的普通玻璃顆粒(Sigma G5019)上，固定方法與實例2中固定硅膠珠的方法相同。
按實例1所述方法，用普通可溶性咖啡萃出物(Nescafé，雀巢公司)的2％蒸餾水溶液在固定床反應器中測試上述制劑。
改變咖啡萃出物的流量，并用HPTLC法分析從反應器流出的萃出物?？梢钥闯觯Ａ魰r間為64秒和81秒時反應產物大部分是二聚甘露糖和梣糖。并仍然可見到含有5聚和6聚甘露糖的痕量低聚物。當停留時間增加到105秒時，萃出物中所存在的僅有的低聚糖是二聚甘露糖和梣糖，這說明半乳甘露聚糖已完全水解。
下表說明所用基質的特性。

實例5從EP專利0 538 512所述的經研磨烘烤后的咖啡的分裂提取法的加壓段得到的液體咖啡萃出物用來連續(xù)供入保持在50℃的實例1中所述的固定床反應器。
該反應器裝有按實例3所述方法固定在Eupergit-C上的Gamanase?？刂屏髁渴雇Ａ魰r間為8分鐘。在48小時內定期取樣，用HPTLC法測定所產生的寡糖。
分析結果表明萃出物中的半乳甘露聚糖達到完全水解，因為經處理后的萃出物中僅有的寡糖是二聚甘露糖和梣糖。
實例6用實例5中所述的咖啡萃出物在含有固定在Eupergit-C上的Gamanase流化床的普通立式柱中進行若干次水解試驗。
基質中每克含有28.6毫克蛋白質，該蛋白質用類似于實例3中所述方法固定。試驗在65℃進行。
用上述色譜法測定每次試驗的洗脫液中所含的二聚甘露糖的量。于是測得半乳甘露聚糖的水解百分率與該萃出物在反應器中的標準停留時間(分鐘×蛋白質的毫克數/毫升)的函數關系。圖4說明了這些試驗的結果。
各次試驗的實驗條件及所得結果列于下表。

實例7用實例5中所述的萃出物在含有固定在Eupergit-C上的Gamanase懸浮液的槽罐式攪拌反應器中進行大約500次連續(xù)水解試驗。
在5克Eupergit-C中加入37.5ml由7.5ml Gamanase和30ml 1.25M pH＝7的磷酸鉀緩沖液組成的溶液，使酶固定。在輕輕攪拌下令其在室溫下反應72小時。
各次水解相當于30分鐘的循環(huán)，在此期間頭兩分鐘用泵將萃出物引入到槽罐中，在攪拌下讓該萃出物反應26分鐘，在最后2分鐘用泵從槽罐底部抽吸經水解的萃出物。用安裝在槽罐底部的過濾器(40微米)截留固定化酶，該槽罐恒溫控制在60℃，用上述HPTLC色譜法分析各次洗脫液。然后測定對應于二聚甘露糖和梣糖色斑的密度。
圖5說明所產生的二聚甘露糖和梣糖的相對量與水解循環(huán)次數的函數關系。可以看出酶損失其酶活性的速度特別慢，因為咖啡萃出物經過500次連續(xù)水解循環(huán)后，固定化β-甘露聚糖酶能保留60％以上的酶活性。
權利要求
1.液體咖啡萃出物中半乳甘露聚糖的水解方法，其中所述萃出物是在20-80℃的溫度下用固定化β-甘露聚糖酶進行水解的。
2.如權利要求1提出的方法，其中β-甘露聚糖酶是通過共價鍵連接固定在一種基質上的。
3.如權利要求1提出的方法，其中β-甘露聚糖酶是通過吸附在基質上的甘露聚糖酶的聚合而固定的。
4.如權利要求1提出的方法，其中所述的萃出物是在30-70℃的溫度下進行水解的。
5.如權利要求1提出的方法，其中所述的β-甘露聚糖酶是從Aspergillus niger中提取出來的β-甘露聚糖酶。
6.如權利要求1提出的方法，其中所述的液體咖啡萃出物是從經研磨烘烤過的咖啡的分裂提取法中的加壓段得到的萃出物。
7.如權利要求2和3提出的方法，其中所述的基質是一種多孔基質。
8.如權利要求7提出的方法，其中所述基質的孔徑為20-200毫微米。
9.如權利要求7提出的方法，其中所述多孔基質可選自二氧化硅、玻璃、丙烯酸類聚合物和酚醛聚合物等的顆粒。
10.如權利要求3提出的方法，其中吸附在基質上的β-甘露聚糖酶是用戊二醛進行聚合的。
11.如權利要求1提出的方法，其中所述的液體咖啡萃出物是在含有固定化β-甘露聚糖酶的固定床反應器中進行連續(xù)水解的。
12.如權利要求1提出的方法，其中所述的液體咖啡萃出物是在含有固定化β-甘露聚糖酶的流化床反應器中進行連續(xù)水解的。
13.如權利要求1提出的方法，其中所述的液體咖啡萃出物是在含有固定化β-甘露聚糖酶懸浮液的槽罐中進行水解的。
全文摘要
一種使液體咖啡萃出物中的半乳甘露聚糖水解的方法，其中該萃出物是在20-80℃的溫度下用固定化β-甘露聚糖酶進行水解的。
文檔編號C12N9/26GK1117349SQ95103639
公開日1996年2月28日 申請日期1995年4月6日 優(yōu)先權日1994年4月7日
發(fā)明者P·尼古拉斯, E·雷茲, S·雷蒙, J·L·索瓦吉特 申請人:雀巢制品公司