專利名稱：熱耐受性肌醇六磷酸酶的制作方法
肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酯磷酸水解酶；EC 3.1.3.8)是一種將肌酸六磷酯水解成肌醇和無機磷酸的酶，并且已知是有價值的飼料添加劑。
1907年首次描述了稻糠中的肌醇六磷酸酶[Suzuki et al.，Bull.Coll.Agr.Tokio Imp.Univ.I，495(1907)]，并在1911年描述了從曲霉得到的肌醇六磷酸酶[Dox and Golden，J.Biol.Chem.10，183—186(1911)]。還在麥麩、植物種子、動物小腸和微生物中發(fā)現(xiàn)了肌醇六磷酸酶[Mowsen and Davis，Enzyme Mierob.Technol.5，377—382(1983)，Lambrechts et al.，Niotech.Lett.14，61—66(1992)，Shine and Ware，Appl.Microbiol.16，1348—1351(1968)]。
Van Hartingsveldt等人在Gene，127，87—94(1993)和歐洲專利申請No.420 358中描述了得自黑曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表達，并且Piddington等人在Gene，133，55—62(1993)中描述了得自黑曲霉變種(var awamori)之肌醇六磷酸酶的克隆和表達。
因為迄今用于農(nóng)業(yè)中的肌醇六磷酸酶有某些缺點，所以本發(fā)明因為迄今用于農(nóng)業(yè)中的肌醇六磷酸酶有某些缺點，所以本發(fā)明的目的是提供新的肌醇六磷酸酶，或者更一般地說是大量提供具有改良屬性的包括肌醇六磷酸酶在內(nèi)之抗肌醇磷酸酯(肌醇六磷酸酶活性)的肌醇六磷酸酶活性的多肽。因為已知迄今使用的肌醇六磷酸酶在飼料成粒加工期間受到熱處理會失去活性，所以本發(fā)明的肌醇六磷酸酶應(yīng)有改善熱耐受性的性質(zhì)。
除煙曲霉(Aspergillus fumigatus)[Dox and Golden et al.，J.Biol.Chem.10，183—186(1911)]和米根霉(Rhizopus oryzae)[Howsonand Davies，Enzyme Microb.Technol.5，377—382(1993)]外，迄今尚未報導(dǎo)過耐熱真菌中的肌醇六磷酸酶。已報導(dǎo)了來源于土曲霉(Aspergillus terreus)菌株9A—1[最適溫度70℃；Yamada et al..Agr.Biol.Chem.，32，1275—1282(1968)]和卡斯坦氏許日王氏酵母(Schwanniomyces castellii)[最適溫度77℃；Segueilha et al.，Bioeng.74，7—11(1992)]的耐熱肌醇六磷酸酶。但這些用于農(nóng)業(yè)時，必須大量得到之。因此，本發(fā)明的目的是提供編碼熱耐受性肌醇六磷酸酶的DNA序列。可用本領(lǐng)域已知的檢測法，如用于飼料造粒的方法或例如由Yamada等人(文獻同上)描述的檢測酶促活性的熱依賴性的方法，檢測由這些DNA序列編碼的改良的肌醇六磷酸酶的熱耐受性。
本發(fā)明的再一個目的是篩選用于肌醇六磷酸酶生產(chǎn)時顯示有某種程度熱耐受性的真菌?？砂磳嵤├?中所述方法進行這種篩選。以這種方法，已第一次鑒定了實施例1中所列的生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的熱耐受性真菌菌株。
可按本領(lǐng)域已知的方法，例如用熱耐受性真菌(參見實施例1)菌株提供者，如American Tissue Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)和Cen-tralbureau voor Schimmelcultures(CBS)等所指定的方法，或者，如實施例2中指出的方法培養(yǎng)這樣的菌株。
進一步的改良的性質(zhì)是例如改善了對植物和種子中的磷的主要儲存形式的肌醇六磷酸[肌醇(1，2，3，4，5，6)六磷酸]底物特異性。為了從肌醇六磷酸中完全釋放出六個磷酸基團，需要有足夠活性的針對肌醇六磷酸和所有其它肌醇磷酸酯分子的酶。為了這種完全釋放，需要使用例如黑曲霉肌醇六磷酸酶，加上pH2.5酸性磷酸酶。只有一種具所需活性的酶顯然是一個進步。例如，國際專利申請No.94/03072中公開了以所需比例表達肌醇六磷酸酯降解酶之混合物的表達系統(tǒng)。然而，更期望在單一多肽中具有兩種上述活性。因此本發(fā)明的目的還包括提供編碼這種多肽的DNA序列?？捎帽绢I(lǐng)域已知的或?qū)嵤├?中描述的方法檢測肌醇六磷酸酶和磷酸酶。
另一個改良的性質(zhì)是例如所謂改善的pH曲線。這就意味著例如兩種肌醇六磷酸鈣鎂降解活性最大，例如一種是在大約pH2.5，其可能是某些動物胃中的pH；另一種在大約pH5.5，其可能是某些動物之胃以下組織中的pH?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法，例如實施例9中描述的方法確定這樣的pH曲線。因此本發(fā)明還提供編碼這些改良之多肽的DNA序列。
總的說來，本發(fā)明的目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且該DNA序列是衍生于選自拉維氏短梗孢(Acrophialophora levis)、土曲霉(Aspekgillus terreus)、煙曲霉(As-pergillus，fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、醬油曲霉(As-pergillus sojae)、Calcarisporiella thermophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、腐質(zhì)霉菌種(Humicola sp.)、Mycelia sterilia、Myrococcum thermophilum、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、Rhizomucor Miehei、Sporotrichum cellulophilum、嗜熱側(cè)孢(Sporotrichumthermophile)、Scytalidium indonesicum和嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces ther-mophilus)，或提供編碼這樣的多肽的仍具有肌醇六磷酸酶活性之片段的DNA序列，或更具體地說是這樣一個DNA序列，即其中所說的真菌選自拉維氏端梗孢、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉、Calcarisporiellathcrmophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、Sporotrichum cellulophilum、嗜熱側(cè)孢、Mycelia sterilia、嗜熱毀絲霉和嗜熱踝節(jié)菌，或者更具體地說的這樣的DNA序列，即其中所說的真菌選自于土曲霉、Myceliophthora thermophilus、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉和Talaromyces thermophilus。編碼本發(fā)明多肽之片段的DNA序列長度例如可在1350至900、較好在900至450，更好在450至150個核苷酸之間，并可基于完整多肽的DNA序列用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組方法或化學(xué)合成方法制備之。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且其DNA序列選自(a)

圖1的DNA序列或其互補鏈；(b)在標準條件下與(a)所限定的序列，或較好與這些序列的編碼區(qū)，或更好這些DNA序列之491至1856位間的區(qū)域，或最好與使用如實施例12中描述的土曲霉9Al的DNA進行隨機探查所得到的基因組探針相雜交的DNA序列。
(c)因為遺傳密碼的簡并性而不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列所編碼的多肽有同樣氨基酸序列之多肽的DNA序列；以及(d)作為(a)、(b)或(c)中所指定的DNA序列之片段的DNA序列。
雜交的“標準條件”在本文中是指本領(lǐng)域技術(shù)人員確定特異性雜交信號所通常使用的，并由Sambrook等人(“Molecular Cloning”，2th cds，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989，N.Y.)所描述的條件，或較好是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并在Sambrook等人的上述文獻中描述的所謂嚴格雜交和非嚴格洗滌條件，或更好是所謂的嚴格雜交和嚴格洗滌條件，或者更好是如實施例12中給出的嚴格雜交條件和非嚴格或嚴格洗滌條件?！癉NA序列的片段”在本文中是指編碼仍具有如上所述肌醇六磷酸酶活性多肽的片段。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且該DNA序列選自(a)圖2的DNA序列或其互補鏈；(b)在標準條件下與(a)中限定的序列，或較好是與擴展到大約至少占編碼區(qū)80％，包括這些DNA序列之非編碼區(qū)5’端的約l00到150位核苷酸的區(qū)域，或者更好是與這些DNA序列的2068至3478位核苷酸區(qū)域，或者最好與使用如實施例12中所述嗜熱毀絲霉(Myccliophthora thermophila)的DNA進行隨機探查所得到的基因組探針相雜交的DNA序列。
(c)因為遺傳密碼的簡并性而不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列編碼的多肽有完全相同氨基酸序列之多肽的DNA序列；以及(d)作為(a)、(b)或(c)中指定是DNA序列的片段的DNA序列。
所述術(shù)語“片段”和“標準條件”具有如上給出的同樣含義。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性的DNA序列，且所述DNA序列選自(a)含有圖4、5、6或10所示DNA序列的DNA序列或其互補鏈
(b)在標準條件下與(a)中限定的序列雜交，或較好與含有可分離自嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilu)的圖4之DNA序列，或可分離自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的圖6的DNA序列、或可分離自土曲霉(Aspergillus terreus)(CBS 220.95)的圖10的DNA序列之一或兩者的上述序列雜交，或更好與至少跨越編碼區(qū)的80％之這樣的DNA序列的一個區(qū)域的序列雜交，或最好與使用的嗜熱踝節(jié)菌或煙曲霉(A.fumigatus)或構(gòu)巢曲霉(A.midulans)或土曲霉(A.terreus)(CBS 220.95)的DNA，以實施例12所述方法進行隨機探查所得到的基因組探針雜交的DNA序列；(c)因為遺傳密碼的簡并性，不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列編碼的多肽有完全相同之氨基酸序列的多肽的DNA序列；以及(d)作為(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列的片段的DNA序列。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，且所說DNA序列選自包含可分離自嗜熱踝節(jié)菌的圖4之DNA序列、可分離自煙曲霉的圖5之DNA序列可分離自巢構(gòu)曲霉的圖6之DNA序列、或可分離自土曲霉(CBS 220.95)的圖10之DNA序列的DNA序列，或具簡并變異體或等同物。
術(shù)語“片段”和“標準條件”具有如上給出的同樣含義?！昂啿⒆儺愺w”在本文中是指因為遺傳密碼的簡并性而與所指序列有不同的核苷酸序列，但編碼有同樣氨基酸序列之多肽的DNA序列?！暗韧铩痹诒疚闹惺侵妇幋a具有肌醇六磷酸酶活性且氨基酸序列因缺失、取代和/或加入1個或多個氨基酸，較好多至50個，更好多至20個，進一步多至10個或最好多至5、4、3或2個氨基酸而不同于內(nèi)其所指等同序列的DNA序列編碼之多肽的氨基酸序列。一般不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域中已知的，并且例如已由H.Neurath和R.L.Hill在“The Proteins”(Academic Press，New York，1976，特別是參見第14頁圖6)描述過。最常見的互換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及相反的交換(用于代表氨基酸的三字母縮寫是本領(lǐng)域已知的標準縮寫字)。
可用本領(lǐng)域已知的和Sambrook等人(文獻同上)描述的方法生產(chǎn)這些等同物?？捎帽绢I(lǐng)域已知的或?qū)嵤├?中所述的方法檢定由這些等同物序列編碼的多肽是否仍具有肌醇六磷酸酶活性。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的上述DNA序列之一，所說DNA序列衍生于真菌，或具體地說衍生于選自上文提到的特定組中的真菌之一。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且所說DNA序列在標準條件下與作為與分離自上述一組真菌之一的DNA和下列PCR引物對進行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的探針雜交＂ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA＂作為有意義引物，和＂TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA＂作為反義引物。
“標準條件”的含義同上所述。“PCR反應(yīng)的產(chǎn)物”較好是指可通過參照實施例11的實施例12中所述反應(yīng)可得到的，或更好是通過該反應(yīng)所得到的產(chǎn)物。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，所說DNA序列在標準條件下與作為與分離自土曲霉(Aspergillus terreus)(CBS 220.95)的DNA和下列兩個PCR引物對進行PCR反應(yīng)所得產(chǎn)物的探針雜交)，(a)＂ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA＂作為有意義引物和＂TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA＂作為反義引物；(b)＂TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA＂作為有意義引物和＂CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C＂作為反義引物。
“標準條件”的含義同上所述；術(shù)語“PCR反應(yīng)的產(chǎn)物”較好是指按實施例11中所述反應(yīng)可得到的或更好是指按該反應(yīng)得到的產(chǎn)物。
本發(fā)明的再一個目的是提供編碼具有肌醇六磷酸酶活性之嵌合構(gòu)建體的DNA序列。所述嵌合構(gòu)建體包含如上文指定之DNA序列的片段，或較好這樣的DNA序列中嵌合構(gòu)建體在其N末端包含一個黑曲霉肌醇六磷酸酶的片段，并融合到其C末端的一個土曲霉肌醇六磷酸酶的片段上，或更好包括這樣一個具有圖7中所示特定核苷酸序列的DNA序列，和其簡并變異體或等同物，其中“簡并變異體”和“等同物”具有如上給出的意義。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上文指定的DNA序列，其中所編碼的多肽是肌醇六磷酸酶。
可按本領(lǐng)域已知的方法[如參見Yelton et al.，Procd.Natl.Acad.Sci.USA，1470—1474(1984)或Sambrook et al.，文獻同上)，或按實施例2中所述方法從真菌菌株制備基因組DNA或eDNA。
然后例如使用已知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法從這樣的基因組DNA中克隆到本發(fā)明的DNA序列。例如White等人(1989)描述了該方法的要點，而Innis等人[PCR ProtocolsAguid to Methods and Ap-plicalions，Academic Press，Inc.(1990)]則描述了改良的方法。PCR是一種體外大量生產(chǎn)有一定長度的特定DNA，和來自不同DNA序列之混合物的序列的方法。因此，PCR是基于酶促擴增感興趣的特定DNA片段，所說的片段側(cè)冀接有兩個對該片段特異的，且雜交到靶序列之相反鏈上的寡核苷酸引物。引物是以它們的彼此指向的3’末端來定位的。對模板重復(fù)進行熱變性循環(huán)，使引物退火到它們的互補序列上并用DNA聚合酶延伸退火的引物而導(dǎo)致在PCR引物間擴增該片段。因為每個引物的延伸產(chǎn)物均可用作另外者的模板，所以上每次循環(huán)基本上使前次循環(huán)中產(chǎn)生的DNA片段擴增雙倍量。利用從嗜熱細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)中分離的熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶，已有可能避免在每個熱變性步驟后必須加入的聚合酶發(fā)生變性。這一發(fā)展已導(dǎo)致可使用不同的單純的溫度循環(huán)裝置自動進行PCR反應(yīng)。另外，因為允許使用較高溫度進行引物退火和鏈延伸，從而增加擴增反應(yīng)的特異性。增加的特異性則通過減少非靶片段對酶和引物的競爭而改善了擴增產(chǎn)物的總得率。以這種辦法有用的特異性序列得以高度擴增，并能很容易地借助已知方法，如在瓊脂糖凝膠上分離將其與非特異性序列分離開，并使用例如Holten和(Craham[Nucleic Acid Res.19，1956(1991)]、Kovalic等人[NucleicAcid Res.19，4560(1991)]、Marchuk等人[Nucleic Acid Res.19，1154(1991)]或Mead等人[Bio/Technology 9，657—663(1991)]所描述的載體，按本領(lǐng)域已知的方法克隆之。
可用本領(lǐng)域已知的和例如Sambrook等人(1989，“Molecularcloning”2nd edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har-bor)所描述的方法制備用于PCR程序的寡核苷酸引物。
已根據(jù)對黑曲霉(A，niger)肌醇六磷酸酶、黑曲霉酸性磷酸酶、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酸性磷酸酶和梨形裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)酸性磷酸酶之已知序列的比較(有關(guān)序列信息參見European Bioinformatics Institute，Hinxton Hall，Cambridge，GB)，設(shè)計了在本發(fā)明實踐中用作簡并引物的特異性引物。根據(jù)基于黑曲霉的已知序列制備的黑曲霉的密碼子使用表選擇某些密碼子，以降低引物的簡并性。此外，已發(fā)現(xiàn)用于限定特異性探針的氨基酸序列的C末端上的氨基酸，應(yīng)是在包括如上指定的肌醇六磷酸酶在內(nèi)的所有酸性磷酸酶中所保留的氨基酸，但其余氨基酸應(yīng)是肌醇六磷酸酶比磷酸酶更為特異。
然后可按本領(lǐng)域已知的或具體地說用實施例5—7中描述的方法，用如此擴增的DNA序列篩選例如真菌來源之DNA的DNA文庫。
一旦得到了本發(fā)明的完整DNA序列，即可用本領(lǐng)域已知的并按Sambrook等人的上述文獻中描述的方法將它們整合到載體中，以在適當?shù)乃拗飨到y(tǒng)中過表達所編碼的多肽。但本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，也可用DNA序列本身轉(zhuǎn)化本發(fā)明的適當?shù)乃拗飨到y(tǒng)，以過表達所編碼的多肽。適當?shù)乃拗飨到y(tǒng)例如可以是真菌、如曲霉屬的黑曲霉[ATCC 9142]或無花果曲霉(A.ficuum)[NRRL 3135]，或例如木霉等的黑宿木霉(Trichoderma reesei)，或酶母如釀酒酵母或畢赤酵母，如巴斯德畢赤酵母—所有這些微生物均可從ATCC得到?？墒褂玫募毦梢允谴竽c桿菌、芽胞桿菌如枯草芽胞桿菌或鏈霉菌，如變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)[參見Anne and Mallaert，F(xiàn)EMS Microbi-ol.Letters 114，121(1993)]?？墒褂玫拇竽c桿菌是大腸桿菌K12菌株如M15[如Villarejo等人在J.Bacteriol.120，466—474(1974)中描述為DZ 291的菌株]、HB 101[ATCC No.33694]或大腸桿菌SG13009[Gottesman et al.，J.Bacteriol.148，265—273(1981)]。
可用于在真菌中表達的載體是本領(lǐng)域已知的并且是在EP 420358中，或Cullen等人[Bio/Technology 5，369—376(1987)]、或Word[Molecular Industrial Mycolgy，Systems and Applications for FilamentousFungi，Marcel Dekker，New York(1991)]、Upshall等人[Bio/Technology5，1301—1304(1987)]、Gwynne等人[Bio/Technology 5，71—79(1987)]、Punt等人[J.Biotechnology 17，19—34(1991)]描述過的，用于在酵母中表達的載體則是由Sreekrishna等人[J.Basic Micro-biol.28，265—278(1988)；Biochem.28，4117—4125(1989)]、Hitze-mann等人[Nature 293，717—722(1981)]或在EP 183 070、EP183071、EP 248 227、EP 263 311中描述過的。用于在大腸桿菌中表達的適當載體是例如Sambrook等人(文獻同上)或Fiers等人[Procd.8th lnt.Biotechnology Symposium；Soc.Franc.de Microbiol.Paris(Durand et al.，eds.)pp.680—697(1999)]或Bujord等人[Methodsin Enzymology，eds.Wu and Grossmann，Academic Press，Inc.Vol.155，416—433(1987)]和Stuber等人[Immuno.Methods，eds.Lefkovitsand Pernis，Academic Press，Inc.，Vol.IV，121—152(1990)]所提列的?？捎迷谘堪麠U菌中表達的載體是已知的并且是已在EP405370中，或Yansura[Proc.Natl.Acad.Sci VSA 81，439(1984)]和Memer[Meth.Enzym.185，199—228(1990)]或EP 207 459中描述過的。
這些載體已經(jīng)攜帶調(diào)節(jié)元件如啟動子，或可工程化改造本發(fā)明的DNA序列使之含有這些元件。可使用的適當啟動子元件是本領(lǐng)域中已知的，并且適用于里賽木霉(Trichoderma reesei)的啟動子元件是cbhl[Haarki et al.，Biotechnoloy 7，596—600(1989)]或Pkil啟動子[Schindler et al.，Gene 130，271—275(1993)]，用于米曲霉的是amy啟動子[Christersen et al.，Abstr.19th Lunteren Lectures onMolccular Genetics F23(1987)，Christensen et al.，Biotechnology 6，1419—1422(1988)、Tada et al.，Mol.Gen.Genet.229，301(1991)]、用于黑曲霉的是glaA-[Cullen et al.，Bio/Technology 5，369-376(1987)，Gwynne et al.，Bio/Tecbnlogy5，713-719(1987)，Ward in Molecular Industrial Mycology，Systems and Applications forFilamentous Fungi，Marcel Dekker，New York，83-106(1991)]，alcA-[Gwynneet al.，Bio/Technology 5，71-719(1987)]，sucl-[Boddy et al.Current Genetics24.60-66(1993)]，aphA-[MacRae et al.，Gene 71，339-348(1988)，MacRae et al.，Gene 132.193-198(1993)]，tpiA-[McKnight et al.，Cell 46.143-147(1986)，Upshall et al.，Bio/Technology 5，1301-1304(1987)]，gpdA-[Punt et al.，Gene69.49-57(1988)，Punt et al.，J.of Biotechnology 17，19-37(1991)]和pkiA-啟動子[de Graaff et al.，Curr.Genet.22.21-27(1992)]?？捎糜谠诮湍钢斜磉_的適當啟動子元件是本領(lǐng)域已知的并且可以是pho5啟動子[Vogel et al.，Molecular and Cellular Biology，2050—2057(1989)Rudolf and Hinnen，Proc.Natl.Acad.Sci.84，1340—1344(1987)]，或用于在釀酒酵母中表達的gap啟動子，及用于在巴斯德華赤酵母中表達的例如aox啟動子[Koutz et al.，Yeast 5，167—177(1989)；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28，265—278(1988)]。
因此，包含本發(fā)明的DNA序列，較好是適于在細菌或真菌或酵母宿主中表達所說DNA序列的載體，以及這些被轉(zhuǎn)化的細菌或真菌或酵母宿主也是本發(fā)明的主題。
一旦在存在于適當培養(yǎng)基中的適當宿主細胞中表達了這些DNA序列，即可用已知的蛋白質(zhì)純化方法或例如EP420 358中描述的方法從培養(yǎng)基中(在肌醇六磷酸酶產(chǎn)物被分泌到培養(yǎng)基中的情況下)或從宿主生物體中(在肌醇六磷酸酶存在于細胞內(nèi)的情況下)分離其所編碼的肌醇六磷酸酶。因此，制備本發(fā)明之多肽的方法的特征在于在適當培養(yǎng)條件下培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化的細菌或宿主細胞，并從中回收多肽；用這樣的方法產(chǎn)生的多肽或由本發(fā)明的DNA序列編碼的多肽也是本發(fā)明的主題。
一旦得到本發(fā)明的多肽，即可用本領(lǐng)域已知的或如Engelen等人[J.AOAC Intern.77，760—764(1994)]或?qū)嵤├?中所述的方法鑒定其活性。就檢測用于農(nóng)業(yè)的本發(fā)明多肽的性質(zhì)來說，可使用本領(lǐng)域已知的和Simons等人[British J.of Nutrition 64，525—540(1990)]、Schner等人[J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.6.248—255(1991)]、Vogt[Arch，Geflügelk.56.93—98(1992)]、Jongbloed等人[J.Anim，Sci..70.1159—1168(1992)]、Rerney等人[PoultryScience 72.2106—2114(1993)]、Farrell等人[J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.69，278—283(1993)]、Broz等人[British Poultry Science35，273—280(1994)]、Düngelhoef等人[Animal Feed Science and Tech-nology 49，1—10(1994)]所述的檢測法。就它們的熱耐受性而言可使用本領(lǐng)域已知的和例如Yamada等人(文獻同上)所描述的檢測法檢測，并可用本領(lǐng)域已知的和實施例9中描述的或Yamada等人(文獻同上)描述的任何檢測法檢測它們的pH和底物特異性曲線。
一般說來，可不限于特定的應(yīng)用領(lǐng)域，將本發(fā)明的多肽用于使肌醇六磷酸轉(zhuǎn)化成肌醇和無機磷酸。
另外，本發(fā)明的多肽可用于制備復(fù)合食品或飼料的方法中，其中這種組合物的成分是與一種或多種本發(fā)明的多肽相混合的。因此，包括一種或多種本發(fā)明之多肽的化合物食品或飼料也是本發(fā)明的主題。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知它們的制備方法。這類復(fù)合食品或飼料還可含有添加劑或用于這種目的的成分，并且是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種降低動物糞肥中肌醇六磷酸水平的方法，其特征在于給動物飼喂有效量的這種飼料組合物，以將飼料中所含的肌醇六磷酸轉(zhuǎn)化成肌醇和無機磷酸。實施例所用的特定培養(yǎng)基和溶液完全培養(yǎng)基(Clutterbuck)葡萄糖 10g/l—CN溶液10ml/l硝酸鈉 6g/l細菌蛋白胨(Difco Lab.，Detroit，MI，USA)2g/l酵母浸膏1g/l酪蛋白氨基酸(Difco) 1.5g/l改良的微量元素溶液 1ml/l維生素溶液 1ml/lM3培養(yǎng)基葡萄糖 10g/l—CN溶液10ml/l改良的微量元素溶液 1ml/l硝酸銨 2g/l
M3培養(yǎng)基—磷酸鹽M3培養(yǎng)基，其中用—CNP代替—CNM3培養(yǎng)基—磷酸鹽＋肌醇六磷酸M3培養(yǎng)基—磷酸鹽加上5g/l Na12肌醇六磷酸(Sigma#P—3168；Sigma，St.Louis，MO，USA)改良的微量元素溶液CuSO40.04％FeSO4·7H2O 0.08％Na2MoO4·2H2O 0.08％ZnSO4·7H2O 0.8％B4Na2O7·10H2O0.004％MnSO4·H2O 0.08％維生素溶液核黃素 0.1％尼克酰胺0.1％對位氨基苯甲酸 0.01％吡哆醇/HCl0.05％維生素B1/HCl 0.05％
生物素 0.001％—CN溶液KH2PO4140g/lK2PO4·3H2O90g/lKCl10g/lMgSO4·7H2O 10g/l—CNP溶液HEPES 47.6g/200mlKCl2g/200mlMgSO4·7H2O 2g/200ml實施例1篩選產(chǎn)生肌醇六磷酸酶活性的真菌使用下列三種培養(yǎng)基在三個平板系統(tǒng)上篩選真菌“M3”(一種含有磷酸鹽的限定的培養(yǎng)基)，“M3—P”(缺少磷酸鹽的M3培養(yǎng)基)和“M3－P＋肌醇六磷酸”(缺少磷酸鹽但含有肌醇六磷酸作為單一磷源的M3培養(yǎng)基)。用瓊脂糖制備平極以降低磷酸鹽的本底水平。
使真菌在培養(yǎng)基上和提供者推薦的溫度下生長。將孢子和菌絲體轉(zhuǎn)移到試驗平板上并在推薦的溫度下保溫直到觀察到生長。
發(fā)現(xiàn)下列耐熱菌株表面有這種生長嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)[ATCC 48 102]嗜熱裸節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)[ATCC 20 186]煙曲霉[ATCC 34 625]實施例2真菌的生長和基因組DNA的制備使嗜熱毀絲霉、嗜熱裸節(jié)菌、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉9A—1和土曲霉CBS 220.95生長在馬鈴薯右旋糖培養(yǎng)液(Difco Lab.，De-troit.MI，USA)或完全培養(yǎng)基(Clutterbuck)中。土曲霉9A—1和構(gòu)巢曲霉已按用于專利目的的布達佩斯條約規(guī)定分別于1994年3月7日和1995年2月17日保藏在DSM(Braunschweig，BRD)，登記號為DSM 9097和DSM 9743。
按下述方法制備基因組DNA用孢子和生長的O/N在振蕩下以高密度接種培養(yǎng)基。如此產(chǎn)生一小的真菌團的厚層培養(yǎng)物。過濾回收菌絲體，吸干并稱重。每份制品達2.0g。在液氮中將菌絲體研成絲粉末，直接加到10ml提取緩沖液(200mM Tris/HCl、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5％SDS、pH8.5)并混勻。向漿液中加入苯酶(7ml)，混合后再加入氯仿(3ml)并再次混勻。離心混合物(20,000g)并回收液相。加入RNaseA到終濃度250μm/ml并于37℃保溫15分鐘。然后用1體積氯仿提取混合物并離心(10,000g，10分鐘)。回收液相并用0.54體積RT異丙醇在室溫下沉淀DNA 1小時。將DNA澆在玻棒上回收之并重新懸浮在水中。
按下述方法進一步純化所得DNA在37℃用蛋白質(zhì)K將一部分DNA消化2小時，然后重復(fù)(2至3次)用等體積苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，再重新懸浮在水中達到濃度約1μg/μl。
實施例3簡并PCR基本上按照Perkin Elmer Cetus[(PEC)；Norwalk，CT，USA]的方法進行PCR。使用下列兩個引物(括號中指出的堿基是兩者/或之一)Phyt85’ATG GA(CT)ATG TG(CT)TCN TT(CT)GA3’簡并度＝32溫度高＝60℃/溫度低52℃Phyt95’TT(AG)CC(AG)GC(AG)CC(GA)TGNCC(GA)TA3’溫度高＝70℃/溫度低58℃
典型反應(yīng)按下述方法進行H2O 24.5μl10XPEC GeneAmp緩沖液 5μlGeneAmp dNTP’s(10mM) 8μl引物1(Phyt8，100μM) 5μl引物2(Phyt9，100μM) 5μlDNA(～1μg/ml) 1μlTaq聚合酶(PEC) 0.5μl50μl除Taq聚合酶外，所有成分均在95℃保溫10分鐘，再在50℃保溫(10)分鐘，然后放在冰上反應(yīng)。之后加入Taq聚合酶(Amplitaq，Hoffmann—La Roche，Basel，CH)并按下述循環(huán)程序在Triothermoblock(Biometra，Gottingen，DE)中進行35次PCR循環(huán)95℃/60″50℃/90″72℃/120″在1.5％瓊脂糖凝膠上分析一等分的反應(yīng)混合物。
實施例4PCR片段的亞克隆和序列測定從低熔點瓊脂糖中切下預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(得自黑曲霉的DNA序列推測約146bp)并基本上按照制造者推薦的方法從NACS—PR EPAC柱(BRL Life Technologics Inc.，Gaithersburg，MD，USA)上純化之。于37℃在50μl 100mM卡可酸鈉pH6.6、12.5mM Tris/HClpH7.0、0.1mM二硫蘇糖醇、125μg/ml牛血清白蛋白、1mM CoCl2、20μM dATP、10單位末端脫氧轉(zhuǎn)移酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，DE)使片段聚腺苷酸化5分鐘，并克隆到p123T載體[Mitchell et al.，PCR Meth.App.2，81—82(1982)]另外，可純化PCR片段并使用“Sure Clone”連接藥盒(Pharmacia)按制造商提供的說明書克隆之。
按照制造商推供的方法，使用二脫氧方法和Pharmacia T7藥盒(Pharmacia，LKB Biotechnology AB，Uppsala，SE)對在Quiagen柱(Diagen GmbH，Hilden，DE)上純化的ds DNA進行序列測定。
實施例6λFix II文庫的構(gòu)建和篩選使用得自土曲霉菌株9A—1和嗜熱毀絲酶的片段進行BamHI和BglII Southerns探查，以確定用于在λFix II載體(Strategene，La Jol-la，CA，USA)中構(gòu)建基因組文庫的適當限制性酶。λFix II可能只接受來自9—23 kb的插入段。按下述方法進行Southern分析。以200μl的最終體積消化基因組DNA(10μg)。準備進行無酶參加的反應(yīng)并在水上保溫2小時。加入酶(50單位)并在適當溫度下將反應(yīng)混合物保溫3小時。然后用等體積苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀。將在裝填緩沖液中重新懸浮的DNA加熱到65℃并保持15分鐘，然后在0.7％瓊脂糖凝膠(O/N 30V)上分離之。在轉(zhuǎn)移前將凝膠在0.2MHCl中室溫下洗兩次，然后在1M NaCl/0.4M NaOH中室溫下洗兩次(15’)。將轉(zhuǎn)移到0.4M NaOH中的DNA在毛細管中經(jīng)4小時轉(zhuǎn)移到Nytran 13N尼龍膜(Scileicher and Schuell AG，F(xiàn)eldbach，Zurich，CH)上。轉(zhuǎn)移后使膜暴露于紫外線下[Auto cross—link，UV Stralinker2400，Stratagene(La Jolla，CA，USA)]。
在雜交緩沖液[50％甲酰胺、1％十二烷基硫酸鈉(SDS)、10％硫酸葡聚糖、4XSSPE(180mM NaCl、10mM NaH2PO4、1mM EDTA，pH7.4)]，將膜于42℃預(yù)雜交4小時，再加入變性的探針后于42℃下O/N。洗滌印跡1XSSPE/0.5％SDS/室溫/30分鐘0.5XSSPE/0.1％SDS/室溫/30分鐘0.1XSSPE/0.1％SDS/65℃/30分鐘結(jié)果表明，用Bam HI消化的土曲霉菌株9A—1基因組DNA和用Bgl II消化的嗜熱毀絲霉基因組DNA產(chǎn)生適于克隆到λFixII載體中的片段。
按照制造商提供的方法(Stratagene在λFixII中構(gòu)建土曲霉菌株9A—1和嗜熱毀絲菌的基因組文庫。
將λ文庫鋪敷在每文庫10個137mm平板上。將噬斑挖出移至Nytran 13N圓形濾膜上并在0.5M NaOH/1.5M NaCl中處理1分鐘，然后在0.5M Tris—HCl pH8.0/1.5M NaCl中處理5分鐘。再將濾膜在2XSSC中處理5分鐘進行空氣干燥。然后用紫外線將其固定(1分鐘，UV Stratalinker 2400，Stratagene)。濾膜按上述方法雜交并洗滌。記錄推測的陽性噬斑并在SM緩沖液(180mM NaCl、8mM MgSO4·7H2O、20mM Tris/HCl pH7.5，0.01％明膠)浸出噬菌體。稀釋該材料并鋪敷在137mm平板上。移出復(fù)制濾膜并按上述方法處理。從各平板中排出清楚的單個陽性噬斑并在SM緩沖液中稀釋之。排出三個陽性噬斑。兩個來自土曲霉菌株9A—1(9Alλ17和9Alλ22)，一個來自嗜熱毀絲霉(MTλ27)。
實施例6λDNA的制備和克隆的驗證從陽性噬斑制備λDNA。使用“Magic Lambda Prep”系統(tǒng)(PromegaCorp.，Madison，WI，USA)并按照制造商推拱的說明書進行制備。為證實克隆確實性，用PstI和SalI消化λDNA并用PCR產(chǎn)物探查所得印跡。在所有情況下，該被證實的克隆均被含有互補于探針之序列的克隆。
實施例7肌醇六磷酸酶基因的亞克隆和序列分析用PstI消化得自9Alλ17的DNA，將所得的片段混合物連接到用PstI切割的pBluescript IISK+(Stratagene)上，并用河蝦堿性磷酸酶(United State Biochemical Corp.，Cleaveland，OH，USA)處理。在15℃對連接混合物進行O/N。將連接混合物轉(zhuǎn)化到XL—1 Blue Supercompetent細胞(Stratagene)中，并鋪敷在含0.5mM異丙醇—β—D—硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、40μg/ml 5—溴—4—氯—3—吲哚基—β—D—半乳糖苷(Xgal)、50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。
用Bgl II和Xba I消化得自9Aλ17的DNA并將所得混合物連接到用Bam HI/Xba I消化的pBluescript II Sk+中。按上述方法連接、轉(zhuǎn)化和篩選。
用Sal I消化得自MTλ27的DNA，將所得片段的混合物連接到用SalI切割的pBluescript II SK+中，并用河蝦堿性磷酸酶處理。連接混合物在16℃下O/N。將連接混合物轉(zhuǎn)化到XL—1 Blue Supercompe-tent細胞中并鋪敷在含有XgaI/IPTG和氨芐青霉素的LB平板上。
挑出上述轉(zhuǎn)化所得的集落并“柵格定位”約75個集落到單一平板。37℃O/N保溫后，將集落挖出移到尼龍濾膜(“Hybond—N”，Amersham Corp.，Arlington Heights，IL，USA)上，并用0.5M NaCl處理1分鐘，用1M Tris/HCl pH7.5處理兩次各1分鐘，然后用0.5Tris/HClpH7.5/1.5M NaCl處理5分鐘。空氣干燥濾膜后用紫外線固定之(2分鐘，UV Stratalinker 2400，Stratagene)，將濾膜與實施例5的PCR產(chǎn)物雜交。選擇陽性集落并制備DNA。按實施例4中所述方法測定亞克隆序列。測得的土曲霉菌株9Al的肌醇六磷酸酶及其編碼DNA的序列示于圖1中，圖2則顯示來自嗜熱毀絲霉的肌醇六磷酸酶的序列及其編碼DNA序列。圖3A顯示土曲霉DNA的限制圖(其中箭頭為編碼區(qū)，條紋為編碼區(qū)之外所測定序列的區(qū)域，且圖3B顯示來自嗜熱毀絲菌的DNA的限制圖；圖4顯示來自嗜熱裸節(jié)菌之肌醇六磷酸酶的一部分及其編碼DNA序列；圖5顯示來自煙曲霉之肌醇六磷酸酶的一部分及其編碼DNA序列；圖6顯示來自構(gòu)巢曲霉之肌醇六磷酸酶的一部分及其編碼DNA序列。按照實施例2—7中所述涉及土曲霉菌株9Al和嗜熱毀絲霉肌醇六磷酸酶的同樣方法，制得來自嗜熱裸節(jié)菌、煙曲霉和構(gòu)巢曲霉之肌醇六磷酸酶的序列及它們的編碼DNA序列。用慣用的一字母代碼縮寫字以小寫字母給出兩條鏈的堿基。在相應(yīng)DNA序列下方用慣用的一字母代碼以大寫字母給出衍生的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。
實施例8黑曲霉和土曲霉肌醇六磷酸酶DNA序列間嵌合構(gòu)建體的構(gòu)建使用Sambrook等人(1989)(Molecular cloning，ALaboratory Man-nual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)所述的標準分子生物學(xué)方法進行所有的構(gòu)建。
將EP 420 356中所述的黑曲霉肌醇六磷酸酶的前146個氨基酸融合到土曲霉9Al基因的320末端氨基酸上。在用PCR克隆了黑曲霉肌醇六磷酸酶基因時，在ATG起始密碼子處引入NcoI位點。使用下列引物(其中豎短線指示向其左側(cè)的序列與第一個外顯子的3’端雜交，向其右側(cè)的序列與第二個外顯子的5’端雜交)，以位點針對性誘變法(Bio—Rad藥盒，Cat Nr170—3581；Bio—Rad.Richmond，CA，USA)除去見于黑曲霉肌醇六磷酸酶中的內(nèi)含子。
為了構(gòu)建黑曲霉和土曲霉之肌醇六磷酸酶的嵌合構(gòu)建體，在黑曲霉編碼序列中導(dǎo)入Eco 4711位點以幫助克隆之。使用以誘變引物(5’CGA TTC GTA GCG CTG GTA G3’)含用T3引物進行的PCR產(chǎn)生用Bam HI和Eco RI裂解的DNA片段。將Bam HI/Eco47III片段插入經(jīng)p9AlPst切割的Bam HI/Eco47III中實施例7。圖7顯示該融合構(gòu)建體的氨基酸序列和其編碼DNA序列。
實施例9肌醇六磷酸酶的表達表達載體的構(gòu)建為了在黑曲霉中表達融合構(gòu)建體，選擇其中融合基因處于可誘導(dǎo)的黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)啟動子控制下的表達暗盒。
對于完整土曲霉9Al基因，制得帶有結(jié)構(gòu)性構(gòu)巢曲霉甘油醛—3—磷酸脫氫酶(gpd A)啟動子的表達暗盒。
用于在黑曲霉中表達的所有基因均攜帶自已的分泌信號序列。
載體pFPANl的構(gòu)建從質(zhì)粒pDH33[Smith et al.(1990)，Gene 88259—262]中分離出作為1960bpXhoI/Cla I片段的黑曲霉葡糖淀粉酶(gla A)啟動子，并克隆到含有構(gòu)巢曲霉trp C終止子之710 bp BamHI/Xba I片段的pBluescript SK+載體(pBS)[Stratagene，La Jolla，CA，USA]中。帶有此暗盒的質(zhì)粒被定名為pGLAC。通過將切成平頭的NcoI/EcoRI片段連接到質(zhì)粒pGLAC的切成平頭的ClaI位點和EcoRV位點上，使實施例8中所述的融合基因處于黑曲霉gla A啟動子的控制下。經(jīng)限制性酶消化驗證正確方向。將整個暗盒作為KpnI/XbaI片段轉(zhuǎn)移到pUC19(New England Biolabs，GmbH，Schwalbach，BRD)中，其攜帶粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)pyr4基(pUC19—phr4)—一種在尿苷營養(yǎng)缺陷型曲霉中的選擇標志，得到載體pFPANl(參見附有所指出的限制性位點和編碼區(qū)的圖8；橫線劃出的位點指示平端連接的位點)。
載體pPATl的構(gòu)建從質(zhì)粒pAN52—1[Punt et al.(1987)，Gene 56117—124]中分離作為～2.3kb EcoRI/NcoI片段的構(gòu)巢曲霉甘油醛—3—磷酸脫氫酶(gpdA)啟動子，克隆到pUC19—NcoI(具有被NcoI位點取代之SmaI位點的pUC19)中，再作為EcoPI/BamHI片段分離之并克隆到帶有上述trpC終止子的pBS中。所得到的暗盒稱為pGPDN。分離作為NcoI/EcoRi片段的土曲霉基因，其中填入EcoRI位點以產(chǎn)生平頭。用BamHI和NcoI切割質(zhì)粒pGPDN。填入Bam HI位點以產(chǎn)生平頭。將土曲霉基因的NcoI/EcoRI(平頭)片段克隆到gpdA啟動子和trpC終止子之間。分離作為KpnI/XbaI片段的表達暗盒并克隆到pUC19—pyr4中，得到質(zhì)粒pPATl(參見圖9；對縮寫字的解釋見圖8)。
在黑曲霉中表達融合蛋白質(zhì)A)轉(zhuǎn)化使用Ballance等人[(1983)，Biochem，Biophys.Res.Commun.112，284—289]的作如下改動的轉(zhuǎn)化方法用質(zhì)粒pFPANl轉(zhuǎn)化黑曲霉—用每毫升106個孢子接種YPD培養(yǎng)基(1％酵母浸膏，2％蛋白胨、2％右旋糖)，并在30℃和250rpm條件下培養(yǎng)24小時；—使用Wero—Lene N組織(No.8011.0600 Wernli AG Verbandstof-fabrik，4852 Rothrist，CH)收獲細胞，并用緩沖液(0.8M KCl、0.05M CaCl2，在0.01M琥珀酸鹽緩沖液中，pH5.5)；—只使用溶解酶(SIGMA L—2265，St.Louis，MO，USA)進行原生質(zhì)體制備；—在30℃和100rpm條件下將細胞保溫90分鐘，并經(jīng)過濾(Wero—Lene N組織)分離原生質(zhì)體；—用STC(1M山梨醇、0.05M CaCl2、0.01M Tris/HCl，pH7.5)將原生質(zhì)體洗一次并重新懸浮在同樣緩沖液中；—將150μl原生質(zhì)體(～108個/ml)與10—15μg質(zhì)粒DNA輕輕混合并于室溫下(RT)保溫25分鐘；—分三步加入聚乙二醇(60％PEG 4000，50mM CaCl2、10mM Tris/HCl，pH7.5)，每次各150μl，200μl和90μl，并在室溫再將樣品保溫25分鐘；—加入5ml STC，離心并將原生質(zhì)體重新懸浮在2.5ml YGS(0.5％酵母浸膏、2％葡萄糖、1.2M山梨醇)；—將樣品于30℃(100rpm)保溫2小時，離心并將原生質(zhì)體重新懸浮在1ml 1.2M山梨醇中；—將轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體與20ml基本再生培養(yǎng)基(0.7％無氨基酸酵母氮堿、2％葡萄糖、1M山梨醇、1.5％瓊脂、20mM Tris/HCl(pH7.5)，其中每升溶加0.2g精氨酸和10ug尼龍酰胺)；—將平板于30℃保溫3—5天。B)表達分離單個轉(zhuǎn)化體、純化并試驗其融合蛋白質(zhì)的過量產(chǎn)生。100mlM25培養(yǎng)基(每升含70g麥芽糖糊精(Glucidex 17D，Sugro Basel，CH)、12.5g酵母浸膏、25％酪蛋白水解物、2g KH2PO4、2gK2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.03g ZnCl2、0.02g CaCl2、0.05g MnSO4·4H2O、0.05gFeSO4，ph5.6)分別接種得自轉(zhuǎn)化體FPANl#11、#13、#16、#E25、#E30和E31的106個孢子/ml，并于30℃和270rpm條件下保溫5天。收集上清并檢測活性。該融合蛋白質(zhì)用肌醇六磷酸作為底物于pH2.5條件下顯示有最高活性，而用4—硝基苯基磷酸酯作為底物則在pH2.5和5.0顯示兩個最佳活性(表1)。
c)活性檢測法a)肌醇六磷酸1ml酶反應(yīng)混合物含有0.5ml透析的上清液(如必要須稀釋)和5.4mM肌醇六磷酸(SIGMAP—3168)。分別在0.2M乙酸鈉緩沖液(pH5.0)、0.2M甘氨酸緩沖液(pH2.5)中進行反應(yīng)。樣品于37℃保溫15分鐘。加入1ml 15％TCA(三氯乙酸)終止反應(yīng)。
為進行顏色反應(yīng)，用0.9ml蒸餾水稀釋0.1ml終止反應(yīng)的樣品，并與1ml試劑溶液(3體積1M H2SO4、1體積2.5％(NH4)6Mo7O24、1體積10％抗壞血酸)。樣品于50℃保溫20分鐘并于820nm處以分光光度法檢測所呈現(xiàn)的蘭色。因為該檢測法是基于磷酸的釋放，故使用磷酸準曲線來(每毫升11—14nmol)確定樣品的活性。
b)4—硝苯基磷酸酯1ml酶反應(yīng)混合物含有100μl透析的上清液(如必要時須稀釋)和1.7mM4—硝基苯基磷酸酯(Merck，6850，Darmstadt，BRD)。分別在0.2M乙酸鈉緩沖液pH5.0和0.2M甘氨酸緩沖液pH2.5中進行酶反應(yīng)。樣品于37℃保溫15分鐘。加入1ml 15％TCA終止反應(yīng)。
使用如上所述的方法檢測酶活性。
表1
>*每毫升單位數(shù)1單位＝31℃下每分鐘釋放1umol磷酸1未轉(zhuǎn)化在黑曲霉中表達土曲霉9Al基因用上述質(zhì)粒pPAT1轉(zhuǎn)化黑曲霉NW205。分離單個轉(zhuǎn)化體，純化并根據(jù)土曲霉蛋白質(zhì)的過產(chǎn)生量篩選之。用分別得自轉(zhuǎn)化體PATl#3、#10、#11、#13和#16的106個孢子/ml接種50ml YPD培養(yǎng)基并于30℃和270rpm條件下保溫3天。收集上清液并大致按上述方法檢測活性，只是酶反應(yīng)的pH不同。用肌醇六磷酸作底物，酶在pH5.5時顯示有其最大活性，而用磷酸硝基苯酯作底物則在pH3.5時表現(xiàn)有最大活性(表2)。
表2
* 每毫升單位數(shù)1單位＝37℃下每分鐘釋放1umol磷酸1未被轉(zhuǎn)化實施例10黑曲霉NW205轉(zhuǎn)化體的發(fā)酵A)轉(zhuǎn)化體FPANl#11用加在振蕩瓶中的106個孢子/ml接種預(yù)培養(yǎng)基[每升含30g麥芽糖糊精(GlucideX170)、5g酵母浸膏、10g酪蛋白水解物、1gKH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、3g Tween 80；pH5.5]，并在34℃和250rpm條件下保溫24小時。
用預(yù)培養(yǎng)物接種10升發(fā)酵罐以將預(yù)培養(yǎng)物最終稀釋到1∶100。在30℃進行分批發(fā)酵，自動控制的溶解氧濃度最小為25％(pO2≥25％)。用5M NaOH自動滴定以使pH保持3.0。
用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是每升含35g麥芽糖糊精、9.4g酵母浸膏、18.7g酪蛋白水解物、2g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、2gK2SO4、0.03gZnCl2、0.02g CaCl2、0.05g MnSO4·4H2O、0.05g FeSO4；pH5.6。
在這些條件下發(fā)酵3天后，如用肌醇六磷酸作底物，pH2.5時所達到的酶活性為35單位/ml，pH5.0時為16單位/ml；如用4—磷酸硝基苯酯作底物，pH2.5時為295單位/ml，pH5.0時為90單位/ml。B)轉(zhuǎn)化體PATl#11預(yù)培養(yǎng)，發(fā)酵罐的接種和發(fā)酵培養(yǎng)基均同上所述，不同的是經(jīng)用5M NaOH自動滴定使pH保持在4.5。
在這些條件下4天后所達到的酶活性分別是，用肌醇六磷酸作底物且在pH5.5時為17.5單位/ml，用4—硝基苯基磷酸酯作底物且在pH3.5時為2單位/ml。
實施例11土曲霉(CBS 220.95)肌醇六磷酸酶基因PCR片段分離使用土曲霉(CBS 220.95)的DNA，用兩個不同的引物進行片段的PCR擴增。所用引物如下表所示。
黑體字DNA序列顯示有意義引物，斜體字則顯示反義引物。引物相當于黑曲霉基因之編碼序列的所指出部分。使用的組合是引物8加9和10加11。按照制造商推薦的方法使用由Clontech(Palo Al-to，CA，USA)提供的Tag—Start抗體藥盒。引物8加9的濃度為0.2mM，引物10加11的濃度為1mM。使用Touch—down PCR進行擴增[Don，R.H.et al.(1991)，Nucleic Acids Res.19，4008]。首先于95℃使DNA變性3分鐘。然后是兩次循環(huán)，每次使用下列退火溫度60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃和51℃，退火時間各1分鐘。退火之前，加熱至95℃保溫1分鐘；退火后于72℃進行延伸反應(yīng)30秒。如下程序進行21至35次循環(huán)95℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃鏈延伸30秒鐘。
得到兩個不同的PCR片段。所得到的DNA序列和它們與土曲霉9Al之肌醇六磷酸酶基因相關(guān)部分的比較如圖10中所示[土曲霉9Al肌醇六磷酸酶基因的相關(guān)部分“9Al”(上引)(1)；土曲霉CBS220.95的PCR片段“aferr 21”(下引)。其中A圖用引物對8加9得到的片段(aterr 21)。B圖用引物對10加11得到的片段(aterr58)。土曲霉CBS 220.95的DNA序列(上引)與土曲霉9Al的DNA序列(1)(下引)]相比較。A圖aterr 21片段中的黑體字gc序列(堿基16加17)可能是cg(DNA序列測定的不確定性)。B圖aterr58 PCR片段26位的X可能代表四種核苷酸的任何一種]。
實施例12在非嚴格和嚴格洗滌條件下交叉雜交將表3中所列各菌株的各5pg基因組DNA分別與每μgDNA 4單位的Hind III或Pst I于37℃保溫4小時。消化后，用苯酚提取該混合物并用乙醇沉淀DNA。然后在0.8％瓊脂糖凝膠上分析樣品。使用含有1M NaCl的0.4M NaOH作為轉(zhuǎn)移溶液將DNA轉(zhuǎn)移到Nytran膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH，USA)上。于42℃雜交18小時。雜交溶液每毫升含有50％甲酰胺、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、4XSSPE(1XSSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA、10mM NaH2PO4、pH7.4)、0.5％blotto(干牛奶粉加在水中)和0.5mg鮭魚精子DNA。在使用最后的和最嚴格洗滌條件的非嚴格條件下，在含有0.1％SDS的0.1XSSPE中室溫保溫30分鐘洗膜。所使用的探針(以大約109dpm/μg DNA)的比活性標記的)是使用嗜熱毀絲霉(Myceli.ther-mo.)構(gòu)巢曲霉(Asperg.midul.)煙曲霉(Asperg.fumig.)、土曲霉9Al(Asperg.terreus 9Al)、嗜熱裸節(jié)菌(Talarom.thermo.)的基因組DNA用引物8加9產(chǎn)生的PCR片段(參見實施例11)。經(jīng)隨機引導(dǎo)(按照Pharmacia，Uppsala，Sweden給出的方法)得到MT2基因組探針，并跨越1410 bp，即從嗜熱毀絲霉肌醇六磷酸酶基因之N末端的BspEI位點上游到C末端中的PvuII位點(位置2068至3478)。經(jīng)隨機引導(dǎo)得到AT2基因組探針并跨越1365bp，即從土曲霉9Al肌醇六磷酸酶基因的Apal位點到NdeI位點(位置491至1856)。經(jīng)隨機引導(dǎo)得到AN2 DNA探針并跨越黑曲霉基因(EP 420 358)的完整編碼序列(1404bp)。結(jié)果在表3中給出。[“*”除外相當于非特異性20kb片段的弱信號；在很弱交叉雜交信號的情況下，使用來自嗜熱裸節(jié)菌的PCR片段在20kb處見有來自黑曲霉的DNA，因為它明顯不同于含有肌醇六磷酸酶基因的預(yù)期的10kb Hind III片段，所以該片段是非特異性的；“**”只因DNA的部分消化所產(chǎn)生的信號]。
為了用嚴格洗滌條件進行交叉雜交，進一步于65℃在含有0.1％SDS的0.1XSSFE中洗滌30分鐘。結(jié)果示于表4中[(1)只是仍測到10.5kb HindIII片段，而未出現(xiàn)6.5kb Hind III片段(參見表3)]。
權(quán)利要求
1.編碼具有肌醇六磷酸酶活的DNA序列，該DNA序列衍生于選下列一組中的真菌拉維氏端梗孢((Acrophialophora levis)、土曲霉(Aspergillus terreus)、煙曲霉(Aspergillus，fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、Calcarisporiellathcrmophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、腐質(zhì)霉菌種(Humicola sp.)、Mycelia sterilia、Myrococcum thermophilum、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、Rhizomacor Miehei、Sporotrichumcellulophilum、嗜熱側(cè)孢(Sporotrichum thermophile)、Scytalidium in-donesicum和嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces Thermophilus)，或編碼這樣一個仍具有肌醇六磷酸酶活性之片段的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA序列，其中真菌選自下列的一組中拉維氏端梗孢(Acrophialophora levis)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、上曲霉(A.terreus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、Calcarisporiella thermophi-la、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、Sporotrichum cell-dophilum、Sporotrichum thermophile、Mycelia sterilia、嗜熱毀絲霉(Myce-liophthora thermophila)和嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA序列，其中真菌選自土曲霉、嗜熱毀絲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉和嗜熱踝節(jié)菌。
4.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，所說的DNA序列選自(a)圖1所示的DNA序列和其互補鏈；(b)在標準條件下與(a)中限定的序列雜交的DNA序列；(c)因為遺傳密碼的簡并性，不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列編碼的多肽有確切相同氨基酸的多肽的DNA序列；和(d)作為(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
5.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，該DNA序列選自(a)圖2所示的DNA序列和其互補鏈；(b)在標準條件下與(a)所限定的序列雜交的DNA序列；(c)因為遺傳密碼的簡并性，在與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列編碼的多肽有確切相同的多肽的DNA序列；和(d)作為(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
6.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，該DNA序列選自(a)包括圖4、5、6或10的DNA序列之一的DNA序列或其互補鏈；(b)在標準條件下與(a)所限定的序列雜交的DNA序列；(c)因為遺傳密碼的簡并性，不與(a)或(b)的序列雜交，但編碼與由這些DNA序列編碼的多肽有確切相同的多肽的DNA序列；和(d)作為(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
7.編碼具有肌醇六磷酸酶活性的DNA序列，該DNA序列選自包括可從嗜熱踝節(jié)菌中分離的圖4 DNA序列、可從煙曲霉中分離的圖5之DNA序列、可從構(gòu)巢曲霉中分離的圖6之DNA序列、可從上曲霉(CBS 220.95)中分離的圖10之DNA序列的DNA序列，或該DNA序列是其簡并變異體或等同物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任何一項的DNA序列，其編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，且該DNA序列衍生于真菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的DNA序列，其中真菌選自如權(quán)利要求1、2或3所限定的組中。
10.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且該DNA序列在標準條件下與作為與分離自如權(quán)利要求1至3中任一項中所限定之真菌的DNA和下列PCR引物對之PCR反應(yīng)產(chǎn)物的探針相雜交“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”作為有意義引物，和“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”作反義引物。
11.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且該DNA序列在標準條件下與一探針雜交，所說的探針是與分離自土曲霉(CBS220.95)的DNA和下列PCR引物對的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(a)“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”作為有意義引物和“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”作為反義引物；以及(b)“TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA”作為有意義引物和“CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C”作為反義引物。
12.編碼具有肌醇六磷酸酶活性之嵌合構(gòu)建體的DNA序列，該嵌合構(gòu)建體包括如權(quán)利要求1至11中任何一項所限定的DNA序列的片段。
13.編碼如權(quán)利要求12中限定的嵌合構(gòu)建體的DNA序列，該嵌合構(gòu)建體包括在其C末端融合到土曲霉肌醇六磷酸酶片段上的在其N末端的黑曲霉肌醇六磷酸片段。
14.如權(quán)利要求13中限定的具有如圖7所示特異性核苷酸序列的DNA序列，和其簡并變異體或等同物。
15.如權(quán)利要求1至14中任何一項所限定的DNA序列，其中所編碼的多肽是肌醇六磷酸酶。
16.由如權(quán)利要求1至15中任何一項所限定的DNA序列編碼的多肽。
17.包括如權(quán)利要求1至15中任何一項中所限定的DNA序列的載體。
18.如權(quán)利要求17中所限定的適于在細菌或真菌或酵母宿主中表達所說的DNA序列的載體。
19.被如權(quán)利要求1至15中任何一項中限定的DNA序列或如權(quán)利要求17或18中限定的載體轉(zhuǎn)化的細菌或真菌或酵母宿主。
20.包含如權(quán)利要求16中限定之一種或多種多肽的復(fù)合食品或飼料。
21.制備如權(quán)利要求16中限定的多肽的方法，其特征在于在適當培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求19中限定的被轉(zhuǎn)化的細菌或宿主細胞，并從中回收該多肽。
22.按權(quán)利要求21中限定的方法生產(chǎn)的多肽。
23.制備復(fù)合食品或飼料的方法，其中組合物的成分與如權(quán)利要求16中限定的一種或多種多肽混合。
24.降低動物糞肥中肌醇六磷酸酶水平的方法，特征在于以可有效地將飼料中所含肌醇六磷酸轉(zhuǎn)化成肌醇和無機磷酸鹽的量給動物喂飼如權(quán)利要求20中限定的復(fù)合飼料。
25.使用根據(jù)權(quán)利要求16的多肽轉(zhuǎn)化肌醇六磷酸成磷酸肌醇酯和無機磷酸鹽。
26.如本文前述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明目的在于得到一種能編碼具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，其中DNA序列衍生自特異的真菌組，由這類DNA序列編碼多肽，而載體含有這類DNA序列，由這類DNA序列或載體來轉(zhuǎn)化細菌或真菌或酵母寄主。即通過培養(yǎng)這類轉(zhuǎn)化性寄主而制備多肽的一種方法，以及制備含一種或多種這類多肽的復(fù)合飼料的方法。
文檔編號C12N1/15GK1126243SQ95104559
公開日1996年7月10日 申請日期1995年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月25日
發(fā)明者A·范·盧恩, D·米切爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司