專利名稱：重組細(xì)菌肌醇六磷酸酶及其應(yīng)用的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的鑒定多核苷酸，由這些多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的用途，以及這些多核苷酸和多肽的產(chǎn)生和分離。更特別的是，本發(fā)明的多肽已經(jīng)被鑒定為肌醇六磷酸酶，尤其是具有肌醇六磷酸酶活性的微生物酶。
2.背景2.1.1-簡(jiǎn)述礦物質(zhì)是所有生物體生長的必要成分。食物中的礦物質(zhì)來源于許多物質(zhì)，包括植物。例如植物的種子是豐富的礦物質(zhì)來源，因?yàn)樗鼈儼信c肌醇六磷酸分子的磷酸根復(fù)合的離子。這些與肌醇六磷酸鹽相關(guān)的礦物質(zhì)滿足了一些圈養(yǎng)類生物的飲食需要，如多胃的反芻動(dòng)物。因此，反芻動(dòng)物不需要在飲食中添加無機(jī)磷酸鹽和礦物質(zhì)，因?yàn)榱鑫钢械奈⑸锂a(chǎn)生催化肌醇六磷酸鹽(肌醇-六磷酸鹽)轉(zhuǎn)變成肌醇和無機(jī)磷酸鹽的酶。在這一過程中，與肌醇六磷酸鹽復(fù)合的礦物質(zhì)被釋放出來。然而，大多數(shù)圈養(yǎng)類生物不能有效的利用與肌醇六磷酸鹽相關(guān)的礦物質(zhì)。因此，例如，在單胃動(dòng)物(如，豬，鳥，和魚)的牲畜產(chǎn)生中，通常需要在飼料中添加礦物質(zhì)和/或抗生素物質(zhì)，改變消費(fèi)生物體的消化菌群環(huán)境，提高生長率。
正如這樣，在許多應(yīng)用中存在許多與肌醇六磷酸鹽沒有充分水解有關(guān)問題，這些問題涉及營養(yǎng)，體內(nèi)外處理步驟，健康和醫(yī)藥，環(huán)境保持和資源管理。以下是這些問題的非限制性實(shí)例1)飲食中添加礦物質(zhì)費(fèi)用昂貴。
2)在許多體內(nèi)外應(yīng)用中未水解的肌醇六磷酸鹽的存在是不希望和有問題的(如導(dǎo)致意外淤泥的出現(xiàn))。
3)飲食中添加抗生素對(duì)人類和動(dòng)物一樣都存在一種醫(yī)療威脅，即增加耐受抗生素的病原體量。
4)大便內(nèi)未吸收的礦物質(zhì)排到環(huán)境中嚴(yán)重干擾和損害了周圍土壤，養(yǎng)魚池和表面水源的生態(tài)系統(tǒng)。
5)許多潛在食物的有價(jià)值的營養(yǎng)成分明顯未被利用和浪費(fèi)了。
2.1.2-營養(yǎng)關(guān)系許多有潛在營養(yǎng)的植物，包括尤其是它們的種子，含有相當(dāng)數(shù)量的營養(yǎng)成分，如，磷酸鹽，其以一種方式與肌醇六磷酸鹽相關(guān)因此這些營養(yǎng)成分不能在消耗時(shí)被自由獲取。這些營養(yǎng)成分的不可獲得性可以被一些生物克服，這些生物體包括母牛和其他反芻動(dòng)物，它們具有充足的消化能力水解肌醇六磷酸鹽，釋放相關(guān)的營養(yǎng)成分，這很大程度上來源于它們消化道內(nèi)共生生命形式的存在。然而，大多數(shù)圈養(yǎng)類動(dòng)物，包括豬，魚，雞，火雞，及其他包括人的非反芻類生物，不能在消化后有效的釋放這些營養(yǎng)成分。
因此，含有肌醇六磷酸鹽的食物需要添加外源營養(yǎng)成分和/或一種有肌醇六磷酸酶活性的來源以彌補(bǔ)大部分種類的生物體在消耗中營養(yǎng)成分的供給不足。
2.1.3-體外體內(nèi)處理關(guān)系在另一個(gè)方面，未水解的肌醇六磷酸鹽的存在導(dǎo)致體內(nèi)外處理中的一些問題，包括，但不局限于-食物的處理。在一個(gè)實(shí)例中，如EP0321004-B1(Vaara等)所描述的，在處理玉米和高粱谷粒中有一個(gè)處理步驟，將堅(jiān)硬的谷粒浸泡在水中以軟化它們。在這一過程中濾出的水溶性物質(zhì)通過蒸發(fā)濃縮變成玉米浸泡液的一部分。玉米浸泡液中未水解的植酸，大部分以鈣和鎂鹽的形式存在，其與磷結(jié)合并且與蛋白和金屬離子一起沉淀為不需要的淤泥。這種淤泥在玉米浸泡液的蒸發(fā)，轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存中是成問題的。因此，在這公開的肌醇六磷酸酶分子-或者單獨(dú)存在或者與其它制劑組合(包括但不局限于酶，包括蛋白酶)-不僅在這一應(yīng)用中(如，防止不需要的淤泥)，而且在其他需要肌醇六磷酸鹽水解作用的應(yīng)用中都是有用的。
2.1.4-醫(yī)學(xué)關(guān)系飲食內(nèi)加入抗生素物質(zhì)在家畜的生產(chǎn)過程中有許多好處。例如，除了它作為預(yù)防性抵御疾病的作用，外源性使用抗生素已經(jīng)被證明可以增加生長率，使其上升3-5％。這一作用的機(jī)制可能也包括(或部分包括)圈養(yǎng)動(dòng)物消化道菌群環(huán)境的變化，導(dǎo)致微菌叢平衡，更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。
然而，與過量應(yīng)用抗生素相關(guān)的明顯副作用是產(chǎn)生病原性抗生素抵抗微生物菌株的儲(chǔ)庫的危險(xiǎn)。這一危險(xiǎn)是急迫的，已知人耐藥性病原體的上升與牲畜類抗生素的使用有關(guān)。例如，阿伏帕星，動(dòng)物飼料中使用的抗生素，1997年在許多地方已經(jīng)被禁止使用，現(xiàn)在給予動(dòng)物另外一種抗生素，維吉霉素，與一種新藥Synercid，非常相似，后者用來代替人類的萬古霉素。然而，許多研究表明圈養(yǎng)動(dòng)物的一些腸球菌素抵抗synercid。結(jié)果，非預(yù)期的耐藥后果，如那些已經(jīng)在阿伏帕星和維吉霉素上看到的，不管什么新抗生素用作圈養(yǎng)動(dòng)物的預(yù)防治療似乎又要發(fā)生。因此，研究人員呼吁應(yīng)嚴(yán)格控制工業(yè)上藥物使用。
在飼料中添加即將公開的肌醇六磷酸酶分子，飼養(yǎng)動(dòng)物使其生長率增加與使用抗生素，如阿伏帕星，獲得的生長率增加是相同的-如果不是過量的話。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子-或單獨(dú)或與其他制劑聯(lián)合(包括但不局限于酶，包括蛋白酶)-不僅在這一應(yīng)用(如，增加圈養(yǎng)動(dòng)物的生長率)中，而且在其他需要肌醇六磷酸鹽水解作用的應(yīng)用中都是有用的。
2.1.5-環(huán)境關(guān)系肌醇六磷酸酶缺乏的生物種類-不管食物中是否添加礦物質(zhì)-消耗含肌醇六磷酸鹽食物的環(huán)境后果是未吸收的礦物質(zhì)排出后導(dǎo)致糞便污染。這一污染不僅對(duì)其棲息地而且繼而對(duì)其周圍水源都有副作用。這一環(huán)境的改變最初在食物鏈的最低層發(fā)生，因此具有穿越高層的潛力，且通過生態(tài)系統(tǒng)引起長久和災(zāi)難性的損害-尤其是在持續(xù)污染多年后。這一問題能在任何有濃縮肌醇六磷酸鹽的地方顯露出來-包括體內(nèi)(如通過牲畜的產(chǎn)生地，動(dòng)物園，野生棲息地的動(dòng)物，等等)和體外(如在商業(yè)谷物濕磨，蜂蠟浸泡過程，等等)處理過程。
2.1.6-財(cái)政關(guān)系決定使用外源添加肌醇六磷酸酶分子-不管是完全代替或增加外源使用礦物質(zhì)和/或抗生素-最終需要使用者通過一項(xiàng)財(cái)政可行性和成本有效性的測(cè)試，使用者的生計(jì)依賴于相關(guān)的應(yīng)用，如牲畜生產(chǎn)。
結(jié)果，在許多應(yīng)用中需要獲得有效和成本上有效的肌醇六磷酸鹽水解的方法。尤其是，在商業(yè)應(yīng)用中需要優(yōu)化水解肌醇六磷酸鹽的方法。在一個(gè)特殊方面，需要優(yōu)化商業(yè)治療方法改善人類和圈養(yǎng)動(dòng)物消耗含肌醇六磷酸鹽食物的營養(yǎng)供給。
以前就有重組肌醇六磷酸酶報(bào)道，但通過本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)的肌醇六磷酸酶分子提高了它們較差的活性。因此，即將公開的肌醇六磷酸酶分子較以前鑒定的肌醇六磷酸酶分子，如真菌來源的肌醇六磷酸酶分子提供了本質(zhì)上更高的工業(yè)性能。2.2-肌醇六磷酸鹽和肌醇六磷酸鹽水解的一般概述2.2.1-肌醇六磷酸鹽水解導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的釋放在實(shí)際上所有的植物種子中肌醇六磷酸鹽作為磷的儲(chǔ)存源存在(Graf(Ed.)，1986)。在谷類和莢果中植酸通常形成種子的正常部分。它與飲食中的礦物質(zhì)結(jié)合起作用，這些礦物質(zhì)在新生植物從種子中發(fā)芽時(shí)是必需的。當(dāng)肌醇六磷酸中的磷酸根被種子中的肌醇六磷酸酶去除時(shí)，其結(jié)合金屬離子的能力消失，礦物質(zhì)變得可以被植物吸收。在牲畜喂養(yǎng)的谷物中，肌醇六磷酸結(jié)合的微量礦物質(zhì)很大程度上不能被缺乏肌醇六磷酸酶活性的單胃動(dòng)物吸收。
雖然一些肌醇六磷酸鹽的水解發(fā)生在結(jié)腸，但是大多數(shù)肌醇六磷酸鹽通過單胃動(dòng)物的胃腸道，在糞尿中排出，導(dǎo)致在密集牲畜生產(chǎn)地區(qū)的糞便肌醇六磷酸鹽污染問題。結(jié)腸中釋放的無機(jī)磷對(duì)牲畜來說營養(yǎng)價(jià)值略微降低，因?yàn)闊o機(jī)磷大部分-如果不是全部-在小腸吸收。因此，肌醇六磷酸鹽中營養(yǎng)學(xué)上的重要飲食礦物質(zhì)的可評(píng)價(jià)量對(duì)單胃動(dòng)物來說是無法獲得的。
總之，肌醇六磷酸鹽-相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)不僅包括與肌醇六磷酸鹽共價(jià)連接的磷酸鹽，而且包括其他與肌醇六磷酸鹽螯合的礦物質(zhì)。而且，在攝取中，未水解的肌醇六磷酸鹽可能進(jìn)一步相遇并與其他礦物質(zhì)結(jié)合。礦物質(zhì)的螯合可以抑制酶的活性，這些礦物質(zhì)用于這些酶作為輔因子起作用。
2.2.2-細(xì)菌酶可以水解肌醇六磷酸鹽肌醇六磷酸鹽轉(zhuǎn)變成肌醇和無機(jī)磷可以被細(xì)菌酶催化，該酶指廣義上的肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶如肌醇六磷酸酶#EC3.1.3.8能催化肌醇六磷酸鹽水解成D-肌醇1，2，4，5，6-五磷酸鹽和正磷酸鹽。據(jù)報(bào)道某些真菌肌醇六磷酸酶將肌醇五磷酸鹽水解成四，三，和低級(jí)磷酸鹽。如，據(jù)報(bào)道A.ficuum肌醇六磷酸鹽產(chǎn)生肌醇二和一-磷酸鹽的混合物(Ullah，1988)。產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的微生物由細(xì)菌如枯草芽胞桿菌(Powar和Jagannathan，1982)和假單胞菌(Cosgrove，1970)；酵母如啤酒酵母(Nayini和Markakis，1984)；和真菌如土曲霉菌(Yamada等，1968)組成。
酸性磷酸酶是催化多種磷酸酯水解的酶，通常最優(yōu)的pH值在6.0以下(Igarashi和Hollander，1968)。如，#EC3.1.3.2酶催化正磷酸單酯水解成正磷酸鹽產(chǎn)物。據(jù)報(bào)道一種酸性磷酸酶已經(jīng)從A.ficuum中純化。去糖基化形式的酸性磷酸酶的分子量明確為32.6kDa(Ullah等，1987)。
肌醇六磷酸酶和較不特異的酸性磷酸酶是通過真菌曲霉屬ficuum作為胞外酶產(chǎn)生的(Shieh等，1969)。Ullah報(bào)道從野生型A.ficuum純化的肌醇六磷酸酶，其分子量為61.7kDA(SDS-PAGE電泳；糖基化作用矯正)；pH最適在pH2.5和pH5.5；Km大約為40μm；特異活性大約為50U/kg(Ullah，1988)。PCT專利申請(qǐng)WO91/05053也報(bào)道公開了從曲霉菌ficuum中分離和分子克隆肌醇六磷酸酶，最適pH是pH2.5和pH5.5，Km大約是250μm，特異活性大約是100U/kg蛋白。
簡(jiǎn)言之，所引用的以前報(bào)道的細(xì)菌酶的特異活性大約在50-100U/kg蛋白范圍內(nèi)。與之相反，已經(jīng)測(cè)定本發(fā)明公開的肌醇六磷酸酶活性大約是4400U/kg。這相當(dāng)于活性改善了大約40倍或更高。2.3-解決肌醇六磷酸鹽水解不充分的問題2.3.1-工業(yè)應(yīng)用中的酶添加劑使用可以產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的微生物作為單胃動(dòng)物飼料添加劑的可能性以前已有報(bào)道(USPN3,297,548 Shieh和Ware；Nelson等，1971)。這一方法的成本有效性是這一和其他工業(yè)應(yīng)用的主要局限。因此改善肌醇六磷酸酶分子勢(shì)在必行。
也有報(bào)道微生物肌醇六磷酸酶可用于在某些工業(yè)過程，如小麥和玉米的消費(fèi)產(chǎn)品，中生產(chǎn)動(dòng)物飼料。在一個(gè)方面，玉米的濕磨過程產(chǎn)生固體谷蛋白作為動(dòng)物飼料。據(jù)報(bào)道加入肌醇六磷酸酶可以改善飼料產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。例如，使用真菌肌醇六磷酸酶和處理?xiàng)l件(t～50℃和pH～5.5)以前已有報(bào)道(如EP 0 321 004)。簡(jiǎn)單地說，在使用傳統(tǒng)浸泡方法制造大豆食品過程中，如，不加入外源性肌醇六磷酸酶的方法，據(jù)報(bào)道未水解的肌醇六磷酸鹽的存在使得食品和廢棄物不適合用來飼養(yǎng)魚，家禽和其他非反芻動(dòng)物，及喂奶的小牛的飼料。據(jù)報(bào)道肌醇六磷酸酶可用于改善這一高蛋白大豆物質(zhì)的營養(yǎng)和商業(yè)價(jià)值(見Finase酶，Alko，Rajamaki，芬蘭)。真菌肌醇六磷酸酶和一種pH2.5最佳酸性磷酸酶的結(jié)合形成A.黑曲霉多糖已經(jīng)被Alko有限公司作為動(dòng)物飼料添加劑用在他們的植酸降解產(chǎn)品Finas F和Finas S.中。然而，這一方法的成本有效性對(duì)更大范圍的應(yīng)用來說仍有較大的局限性。因此一種成本有效的肌醇六磷酸酶來源將明顯增加大豆餐食作為動(dòng)物飼料的價(jià)值(Shieh等，1969)。
2.3.2-需要最佳的酶添加劑為了解決暴露的問題，已經(jīng)建議用外源性肌醇六磷酸酶處理食品，但這一方法沒有完全優(yōu)化，尤其關(guān)于實(shí)用性和成本有效性。這種優(yōu)化需要考慮存在較廣范圍的應(yīng)用，尤其是用于大批量的生產(chǎn)。例如，食品及其制備方法，和接受的微生物的種類都有很大的范圍。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，要重視的是魚飼料膠囊的制造需要將其成分暴露在高溫和/或高壓之下以便使產(chǎn)生的膠囊在投入水之前不溶解和/或降解(如在消費(fèi)前)。因此需要這一制造過程獲得高溫和/或高壓條件下穩(wěn)定的添加酶。因此，不同肌醇六磷酸酶可以分別優(yōu)選或適于不同的應(yīng)用。
此外可以認(rèn)識(shí)到優(yōu)化一個(gè)酶過程的方法是通過對(duì)重要催化酶進(jìn)行修飾和改善。例如，要形成的轉(zhuǎn)基因植物是由一個(gè)表達(dá)肌醇六磷酸酶分子的表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成的。要重視的是，通過嘗試改善不直接涉及表達(dá)的分子的活性的因子，如表達(dá)水平，只有有限的-可能是不充分的-優(yōu)化水平可能在最大程度上實(shí)現(xiàn)。因此，也需要獲得改善了特性的分子。
一種特別的實(shí)現(xiàn)分子特征改善的方法是通過一種稱為定向進(jìn)化(directedevolution)的技術(shù)方法，包括Diversa Corporation的所有的方法，該方法中的術(shù)語DirectEvolution已形成和注冊(cè)。這些方法在Diversa的共同擁有的專利(US5,830,696)和一些共同待批的專利申請(qǐng)中有進(jìn)一步的詳細(xì)闡述。簡(jiǎn)單地說，DirectEvolution包括a)一種或多種分子模板經(jīng)受誘變產(chǎn)生新分子和b)從具有更多所需特征的新分子的子代種類中選擇。
然而，定向進(jìn)化的能力依賴于起始模板的起始選擇，及誘變過程的選擇和使用的篩選過程。例如，對(duì)隨機(jī)選擇的分子模板和/或?qū)羞^度亞理想特征的初始分子模板的全范圍的誘變排列的產(chǎn)生和評(píng)價(jià)的方法常常是一項(xiàng)可怕的巨大工程。這些模板的使用提供了，在最好的程度上，間接的亞理想通路并且潛在提供了產(chǎn)生充足的改良子代分子的很少的前景。另外，也意識(shí)到我們目前關(guān)于嚴(yán)格預(yù)測(cè)有益的修飾能力的知識(shí)是非常局限的。
因此，需要一種發(fā)現(xiàn)和利用自然界中具有進(jìn)化前特性-優(yōu)選進(jìn)化前酶的優(yōu)點(diǎn)-的分子的方法。因此在本公開中，要意識(shí)的自然界提供了(通過我們有時(shí)稱之為“自然進(jìn)化”的過程)可以立即用于商業(yè)應(yīng)用或其他應(yīng)用的分子，為了獲得甚至更大的改變可以進(jìn)行定向進(jìn)化。
總之，需要新的，高活性的，生理上有效的，來源經(jīng)濟(jì)的肌醇六磷酸酶活性。特別地，需要鑒定新的肌醇六磷酸酶a)在一種或多種特異應(yīng)用中有較高活性，因此可以用來優(yōu)化這些特異的應(yīng)用；b)作為定向進(jìn)化的模板獲得甚至更進(jìn)一步改善的新生分子；和c)通過諸如雜交為基礎(chǔ)的方法等方式，作為鑒定其他相關(guān)分子的工具。本發(fā)明以一種新的方式滿足了這些需要。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種多核苷酸和一種多核苷酸編碼的多肽，它已被鑒定為具有肌醇六磷酸酶活性的肌醇六磷酸酶。依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新穎的重組酶，及其活性片段，類似物和衍生物。
更特別的，本發(fā)明涉及細(xì)菌來源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，其可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養(yǎng)價(jià)值。早期出版物已揭示了真菌肌醇六磷酸酶的使用，但用于這一目的細(xì)菌肌醇六磷酸酶是新的。
更特別的，本發(fā)明涉及新鑒定的大腸桿菌來源的重組肌醇六磷酸酶分子的用途，其可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養(yǎng)價(jià)值。
這種應(yīng)用包括使用新鑒定的分子來水解食物中的肌醇六磷酸鹽。水解可以在肌醇六磷酸鹽攝取前或在攝取后或者在攝取前和攝取后都發(fā)生。這一應(yīng)用尤其與非反芻生物相關(guān)，但不局限于此，并且包括在轉(zhuǎn)化宿主公開的新肌醇六磷酸酶分子的表達(dá)，公開的新肌醇六磷酸酶分子與食物和其他物質(zhì)中的肌醇六磷酸鹽的接觸，和在動(dòng)物的消化系統(tǒng)使用公開的新肌醇六磷酸酶分子。
另外，水解可不依賴于消耗發(fā)生，如，在體外應(yīng)用，如在反應(yīng)容器中。因此，含肌醇六磷酸鹽的物質(zhì)的處理包括較大范圍的物質(zhì)的處理，包括那些并不需要成為食物的物質(zhì)，如，對(duì)排泄物(或糞便)的處理。
本發(fā)明優(yōu)選的分子包括從大腸埃希氏桿菌B中分離的重組肌醇六磷酸酶，與以前鑒定的真菌肌醇六磷酸酶相比，它能改善磷從肌醇六磷酸和肌醇六磷酸的鹽類中釋放的效率。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種可用于摻入食物中的肌醇六磷酸酶。更具體地，提供了一種可用于改善含肌醇六磷酸鹽食物的營養(yǎng)價(jià)值的肌醇六磷酸酶。更具體地，還提供了一種肌醇六磷酸酶，當(dāng)用于含肌醇六磷酸鹽的食物中時(shí)，可明顯改善消耗它的生物體生長的情況。從理論上講，肌醇六磷酸酶活性的有益作用機(jī)制主要包括(如果不是本質(zhì)上的)可以察覺的肌醇六磷酸酶的水解。有益的作用可以在含肌醇六磷酸鹽的食物攝取前或可選擇攝取后或可選擇在攝取前和攝取后都發(fā)生。在攝取后發(fā)生有益作用的情況下，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種肌醇六磷酸酶，其具有非反芻生物在消耗過程中仍保留的活性。
依據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了編碼本發(fā)明酶的分離核酸分子-包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA-及活性衍生物，類似物和這些酶的片段。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一個(gè)通過重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法，該方法包括在促進(jìn)所述酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組的原核和/或真核宿主細(xì)胞并隨后回收所述的酶，該重組的原核和/或真核宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一個(gè)在轉(zhuǎn)基因植物或植物器官表達(dá)這種酶或編碼這種酶的多核苷酸的方法和產(chǎn)生這種植物的方法。該是通過引入植物中一個(gè)由編碼這種肌醇六磷酸酶的核酸序列組成的表達(dá)構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)的。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了將這種酶或編碼這種酶的多核苷酸用于工業(yè)化生產(chǎn)過程的方法，如從植物材料的肌醇六磷酸鹽釋放礦物質(zhì)的方法，這一方法或在體外，即，飼料的處理方法，或在體內(nèi)，如將這種酶施用動(dòng)物身上。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了由公開的飼料處理方法制造的食品。
依據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了將這種酶或編碼這種酶的多核苷酸用于涉及研究，發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的體外應(yīng)用目的的使用方法。在一個(gè)非限定性的實(shí)例中，這種方法包括鑒定和分離相似序列的探針的產(chǎn)生，這種序列可能編碼其他生物中相似的酶。
在一個(gè)特定的非限定的實(shí)例中，也提供了生產(chǎn)核酸探針的方法，這種探針包括足夠長度的核酸分子以便與本發(fā)明的核酸序列特異雜交。通過優(yōu)選實(shí)施方案，這些探針的雜交基礎(chǔ)方法包括，但不限制于，PCR，北方(Northern)和南方(Southern)雜交類型，RNA保護(hù)測(cè)定和原位雜交類型。本發(fā)明公開的分子的用途進(jìn)一步包括，以一種非限定性的方式的診斷應(yīng)用。
根據(jù)一個(gè)非限定的實(shí)例，這些方法包括公開的分子的抗體的產(chǎn)生，這些抗體的使用，包括，例如用于與其他生物體酶相似序列的鑒定和分離。在另外一個(gè)非限定性的實(shí)例中這些方法包括使用本發(fā)明的酶作為模板用于定向進(jìn)化，該方法包括用篩選基礎(chǔ)方法產(chǎn)生新分子，發(fā)現(xiàn)具有改善特征的子代分子。
也提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人類生物體，其基因組包括編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異源核酸序列，其中所述轉(zhuǎn)基因?qū)е录〈剂姿崦付嚯牡谋磉_(dá)。
本發(fā)明的這些和其他方面從本文的講授中對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員是顯而易見的。
4.附圖的簡(jiǎn)要說明下述附圖是發(fā)明實(shí)施方案的描述，并不意味限制于本發(fā)明被權(quán)利要求所包含的范圍。


圖1A和B表明核苷酸和本發(fā)明酶的推論的氨基酸序列。序列測(cè)定使用378自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems，Inc.)。
圖2顯示本發(fā)明肌醇六磷酸酶的pH值和溫度曲線以及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。這些分析使用的測(cè)定見下述肌醇六磷酸酶活性的測(cè)定肌醇六磷酸酶的測(cè)定是在37℃孵育150μl酶預(yù)備液與添加1mM CaCl2的600μl 2mM植酸鈉的pH7.5，100mM TrisHCl緩沖液30分鐘。孵育后通過加入750μl 5％三氯乙酸終止反應(yīng)。在加入1500μl顯色試劑(4體積的1.5％鉬酸銨在5.5％硫酸溶液和1體積的2.7％硫酸亞鐵Shimizu，1992)后用700nm磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)分光光度測(cè)定法測(cè)定釋放的磷酸鹽。圖2中Y軸表示700nm處的OD值。X軸表示溫度或pH。
5.術(shù)語的定義為了更好的理解這里提供的實(shí)施例，我們將描述某些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。另外，這里使用的標(biāo)題和次標(biāo)題是為了給讀者提供方便，不以何種方式限定本發(fā)明。
這里使用的術(shù)語“抗體”指完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的片段，如Fab，F(xiàn)ab’，(Fab’)2，F(xiàn)v，和SCA片段，它們能結(jié)合肌醇六磷酸酶多肽的抗原決定簇。可以用本領(lǐng)域已知的方法制造(見Harlow and Lane，見上)這些抗體片段，這些抗體片段保留一些與與它們來源抗體的抗原(如肌醇六磷酸酶抗原)選擇性結(jié)合能力進(jìn)一步描述如下。
(1)Fab片段由抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段組成，并可以通過用木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體分子產(chǎn)生，產(chǎn)生由整個(gè)輕鏈和重部分鏈組成的片段。
(2)抗體分子的Fab’片段可以通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體分子獲得，接著還原，產(chǎn)生由整個(gè)輕鏈和重部分鏈組成的分子。每個(gè)抗體分子經(jīng)這一方法處理后獲得兩個(gè)Fab’片段。
(3)抗體的(Fab’)2片段可以通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體分子獲得，而不要后續(xù)的還原。一個(gè)(Fab’)2片段是兩個(gè)Fab’片段的二聚體，通過兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起。
(4)Fv片段定義為包含表達(dá)為兩個(gè)鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段。
(5)單鏈抗體(“SCA”)是一個(gè)基因工程單鏈分子包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，通過合適的，彈性的多肽連接子連接。
術(shù)語“降解有效的”數(shù)量指與未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，需要降解至少50％肌醇六磷酸鹽的酶的數(shù)量。優(yōu)選的是，至少80％的肌醇六磷酸鹽被降解。
DNA的“消化”指用限制酶催化的DNA的斷裂，限制酶僅在DNA的某些序列中起作用。這里用的不同的限制酶是商業(yè)上可以獲得的，它們的作用條件，輔助因子和其它需要的條件對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是已知的。為了分析的目的，典型的1μg質(zhì)?；駾NA片段在大約20μl的緩沖液中與大約2單位的酶作用。為了質(zhì)粒構(gòu)建中分離DNA片段的目的，典型的5至50μg的DNA用20至250單位的酶在一個(gè)大容積內(nèi)消化。特定限制酶合適的緩沖液和底物數(shù)量由制造商說明。通常使用的孵育時(shí)間大約是37℃約1小時(shí)，但是可以根據(jù)提供者的說明書改變。消化后反應(yīng)物直接在凝膠上電泳以分離需要的片段。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“抗原決定簇”指一個(gè)抗原上的抗原決因素，如肌醇六磷酸酶多肽，可與抗體的抗體結(jié)合位點(diǎn)，如肌醇六磷酸酶特異的抗體結(jié)合?？乖瓫Q定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并可以有特異的三維結(jié)構(gòu)特征，和特異的電荷特征。
術(shù)語“片段”，“衍生物”和“類似物”當(dāng)指
圖1中的酶時(shí)，包括保留至少一個(gè)生理功能或活性與參考酶至少本質(zhì)上相同的酶。而且，術(shù)語“片段”，“衍生物”和“類似物”可以用一個(gè)“原體形式”，如可以通過分裂來修飾的，以產(chǎn)生具有明顯高活性的成熟酶的低活性的原蛋白的實(shí)例說明。
術(shù)語“基因”表示參與了產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段；它包括編碼區(qū)的前區(qū)或后區(qū)(頭和尾)，以及單一編碼片段(外顯子)之間的中介序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語“分離的”表示從其最初環(huán)境(如，如果它是自然發(fā)生的話即自然環(huán)境)移走的物質(zhì)。例如，在一個(gè)活體動(dòng)物存在的自然形成的多核苷酸或酶沒有被分離，但是從自然系統(tǒng)一些或所有共同存在的物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或酶是被分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或這些多核苷酸或酶可以是組成成分的一部分，但如果這些載體或組成成分不是自然環(huán)境的一部分的話，仍然被分離。
通過“分離的核酸”表示一種核酸，如一個(gè)DNA或RNA分子，這種核酸不緊鄰5’或3’末端側(cè)向序列，而它正常在它來源的生物的自然存在的基因組中是緊鄰的。因此這個(gè)術(shù)語描述了，例如，摻入到載體如質(zhì)粒或病毒載體中的核酸；摻入到異種細(xì)胞(或同種細(xì)胞的基因組，但所在位點(diǎn)與自然發(fā)生的位點(diǎn)不同)基因組中的核酸；和作為分離分子，如PCR擴(kuò)增或限制酶消化產(chǎn)生的DNA片段，或體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子存在的核酸。術(shù)語也描述了形成雜交基因部分的重組核酸，后者編碼可用來例如，在產(chǎn)生融合蛋白的其它多肽序列。
“連接”指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的方法(Sambrook等，1989)。除非其他所指，連接可以使用已知的緩沖液和條件完成，用每0.5μg大約等摩爾量的待連接DNA片段使用10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)。
在此使用的一個(gè)“核酸分子”包括至少一個(gè)核苷酸堿基或一個(gè)核苷酸堿基對(duì)，分別依賴它是否是單鏈或是雙鏈。而且，一個(gè)核酸分子可以排它地或嵌合地屬于任何含核苷酸分子的基團(tuán)，舉例如，但不局限于，以下核酸分子基團(tuán)RNA，DNA，基因組核酸，非基因組核酸，自然產(chǎn)生或非自然產(chǎn)生的核酸，和合成的核酸。這包括，以非限定性舉例，與任何細(xì)胞器，如線粒體相關(guān)的核酸，核糖體RNA，和由一種或多種自然存在或非自然存在的成分嵌合組成的核酸分子。
另外，“核酸分子”可以包含部分一個(gè)或多個(gè)以非核苷酸為基礎(chǔ)一，舉例，但不限于氨基酸和糖。因此，通過實(shí)例，但不限于一個(gè)部分是以核苷酸為基礎(chǔ)的，部分是以蛋白為基礎(chǔ)的核糖體，被認(rèn)為是“一個(gè)核酸分子”。
另外，通過實(shí)例，但不局限于，用可探測(cè)部分標(biāo)記，如放射活性或可選擇的非放射活性標(biāo)記的核酸分子，也同樣作為一個(gè)“核酸分子”。
術(shù)語“編碼特定酶的核酸序列”或一個(gè)特定酶“的DNA編碼序列”或一個(gè)“編碼特定酶的核苷酸序列”-及其他同名術(shù)語-指在合適的調(diào)控序列的控制下轉(zhuǎn)錄和翻譯成酶的DNA序列?！皢?dòng)子序列”是能在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)域。啟動(dòng)子是DNA序列的一部分。這一序列區(qū)在3’端有一個(gè)起始密碼子。啟動(dòng)子序列包括堿基的最小數(shù)目，以背景結(jié)合以上的可檢測(cè)水平啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的必需元件結(jié)合于此。然而，RNA聚合酶與序列結(jié)合，并且在起始密碼子(啟動(dòng)子的3’末端)開始轉(zhuǎn)錄以后，轉(zhuǎn)錄在3’方向下游發(fā)生。在啟動(dòng)子序列內(nèi)會(huì)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通過核酶S1基因序列方便地確定)及負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)(連續(xù)序列)。
術(shù)語“編碼一種酶(蛋白)的核酸”或“編碼一種酶(或蛋白)的DNA”或“編碼一種酶(蛋白)的多核苷酸”和其他同名術(shù)語包括一種僅包括酶的編碼序列的多核苷酸及包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種“特異核酸分子種類”通過其化學(xué)結(jié)構(gòu)定義，舉例如通過，但不局限于，其基本序列。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種特異的“核酸分子種類”通過核酸種類的功能定義或通過來源于核酸種類產(chǎn)品的功能定義。因此，通過非限定性實(shí)例的方式，一個(gè)“特異核酸分子種類”可以通過一種或多種歸因于它的活性或特性定義，包括歸因于它表達(dá)產(chǎn)物的活性或特性。
“工作核酸樣品收集入核酸庫”的直接定義包括將核酸樣品并入載體-為基礎(chǔ)的集合物中的方法，如通過連接進(jìn)入載體，和轉(zhuǎn)化入一個(gè)宿主。相關(guān)載體，宿主，和其他試劑的描述及它的特異非限定實(shí)例在以后提供?！皩⒐ぷ骱怂針悠肥占牒怂釒臁钡闹苯佣x也包括將核苷酸樣品并入非載體-為基礎(chǔ)的集合物中的方法，如通過連接到接頭上。優(yōu)選的接頭可以使PCR引物退火以加速PCR擴(kuò)增。
因此，在一個(gè)非限定實(shí)施方案中，一個(gè)“核酸庫”是包括一種或多種核酸分子的載體-為基礎(chǔ)的集合物。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)“核酸庫”是包括核酸分子的非載體-為基礎(chǔ)的集合物。仍然在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)“核酸庫”是包括核酸分子的聯(lián)合集合物，部分是載體-為基礎(chǔ)的，部分是非載體-為基礎(chǔ)的。優(yōu)選的是，根據(jù)個(gè)體核酸分子種類，包括庫的分子的集合物是可搜索和分離的。
本發(fā)明提供了一個(gè)“核酸構(gòu)建物”或可選擇的一個(gè)“核苷酸構(gòu)建物”或可選擇的一個(gè)“DNA構(gòu)建物”。這里使用的術(shù)語“構(gòu)建物”描述了一個(gè)分子，如多核苷酸(如一個(gè)肌醇六磷酸酶多核苷酸)可以選擇性的以化學(xué)鍵與一種或多種其它的分子部分如一個(gè)載體，或載體的一部分結(jié)合。在一個(gè)特異-但非限制-的方面，一個(gè)核苷酸構(gòu)建物以適于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的DNA表達(dá)為例。
“寡核苷酸”指或者一個(gè)單鏈多脫氧核苷酸或者兩個(gè)互補(bǔ)的多脫氧核苷酸鏈，它們可以通過化學(xué)合成。這種合成的寡核苷酸可以具有或不具有5’磷酸鹽。在激酶存在的情況下，那些沒有5’磷酸者不用ATP添加磷酸鹽將不與另外的寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒有被去磷酸化的片段連接。
當(dāng)RNA聚合酶將兩個(gè)編碼序列轉(zhuǎn)錄成單獨(dú)的mRNA時(shí)，一個(gè)編碼序列與另外一個(gè)編碼序列“可操作地連接”，mRNA然后翻譯成單獨(dú)的具有來源于兩種編碼序列氨基酸的多肽。編碼序列不需要一個(gè)與另一個(gè)相鄰，只要表達(dá)的序列最后被加工產(chǎn)生需要的蛋白。
在發(fā)明方法中的術(shù)語“肌醇六磷酸酶特異探針”，指與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸結(jié)合，或其互補(bǔ)序列結(jié)合的探針，其可檢測(cè)程度比編碼其他酶，或其互補(bǔ)序列的核酸要大。
嚴(yán)格意義上，術(shù)語“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”可以區(qū)別如下“肌醇六磷酸鹽”指植酸的陰離子形式；“植酸”指肌醇六磷酸，植物包括尤其是植物的葉子中自然存在的一種化合物，可以作為肌醇六磷酸酶的底物；和“肌醇六磷酸鈣鎂”指植酸的一種鹽，如植酸的鈣鎂鹽。因此，可以理解“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”是化學(xué)相關(guān)和可以內(nèi)在轉(zhuǎn)化的形式，具有一個(gè)共同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，正如在此使用的，“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”是可互換的術(shù)語，由于它們高度相關(guān)，相似，化學(xué)上可以內(nèi)在轉(zhuǎn)化，都(或者具有或者沒有所述的化學(xué)內(nèi)在轉(zhuǎn)化)可以被在此公開的新的肌醇六磷酸酶降解。因此，術(shù)語“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”的其中一種在這里公開方法的描述中，可以理解它作為一個(gè)代表性術(shù)語起作用，其進(jìn)一步是指肌醇六磷酸酶的任何底物，包括“肌醇六磷酸鹽”，“植酸”和“肌醇六磷酸鈣鎂”。
一個(gè)“多核苷酸”是由2個(gè)或更多核苷酸堿基或核苷酸堿基對(duì)組成的分子。
具有“前體”或“原體”的分子是在途中經(jīng)過一種或多種共價(jià)或非共價(jià)化學(xué)修飾的任何組合(如糖基化，水解分裂，二聚體化或低聚體化，溫度-誘導(dǎo)或pH-誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，伴隨輔因子，等等)，獲得一種更成熟的分子形式，這種分子形式與參考的原體分子相比有不同的特性(如活性增加)。當(dāng)一個(gè)“前體”或“原體”的前體分子能經(jīng)歷兩種或更多化學(xué)修飾時(shí)(如兩個(gè)水解裂開，或一個(gè)水解裂開和一個(gè)糖基化變化)，途中產(chǎn)生了成熟分子，術(shù)語“前體”或“原體”也可以用于參考的前體分子。因此，前體—原體酶是“前態(tài)—原體—形式”的酶。同樣的，前體—原體激素是“前體—原體—形式”的激素。
這里使用的術(shù)語“試劑”包括本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子。優(yōu)選的是，這種肌醇六磷酸酶分子催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和游離磷酸鹽，從植酸復(fù)合物中釋放礦物質(zhì)。一種肌醇六磷酸酶的實(shí)例是來源于大腸埃希氏桿菌B.的肌醇六磷酸酶。這種實(shí)例的酶見
圖1，SEQ ID NO2。另外，如此所述，術(shù)語“試劑”包括本發(fā)明的底物試劑分子，如肌醇六磷酸鹽分子。優(yōu)選的是，在食物，潛在食物，副食品(既有體外副食品也有體內(nèi)副食品，如體內(nèi)外反應(yīng)產(chǎn)物和動(dòng)物排泄產(chǎn)物)，食物前體，和其他來源的肌醇六磷酸鹽中可以發(fā)現(xiàn)這種肌醇六磷酸鹽分子。
“重組”酶指重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的酶，即，編碼需要酶的外源DNA構(gòu)建轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生?！昂铣伞泵甘悄切┗瘜W(xué)合成的酶。
本領(lǐng)域中已知的兩種酶之間的“相似性”是通過比較氨基酸序列和一種酶的氨基酸與第二種酶的序列的保守氨基酸替代物決定的。相似性可以由本領(lǐng)域內(nèi)熟知的步驟測(cè)定，例如，BLAST程序(國家生物信息中心的局部基本排列搜索工具)。
一對(duì)分子的成員(如，抗體-抗原對(duì)或核酸對(duì))說成相互“特異結(jié)合”，如果它們相互結(jié)合后親和力比其他非特異分子的結(jié)合力大。例如，抗體與它結(jié)合的抗原的結(jié)合比非特異蛋白更有效可以描述成與抗原的特異結(jié)合。(類似地，核酸探針可以描述成與靶核酸特異結(jié)合，如果它通過堿基連接相互作用與靶核酸形成特異雙體(見上)。)
“嚴(yán)格的雜交條件”表示僅僅在序列間至少90％相同，優(yōu)選的是至少95％相同，最好是97％相同，雜交才會(huì)發(fā)生。見Sambrook等，1989，在此整體引入作為參考。
本發(fā)明還包括具有與肌醇六磷酸酶多肽序列“實(shí)質(zhì)上相同的”的序列的多肽，如SEQ ID NO1的一種。一種“實(shí)質(zhì)上相同的”氨基酸序列是不同于參考文獻(xiàn)序列的序列和僅僅通過保守氨基酸替代的序列，例如，一種氨基酸序列替代另外一種同類的氨基酸序列(如替代一種疏水氨基酸，如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸，或蛋氨酸，為另外一種，或替代一種極性的氨基酸為另外一種，如替代精氨酸為賴氨酸，谷氨酸為天冬氨酸，或谷氨酰胺為天冬酰胺)。
另外一種“實(shí)質(zhì)上相同的”氨基酸序列是不同于一個(gè)參考序列的序列和通過一種或多種非-保守替代，缺失，或插入的序列，尤其是當(dāng)這樣一個(gè)替代發(fā)生在分子的非活性位點(diǎn)的位點(diǎn)時(shí)，提示多肽必須保留它的行為特性。例如，一種或多種氨基酸可以從肌醇六磷酸酶多肽缺失，導(dǎo)致多肽的結(jié)構(gòu)修飾，但并不明顯改變其生理活性。例如，不需要肌醇六磷酸酶生物活性的氨基-或羧基-末端氨基酸可以被去掉。這種修飾導(dǎo)致形成更小的活性肌醇六磷酸酶多肽。
本發(fā)明提供了一種“實(shí)質(zhì)上的純酶”。這里使用的術(shù)語“實(shí)質(zhì)上的純酶”描述了一種分子，如一種實(shí)質(zhì)上不含有其他蛋白，脂類，碳水化合物，核酸和其他生物物質(zhì)的多肽(如肌醇六磷酸酶多肽，或其片段)，但它與它們是自然相關(guān)的。例如，一種實(shí)質(zhì)上的純分子，如一種多肽，至少占目標(biāo)分子干重的60％。多肽的純度可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，包括如，多丙烯酰胺凝膠電泳(如SDS-PAGE)，柱層析法(如高效液相色譜(HLPC))，和氨基末端氨基酸序列分析。6.發(fā)明的詳細(xì)描述6.1-新的肌醇六磷酸酶6.1.1-新肌醇六磷酸酶-一般概述本發(fā)明提供了純化的重組肌醇六磷酸酶，見
圖1。另外，本發(fā)明提供了編碼成熟酶的分離核酸分子(多核苷酸)，此成熟酶具有
圖1推斷的氨基酸序列。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子(尤其是重組酶和編碼它的多核苷酸)，它們的結(jié)構(gòu)和它們的起源在專利上是新的。另外，關(guān)于本活性肌醇六磷酸酶分子在專利上也是新的。例如，使用一種測(cè)定方法(在食品化學(xué)藥典，第四版中有描述)，證明本發(fā)明的肌醇六磷酸酶的活性與真菌(曲霉屬)肌醇六磷酸酶相比有明顯高的活性。具體地，許多實(shí)驗(yàn)表明大腸桿菌肌醇六磷酸酶的活性大約是4400U/mg，而曲霉屬肌醇六磷酸酶的活性大約是105U/mg。這相當(dāng)于在活性上有超過40倍以上的差異。
6.1.2-肌醇六磷酸酶多肽本發(fā)明提供了一種純化的重組酶，其催化肌醇六磷酸鹽水解為肌醇和游離磷酸鹽，從植酸復(fù)合物中釋放出礦物質(zhì)。典型的純化酶是來源于大腸埃希氏桿菌B的肌醇六磷酸酶。這一典型的肌醇六磷酸酶見
圖1 SEQID NO2所不。
除了
圖1的酶(尤其是成熟酶)以外，本發(fā)明的酶還包括具有與肌醇六磷酸酶多肽序列“實(shí)質(zhì)上相同的”序列的多肽，如SEQ ID 1中的一種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明SEQ ID NO2的肌醇六磷酸酶的分子量大約是47,056千道爾頓，其測(cè)定使用SDS-PAGE并從基因的核苷酸序列推斷。PI是6.70。這種酶的pH和溫度的關(guān)系以及穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見圖2。這種純化的酶可以用來催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和需要的游離磷酸鹽。本發(fā)明的肌醇六磷酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性；因此它尤其適用于高溫和/或高壓應(yīng)用包括，但不局限于，不過早溶于水的魚食膠囊的制備。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶多肽具有
圖1所示的肌醇六磷酸酶氨基酸序列(SEQID NO2)。肌醇六磷酸酶多肽，如從中大腸桿菌B分離的那些，其特征是催化肌醇六磷酸鹽水解成肌醇和游離的磷酸鹽，從植酸復(fù)合物中釋放出礦物質(zhì)。
本發(fā)明的其他肌醇六磷酸酶多肽是與肌醇六磷酸酶多肽氨基酸序列至少有約50％相同的氨基酸序列的多肽，如SEQ ID NO2中任何肌醇六磷酸酶。決定氨基酸序列同源性的比較的長度可以是，例如，至少15個(gè)氨基酸和例如至少20，25或35個(gè)氨基酸。
同源或相同性常常使用序列分析軟件(如基因計(jì)算機(jī)集團(tuán)的序列分析軟件包，Wisconsin大學(xué)生物工程中心，1710大學(xué)大道，Madison，WI53705)測(cè)定。這個(gè)軟件通過選定多個(gè)缺失，替代或其他修飾的同源程度選出相同的序列。上下文中兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的術(shù)語“同源”和“相同”指當(dāng)在對(duì)比窗口或指定區(qū)域比較和排列最大一致性時(shí)，兩個(gè)或多個(gè)相同序列或或相同的子序列，或具有特異比例的氨基酸殘基或相同的核苷酸，其測(cè)定使用任何數(shù)目的序列比較算法或通過手工排列和可視化檢查。
為了序列比較，典型地，是將一種序列作為參考序列，與測(cè)試序列比較，但可以使用參考序列的數(shù)據(jù)庫。當(dāng)使用一種序列比較算法，測(cè)試和參考序列輸進(jìn)計(jì)算機(jī)，繼之同等序列被指定，如果需要，序列算法程序參數(shù)被指定。使用默認(rèn)程序參數(shù)，或可以指定其他可選擇的參數(shù)。然后序列比較算法基于程序參數(shù)上計(jì)算檢測(cè)序列相對(duì)參考序列的序列等同百分比。
這里使用的一個(gè)“對(duì)比窗口”，包括任何鄰位數(shù)目的一個(gè)片段的參考，該鄰位選自由20至600組成的基團(tuán)，通常大約50至大約200，更通常大約100至大約150，在兩種序列都最佳排列后，其中一種序列可以與鄰位相同數(shù)目的參考序列相比較。作為比較的序列排列方法在本領(lǐng)域中是已知的。比較序列的最佳排列可以通過，如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981的局部同源算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol 48443，1970的同源排列算法，Person和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444，1988的相似性方法搜索，這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(Wisconsin基因軟件包，基因計(jì)算機(jī)組，575科學(xué)Madison博士，WI的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA)，或手工排列和可視化檢查來進(jìn)行。其他測(cè)定同源或相同性的算法包括，例如，除了BLAST程序(國家生物資料中心的局部基本排列搜索工具)以外，ALIGN，AMAS(多排列序列的分析)，AMPS(蛋白多序列排列)，ASSET(排列片斷統(tǒng)計(jì)估算工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物序列比較分析節(jié)點(diǎn))，BLIMPS(Blocks IMProved Searcher)，F(xiàn)ASTA，區(qū)間和切點(diǎn)，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，F(xiàn)NAT(強(qiáng)化核苷酸排列工具)，框架排列，框架尋找，DYNAMIC，F(xiàn)ILTER，F(xiàn)SAP(Fristensky序列分析包)，GAP(全球排列程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(敏感序列比較)，LALIGN(局部序列排列)，LCP(局部容量程序)，MACAW(多排列構(gòu)建和分析工作臺(tái))，MAP(多排列程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(模式誘導(dǎo)的多序列排列)，SAGA(基因算法序列排列)和WHAT-IF。這些算法程序也可以用來掃描基因數(shù)據(jù)庫，以鑒定有實(shí)質(zhì)上相同序列的多核苷酸序列。許多基因數(shù)據(jù)庫都是可獲得的，例如，人類基因組的實(shí)質(zhì)部分可作為人類基因組序列計(jì)劃的一部分而獲得(J.Roach，http//weber.u.Washington.edu/～roach/human_genome_progess 2.html)(Gibbs，1995)。至少21個(gè)其他基因組已經(jīng)被測(cè)序，包括，例如，M.genitalium(Fraser等，1995)M.jannaschii(Bult等，1996)，H.influenzae(Fleischmann等，1995)，大腸桿菌(Blattner等，1997)，和酵母(S.cerevisiae)(Mewes等，1997)和D.melanogaster(Adams等，2000)。在模型生物如小鼠，C.elegans，和Arabadopsis sp基因組測(cè)序中已經(jīng)取得了明顯的進(jìn)步。含有一些功能信息注釋的基因組信息的許多數(shù)據(jù)庫由不同的組織進(jìn)行維護(hù)，通過國際互聯(lián)網(wǎng)可以得到，例如，http//wwwtigr.org/tdb；http//www.genetics.wisc.edu；http//genome-www.stanford.edu/～ball；http//hiv-web.lanl.gov；http//www.ncvi.nlm.nih.gov；http//www.ebi.ac.uk；http//pasteur.fr/other/biology；和http///www.genome.wi.mit.edu.
一個(gè)有用的算法實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，分別在Altschul等，Nuc.AcidRes.253389-3402，1977，和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990中分別描述。運(yùn)行BLAST分析的軟件可以公開通過生物技術(shù)信息國家中心獲得(http//www.ncvi.nlm.nih.gov)。這一算法首先包括通過在所查詢的序列中鑒別長度W的短代碼識(shí)別高分?jǐn)?shù)序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)在序列數(shù)據(jù)庫中排列相同長度的代碼時(shí)，它可以匹配或滿足一些正值一值分?jǐn)?shù)T。T指作為相鄰代碼的域值分?jǐn)?shù)(Altschul等，見上)。這些最初的相鄰代碼命中作為啟動(dòng)尋找含它們的較長HSPs的搜索依據(jù)。只要累加排列分?jǐn)?shù)增加，命中的代碼沿著每一序列向兩個(gè)方向延伸。核苷酸序列的累加分?jǐn)?shù)使用參數(shù)M計(jì)算(一對(duì)匹配殘基的回饋分?jǐn)?shù)；總是＞0)。氨基酸序列的評(píng)分矩陣使用累加分?jǐn)?shù)計(jì)算。命中的代碼在每一方向延伸，在以下情況下停止，當(dāng)累加排列分?jǐn)?shù)從它的最大獲得值通過定量X下降時(shí)；累加分?jǐn)?shù)由于一種或多種負(fù)分殘基排列累加降至0或以下時(shí)；或任何一個(gè)序列到達(dá)末端時(shí)。BLAST算法參數(shù)W，T和X決定了排列的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用默認(rèn)一個(gè)長度為11的代碼，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩鏈的比較。用于氨基酸序列的BLASTP程序采用默認(rèn)的一個(gè)長度為3的代碼，期望值(E)為10，BLOSUM62評(píng)分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915，1989)排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，和兩鏈的比較。
BLAST算法在統(tǒng)計(jì)分析兩個(gè)序列的相似性時(shí)也起作用(見如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993)。BLAST算法提供的一種相似性的測(cè)量是最小數(shù)目的可能性(P(N))，它提供一種可能性的提示，即兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列可能偶然相配。例如，如果檢測(cè)的核酸與參考核酸相比其最小數(shù)目可能性低于0.2的話，可以認(rèn)為這一核酸與參考核酸序列相似，更優(yōu)選低于大約0.01，最好優(yōu)選低于大約0.001。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白和核酸序列同源使用基礎(chǔ)局部排列搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool)(“BLAST”)評(píng)價(jià)。尤其是，5種特異的BLAST程序用來進(jìn)行以下工作(1)BLASTP和BLAST3比較一個(gè)氨基酸查詢序列與一個(gè)蛋白序列數(shù)據(jù)庫；(2)BLASTN比較一個(gè)核苷酸查詢序列與一個(gè)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫；(3)BLASTX比較一個(gè)查詢核苷酸序列(雙鏈)的六框架結(jié)構(gòu)概念翻譯產(chǎn)物與一個(gè)蛋白序列數(shù)據(jù)庫；(4)TBLSTN比較一個(gè)查詢蛋白序列與所有六種可讀框架(雙鏈)中翻譯的一個(gè)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫；和(5)TBLASTX比較一個(gè)核苷酸查詢序列的六框架結(jié)構(gòu)翻譯物與一個(gè)數(shù)據(jù)庫核苷酸序列六種框架結(jié)構(gòu)。
BLAST程序通過在一個(gè)查詢氨基或核酸序列與一個(gè)優(yōu)選通過蛋白或核酸序列數(shù)據(jù)庫獲得的檢測(cè)序列之間鑒別相似片段鑒別同源序列，這里的片段是指“高分?jǐn)?shù)的片段堿基對(duì)”。高分?jǐn)?shù)片段堿基對(duì)優(yōu)選通過評(píng)分矩陣的方法鑒別(即，排列)，其中許多在本領(lǐng)域中是已知的。優(yōu)選的使用的評(píng)分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，Science 2561443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins1749-61，1993)。次優(yōu)選的是，可以使用PAM或PAM250矩陣(見，如Schwartz和Dayhoff，eds，1978，檢測(cè)距離關(guān)系的矩陣蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集，Washington國家生物醫(yī)學(xué)研究委員會(huì))。BLAST程序可以通過美國國家醫(yī)學(xué)圖書館獲得，如在www.ncbi.nlm.nih.gov.
上述算法中的參數(shù)可以根據(jù)研究的序列長度和同源的程度來修改。在一些實(shí)施方案中，在使用者沒有說明書的時(shí)候，參數(shù)可以是算法的默認(rèn)參數(shù)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種具有
圖1推斷的氨基酸序列的酶，及類似物，衍生物，和這種酶的片段。
圖1酶的一個(gè)類似物，衍生物或酶的片段可以是(a)用不是由基因代碼編碼的一個(gè)氨基酸殘基替代的一種或多種氨基酸殘基其中的一個(gè)，或(b)包括一個(gè)替代基團(tuán)的一種或多種氨基酸殘基中的一個(gè)，或(c)成熟酶與另一種化合物融合的一個(gè)，如增加酶的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(d)提供了一種標(biāo)記或標(biāo)識(shí)，如6倍His標(biāo)記或綠色熒光蛋白標(biāo)記，(e)附加的氨基酸融合至成熟酶內(nèi)中的一個(gè)，如一種引導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟酶或原蛋白原序列的一個(gè)序列。這些類似物，衍生物和片段被認(rèn)為是在此講授的本領(lǐng)域中的專業(yè)技術(shù)人員的范圍之內(nèi)。
一種變體，如，一種“片段”，“類似物”或“衍生物”酶，和參考酶可能在氨基酸序列的一種或多種替代物，附加物，缺失物，融合物和截?cái)辔锷喜煌?，它可以以任何組合形式存在。
優(yōu)選變體中，那些是從保守氨基酸替代的參考物中發(fā)生變化的。這種替代是在一個(gè)多肽中給定的氨基酸被另外一種類似特征的氨基酸替代。已知典型的保守替代是用替換，一種替換另一種，在脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中；Ser和Thr羧基互換，酸基殘基Asp和Glu的交換，Asn和Gln氨基殘基之間替代，Lys和Arg堿性殘基交換和芳香族殘基Phe和Tyr中的替換。
因此，在一個(gè)特異的非限定的實(shí)例中，一種替代可以包括一個(gè)氨基酸被另外一個(gè)類似特性的氨基酸替代。在另外一個(gè)特異的非限定性實(shí)例中，一種替代可以包括一個(gè)氨基酸被不相似的氨基酸替代，其中變化是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強(qiáng)。
另外，在一個(gè)非限定性的實(shí)例中，一種附加物包括在蛋白的羧基末端或者氨基或可選擇的在末端區(qū)之間的一種附加物，其中變化是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強(qiáng)。
在另外一個(gè)特異的非限定的實(shí)例中，一種變化可以由許多修飾組成，包括替代，附加，缺失，融合和/或切斷，在由參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶中，因此，不管個(gè)別修飾的的效果，當(dāng)共同發(fā)生時(shí)，修飾效果是非抑制或靜止的或至少一種酶的特性被加強(qiáng)。
最優(yōu)選的是保留與來自其改變的參考多肽具有實(shí)質(zhì)上相同生物學(xué)功能和活性的變體。
本發(fā)明的術(shù)語“變體”指多核苷酸或多肽，其一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，密碼子，內(nèi)含子，外顯子或氨基酸殘基(分別)被修飾，仍然保留本發(fā)明肌醇六磷酸酶的生物學(xué)活性。變體可以通過任何數(shù)目的方式產(chǎn)生，包括方法如，錯(cuò)誤傾向PCR、移動(dòng)、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內(nèi)突變、盒式突變、循環(huán)集合突變、指數(shù)集合突變、位點(diǎn)特異的突變、連接重裝、GSSM和它們?nèi)魏蔚慕M合，以下會(huì)有更完整的討論。
6.1.3-肌醇六磷酸酶多核苷酸依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼成熟酶的分離核酸分子(多核苷酸)，該酶具有
圖1推斷的氨基酸序列。
編碼SEQ ID NO2的多核苷酸最初從大腸埃希桿菌B基因組中回收的基因組DNA，以下會(huì)有描述。它包含一種開放的可讀框架，該框架編碼一個(gè)432個(gè)氨基酸殘基的蛋白。
依據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸編碼包括
圖1的DNA的本發(fā)明的一個(gè)典型的酶(SEQ ID NO1)。
本發(fā)明還涉及與參考多核苷酸不同的多核苷酸，其變化是靜止的變化，例如，這種變化不改變多核苷酸編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及核苷酸變化，該變化引起由參考多核苷酸(SEQ ID NO1)編碼的酶的氨基酸替代，附加，缺失，融合，和切斷。在發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，這些酶保留了與參考多核苷酸編碼的酶大致相同的生物功能。
本發(fā)明還提供了編碼上述肌醇六磷酸酶多肽的分離的核酸分子。例如，包括在本發(fā)明內(nèi)的編碼SEQ ID NO2的核酸。這些核酸包含自然產(chǎn)生的核苷酸序列，或不同于那些自然產(chǎn)生的編碼肌醇六磷酸酶的核酸，但編碼相同的氨基酸的序列，這是由于基因代碼的簡(jiǎn)并性。本發(fā)明的核酸包含DNA或RNA核苷酸，或它的組合體或修飾體。發(fā)明的典型核酸見SEQ ID NO1。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA的形式，DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟酶的的編碼序列可以與
圖1所示的編碼序列和/或淀質(zhì)克隆(SEQ ID NO1)相同，或可以是一個(gè)不同的編碼序列，而這一編碼序列，是基因代碼的超員或簡(jiǎn)并的結(jié)果，編碼了與
圖1DNA(如，SEQ ID NO1)相同的成熟酶。
編碼
圖1(如，SEQ ID NO2)成熟酶的多核苷酸可以包括，但不局限于僅對(duì)成熟酶的編碼序列；成熟酶的編碼序列和附加編碼序列如一個(gè)引導(dǎo)序列或一個(gè)原蛋白序列；成熟酶的編碼序列(選擇性附加編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟酶的非編碼序列5’和/或3’編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及這里和上面描述的多核苷酸的變體，它編碼具有
圖1(如，SEQ ID NO2)推斷的氨基酸序列酶的片段，類似物和衍生物。多核苷酸的變體可以是一個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸的等位基因變體或一個(gè)多核苷酸的非自然產(chǎn)生的變體。
因此，本發(fā)明包括編碼與
圖1所示相同成熟酶的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變體，該變體編碼
圖1酶的一個(gè)片段，衍生物或類似物。這種核苷酸變體包括缺失變體，替代變體和附加或插入變體。
正如這里和上面所示，多核苷酸可以具有一個(gè)自然產(chǎn)生
圖1所示編碼序列的等位基因變體的一個(gè)編碼序列。如在本領(lǐng)域中已知的，一個(gè)等位基因變體是一個(gè)多核苷酸序列的另外一種形式，它可以有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替代，缺失或附加，實(shí)質(zhì)上并不改變所編碼酶的功能。
如這里討論的，變體可以通過任何種方式產(chǎn)生，包括的方法如錯(cuò)誤傾向PCR、移動(dòng)、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內(nèi)突變、盒式突變、循環(huán)集合突變、指數(shù)集合突變、位點(diǎn)特異的突變、連接重裝、GSSM和它們?nèi)魏蔚慕M合。
在一個(gè)方面，一個(gè)非隨機(jī)方法命名為合成的連接重裝(SLR)，有一些與隨機(jī)移動(dòng)相關(guān)，只是核酸構(gòu)筑塊不是移動(dòng)或鏈狀結(jié)合或隨機(jī)嵌合，而是非隨機(jī)結(jié)合，可以用于產(chǎn)生變體。
SLR方法不依賴于要移動(dòng)的多核苷酸之間高水平同源物的存在。本發(fā)明可以用于非隨機(jī)產(chǎn)生子代分子庫(或區(qū))，包括超過10100不同的嵌合體?？梢韵胂?，SLR甚至可以用來產(chǎn)生包括超過101000不同子代嵌合體的庫。
因此，在一個(gè)方面，發(fā)明提供了一個(gè)非隨機(jī)方法產(chǎn)生一類具有總裝配順序的最終嵌合核酸分子，該其順序是通過設(shè)計(jì)選擇，設(shè)計(jì)方法包括通過設(shè)計(jì)產(chǎn)生一些具有有用的相容的可連接末端的多數(shù)特異核酸構(gòu)筑塊的步驟，將這些核酸構(gòu)筑塊裝配，因此獲得了總裝配順序的設(shè)計(jì)。
要裝配的核酸構(gòu)筑塊的相容的可連接末端對(duì)這類順序的裝配來說認(rèn)為是“有用的”，如果它們能使構(gòu)筑塊在測(cè)定前順序中被偶聯(lián)。因此，在一個(gè)方面，核酸構(gòu)筑塊可以偶聯(lián)的總裝配順序通過專門對(duì)可連接末端進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且如果使用了超過一種裝配步驟，那么可被偶聯(lián)的核酸構(gòu)筑塊的總裝配順序可通過裝配步驟系列順序來特殊化。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，退火構(gòu)筑部件用酶處理，如連接酶(如T4 DNA連接酶)以實(shí)現(xiàn)構(gòu)筑部件的共價(jià)結(jié)合。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)筑塊的設(shè)計(jì)依賴一些前體核酸模板的序列分析獲得，模板作為產(chǎn)生子代最終嵌合核酸分子的基礎(chǔ)。因此這些前體核酸模板作為序列資料來源幫助設(shè)計(jì)要突變，如嵌合或移動(dòng)的核酸構(gòu)筑塊。
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了相關(guān)基因家族的嵌合及其編碼相關(guān)產(chǎn)物的家族。在一個(gè)特定的實(shí)例中，編碼的產(chǎn)品是酶。本發(fā)明的酶和多肽可以依據(jù)這里描述的方法突變。
因此根據(jù)發(fā)明的一個(gè)方面，一些前體核酸模板序列為了選擇一種或多種分界點(diǎn)而排列，分界點(diǎn)可以定位于同源區(qū)域。分界點(diǎn)可以用于描述要產(chǎn)生的的核酸構(gòu)筑塊的界限。因此，在前體分子中鑒別和選擇的分界點(diǎn)作為子代分子裝配的潛在嵌合點(diǎn)。
一個(gè)有用的典型分界點(diǎn)是同源區(qū)域(包括至少一個(gè)同源核苷酸堿基)被至少兩個(gè)前體模板分享，但是典型分界點(diǎn)是被至少一半前體，至少三分之二的前體模板，至少四分之三的前體模板，優(yōu)選的是幾乎所有的前體模板，分享的同源區(qū)域。甚至最優(yōu)選的是有用的典型分界點(diǎn)是同源區(qū)域被所有的前體模板分享。
在一個(gè)實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生詳盡的庫進(jìn)行完整的連接重裝方法。換一句話說，核酸構(gòu)筑塊的所有可能的順序組合是以一類最終嵌合的核酸分子為代表。同時(shí)，每一組合的裝配順序(如在每一最終嵌合核苷酸的5’至3’序列的每一構(gòu)筑塊的順序)經(jīng)過設(shè)計(jì)(或非隨機(jī))。由于方法的非隨機(jī)屬性，出現(xiàn)不需要的副產(chǎn)品的可能被大大降低了。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，方法提供了系統(tǒng)性執(zhí)行的連接重裝過程，例如為了產(chǎn)生系統(tǒng)性的區(qū)室文庫，可以系統(tǒng)性的篩選區(qū)室，如一個(gè)挨一個(gè)。換一句話說發(fā)明提供，通過選擇性和審慎使用特異核苷酸構(gòu)筑塊，與選擇性和審慎使用的順序的分步驟的裝配反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性的設(shè)計(jì)，其中子代產(chǎn)品特異種類可以在每一反應(yīng)管獲得。這允許進(jìn)行一個(gè)系統(tǒng)性的檢查和篩選步驟。因此，這允許潛在非常大數(shù)量的子代分子可以在較小基團(tuán)中進(jìn)行檢查。
由于它執(zhí)行嵌合的能力在一定意義上是高度彈性的，雖然也很詳盡和系統(tǒng)性，尤其當(dāng)在子代分子中有低水平的同源性時(shí)，但本發(fā)明提供一個(gè)包括大量子代分子的庫(組)的產(chǎn)生。由于本發(fā)明的連接重裝的非隨機(jī)屬性，優(yōu)選產(chǎn)生的子代分子包括最終嵌合核酸分子的庫，該分子具有一個(gè)總體的通過設(shè)計(jì)選擇的裝配順序。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，這樣一個(gè)產(chǎn)生的庫包括超過103至101000不同的子代分子種類。
在一個(gè)方面，一類最終嵌合的核酸分子，其產(chǎn)生如上描述，包括編碼多肽的多核苷酸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，這一多核苷酸是一個(gè)基因，可以是人造基因。根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，這種多核苷酸是一個(gè)基因通路，可以是一個(gè)人造基因通路。本發(fā)明提供一種或多種由本發(fā)明產(chǎn)生的人造基因可以被摻入一個(gè)人造基因通路，如一個(gè)真核生物中的(包括一種植物)可操作通路。
在另外一個(gè)實(shí)例中，產(chǎn)生構(gòu)筑塊的步驟的合成屬性允許設(shè)計(jì)和引入核苷酸(如，一種或多種核苷酸，例如可能是密碼子或內(nèi)含子或調(diào)控序列)，以后可選擇性在體外過程(如通過基因突變)或體內(nèi)過程(如通過利用宿主生物的基因剪接能力)中移除。適宜的是，除了產(chǎn)生可用分界點(diǎn)的潛在益處外，許多例子中引入這些核苷酸還需要許多其它理由。
因此，根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，發(fā)明提供了一個(gè)核酸構(gòu)筑塊可以用于引入一個(gè)內(nèi)含子。因此，發(fā)明提供功能性內(nèi)含子可以引入本發(fā)明的人造基因中。本發(fā)明還提供了功能性內(nèi)含子引入本發(fā)明人造基因的通路。因此，本發(fā)明提供了嵌合多核苷酸的產(chǎn)生，該多核苷酸是含一個(gè)(或多個(gè))人工引入內(nèi)含子的人造基因。
因此，發(fā)明還提供了一個(gè)嵌合多核苷酸的產(chǎn)生，多核苷酸是包含一個(gè)(或多個(gè))人工引入內(nèi)含子的人造基因通路。優(yōu)選是，人工引入的內(nèi)含子在一種或多種宿主細(xì)胞的基因剪接上有用的，剪接的方式是自然發(fā)生的內(nèi)含子在基因剪接中起作用。發(fā)明提供了產(chǎn)生含內(nèi)含子的人造多核苷酸引入宿主生物用作重組和/或剪接方法。
本發(fā)明產(chǎn)生的人造基因也可以用作與另外的核酸重組的底物。類似的，本發(fā)明產(chǎn)生的人造基因通路也可以用作與另外的核酸重組的底物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，重組的促進(jìn)是通過，或發(fā)生在，在人造含內(nèi)含子基因和一個(gè)核酸之間作為一個(gè)重組對(duì)的同源區(qū)域。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)例中，重組對(duì)也可以是本發(fā)明產(chǎn)生的一個(gè)核酸，包括一個(gè)人造基因或一個(gè)人造基因通路。重組的促進(jìn)可以通過，或發(fā)生在，存在在一個(gè)或(多個(gè))人工引入的人工基因的內(nèi)含子上的同源區(qū)域。
本發(fā)明的合成連接重新裝配方法利用許多核酸構(gòu)筑塊，每一個(gè)優(yōu)選具有兩個(gè)可連接端。每一個(gè)核酸構(gòu)筑塊的兩個(gè)可連接端可以是兩個(gè)平端(如每一個(gè)含0個(gè)核苷酸的懸垂)，或優(yōu)選一個(gè)平端一個(gè)懸垂端，或最優(yōu)選的是有兩個(gè)懸垂端。
這一目的的可用的懸垂可以是3’懸垂或5’懸垂。因此，核酸構(gòu)筑塊可以有一個(gè)3’懸垂或一個(gè)5’懸垂或兩個(gè)3’懸垂或兩個(gè)5’懸垂。核酸構(gòu)筑塊聚合形成一個(gè)最后嵌合核酸分子的總順序通過目的性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而不是隨機(jī)決定。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸構(gòu)筑塊通過兩個(gè)單鏈核酸(也指單鏈寡核苷酸)的化學(xué)合成產(chǎn)生，使它們接觸以便讓它們退火形成雙鏈核酸構(gòu)筑段塊。
雙鏈核酸構(gòu)筑塊尺寸可以變化。這些構(gòu)筑塊的尺寸可以很小也可以很大。優(yōu)選的構(gòu)筑段塊尺寸區(qū)域從一個(gè)堿基對(duì)(不包括任何懸垂)至100,000堿基對(duì)(不包括任何懸垂)。也提供了其他優(yōu)選的尺寸范圍，較低的限度從1個(gè)堿基對(duì)至10,000個(gè)堿基對(duì)(包括兩者之間的每一整數(shù)值)，和高限度從2個(gè)堿基對(duì)至100,000個(gè)堿基對(duì)(包括兩者之間的每一整數(shù)值)。
許多通過產(chǎn)生雙鏈核酸構(gòu)筑塊的方法可用于本發(fā)明；它們?cè)诒绢I(lǐng)域中是已知的，可以逐漸被熟練的專業(yè)技術(shù)人員所使用。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，雙鏈核酸構(gòu)筑塊的產(chǎn)生，首先通過產(chǎn)生兩個(gè)單鏈核酸允許它們退火形成一個(gè)雙鏈核酸構(gòu)筑塊。雙鏈核酸構(gòu)筑塊的兩條鏈可以在每一個(gè)遠(yuǎn)離任何形式懸垂的核苷酸上互補(bǔ)；因此不包含錯(cuò)配，也遠(yuǎn)離任何懸垂。根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案，雙鏈核酸構(gòu)筑段塊的兩條鏈互補(bǔ)較每一遠(yuǎn)離任何形式懸垂的核苷酸少。因此，根據(jù)這一實(shí)施方案，雙鏈核酸構(gòu)筑塊可以用于引入密碼子簡(jiǎn)并。優(yōu)選的密碼子簡(jiǎn)并是使用這里描述的區(qū)域飽和基因突變引入，使用一種或多種N，N，G/T基因盒或選擇使用另外一種或多種N，N，N基因盒。
本發(fā)明的體內(nèi)重組方法可以在一個(gè)未知的特異多核苷酸或序列的雜交或等位基因上設(shè)盲進(jìn)行。然而，不必要知道特異多核苷酸的實(shí)際的DNA或RNA序列。
在混合數(shù)量基因內(nèi)使用重組方法對(duì)產(chǎn)生任何有用蛋白是有用的，例如，白介素I，抗體tPA和生長激素。這種方法可以用于產(chǎn)生具有變化特性或活性的蛋白。這一方法對(duì)產(chǎn)生雜交核酸序列也是有用的，例如，啟動(dòng)子區(qū)，內(nèi)含子，外顯子增強(qiáng)子序列，基因的31未翻譯區(qū)或51未翻譯區(qū)。因此這一方法可以用來產(chǎn)生增加表達(dá)率的基因。這一方法在研究重復(fù)DNA序列中也是有用的。最后，這一方法可能用于突變核糖體或aptamers。
在一個(gè)方面，這里描述的多核苷酸和多肽的變體通過使用還原基因重新分配，重組和選擇的重復(fù)循環(huán)獲得，它們?cè)试S高度復(fù)合線性序列如DNA，RNA的定向分子進(jìn)化或蛋白的完全重組。
分子的體內(nèi)移動(dòng)對(duì)提供變體有用，可以利用細(xì)胞的自然屬性重組多聚體。而體內(nèi)重組為分子的多樣性提供了較大的自然條件，基因重組保持相對(duì)較復(fù)雜的過程包括1)識(shí)別同源序列；2)鏈解開，鏈進(jìn)入和導(dǎo)致重組交叉產(chǎn)物的代謝步驟；最后3)檢查交叉進(jìn)入分泌重組分子。交叉的形成需要識(shí)別同源序列。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括從至少第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸產(chǎn)生雜交多核苷酸的方法。本發(fā)明可以用來產(chǎn)生一個(gè)雜交多核苷酸，其方法是通過引入至少第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞，它們至少有一個(gè)相同的部分同源序列區(qū)。部分同源序列區(qū)促進(jìn)導(dǎo)致序列重新識(shí)別產(chǎn)生一個(gè)雜交多核苷酸的過程。這里使用的術(shù)語“雜交多核苷酸”，是從本發(fā)明的方法中得到的任何核苷酸序列，包含至少兩種來源多核苷酸序列。這種雜交多核苷酸可以從分子內(nèi)重組事件中得到，它促進(jìn)了DNA分子中的序列整合。另外，這種雜交多核苷酸可以從還原基因重配的分子外過程得到，這一過程利用了重復(fù)序列在DNA分子內(nèi)改變核苷酸序列。
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生雜交多核苷酸的方法，該雜交多核苷酸可以編碼生物活性雜交多肽(如雜交肌醇六磷酸酶)。在一個(gè)方面，原始多核苷酸編碼生物活性多肽。本發(fā)明的方法通過利用細(xì)胞過程產(chǎn)生新的雜交多肽，這一過程整合原始多肽序列，因此得到的雜交多核苷酸編碼表現(xiàn)來源于原始生物活性多肽的多肽。例如，原始多肽可以從不同的微生物中編碼一個(gè)特殊的酶。從一種生物或變體的第一個(gè)多核苷酸編碼的酶可以，例如，有效的在特殊的環(huán)境條件下起作用，如高鹽。從一種不同的生物或變體來源的第二個(gè)多核苷酸編碼的酶可以，例如，有效的在不同的環(huán)境條件下起作用，如極高溫度。包含來自第一個(gè)和第二個(gè)原始多核苷酸順序的雜交多核苷酸可以編碼一種展示原始多核苷酸編碼的兩種酶的特性的酶。因此，雜交多核苷酸編碼的酶可以有效的在第一個(gè)和第二個(gè)多核苷酸編碼的每一個(gè)酶共有的環(huán)境條件下有效作用，如，高鹽和極高的溫度。
原始多核苷酸編碼的酶包括，但不局限于，肌醇六磷酸酶。來自本發(fā)明方法的一個(gè)雜交多核苷酸可以展示特殊的酶活性，而不表現(xiàn)原始酶的特殊酶活性。例如，編碼水解酶活性多核苷酸重組和/或還原基因重新分配后，得到的雜交多核苷酸編碼的雜交多肽可以篩選從每一個(gè)原始酶獲得的特殊水解酶活性，如，水解酶起作用的鍵的類型和水解酶作用的溫度。因此，例如，水解酶可以被篩選以確定那些化學(xué)功能，從原始酶中鑒別雜交水解酶，如(a)酰胺(肽鍵)，如蛋白酶；(b)脂鍵，如酯酶和脂肪酶；(c)乙縮醛，如糖苷酶和例如，雜交多肽作用的溫度，pH或鹽濃度。
原始多核苷酸的來源可以是從個(gè)體生物體分離(“分離物”)，在限定介質(zhì)內(nèi)生長的生物收集(“強(qiáng)化培養(yǎng)”)，或，非培養(yǎng)生物(“環(huán)境樣品”)。優(yōu)選使用不依賴培養(yǎng)的方法從環(huán)境樣品中獲得多核苷酸編碼的新活性，因?yàn)樗试S獲得生物多樣性的未使用資源。
“環(huán)境庫”是從環(huán)境樣品中產(chǎn)生，代表自然發(fā)生生物的基因組集合，在克隆載體中實(shí)現(xiàn)，可以在合適的原核宿主內(nèi)繁殖。因?yàn)榭寺〉腄NA最初是從環(huán)境樣品中直接提取，庫不局限于可以在純培養(yǎng)下生長的小部分原核細(xì)胞。另外，在這些樣品中存在的環(huán)境DNA的正?；稍试S原始樣品中存在的所有種類有更多同等DNA顯示。這可以明顯增加從樣品中的最小成分中發(fā)現(xiàn)興趣基因的效率，這可以通過相對(duì)顯性種類的幾個(gè)數(shù)量順序來顯示。
例如，從一個(gè)或多個(gè)非培養(yǎng)微生物產(chǎn)生的基因庫中篩選感興趣的活性。編碼感興趣的生物活性分子的潛在通路首先被基因表達(dá)文庫形式的原核細(xì)胞捕獲。編碼感興趣的活性的多核苷酸從這些庫中分離，引入一個(gè)宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞在促進(jìn)重組和/或還原基因重排的條件下生長，產(chǎn)生潛在的具有新的或增加活性的活性生物分子。
多核苷酸制備的微生物包括原核微生物，如黃色無芽孢桿菌屬，真細(xì)菌，和原始真細(xì)菌，和較低級(jí)真核微生物如真菌，一些藻和原蟲。多核苷酸可以從環(huán)境樣品中分離，其中核酸可以不從培養(yǎng)生物獲得或從一種或多種培養(yǎng)的生物中獲得。在一個(gè)方面，這些微生物可以是有特殊嗜好，如嗜高溫，嗜寒冷，psychrotrophs，適鹽性，嗜酸性。特別優(yōu)選有特殊嗜好的微生物中分離的編碼酶的多核苷酸。這種酶可以在陸棲熱噴泉和深海高溫孔內(nèi)超過100℃的溫度下工作，可以在北極水低于0℃下，在死海飽和鹽環(huán)境，在煤沉淀和地?zé)嶝S富含硫物的pH在0左右，或在污泥pH超過11環(huán)境下工作。例如，一些從特別嗜好的生物中克隆和表達(dá)的酯酶和脂肪酶在較廣范圍溫度和pH值下表現(xiàn)很高活性。
這里和上面描述的選擇和分離的多核苷酸被引入合適的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞是任何能促進(jìn)重組和/或還原基因重新分配的細(xì)胞。選擇的多核苷酸優(yōu)選是已經(jīng)在一個(gè)包含合適控制序列的載體內(nèi)。宿主細(xì)胞可以是高級(jí)真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低級(jí)真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或優(yōu)選的，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞可以用鈣磷轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Dasiv等，1986)。
作為合適宿主的代表性的實(shí)例，將提到細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌屬，沙門菌屬typhimurium；細(xì)菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和Spodoptera SF9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS或小牛黑色素瘤；腺病毒；和植物細(xì)胞。在此所講授的合適宿主的選擇在本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員的理解范圍內(nèi)。
對(duì)不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的特殊參考可以用于表達(dá)重組蛋白，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)實(shí)例包括COS-7系猴子腎臟成纖維細(xì)胞，見“SV40轉(zhuǎn)化猴細(xì)胞支持早期SV40突變體的復(fù)制”(Gluzman)描述，和其他能表達(dá)相容性載體的細(xì)胞系，如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括復(fù)制起始，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，和其他必須的核糖體結(jié)合區(qū)，多腺苷酸區(qū)，剪接供區(qū)和受區(qū)，轉(zhuǎn)錄末端序列，和5’側(cè)向非轉(zhuǎn)錄區(qū)。來源于SV40剪接的DNA序列，和多腺苷酸區(qū)可以用于提供需要的非轉(zhuǎn)錄基因成分。
包含需要的多核苷酸的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基為激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?。培養(yǎng)條件，如溫度pH值以及類似物，以前用于選擇表達(dá)的宿主細(xì)胞，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是明顯的。然后鑒定為具有特異酶活性的克隆進(jìn)行測(cè)序以鑒別編碼具有編碼增強(qiáng)活性的酶的多核苷酸序列。
在另外一個(gè)方面，方法可以用于從一個(gè)或多個(gè)操縱子或基因束或它們的部分產(chǎn)生新地編碼生物化學(xué)通路的多核苷酸。例如，細(xì)菌或許多真核細(xì)胞具有一個(gè)調(diào)節(jié)基因的協(xié)調(diào)機(jī)制，該基因的產(chǎn)物參與相關(guān)過程?；蚣性谠趩我蝗旧w或和與另外一個(gè)緊緊相鄰，結(jié)構(gòu)上指“基因束”，在單個(gè)調(diào)控序列的控制之下共同轉(zhuǎn)錄，包括單個(gè)啟動(dòng)子發(fā)動(dòng)了整個(gè)束的轉(zhuǎn)錄。因此，一個(gè)基因束是一組相鄰基因，它們通常與它們的功能或者相同或者相關(guān)。一個(gè)由基因束編碼的生物化學(xué)通路的一個(gè)實(shí)例是聚酮化合物。聚酮化合物是具有極端豐富生物活性資源的分子，包括抗生素(如四環(huán)素族和紅霉素)，抗癌制劑(柔紅霉素)，免疫抑制劑(FK506和雷怕霉素)，和獸藥產(chǎn)品(莫能星)。許多聚酮化合物(由聚酮化合物合成酶產(chǎn)生)是有價(jià)值的治療制劑。聚酮化合物合成酶是多功能酶，催化大量的長度不同，功能和成環(huán)作用的方式不同的碳鏈的生物合成。聚酮化合物合成酶基因進(jìn)入基因束，至少一種類型(命為I類)的聚酮化合物合成酶有擁有大量的基因和酶，復(fù)雜的基因調(diào)控和這些基因/蛋白的體外研究。
基因束DNA可以從不同生物分離，連接進(jìn)入載體，尤其是那些含有表達(dá)調(diào)控序列的載體，可以控制和調(diào)節(jié)連接基因束的可探測(cè)蛋白的產(chǎn)生或來自連接的基因束的蛋白相關(guān)排列活性。使用含允許大量外源DNA引入的載體尤其適于這些基因束的使用，通過這里的實(shí)例描述，包括大腸桿菌的f-因子(或生育力因子)。大腸桿菌的f-因子是在結(jié)合過程中的一個(gè)影響其本身高頻率轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，對(duì)獲得和穩(wěn)定繁殖大量DNA片段是理想的，如混合微生物樣品的基因束。一旦連接進(jìn)入合適的載體，兩個(gè)或多個(gè)行不同肌醇六磷酸酶基因束的載體被引入合適的宿主細(xì)胞?；蚴灿械牟糠滞葱蛄袇^(qū)域?qū)⒋龠M(jìn)導(dǎo)致序列重組的過程，獲得雜交基因束。新的雜交基因束然后在起始基因束進(jìn)行篩選未發(fā)現(xiàn)活性的增加。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生一種生物活性雜交多核苷酸和篩選這樣的增加活性的多肽的方法，通過1)引導(dǎo)至少第一個(gè)多核苷酸以可操作的連接和第二個(gè)多核苷酸以可操作的連接進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞，所述的至少第一個(gè)多核苷酸和第二個(gè)多核苷酸分享至少一個(gè)部分序列同源的區(qū)域；2)使宿主細(xì)胞在促進(jìn)序列重組的條件下生長，在可操作連接處獲得一個(gè)雜交多核苷酸；3)表達(dá)一個(gè)雜交多核苷酸編碼的雜交多肽；
4)在促進(jìn)鑒定增加的生物活性的條件下篩選雜交多肽；和5)分離編碼雜交多肽的一個(gè)多核苷酸。
篩選不同的酶活性的方法對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員是已知的，且通過本特例討論。當(dāng)分離發(fā)明的多肽和多核苷酸時(shí)這種方法可以使用。
可在此使用的表達(dá)載體的代表性實(shí)例，將提到病毒微粒，桿狀病毒群，噬菌體，質(zhì)粒，噬菌粒，粘粒，磷粒，人造細(xì)菌染色體，病毒DNA(如牛痘，腺病毒，禽痘病毒，假性狂犬病和SV40衍生物)，P1-依賴的人造染色體，酵母質(zhì)粒，酵母人造染色體，和其他任何人造宿主的特異載體(如芽胞桿菌屬，曲霉屬和酵母)。因此，例如，DNA可以包括在任何表達(dá)多肽的表達(dá)載體中。這種載體包括染色體，非染色體和合成DNA序列。大量的合適載體對(duì)本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員是已知的，可以通過商業(yè)獲得。以下載體可以通過實(shí)例獲得細(xì)菌pQE載體(Qiagen)，pBluescript質(zhì)粒，pNH載體，λZAP載體(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia)；真核細(xì)胞pXT1，pSG5(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVLSV40(Pharmacia)。然而，只要它們?cè)谒拗骷?xì)胞內(nèi)是可以復(fù)制和有活性的，任何其他質(zhì)?；蜉d體都可以使用。本發(fā)明使用了低拷貝數(shù)目或高拷貝數(shù)目的載體。
本發(fā)明優(yōu)選使用的載體類型包含f-因子來源的復(fù)制。大腸桿菌的F-因子(或生育力因子)是一個(gè)在結(jié)合過程中影響高頻轉(zhuǎn)移和細(xì)菌染色體本身的低頻轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。優(yōu)選的實(shí)例是使用克隆載體，指作為“磷粒”或人工細(xì)菌染色體(BAC)載體。這些來源于大腸桿菌的f-因子能穩(wěn)定整合基因組DNA的大片段。當(dāng)從混合非培養(yǎng)環(huán)境樣品中整合DNA時(shí)，可能實(shí)現(xiàn)大基因組片段成為穩(wěn)定的“環(huán)境DNA庫”形式。
發(fā)明使用的另外一類載體是粘粒載體。粘粒載體最初為了克隆和傳代大量基因組DNA片段設(shè)計(jì)?？寺∵M(jìn)入粘粒載體詳細(xì)描述在“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(Sambrook等，1989)。
表達(dá)載體的DNA序列可操作性的與指導(dǎo)RNA合成的合適表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連接。特殊命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，拉拇達(dá)PR，PL和trp。真核啟動(dòng)子包括立即早期CMV，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和小鼠金屬硫因-I。選擇合適的載體和啟動(dòng)子在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。表達(dá)載體還包括翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)的核糖體結(jié)合區(qū)。載體還包括擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。啟動(dòng)子區(qū)可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其他有選擇標(biāo)記的載體從任何可用的基因中選擇。另外，優(yōu)選的表達(dá)載體包含一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)志基因提供轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型特性，如二氫葉酸還原酶或新霉素抗性的真核細(xì)胞培養(yǎng)，或大腸桿菌四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
體內(nèi)基因重新分配集中于“分子間”過程，總體是指“重組”，在細(xì)菌中常常指“RecA依賴”現(xiàn)象。發(fā)明依賴于一個(gè)宿主細(xì)胞的重組和基因的重新分配的重組過程，或細(xì)胞介導(dǎo)還原過程的能力，該過程通過缺失來減少細(xì)胞內(nèi)準(zhǔn)重復(fù)序列的復(fù)雜性。這一“還原性基因重新分配”的過程發(fā)生在“分子中”，RecA-不依賴的過程中。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，變體多核苷酸可以通過還原性基因重新分配方法產(chǎn)生。該方法包括含連續(xù)序列(起始編碼序列)構(gòu)建體的產(chǎn)生，它們插入合適的載體，繼之引入合適的宿主細(xì)胞。個(gè)體分子同一性的基因重新分配通過擁有同源區(qū)的構(gòu)建體中連續(xù)序列之間的組合過程發(fā)生，或準(zhǔn)-重復(fù)單位之間。基因重新分配過程重組和/或減少重復(fù)序列的復(fù)雜性和程度，導(dǎo)致新分子種類的產(chǎn)生?？梢詰?yīng)用許多處理作用增加基因重組比率。這些包括用紫外光處理，或DNA化學(xué)性損傷，和/或使用宿主細(xì)胞系顯示的“基因不穩(wěn)定性”的增強(qiáng)水平。因此，基因重新分配過程包括同源重組或準(zhǔn)重復(fù)序列的自然特性以指導(dǎo)它們的進(jìn)化。
重復(fù)或“準(zhǔn)重復(fù)”序列在基因的不穩(wěn)定性上具有重要作用。在本發(fā)明中，“準(zhǔn)重復(fù)”是不限于它們起始單位結(jié)構(gòu)的重復(fù)。準(zhǔn)-重復(fù)單位可以表現(xiàn)為構(gòu)建體的序列排列；相似序列的連續(xù)單位。一旦連接后，連續(xù)序列之間的連接基本上看不見，所得構(gòu)建體的準(zhǔn)-重復(fù)屬性在分子水平繼續(xù)。細(xì)胞降低所得構(gòu)建體復(fù)雜性的缺失過程在準(zhǔn)-重復(fù)序列之間起作用。準(zhǔn)重復(fù)單位提供實(shí)際上無限的模板，在模板上可發(fā)生滑脫作用。含準(zhǔn)-重復(fù)的構(gòu)建體因此有效的提供了幾乎在準(zhǔn)重復(fù)單位內(nèi)的任何地方缺失(和潛在的插入)發(fā)生的充足的分子彈性。
當(dāng)準(zhǔn)重復(fù)序列在相同的方向都連接時(shí)，例如頭至尾或相反的方向，細(xì)胞不能區(qū)別個(gè)體單位。結(jié)果，還原過程可以通過序列發(fā)生。與之相反，例如，當(dāng)顯示頭至頭的單位時(shí)，而不是頭至尾，反轉(zhuǎn)表明了鄰近單位的終點(diǎn)，所以缺失的形成將對(duì)分離單位的失去有利。因此，本方法優(yōu)選是序列在相同的方向。準(zhǔn)重復(fù)序列的隨機(jī)方向會(huì)導(dǎo)致基因重新分配效率的喪失，而一致的序列方向會(huì)提供最高的效率。然而，雖然相同方向具有較少的鄰近序列會(huì)降低效率，但是它仍然會(huì)提供充足的彈性有效的獲得新分子。在準(zhǔn)-重復(fù)序列內(nèi)的相同方向制造構(gòu)建體會(huì)有較高的效率。
序列可以使用任何方法在頭至尾方向裝配，包括以下a)可以使用包括制造單鏈時(shí)提供方向的多-A頭和多-T尾的引物。這可以通過具有從RNA制造引物的最初少量堿基來實(shí)現(xiàn)，因此易于移走RNAseH。
b)可以使用包含唯一限制剪切位點(diǎn)的引物。需要多個(gè)位點(diǎn)，唯一序列的集合，和重復(fù)合成和連接步驟。
c)引物的內(nèi)在少量堿基可以硫基化，使用核酸外切酶產(chǎn)生合適的尾分子。
回收基因重新分配序列依賴于具有降低的RI的克隆載體的識(shí)別。重新分配的基因編碼序列然后通過擴(kuò)增回收。產(chǎn)物被重新克隆和表達(dá)。降低的RI克隆載體的回收可以被以下影響1)當(dāng)構(gòu)建體的復(fù)雜性降低時(shí)載體的使用僅僅可穩(wěn)定的保留，2)通過物理程序物理性回收變短的載體。在這一實(shí)例中，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分離方法和尺寸分離獲得克隆載體，分離使用瓊脂糖凝膠或用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒌头肿恿咳コ闹?)當(dāng)插入尺寸降低時(shí)，可以選擇回收含切斷基因的載體。4)使用直接選擇技術(shù)和一個(gè)表達(dá)載體和合適的選擇。
來自相關(guān)生物的編碼序列(如基因)可以闡明高度同源和編碼多種蛋白產(chǎn)品。這些類型的序列作為準(zhǔn)-重復(fù)在本發(fā)明中尤其有用。然而，雖然下面的實(shí)例闡明幾乎相同起源編碼序列(準(zhǔn)-重復(fù))的基因重新分配，但是這一過程不局限于這些幾乎相同的重復(fù)。
以下實(shí)例闡明了發(fā)明的一種方法。描述了來源于3種獨(dú)特種類的編碼核酸序列(準(zhǔn)-重復(fù))。每一序列編碼一個(gè)獨(dú)特特性的蛋白。每一序列的不同在于在序列的獨(dú)特位置一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)，稱為“A”，“B”和“C”。準(zhǔn)-重復(fù)序列被分別或共同擴(kuò)增和連接進(jìn)入隨機(jī)的集合體，因此在眾多的連接分子中所有可能的排列和組合都是可行的。準(zhǔn)-重復(fù)單位數(shù)目可以被集合條件控制。構(gòu)建體中準(zhǔn)-重復(fù)單位平均數(shù)目用重復(fù)索引(RI)定義。
一旦形成，構(gòu)建體可以，或不可以根據(jù)公開發(fā)表的方案在瓊脂糖凝膠上按大小分開，插入克隆載體，轉(zhuǎn)染進(jìn)入合適的宿主細(xì)胞。然后細(xì)胞傳代和“還原性基因重排”發(fā)生。還原性基因重排過程的比率可以引入DNA的損傷來刺激，如果需要的話。RI的減少是否通過一種“分子間機(jī)制”在重復(fù)序列之間的缺失來介導(dǎo)的，或是通過“分子內(nèi)機(jī)制”的類似重組事件的介導(dǎo)不重要。最終結(jié)果是分子的基因重新分配進(jìn)入所有可能的組合中。
選擇性的，本方法包括篩選移動(dòng)庫的文庫成員的附加步驟以識(shí)別具有結(jié)合或相互作用，或催化特殊反應(yīng)(如催化鏈烷鹽水解)能力的單一移動(dòng)文庫成員。
從這些庫里識(shí)別的多肽可以用于治療，診斷，研究和相關(guān)目的(如催化劑，增加水溶液的容積滲透克分子濃度的溶質(zhì)，等等)，和/或可以用于一種或多種移動(dòng)和/或選擇的加性循環(huán)。
在另外一個(gè)方面，在基因重組或重新分配之前或之中，本發(fā)明的多核苷酸或這里描述的方法產(chǎn)生的多核苷酸可以用作制劑或促進(jìn)突變體引入起始多核苷酸的方法。這些突變的引入增加了獲得的雜交多核苷酸和它們編碼的多肽的多樣性。促進(jìn)突變形成的制劑或過程包括，但不局限于(+)-CC-1065，或合成的類似物如(+)-CC-1065-(N3-腺苷酸，見Sun和Huley，1992)；N-乙?；蛉ヒ阴?’-氟-4-氨二苯加合物，能抑制DNA合成(見，例如，van de Poll等，1992)；或N-乙?；蛉ヒ阴?-氨二苯加合物，能抑制DNA合成(同樣見，van de Poll等，1992，pp.751-758)；三價(jià)鉻，一種三價(jià)鉻鹽，多環(huán)的芳香族碳水化合物(“PHA”)DNA加合物，能抑制DNA復(fù)制，如7-溴甲基-苯[a]蒽(“BMA”)，tris(2，3，二溴丙基)磷酸鹽(“Tris-BP”)，1，2-二溴-3-氯丙烷(“DBCP”)，二溴丙烯醛(2BA)，苯[a]芘-7，8-二氫化二醇-9-10-環(huán)氧化物(“BPDE”)，一種鉑(II)鹵素鹽，N-羥基-2-氨基-3甲基咪唑[4，5-f]喹啉(“N-羥基-IQ”)，和N-羥基-2-氨基-1-甲基-6-苯咪唑[4，5-f]吡啶(“N-羥基-PhIP”)。減慢和停止PCR擴(kuò)增的優(yōu)選方法包括紫外光(+)-CC-1065和(+)-CC-1065-(N3-腺苷酸)。特殊的包括方法是DNA加合物或多核苷酸包括多核苷酸或多核苷酸池的DNA加合物，它可以通過一個(gè)過程釋放或去除，這一過程包括在進(jìn)一步的過程之前將包括多核苷酸的溶液加熱。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有生物活性重組蛋白的方法，該方法在本發(fā)明的為產(chǎn)生雜交或重新分配的多核苷酸提供的條件下，處理包括編碼野生型蛋白的雙鏈模板多核苷酸的樣品。
發(fā)明還提供了使用專用密碼子引物(包含簡(jiǎn)并的N，N，N序列)將點(diǎn)突變進(jìn)入多核苷酸，以便產(chǎn)生一類子代多肽，其中完全范圍的單個(gè)氨基酸替代在每一氨基酸位置展示(基因區(qū)飽和的突變基因(GSSM))。使用的寡探針包括相鄰的第一個(gè)同源序列，簡(jiǎn)并的N，N，N序列，優(yōu)選但不必需的第二個(gè)同源序列。使用這種寡探針的下游子代翻譯產(chǎn)物包括所有可能的沿著多肽的氨基酸區(qū)的氨基酸變化，因?yàn)楹?jiǎn)并的N，N，N序列包括所有20種氨基酸的密碼子。
在一個(gè)方面，這種簡(jiǎn)并的寡體(包括一個(gè)簡(jiǎn)并的N，N，G/T基因盒)用于進(jìn)行每一母代多核苷酸模板起始密碼子全范圍的密碼子替代。在另一方面，至少兩個(gè)簡(jiǎn)并N，N，G/T基因盒被使用-或用相同的寡探針或不用，在母代多核苷酸模板上至少兩個(gè)起始密碼子進(jìn)行全范圍的密碼子替代。因此，一種以上的N，N，G/T序列包含在一個(gè)寡探針之中，在超過一個(gè)區(qū)域引入氨基酸突變。這些N，N，G/T序列可以直接相鄰，或被一種或多種附加的核苷酸序列分離。在另一方面，對(duì)引入附加和缺失可用的寡探針可以單獨(dú)或與含N，N，G/T序列的密碼子一起使用，以引入任何氨基酸附加，缺失，和/或替代的結(jié)合或突變。
在一個(gè)特定實(shí)例中，用含相鄰N，N，G/T三聯(lián)體寡體，如簡(jiǎn)并(N，N，G/T)n序列的寡探針同時(shí)使兩個(gè)或多個(gè)相鄰氨基酸位置突變是可能的。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用含較N，N，G/T序列簡(jiǎn)并少的簡(jiǎn)并基因盒。例如，在一些例子中需要使用(如寡體)簡(jiǎn)并三聯(lián)體序列，簡(jiǎn)并三聯(lián)體包括只有一個(gè)N，其中所述N可以在三聯(lián)體的第一第二或第三的位置。任何其他堿基包括它的任何組合和突變可以用于保留三聯(lián)體中的兩個(gè)位置。另外，在一些例子中需要使用(如寡體)簡(jiǎn)并N，N，N三聯(lián)體序列或一個(gè)N，N，G/C三聯(lián)體序列。
然而，可以發(fā)現(xiàn)因?yàn)橐恍├碛墒褂帽景l(fā)明公開的簡(jiǎn)并三聯(lián)體(如N，N，G/T或N，N，G/C三聯(lián)體序列)是有幫助的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了系統(tǒng)性和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法產(chǎn)生全范圍的可能氨基酸(總數(shù)為20個(gè)氨基酸)替代為多肽中的每一氨基酸位置。因此，為了100個(gè)氨基酸多肽，本發(fā)明提供了系統(tǒng)性和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法產(chǎn)生2000個(gè)不同種類(如，每一位置20個(gè)可能的氨基酸乘100個(gè)氨基酸位置)?？梢园l(fā)現(xiàn)提供了，通過使用含簡(jiǎn)并N，N，G/T或N，N，G/C三聯(lián)體序列的寡探針，編碼20個(gè)可能氨基酸的32個(gè)個(gè)體序列。因此，在一個(gè)母代多核苷酸序列的反應(yīng)管中使用一個(gè)這類寡探針用于飽和基因突變，產(chǎn)生32個(gè)不同子代多核苷酸編碼的20個(gè)不同多肽。作為對(duì)照，在區(qū)域介導(dǎo)的基因突變中使用非簡(jiǎn)并寡探針導(dǎo)致每一反應(yīng)管中只有一種子代多肽產(chǎn)品。
本發(fā)明還提供了使用非簡(jiǎn)并寡體，它可以選擇性的與公開的簡(jiǎn)并寡體一起使用。可以發(fā)現(xiàn)在一些情況下，使用非簡(jiǎn)并寡體在工作多肽中產(chǎn)生特異突變點(diǎn)是有幫助的。這提供了一種方法產(chǎn)生特異的無義點(diǎn)突變，導(dǎo)致了相應(yīng)的氨基酸改變的點(diǎn)突變，引起終止密碼子產(chǎn)生的點(diǎn)突變和多肽片段的相應(yīng)表達(dá)。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，每一飽和突變基因反應(yīng)管包含編碼至少20個(gè)子代多肽分子的多核苷酸，以至于所有20個(gè)氨基酸顯示在一個(gè)與母代多核苷酸突變密碼子位置相對(duì)應(yīng)的特異氨基酸位置上。從每一飽和突變基因反應(yīng)管產(chǎn)生的32倍簡(jiǎn)并子代多肽可以用于克隆擴(kuò)增(如，用一個(gè)表達(dá)載體克隆進(jìn)入合適的大腸桿菌宿主中)和進(jìn)行表達(dá)篩選。當(dāng)個(gè)體子代多肽通過篩選識(shí)別表現(xiàn)可取的特性變化時(shí)(與母代多肽比較)，可以測(cè)序識(shí)別包含它們的相關(guān)可取的氨基酸替代。
可以發(fā)現(xiàn)基因突變中在使用這里公開的飽和基因突變?cè)谀复嚯牡拿恳话被嵛恢蒙?，發(fā)現(xiàn)可取的氨基酸變化可以在超過一個(gè)氨基酸位置。一個(gè)或多個(gè)新子代分子可以在包含所有或部分這些可取的氨基酸替代的組合中產(chǎn)生。例如，如果2個(gè)特異可取的氨基酸變化鑒定在多肽三個(gè)氨基酸位置的任一時(shí)，每一位置突變包括三個(gè)可能(起始氨基酸沒有變化，兩個(gè)可能的改變中的每一個(gè))和三個(gè)位置。因此，有3×3×3或27種總的可能，包括7種以前檢查出來的-6個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)突變(如三個(gè)位置，每個(gè)有2個(gè))和任何位置沒有變化。
在另一方面，位點(diǎn)飽和突變基因可以與篩選一起共同用于移動(dòng)，嵌合，重組和其他突變方法。本發(fā)明提供以重復(fù)方式使用任何基因突變過程，包括突變基因飽和。在一個(gè)實(shí)例中，重復(fù)使用任何基因突變方法與篩選一起使用。
因此，在一個(gè)非限定性實(shí)例中，本發(fā)明的多核苷酸和多肽來源于加性基因突變過程結(jié)合的飽和基因突變，如兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)多核苷酸引入合適的宿主細(xì)胞的過程，通過重組和還原性基因重新分配產(chǎn)生一個(gè)雜交多核苷酸的方法。
除了沿著整個(gè)基因序列進(jìn)行的基因突變過程，基因突變可以用于替換多核苷酸序列中任何數(shù)目堿基的每一個(gè)，其中突變的堿基數(shù)目優(yōu)選從15至100000的每一整數(shù)。因此，除了沿著分子的每一位置的基因突變，可以將每一或分散數(shù)目的堿基(優(yōu)選總數(shù)從15至100000)進(jìn)行基因突變。優(yōu)選的，分離核苷酸用于沿著多核苷酸序列的每一位置或位置組進(jìn)行基因突變。三個(gè)位置一組進(jìn)行基因突變是一個(gè)密碼子。突變優(yōu)選使用突變基因引物引入，引物包含外源基因盒，也指作為一個(gè)突變基因盒。優(yōu)選的基因盒可以具有從1至500個(gè)堿基。在這樣的基因盒中每一核苷酸位置是N，A，C，G，T，A/C，A/G，A/T，C/G，C/T，G/T，C/G/T，A/G/T，A/C/T，A/C/G，或E，其中E是非A，C，G，或T的任何堿基(E可以指設(shè)計(jì)寡體)。
一般意義上來說，飽和基因突變包括突變基因盒(其中每一基因盒優(yōu)選大約1-500堿基長度)的完全突變，基因盒在限定的多核苷酸序列進(jìn)行突變(其中突變的序列優(yōu)選大約從15至100000堿基長度)。因此，一組突變(從1至100突變范圍)引入每一基因盒進(jìn)行突變。在一個(gè)周期的飽和基因突變過程中，一組引入一個(gè)基因盒的突變可以與引入第二個(gè)基因盒的的第二組突變不同或相同。這類組別通過缺失，附加，特殊密碼子組，和特殊核苷酸基因盒組進(jìn)行實(shí)例。
突變的限定序列包括完整的基因，通路，cDNA，完整的開放可讀框架(ORF)，和完整的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，抑制子/轉(zhuǎn)化激活子，復(fù)制起始，內(nèi)含子，操縱子，或任何多核苷酸功能基團(tuán)。一般的，這一目的的“限定序列”可以是任何多核苷酸，即15個(gè)堿基-多核苷酸序列，15個(gè)堿基和15000個(gè)堿基之間長度的多核苷酸序列(本發(fā)明特異命名了之間的每一整數(shù))。選擇密碼子組的考慮包括簡(jiǎn)并突變基因盒編碼的氨基酸類型。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，一組突變可以引入突變基因盒，這一發(fā)明特異提供了簡(jiǎn)并密碼子替代(使用簡(jiǎn)并寡探針)在每一位置編碼2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，和20個(gè)氨基酸，和因此編碼的多肽庫。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟酶的編碼序列可以在相同的可讀框架中融合至多核苷酸序列，可以幫助酶從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌，例如，控制酶從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)的引導(dǎo)序列。具有引導(dǎo)序列的酶是一個(gè)蛋白前體的實(shí)例，可以通過宿主細(xì)胞切斷引導(dǎo)序列形成一個(gè)成熟形式的酶。多核苷酸還編碼蛋白原，其實(shí)例是成熟蛋白加附加5’氨基酸殘基。另外一種具有原序列的成熟蛋白實(shí)例是無活性形式蛋白的蛋白原。一旦原體序列被切斷，活性成熟蛋白就形成了。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟的酶，或具有原體序列的酶或具有原體序列和前體序列的酶(如引導(dǎo)序列)。
6.1.4-分離方法本發(fā)明肌醇六磷酸酶編碼序列通過制備大腸桿菌B基因組DNA，和例如從基因組DNA(通過，例如，PCR擴(kuò)增)，編碼肌醇六磷酸酶活性的DNA回收來鑒定。這些回收方法在本領(lǐng)域中是已知的。一種方法，例如，包括設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物回收編碼序列，從基因組DNA擴(kuò)增基因，亞克隆DNA進(jìn)入載體，所得構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主系，表達(dá)肌醇六磷酸酶用于評(píng)價(jià)。這些過程在本領(lǐng)域中是已知的，并且Sambrook等，1989已提供了方法(本文整體引入作為參考)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶，通過以下技術(shù)從大腸桿菌B基因組DNA中分離大腸桿菌B基因組DNA是商購獲得(SigmaCatalog#D-2001，St.louis，New Jersey)。以下引物用于直接從基因組DNA擴(kuò)增基因5’引物gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQ IDNO3)；和3’引物gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ ID NO4)Pfu聚合酶使用根據(jù)制造商說明(Stratagene Cloning Systems，Inc，La Jolla，CA)。
PCR產(chǎn)物和pQE60載體(Qiagen)根據(jù)制造商說明用EcoRI和BglII限制內(nèi)切酶消化(New England Biolabs)。在M15 pREP4宿主細(xì)胞(Qiagen)的連接和轉(zhuǎn)化進(jìn)入和表達(dá)產(chǎn)生c-term 6X-His標(biāo)記蛋白。
6.1.5-活性測(cè)定然后可以測(cè)定分離的核酸序列和其他酶，以保留本發(fā)明酶的生物活性特性，例如，在一個(gè)檢測(cè)肌醇六磷酸酶活性的測(cè)定(食品化學(xué)規(guī)程第4版)。這些酶包括肌醇六磷酸酶的切斷形式，和變體如缺失和插入變體。
這種體外測(cè)定的實(shí)例是檢測(cè)肌醇六磷酸酶活性的以下測(cè)定肌醇六磷酸酶的測(cè)定是150μl酶預(yù)備液與600μl 2mM植酸鈉在添加1mM CaCl2的100mM TrisHCl緩沖液pH7.5中37℃孵育30分鐘。孵育后通過加入750μl5％三氯乙酸終止反應(yīng)。磷酸鹽釋放測(cè)定在加入1500μl顯色制劑(4體積1.5％鉬酸銨在5.5％硫酸和1體積2.7％硫酸亞鐵Shimizu，1992)后用700nm磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)分光光度測(cè)定法。一單位的酶活性定義為每分鐘釋放1μmol測(cè)定條件需要的酶的數(shù)量。特異活性可以用每毫克蛋白表達(dá)的酶活性單位來表示。
本發(fā)明的酶具有植酸鹽水解為肌醇和游離磷酸鹽相關(guān)的酶活性。6.2-新肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生6.2.1-產(chǎn)生的方法-一般概述本發(fā)明的酶和多核苷酸優(yōu)選以分離形式提供，優(yōu)選是純化的同源基因。發(fā)明的肌醇六磷酸酶多肽可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。例如，肌醇六磷酸酶多肽可以在標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)系統(tǒng)(見下)中產(chǎn)生，化學(xué)合成(這一方法限于少量肌醇六磷酸酶肽片段)，或從它們自然表達(dá)的生物中純化產(chǎn)生?？捎玫闹亟M表達(dá)方法包括使用哺乳動(dòng)物宿主，微生物宿主，和植物宿主。
本肌醇六磷酸酶分子的重組表達(dá)可以與一個(gè)或多個(gè)附加分子結(jié)合獲得如，例如，其他酶。這一方法可用于產(chǎn)生組合產(chǎn)物，如包含本肌醇六磷酸酶分子和一個(gè)或多個(gè)附加分子的植物或植物部分-優(yōu)選所述的肌醇六磷酸酶分子和所述的附加分子用于聯(lián)合的應(yīng)用中。獲得的重組表達(dá)分子可以用于同源基因和/或純化形式或選擇性的相對(duì)未純化形式(如可食用的植物部分，當(dāng)與其他食物混合催化植酸鹽降解時(shí)是可用的)。
總之，在一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)宿主內(nèi)表達(dá)的重組酶。在另外一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了實(shí)質(zhì)上純的肌醇六磷酸酶。因此，本發(fā)明的酶可以是一個(gè)重組酶，一個(gè)自然酶，或一個(gè)合成酶，優(yōu)選是一個(gè)重組酶。
6.2.2-重組表達(dá)本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明多核苷酸的載體，本發(fā)明載體的基因工程宿主細(xì)胞，通過重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的酶。
宿主細(xì)胞用含本發(fā)明的多核苷酸載體進(jìn)行基因工程(如轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。這些載體可以是，例如，一個(gè)克隆載體或一個(gè)表達(dá)載體。載體可以是，例如，質(zhì)粒的形式，病毒微粒，噬菌體，朊病毒等等。工程宿主細(xì)胞可以在為適于激活啟動(dòng)子而改良的常規(guī)營養(yǎng)介質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)，和/或選擇轉(zhuǎn)化或擴(kuò)增本發(fā)明的基因。培養(yǎng)條件，如溫度，pH和類似物，以前用于選擇表達(dá)的宿主細(xì)胞所使用的，對(duì)普通的技術(shù)人員是明顯的。
本發(fā)明的多核苷酸可以通過重組技術(shù)產(chǎn)生酶。因此，例如，多肽可以包括在許多表達(dá)酶的表達(dá)載體的任何一個(gè)。這種載體包括染色體，非染色體和合成DNA序列，如，SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體DNA；桿狀病毒群；酵母質(zhì)粒；來源于重組質(zhì)粒和噬菌體DNA的載體，病毒DNA如牛痘，腺病毒，禽痘病毒和偽狂犬病。然而，任何其他的載體都可以使用只要它在宿主內(nèi)可復(fù)制的和具有活力的。
合適的DNA序列可以通過一些步驟插入載體中。一般地，DNA序列通過領(lǐng)域中已知的過程插入合適的限制內(nèi)切酶區(qū)域。這一方法除外的是使用平端分子，它可以通過使用限制消化和不依賴限制消化方法產(chǎn)生。另外，插入可以通過叫“不依賴連接酶”方法摻入一個(gè)載體。在一個(gè)特殊方面，“不依賴連接酶”方法通過在室溫下使用拓?fù)洚悩?gòu)酶-介導(dǎo)的連接反應(yīng)來實(shí)例，例如根據(jù)商業(yè)獲得的試劑盒叫TOPO-TA Cloning(Introgen Corporation，Carlsbad，CA)。另外的酶，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶的異構(gòu)體或更遠(yuǎn)涉及的重組酶(如重組酶)，也可以用于介導(dǎo)這類“不依賴連接酶”的摻入。在另外一個(gè)特殊方面，“不依賴連接酶”方法通過使用宿主修復(fù)機(jī)制來實(shí)例。這些步驟和其他一些被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
表達(dá)載體的DNA序列可操作性的與合適的表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連接介導(dǎo)mRNA合成。作為這些啟動(dòng)子的代表實(shí)例，可以提到LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體拉拇達(dá)PL啟動(dòng)子和其他已知控制原核或真核細(xì)胞或它們的病毒表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括用于翻譯起始的核糖體結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還包括擴(kuò)增表達(dá)的合適序列。
另外，優(yōu)選的表達(dá)載體包含一種或多種可選擇的標(biāo)志基因提供選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型特性，如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如大腸桿菌中的四環(huán)素抗性或氨芐青霉素。
如這里和上面描述的含合適DNA序列的載體和合適的啟動(dòng)子或控制序列，可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，允許宿主表達(dá)蛋白。
作為合適宿主的代表實(shí)例，可以提到細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉素，枯草桿菌；細(xì)菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS或小牛黑色素瘤，腺病毒；植物細(xì)胞，等等。從在此的講授，選擇合適的宿主被認(rèn)為在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員的范圍為之內(nèi)。
更特殊的是，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，后者包括一種或多種序列，上面已有廣泛描述。構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，發(fā)明的序列已經(jīng)被插入其中，在一個(gè)正向或相反方向。在本實(shí)施方案的優(yōu)選方面，構(gòu)建體進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動(dòng)子，可操作的與序列連接。一個(gè)或多個(gè)附加插入物也可以被摻入導(dǎo)致一種或多種附加分子的表達(dá)，如另外一種肌醇六磷酸酶或蛋白酶，優(yōu)選的上述一種或多種附加分子可用于在聯(lián)合應(yīng)用中與本肌醇六磷酸酶結(jié)合。
大量的合適載體和啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域中的專業(yè)技術(shù)人員是已知的，商業(yè)中可以獲得?！百|(zhì)粒”命名是通過小寫的p在前和/或其后是大寫字母和/或數(shù)字。這里的初始質(zhì)粒既可以商業(yè)獲得，非限制的公開購買，也可以根據(jù)出版公開的步驟從獲得的質(zhì)粒中構(gòu)建。另外，與那些所描述的同等的質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，對(duì)于普通的專業(yè)技術(shù)人員是很明顯的。
以下的載體是以實(shí)例的方式提供的；細(xì)菌的pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBluescript II(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia)；真核生物的pXT1，pSG5(Stratagene)pSVK3，pBPV pMSG，pSVLSV40(Pharmacia)。但是，任何其他質(zhì)?；蚱渌d體只要可以在宿主中復(fù)制和具有活力均可以使用。
啟動(dòng)子區(qū)可以采用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其他具有可選擇標(biāo)記物的載體選自任何需要的基因。兩個(gè)合適的載體為pKK232-8和pCM7。特殊命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，gpt，λPR，PL和trp。真核細(xì)胞啟動(dòng)子包括前早期CMV，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和鼠金屬硫蛋白-I。合適載體和啟動(dòng)子的選擇很好地在本領(lǐng)域普通技術(shù)水平范圍內(nèi)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建物的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是一個(gè)較高級(jí)的真核細(xì)胞，如一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或一個(gè)較低級(jí)的真核細(xì)胞，如一個(gè)酵母細(xì)胞，或宿主細(xì)胞可以是一個(gè)原核細(xì)胞，如一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，1986)將構(gòu)建物導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以是有效的。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建物可以采用常規(guī)的方式來產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?？梢赃x擇的是，本發(fā)明的酶可以通過常規(guī)的肽合成儀來合成地產(chǎn)生。
成熟的蛋白可以在合適啟動(dòng)子的控制下在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母，細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)。無細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)也可以采用來源于本發(fā)明DNA構(gòu)建物的RNA來生產(chǎn)這樣的蛋白。原核細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞中使用的合適的克隆和表達(dá)載體得到了描述(如，Sambrook等，1989，其中公開的在此引用作為參考)。
真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄編碼本發(fā)明酶的DNA可以通過在載體中插入一個(gè)增強(qiáng)子序列而增加。增強(qiáng)子是DNA的順式反應(yīng)元件，通常大約為10至300bp，作用于啟動(dòng)子而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。實(shí)例包括位于復(fù)制起點(diǎn)bp100至270后側(cè)的SV40增強(qiáng)子，一個(gè)細(xì)胞巨病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制區(qū)起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。
一般來說，重組表達(dá)載體將包括復(fù)制區(qū)起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記物以保證宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如，大腸桿菌的氨比西林抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因，和來源于高度表達(dá)基因的啟動(dòng)子，用來引導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這樣的啟動(dòng)子可以來源于編碼如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白，以及其他的糖分解酶的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列與翻譯的起始點(diǎn)和終止序列，以及優(yōu)選地一個(gè)能夠引導(dǎo)翻譯酶分泌的引導(dǎo)序列在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期進(jìn)行裝配?？梢赃x擇的是，異源序列可以編碼一個(gè)融合蛋白，該蛋白包括一個(gè)具有所需特性的N-末端鑒定肽，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定或簡(jiǎn)單純化。
細(xì)菌中有用的表達(dá)載體通過在具有功能性啟動(dòng)子的讀碼運(yùn)行期內(nèi)插入編碼所需蛋白的結(jié)構(gòu)性DNA序列，以及合適的翻譯起始點(diǎn)和終止信號(hào)。載體將包括一個(gè)或多個(gè)顯性選擇標(biāo)記物和一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)以保證載體的維持，以及如果需要提供在宿主內(nèi)的擴(kuò)增。雖然其他也可以作為選擇，適合轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞宿主包括大腸桿菌，枯草芽胞桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和假單胞菌屬，鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的多種菌屬。
作為一個(gè)代表性但非限制性的實(shí)例，細(xì)菌用的有用表達(dá)載體由一個(gè)選擇性標(biāo)記物和來源于市售質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)組成，市售質(zhì)粒包括已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的基因元件。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“主干”區(qū)與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和將表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
在一個(gè)合適宿主菌株的轉(zhuǎn)化和宿主的生長達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)菌密度后，選擇的啟動(dòng)子通過適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行誘導(dǎo)(如，溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)誘導(dǎo))，且細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間。
細(xì)胞常規(guī)的收集采用離心，用物理或化學(xué)方式破裂，為進(jìn)一步純化保留得到的原始提取物。
在表達(dá)蛋白中使用的微生物細(xì)胞可以通過方便的方法進(jìn)行破裂，包括冷凍-復(fù)溫的重復(fù)，超聲作用，機(jī)械性破壞，或采用細(xì)胞溶解劑，這樣的方法對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員是已知的。
也可以使用不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系，如Gluzman(1981)所描述的，和其他能夠表達(dá)相容性載體的細(xì)胞系，如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包括一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’-側(cè)向非轉(zhuǎn)錄序列。來源于SV40剪接和多腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可能用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄基因元件。
酶可以重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，其方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和植物凝集素層析。如果需要可以使用蛋白折疊步驟，以完成成熟蛋白的構(gòu)型。最后，也可以使用高效液相(HPLC)來進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的酶可能是一個(gè)天然純化的產(chǎn)物，或一個(gè)化學(xué)合成的產(chǎn)物，或通過重組技術(shù)從原核細(xì)胞或真核細(xì)胞宿主(如培養(yǎng)的細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生的。在重組生產(chǎn)方法依靠使用的宿主，本發(fā)明的酶可能被糖基化或非糖基化。發(fā)明的酶可能不包括一個(gè)起始的蛋氨酸殘基。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶是一個(gè)肌醇六磷酸酶，它是熱穩(wěn)定的，具有熱抵抗性，可以催化肌醇六磷酸鹽的酶性水解，即該酶能夠復(fù)性，并在一個(gè)簡(jiǎn)短(即5到30秒)或較長的時(shí)期，如幾分鐘或幾小時(shí)，暴露于直至大約50℃或稍微超過50℃的溫度后恢復(fù)活性。
本發(fā)明進(jìn)一步由在此包含的文獻(xiàn)進(jìn)行描述；但是，可以理解的是，本發(fā)明不限于這樣的實(shí)例。所有的部分或數(shù)量，如果沒有特殊說明，均由重量來表示。
在發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一個(gè)產(chǎn)生一個(gè)肌醇六磷酸酶的方法，如在
圖1中所顯示。該方法包括在允許核酸表達(dá)，和選擇性分離編碼核酸的酶的條件下使一個(gè)宿主細(xì)胞生長，該細(xì)胞包含一個(gè)編碼酶(如SEQ ID1)的多核苷酸酸。培養(yǎng)宿主細(xì)胞的方法在實(shí)例中描述，并被本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟知。
6.2.3-轉(zhuǎn)基因植物和植物器官的使用在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因植物或植物器官中肌醇六磷酸酶的表達(dá)和產(chǎn)生它的方法。提供DNA構(gòu)建物用來在調(diào)控序列的控制下用編碼肌醇六磷酸酶的基因來轉(zhuǎn)化植物，該調(diào)控序列能夠引導(dǎo)肌醇六磷酸酶的表達(dá)。這些調(diào)控序列包括能夠引導(dǎo)植物中的轉(zhuǎn)錄，以構(gòu)成性或階段性和/或組織特異的方式。
表達(dá)的方式部分依靠使用植物或其一部分。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因植物和植物器官可用于許多工業(yè)的方法中，該方法可以直接，如用于動(dòng)物的飼養(yǎng)，或可以選擇的，表達(dá)的肌醇六磷酸酶可能被提取，如果需要，在應(yīng)用前進(jìn)行純化?？梢赃x擇的是，重組的宿主植物或植物的一部分可以直接使用。在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明提供了采用含有大量肌醇六磷酸酶的種子催化肌醇六磷酸鹽水解反應(yīng)的方法。方法涉及將轉(zhuǎn)基因，非野生型種子的優(yōu)選以一種基本形式或破碎的形式與含有肌醇六磷酸鹽的底物接觸，并允許酶包含在種子中以增加反應(yīng)率。通過直接將種子加入到含有肌醇六磷酸鹽的底物中，發(fā)明提供了一個(gè)提取和純化酶的昂貴和有問題的方法的解決方法。在一個(gè)特殊—但不限于的實(shí)例中，本發(fā)明也提供了處理的方法，其中將酶以含有大量酶的種子的形式提供給缺乏足夠酶供應(yīng)的生物體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將酶給予生物體的時(shí)間選擇與含有肌醇六磷酸鹽糧食的的消耗相適應(yīng)。
肌醇六磷酸酶在植物中的表達(dá)可以通過許多的方法實(shí)現(xiàn)。具體地，如可以獲得轉(zhuǎn)化大量植物種屬，包括雙子葉屬(如煙草，馬鈴薯，番茄，矮牽牛花，蕓苔)的技術(shù)?？梢赃x擇的是，如在植物中表達(dá)外源基因的戰(zhàn)略是可以獲得的。仍然可以選擇的是，已經(jīng)鑒定的來自植物基因的調(diào)控序列對(duì)于嵌合基因的構(gòu)建是有用的，該嵌合基因可以在植物和植物細(xì)胞中功能性的表達(dá)(如Klee等，1987；Clark等，1990；Smith等，1990)。
基因構(gòu)建物導(dǎo)入植物可以采用幾種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，這些技術(shù)包括用膨脹土壤桿菌或土壤桿菌生根基因來轉(zhuǎn)化。因此可以轉(zhuǎn)化的非限制性的植物組織的實(shí)例包括原生物，小孢子或花粉，和如葉，莖，根，下胚軸和胚軸的外植體。DNA可以直接通過微注射，電穿孔，微粒轟擊和直接DNA攝取的方法導(dǎo)入原生物和植物細(xì)胞或組織中。
蛋白可以在植物中通過多種表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。例如，如花椰菜嵌合病毒的35S啟動(dòng)子(Guilley等，1982)的構(gòu)成性啟動(dòng)子事實(shí)上在轉(zhuǎn)基因植物的所有器官中濃集表達(dá)的蛋白中是有用的。可以選擇的是，高度組織特異性和/或時(shí)期特異性啟動(dòng)子的使用對(duì)于本發(fā)明是有用的(Higgins，1984；Shotwell，1989)，其目的是使表達(dá)朝向所希望的組織和/或朝向所希望的進(jìn)展期。進(jìn)一步關(guān)于本發(fā)明的在植物中表達(dá)肌醇六磷酸酶分子的詳細(xì)描述也進(jìn)行了公開，例如，在USPN5,770,413(Van Ooijen等)和USPN5,593,963(Van Ooijen等)，雖然公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料不能講授本申請(qǐng)的發(fā)明的分子，但卻能講授真菌肌醇六磷酸酶的使用。
總之，與本發(fā)明有關(guān)的是，許多方法可以用于實(shí)現(xiàn)在一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或一部分植物中重組表達(dá)肌醇六磷酸酶。這樣一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物和植物的一部分可以用作重組表達(dá)的肌醇六磷酸酶的來源，它可以直接加入到含有肌醇六磷酸鹽的來源物中。可以選擇的是，重組的植物表達(dá)的肌醇六磷酸酶可以從植物來源中提取出來，如果需要，在于肌醇六磷酸酶底物接觸前進(jìn)行純化。
6.2.4-可用植物的實(shí)例在本發(fā)明的內(nèi)容中，可選擇的植物包括，但不限于產(chǎn)生，可食用花朵如菜花(蕓苔oleracea)，朝鮮薊(朝鮮薊scolymus)的作物，如蘋果(蘋果屬，如domesticus)，香蕉(Musa，如acuminata)，草莓(如黑醋栗，虎耳草科酷栗屬，如rubrum)，櫻桃(如甜櫻桃，李屬，如avium)，黃瓜(香瓜屬，如sativus)，葡萄(vitis，如vinifera)，檸檬(柑橘檸檬)，甜瓜(melo甜瓜)，堅(jiān)果(如核桃，胡桃屬，如regia；花生，地花生)，橙(柑橘屬，如maxima)，桃(李屬如persica)，梨(pyra，如communis)，李子(李屬如domestica)，草莓(fragaria，如moschata)，番茄(番茄屬，如esculentum)，葉，如苜蓿(苜蓿屬，如sativa)，卷心菜(如蕓苔屬oleracea)，菊苣(cichoreum，如endivia)，韭蔥(蔥屬，如porrum)，萵苣(萵苣屬，如sativa)，菠菜(菠菜，如oleraceae)，煙草(煙草屬，如煙草)，根，如竹竽(竹竽，如arundinacea)，甜菜(Beta，如vulgaris)，胡蘿卜(daucus，如carota)，木薯(木薯屬，如esculenta)，蕪箐(蕓苔屬，如rapa)，蘿卜(raphanus，如sativus)，薯蕷屬(薯蕷屬，如esculenta)，番薯(番薯屬batatas)和種子，如豆類(菜豆屬，如vulgaris)，豌豆(pisum，如sativum)，大豆(glycin，如max)，小麥(小麥屬，如aestivum)，大麥(大麥屬，如vulgare)，玉米(玉蜀黍?qū)?，如mays)，稻米(oryza，如sativa)，油菜籽(蕓苔napus)，栗(黍L.)，向日葵(helianthus annus)，燕麥(avena sativa)，塊莖，如大頭菜(蕓苔，如oleraceae)，馬鈴薯(茄屬，如tuberosum)和類似物。
可以理解的是，其他植物和非植物表達(dá)系統(tǒng)可以在本發(fā)明的內(nèi)容中使用。植物種屬的選擇是根據(jù)植物或其部分的使用目的來基本的確定，并以要轉(zhuǎn)化的植物種屬為根據(jù)。
6.2.5-植物轉(zhuǎn)化的方法幾種技術(shù)可以用來將含有肌醇六磷酸酶編碼的DNA序列的表達(dá)構(gòu)建物導(dǎo)入目標(biāo)植物中。這樣的技術(shù)包括但不限于采用鈣/聚乙二醇法，電穿孔和微注射或(包被的)微粒轟擊(Potrykus，1990)進(jìn)行的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化。除了這些所謂的直接DNA轉(zhuǎn)化方法，涉及載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以廣泛的獲得，如病毒載體(如，來自花椰菜嵌合病毒(CaMV))和細(xì)菌載體(如，來自土壤細(xì)菌屬)(Potrykus，1990)。在選擇和/或篩選后，被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)，細(xì)胞或植物的一部分可以在整個(gè)植物中再生，采用的方法在本領(lǐng)域是為人熟知的(Horsch等，1985)。轉(zhuǎn)化和/或再生技術(shù)的選擇對(duì)于本發(fā)明是不重要的。
6.2.6-雙子葉植物的方法對(duì)于雙子葉植物，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案采用了雙重載體系統(tǒng)的原理(Hoekema等，1983；EP 0120516 Schilperoort等)，其中使用了土壤桿菌菌株，該菌株含有一個(gè)具有毒性基因的病毒質(zhì)粒和一個(gè)含有要轉(zhuǎn)移基因構(gòu)建物的相容質(zhì)粒。這個(gè)載體可以在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制，來源于雙重載體Bin19(Bevan，1984)，其細(xì)節(jié)可以改變，這與本發(fā)明無關(guān)。在本實(shí)例中使用的雙重載體包含在T-DNA的左和右邊界序列之間，一個(gè)編碼卡那霉素抗性(Bevan，1984)的相同的NPTII基因和一個(gè)在所需基因構(gòu)建物中克隆的多克隆位點(diǎn)。
6.2.7-單子葉植物的方法單子葉植物作物的轉(zhuǎn)化和再生不是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的步驟。但是，最近的科學(xué)進(jìn)展顯示從原理上，單子葉植物是可以接受轉(zhuǎn)化的，從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以再生出多產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)這些作物的再生產(chǎn)組織培養(yǎng)系統(tǒng)的建立和將基因物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞中的強(qiáng)有力的方法，將有助于轉(zhuǎn)化。最近選擇單子葉植物轉(zhuǎn)化的方法是外植體或懸浮細(xì)胞的微型發(fā)射轟擊作用，和直接DNA的攝取或原生質(zhì)的電穿孔。例如，轉(zhuǎn)基因大米植物已經(jīng)可以采用細(xì)菌的hph基因獲得，該基因編碼一個(gè)作為選擇性標(biāo)記物的潮霉素抗性。基因通過電穿孔的方法導(dǎo)入(Shimamoto等，1993)。轉(zhuǎn)基因玉米植物已經(jīng)可以通過導(dǎo)入鏈霉素hygroscopicus棒狀基因到通過微型發(fā)射轟擊作用產(chǎn)生的玉米懸浮培養(yǎng)液的胚細(xì)胞(GordonKamm等，1990)中來獲得，該基因編碼phosphinothricin乙?；D(zhuǎn)移酶(一個(gè)可以滅活除草劑Phosphinothricin的酶)。已經(jīng)有報(bào)道將基因物質(zhì)導(dǎo)入如小麥和大麥的其他單子葉作物的糊粉原生質(zhì)中(Lee等，1989)。小麥植物已經(jīng)從胚懸液培養(yǎng)物中再生，該培養(yǎng)物是僅從為形成胚懸液培養(yǎng)物所使用的老塊和結(jié)節(jié)胼胝組織中選擇的(Vasil等，1972；Vasil等，1974)。這些作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的結(jié)合使本發(fā)明可以應(yīng)用于單子葉植物。這些方法也可以應(yīng)用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化和再生。
6.2.8-在植物中表達(dá)的方法肌醇六磷酸酶構(gòu)建物的表達(dá)涉及一些細(xì)節(jié)，如通過植物聚合酶的基因轉(zhuǎn)錄，mRNA的翻譯等，這些對(duì)于重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員是熟知的。下面僅討論本發(fā)明正確含義的相關(guān)細(xì)節(jié)。已知或發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致肌醇六磷酸酶表達(dá)的調(diào)控序列可能在本發(fā)明中使用。使用的調(diào)控序列的選擇依依賴于感興趣的目的作物和/或目的器官。這些調(diào)控序列可能從植物或植物病毒中獲得，或可能是化學(xué)合成的。這些調(diào)控序列是在引導(dǎo)植物轉(zhuǎn)錄中有活性的啟動(dòng)子，是構(gòu)成性或時(shí)期性和/或組織特異性，這取決于使用植物或植物的一部分。這些啟動(dòng)子包括，但不限于顯示構(gòu)成性表達(dá)的啟動(dòng)子，如花椰菜嵌合病毒(CaMV)(Guilley等，1982)的35S啟動(dòng)子，葉特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，如核酮糖二磷酸羥化酶小亞單位基因的啟動(dòng)子(Coruzzi等，1984)，種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子，如來自蕓苔napus(Ryan等，1989)的cruciferinA啟動(dòng)子，結(jié)節(jié)特異表達(dá)的啟動(dòng)子，如來自馬鈴薯的I型patatin啟動(dòng)子(Koster-Topfer等，1989；Wenzler等，1989)或果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子，如來自番茄的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的啟動(dòng)子(Bird等，1988)。
其他調(diào)控序列如終止序列和多聚腺苷酸化信號(hào)，包括任何在植物中發(fā)揮作用的此類序列，在其中的選擇可以為專業(yè)人員所掌握。這樣序列的一個(gè)實(shí)例是tumefaciens土壤桿菌的胭脂堿合酶(nos)基因3’-側(cè)向區(qū)域(Bevan，見前)。調(diào)控序列可能也包括增強(qiáng)子序列，如在CaMV 35S啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的，和mRNA穩(wěn)定序列，如苜蓿(AIMV)RNA4(Brederode等，1980)的引導(dǎo)序列或已相似的方式發(fā)揮功能的任何其他序列。
肌醇六磷酸酶應(yīng)該在允許穩(wěn)定表達(dá)蛋白的環(huán)境中進(jìn)行表達(dá)?？梢栽诒景l(fā)明中使用細(xì)胞內(nèi)區(qū)室如胞液，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，空胞，蛋白體或胞質(zhì)周圍空間來建立這樣一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，依靠肌醇六磷酸酶的生物物理參數(shù)。這樣的參數(shù)包括，但不限于最佳pH，對(duì)蛋白水解酶的敏感性或?qū)?yōu)選區(qū)室的克分子濃度的敏感性。
為在細(xì)胞胞漿中獲得表達(dá)，已表達(dá)的酶不應(yīng)含有一個(gè)分泌肽或其他任何目的序列。為在葉綠體和線粒體中表達(dá)，表達(dá)的酶應(yīng)該含有特異的進(jìn)入這些細(xì)胞器的所謂轉(zhuǎn)運(yùn)肽。可以與為實(shí)現(xiàn)這樣目的的感興趣的酶結(jié)合的目的序列是已知的(Smeekens等，1990；Vanden Broeck等，1985；Wolter等，1988)。如果在空胞中需要該酶的活性，要存在一個(gè)分泌信號(hào)肽以及一個(gè)特異的目的序列，該序列可以引導(dǎo)該酶導(dǎo)入這些空胞中(Tague等，1990)。對(duì)在種子中的蛋白體也是一樣。編碼感興趣酶的DNA序列應(yīng)該以下面的方式進(jìn)行修飾，即該酶可以在細(xì)胞中需要的部位發(fā)揮作用。
為在細(xì)胞外表達(dá)肌醇六磷酸酶，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物使用一個(gè)分泌信號(hào)序列。雖然優(yōu)選使用與植物宿主種屬同源(天然)的信號(hào)序列，異源性的信號(hào)序列，即那些來源于其他植物種屬或微生物來源的序列也可以使用。這樣的信號(hào)序列對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員是熟知的。在本發(fā)明的內(nèi)容中可能使用的合適的信號(hào)序列在Blobel等，1979；Von Heijne，1986；Garcia等，1987；Sijmons等，1990；Ng等，1994；和Powers等，1996中公開。
本發(fā)明的相關(guān)DNA構(gòu)建物的所有部分可能被修飾，如果需要，可以采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟知的方法影響其控制特性?？梢灾赋觯薪?jīng)本發(fā)明獲得的肌醇六磷酸酶的植物可以用于獲得具有更高肌醇六磷酸酶水平的植物或植物器官。例如，可能通過使用somoclonal變異技術(shù)或雜交技術(shù)來獲取這樣的植物或植物器官。這樣的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員是熟知的。
6.2.9-新的肌醇六磷酸酶和其他分子的雙重表達(dá)在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種實(shí)現(xiàn)肌醇六磷酸酶和其他分子高效過量表達(dá)的方法(及其產(chǎn)物)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在木霉屬中實(shí)現(xiàn)肌醇六磷酸酶和pH2.5酸性磷酸酶的高效過量表達(dá)系統(tǒng)(及其產(chǎn)物)的方法。這個(gè)系統(tǒng)可以產(chǎn)生酶組合物，它在動(dòng)物飼養(yǎng)工業(yè)中具有特殊的用途。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括EP 0659215(WO 9403612 A1)(Nevalainen等)，雖然公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料不能講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.2.10-新的肌醇六磷酸酶及其穩(wěn)定的液體配方的可溶性制劑在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有肌醇六磷酸酶活性的穩(wěn)定的水溶液制劑的方法，該制劑可增加酶活性對(duì)熱滅活的抵抗力，并在延長儲(chǔ)存期間保留其肌醇六磷酸酶活性。液體制劑的穩(wěn)定是通過添加尿素和/或如山梨醇和甘油的多元醇作為穩(wěn)定劑。也提供了單胃動(dòng)物的飼料制劑和使用上述穩(wěn)定的水溶液制劑來進(jìn)行生產(chǎn)的方法。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括EP 0626010(WO9316175 A1)(Barendse等)，雖然公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料不能講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3-新的肌醇六磷酸酶的使用6.3.1-肌醇六磷酸鹽的一般應(yīng)用，水解和肌醇的產(chǎn)生在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種水解肌醇六磷酸鹽的方法，該法包括將肌醇六磷酸鹽與一個(gè)或多個(gè)在此公開的新的肌醇六磷酸酶分子接觸。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種催化肌醇六磷酸鹽水解為肌醇和磷酸鹽，從植酸復(fù)合體中釋放無機(jī)離子的方法。該方法包括將一個(gè)肌醇六磷酸鹽底物和有效降解量的本發(fā)明的酶接觸，該酶如在SEQ ID NO2中顯示的酶。術(shù)語“有效降解”的量是指與未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，降解至少50％肌醇六磷酸鹽，優(yōu)選至少降解80％的肌醇六磷酸鹽所需酶的量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在肌醇六磷酸鹽中水解磷酸單酯鍵的方法。該方法包括施用有效量的本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子(例如SEQ ID NO2)以產(chǎn)生肌醇和游離磷酸鹽?！坝行А绷渴侵概c未與酶接觸的肌醇六磷酸鹽相比，水解至少50％的磷酸單酯鍵，優(yōu)選水解至少80％的鍵所需酶的量。
在一個(gè)特定的方面，當(dāng)需要時(shí)，為了在肌醇六磷酸鹽分子和/或其他底物來源的分子中產(chǎn)生化學(xué)性改變(如水解)，肌醇六磷酸酶分子可以用來與其他試劑結(jié)合，如其它催化劑。根據(jù)這一方面，優(yōu)選肌醇六磷酸酶分子和添加的試劑不能互相抑制，更優(yōu)選肌醇六磷酸酶分子和添加的試劑具有整體的加性效應(yīng)，更優(yōu)選肌醇六磷酸酶和添加的試劑具有整體的協(xié)同效應(yīng)。
底物肌醇六磷酸鹽分子的相關(guān)來源包括食品，潛在的食品，食品的副產(chǎn)品(在體外和體內(nèi)的副產(chǎn)品，如體內(nèi)體外反應(yīng)產(chǎn)物和動(dòng)物排泄產(chǎn)物)，食品的前體和任何其他肌醇六磷酸鹽的物質(zhì)來源。
6.3.2-給予生物體在一個(gè)非限制性的方面，重組的肌醇六磷酸酶可以通過生物體來消耗，并在消耗的過程保持活性。在另一個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因的方法可以用來實(shí)現(xiàn)重組肌醇六磷酸酶的表達(dá)—優(yōu)選以一個(gè)可控的方式進(jìn)行(以時(shí)間特異性和組織特異性的方式控制轉(zhuǎn)基因分子的表達(dá)的方法是可以獲得的)。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，在來源物質(zhì)(一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物來源或重組原核生物宿主)中的肌醇六磷酸酶活性可能在消耗的過程中增加；這種活性的增加，例如可能發(fā)生在以蛋白原形式的前體肌醇六磷酸酶分子轉(zhuǎn)變?yōu)楦墒煨问降幕钚愿用黠@的蛋白的過程中，其中所述的轉(zhuǎn)變可能，例如來自肌醇六磷酸酶來源的攝取和消化。肌醇六磷酸鹽底物的水解可在肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸鹽接觸過程中的任何時(shí)候發(fā)生；例如，這可能發(fā)生在攝取(injestion)前，或攝取后，或底物或酶，或兩者的攝取之前和之后都攝取。另外要重視的是肌醇六磷酸鹽底物可與—除了肌醇六磷酸酶以外—一個(gè)或多個(gè)添加的試劑，如另一個(gè)酶接觸，這也可以直接或從其來源物質(zhì)純化后應(yīng)用。
令人欣賞的是，一種肌醇六磷酸酶來源物質(zhì)(多種)可以直接與一種肌醇六磷酸鹽來源物質(zhì)(多種)接觸；如，一種肌醇六磷酸酶來源(多種)和一種肌醇六磷酸鹽來源(多種)的其中一種或兩者一起在體外或體內(nèi)研磨或咀嚼時(shí)?？梢赃x擇的是肌醇六磷酸酶可以從一種來源物質(zhì)(多種)中純化，或肌醇六磷酸鹽底物可以在肌醇六磷酸酶與肌醇六磷酸鹽底物接觸前從一種來源物質(zhì)(多種)中純化。要重視的是純化和未純化的試劑的結(jié)合—包括一種酶(多種)或一種底物(多種)或兩者—都可以使用。
適合的是，超過一種來源物質(zhì)可以用作肌醇六磷酸酶活性的來源。這在作為實(shí)現(xiàn)從一種來源物質(zhì)(多種)中定時(shí)釋放一種試劑(多種)的一種方法中是有用的，其中的釋放是從各自的來源物質(zhì)分別釋放不同的試劑，例如，如同攝取(injested)來源物質(zhì)在體內(nèi)被消化或來源物質(zhì)在體外應(yīng)用時(shí)被處理一樣。可以遇到這樣的問題，超過一種肌醇六磷酸酶活性的來源物質(zhì)的使用也可用來在一定條件和波動(dòng)的范圍內(nèi)獲得肌醇六磷酸酶活性，如pH值，溫度，鹽度和時(shí)間間隔范圍—例如，在一種應(yīng)用的不同處理步驟中。不同來源物質(zhì)的使用也可用于獲得不同的試劑，如通過肌醇六磷酸酶/或肌醇六磷酸鹽和/或其他物質(zhì)的一種或多種形式所實(shí)例的。
適合的是，一個(gè)單一的來源物質(zhì)，如一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物種屬(或植物的一部分)，可以是肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸鹽的來源物質(zhì)；該酶和底物可分別隔離在所述的單一來源之內(nèi)的區(qū)室中—如，分泌相對(duì)非分泌的，分別表達(dá)和/或分別富含在不同植物部分或器官或組織，或同一植物部分或器官或組織中的亞細(xì)胞區(qū)室中。在此含有的肌醇六磷酸酶分子的純化可能包括將一個(gè)或多個(gè)所需的植物部分或器官或組織或亞細(xì)胞區(qū)室分離和/或進(jìn)一步處理。
在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明提供了一種采用含有大量酶的種子催化體內(nèi)和/或體外反應(yīng)的方法。這種方法包括將轉(zhuǎn)基因，非野生型種子，優(yōu)選以研磨的方式加入到一個(gè)反應(yīng)混合物中，使酶在種子中增加反應(yīng)率。通過直接將種子加入到反應(yīng)混合物中，該法提供了一種對(duì)提取和純化酶的更昂貴和煩瑣方法的解決辦法。也提供了處理的方法，其中缺乏足量酶供應(yīng)的生物體中使用種子形式的酶，該種子來自一種或多種植物種屬，優(yōu)選含有大量酶的轉(zhuǎn)基因植物種屬。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括USPN5,543,576(Van Ooijen等)和USPN5,714,474(Van Ooijen等)，雖然公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料不能講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子并講授真菌肌醇六磷酸酶的使用。
在一個(gè)非限制性的方面，本肌醇六磷酸酶分子可用于產(chǎn)生重組消化系統(tǒng)的生命形式(或微生物或植物)和將所述的重組消化系統(tǒng)的生命形式給予動(dòng)物。施用可以任選單獨(dú)進(jìn)行或與其他酶和/或與其他可以在一個(gè)消化系統(tǒng)中提供酶活性的生命形式聯(lián)合給予，其中所述的其他酶和所述的生命形式可能是重組的或其他方式。例如，施用可能是與xylanolytic細(xì)菌聯(lián)合使用。
6.3.3-谷類的浸泡在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一個(gè)在含有二氧化硫的溫水中浸泡谷物或高粱谷粒的方法，溫水中存在含有一個(gè)或多個(gè)植酸鈣鎂降解酶的酶制劑，其量優(yōu)選的量為將存在于谷物或高粱中的植酸鈣鎂基本被降解。酶制品可包括肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶和任選其他植物材料降解酶。浸泡的時(shí)間可以是12至18小時(shí)。浸泡通過中間的研磨步驟，減少浸泡時(shí)間來中止。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，谷物或高粱谷粒浸泡在含有二氧化硫的溫水中來消除或大幅度減少植酸和肌醇六磷酸鹽，溫水中存在包括一個(gè)或多個(gè)如肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的植酸鈣鎂降解酶的酶制劑。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括USPN4,914,029(Caransa等)和EP 0321004(Vaara等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.4-發(fā)酵面團(tuán)的制備在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種獲得具有所需物理特性如非粘性和有彈性的面包團(tuán)和高質(zhì)量如比容的面包產(chǎn)品的方法，該方法包括將肌醇六磷酸酶分子加入到面包團(tuán)中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子加入到正在制作中的面包團(tuán)制品中，隨后成型和烘烤。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括JP03076529(Hara等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子并且是講授的真菌肌醇六磷酸酶的使用。
6.3.5-含大豆食品的生產(chǎn)在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生改良的大豆食品的方法。大豆與本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子混合以去除大豆中的植酸，因此產(chǎn)生的大豆食品在提供消化生物體的重要微量營養(yǎng)物和蛋白的消化性方面有所改善。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在豆奶的產(chǎn)生中，將本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子加入或開始與大豆接觸以減少植酸含量。在一個(gè)非限制性的實(shí)例中，應(yīng)用的方法可以通過將豆奶與酶在加熱的條件下振動(dòng)或通過在一個(gè)振動(dòng)容器中采用固定酶進(jìn)行混合型反應(yīng)。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括JP 59155049(Kamikubo等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.6-液體食品包括米酒的生產(chǎn)在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)飲用水或液體形式動(dòng)物飼養(yǎng)的混合產(chǎn)物的方法，該方法包括采用礦物質(zhì)混合物和維生素混合物，也包括本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為消耗生物體形成必須營養(yǎng)物的正確的給予和組成的混合物，而沒有任何重要礦物質(zhì)/維生素的沉淀和破壞的危險(xiǎn)，而同時(shí)最佳的應(yīng)用是由在飼料中植酸結(jié)合的磷酸鹽組成的。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括EP 0772978(Bendixen等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
適合的是，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子也可以用于產(chǎn)生其他酒精和非酒精的基于使用土壤和/或谷物和/或其他植物的可飲用的食品(或飲料)。這些可飲用的食品包括酒，葡萄酒，混合的酒精飲料(如冷酒器，其他酒精咖啡如愛爾蘭咖啡等等)，啤酒，仿制啤酒，果汁，榨汁，勻漿和濃湯。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，這里公開的肌醇六磷酸酶分子可用于產(chǎn)生可用于產(chǎn)生這樣可飲用食品的真菌和/或谷物和/或其他植物的轉(zhuǎn)基因副本。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中。這里公開的肌醇六磷酸酶分子用作制造過程中和/或在這樣可飲用的食品的最終容量中的其他成分。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。但是，由于本發(fā)明的新穎性—這些公開發(fā)表的文獻(xiàn)沒有講授這里公開的發(fā)明的分子。
在另一個(gè)非限制性的實(shí)例中，本發(fā)明提供了一種獲得植酸鈣鎂量較少和肌醇較多的精制米酒的方法。這樣的米酒可—通過直接和/或心理效應(yīng)—具有預(yù)防肝臟疾病，動(dòng)脈硬化和其他疾病的作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，米酒是從日本大米青酒曲通過作為原料的增加具有高度肌醇六磷酸酶活性的大米日本青酒曲產(chǎn)生的。要重視的是本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可能用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)活性的有用的真菌(優(yōu)選一個(gè)轉(zhuǎn)基因真菌)和/或被外源性的加入以增加青酒曲真菌的效應(yīng)。菌株加入到一種煮沸的大米中，青酒曲通過常規(guī)的步驟產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，使用制備的青酒曲，全部大米在兩個(gè)時(shí)期進(jìn)行制備，米酒在15℃的固定米酒溫度下產(chǎn)生以得到目的精制米酒，其中植酸鈣鎂較少，肌醇量較多。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括JP 06153896(Soga等)和JP06070749(Soga等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.7-礦物質(zhì)吸收劑的生產(chǎn)在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了獲得能夠促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的吸收劑的方法，該方法包括以較低的代價(jià)攝取鈣，而不被胃液或腸液消化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的礦物質(zhì)吸收劑含有植酸的部分水解產(chǎn)物作為活性成分。優(yōu)選地，植酸的部分水解產(chǎn)物是通過用本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子水解植酸或其鹽產(chǎn)生的。用所述肌醇六磷酸酶進(jìn)行的處理可單獨(dú)發(fā)生和/或聯(lián)合處理(抑制或增加最后的效應(yīng))，隨后在一定范圍內(nèi)抑制水解作用而不釋放所有的磷酸根。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括JP 04270296(Hoshino)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.8-與其他肌醇六磷酸酶和/或酸性磷酸酶聯(lián)合使用在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有添加劑或優(yōu)選的協(xié)同肌醇六磷酸鹽水解活性成分的酶組合物的方法；所述的組合物包括新的本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子和一種或多種添加的試劑，形成一種可聯(lián)合使用的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合處理可以使用至少兩種不同位置特異性的肌醇六磷酸酶來實(shí)現(xiàn)，即1-，2-，3-，4-，5-和6-肌醇六磷酸酶的任何組合。通過聯(lián)合不同位置特異性的肌醇六磷酸酶，可以獲得加性的或協(xié)同的效應(yīng)。如食物和飼料的組合物或包括聯(lián)合使用的肌醇六磷酸酶的食物和飼料添加劑也包括在本發(fā)明中作為制備的方法。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括WO9830681(Ohmann等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的聯(lián)合處理是用酸性磷酸酶來實(shí)現(xiàn)，該酶在pH2.5具有肌醇六磷酸鹽水解活性，以較低的比例對(duì)應(yīng)于pH2.5∶5.0的活性資料，從大約0.1∶1.0至10∶1，優(yōu)選從大約0.5∶1.0至5∶1，更優(yōu)選從大約0.8∶1.0至3∶1，更優(yōu)選從大約0.8∶1至2∶1。所述的酶組合物優(yōu)選在熱處理后顯示更高的協(xié)同性肌醇六磷酸鹽水解活性。所述的酶組合物可用于處理食品(可飲用的和固體食品，飼料和飼料產(chǎn)品)以提高肌醇六磷酸鹽的水解。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括USPN5,554,99(Vanderbeke等)和，USPN5,443,979(Vanderbeke等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子，只講授真菌(特殊的曲霉菌)肌醇六磷酸酶的應(yīng)用。
6.3.9-與作用于多糖(如木糖膠酶)的酶聯(lián)合使用在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生作用于多糖的組合物的方法(及其產(chǎn)物)，該組合物由本發(fā)明的新的肌醇六磷酸鹽作用酶和一種或多種添加的酶組成。這些多糖選自阿聚糖，果聚糖，巖藻聚糖，半乳聚糖，聚半乳糖醛酸，葡萄糖，甘露聚糖，木聚糖，左聚糖，墨角藻聚糖，愛蘭苔膠，半乳卡洛糖，果膠，果膠酸，支鏈淀粉，出芽短梗霉聚糖，動(dòng)物淀粉，支鏈淀粉，纖維素，羧甲基纖維素羥丙基甲基纖維素，葡聚糖，石耳素，殼多糖，瓊脂糖，角質(zhì)素，軟骨素，皮膚素(dermatan)，透明質(zhì)酸，褐藻酸和多糖，含有至少一個(gè)赤蘚糖，蘇糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，來蘇糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔羅糖，赤蘚酮糖，核酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，果糖，山梨糖，塔格糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖酸，葡萄糖二酸，半乳糖醛酸，甘露糖醛酸，葡萄糖胺，半乳糖胺和神經(jīng)氨糖酸。
在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生具有協(xié)同肌醇六磷酸鹽水解活性的組合物，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子，一種纖維素酶(包括優(yōu)選但不排除木聚糖酶)，選擇性的使用一種蛋白酶和選擇性的使用一種或多種添加的試劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的組合物可用于處理食品，木材產(chǎn)品，如紙產(chǎn)品和清潔液和固體。
在一個(gè)非限制性的實(shí)例中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可與多纖維素酶體成分聯(lián)合使用。已知許多可分解纖維素的細(xì)菌酶分子可組成不連續(xù)的多酶復(fù)合體，稱為多纖維素酶體。多纖維素酶體的多個(gè)亞單位由大量的功能區(qū)組成，它們可以互相作用，可與纖維質(zhì)底物作用。這些亞單位之一包括特色的新的一類非催化性支架多肽，可以選擇性的整合多種纖維素酶和木聚糖酶亞單位成為粘著復(fù)合體。多纖維素酶體雜合體和多纖維素酶體區(qū)的嵌合構(gòu)建物的精心應(yīng)用應(yīng)該能夠更好的使用纖維素的生物量，并可能提供在研究，醫(yī)藥和工業(yè)中廣闊范圍的新應(yīng)用。
在另一個(gè)非限制性的實(shí)例中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可用于—單獨(dú)或聯(lián)合使用—生物制漿和生物漂白領(lǐng)域，其中需要還原傳統(tǒng)在制漿和造紙工業(yè)中使用的環(huán)境有害化學(xué)物質(zhì)。廢水的處理代表了另一個(gè)廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，其中生物酶顯示不僅可有效去除顏色，而且可有效地將潛在有害物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化為有用的生物產(chǎn)品。
在另一個(gè)非限制性的實(shí)例中，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可用于產(chǎn)生生命形式，該形式可以在生物體的消化系統(tǒng)處理中提供至少一種酶活性—單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用。特定的相關(guān)的待處理的生物體包括非反芻生物體。具體地，要重視的是這種方法可以單獨(dú)進(jìn)行或與其他生物分子(例如木聚糖酶)聯(lián)合應(yīng)用以產(chǎn)生一個(gè)表達(dá)多數(shù)生物分子的重組宿主。也要重視的是，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子和/或表達(dá)本發(fā)明肌醇六磷酸酶分子的重組宿主的施用可單獨(dú)或與其他生物分子，和/或可以在消化系統(tǒng)中提供酶活性的生命形式聯(lián)合施用，其中所述的其它的酶和所述的生命形式可以是重組或其他方式的。例如，可以與分解木聚糖的細(xì)菌聯(lián)合施用。
例如，除了肌醇六磷酸鹽以外，許多生物體也不能完全消化半纖維素。半纖維素或木聚糖是植物中的主要成分(35％)。對(duì)于反芻動(dòng)物，大約50％的飲食中的木聚糖被降解，但在非反芻動(dòng)物和人的下消化道中僅有小量的木聚糖被降解。在瘤胃中，主要的木聚糖分解菌屬是溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃擬桿菌。在人的直腸中，卵圓形的擬桿菌和脆弱擬桿菌亞種“a”是主要的木聚糖分解細(xì)菌。木聚糖是化學(xué)復(fù)合體，它們的降解需要多種酶。溶纖維丁酸弧菌可制造細(xì)胞外木聚糖酶，而擬桿菌屬具有細(xì)胞結(jié)合的木聚糖酶活性。來自消化道細(xì)菌的木聚糖分解酶的生物化學(xué)特性還沒有完全完成。木糖苷酶基因已經(jīng)從溶纖維丁酸弧菌113中克隆。采用從溶纖維丁酸弧菌49克隆的木聚糖酶基因進(jìn)行DNA雜交得到的數(shù)據(jù)表明這個(gè)基因存在其他溶纖維丁酸弧菌菌株中。一個(gè)從棲瘤胃擬桿菌中克隆的木聚糖酶轉(zhuǎn)移到并高度表達(dá)于脆弱擬桿菌和uniformis擬桿菌中。來自卵圓形的擬桿菌的阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶基因已經(jīng)被克隆，兩種活性似乎都是通過單一的雙重功能的新的酶來催化的。
相應(yīng)地，適合的是，本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可用于1)轉(zhuǎn)移進(jìn)合適的宿主中(如脆弱擬桿菌或uniformis擬桿菌)；2)在得到的重組宿主中獲得適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；和3)將所述的重組宿主施用于生物體中以提高所處理的生物體降解肌醇六磷酸鹽的能力。在基因和生物化學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究將為在腸道水平控制消化提供知識(shí)和深入洞察，并提高對(duì)結(jié)腸纖維素消化的認(rèn)識(shí)。
關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員已知的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的文獻(xiàn)包括USPN5,624,678(Bedford等)，USPN5,683,911(Bodie等)，USPN5,720,971(Beauchemin等)，USPN 5,759,840(Dunh等)，USPN5,770,012(Cooper)，USPN5,786,316(Baeck等)，USPN5,817,500(Hansen等)和期刊文章(Jeffries，1996；Prade，1996；Bayer等，1994；Duarte等，1994；Hespell和Whitehead，1990；Wong等，1998)，但這些文獻(xiàn)沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子，也沒有講授所有在生產(chǎn)食品，木材產(chǎn)品如紙產(chǎn)品和清潔液和固體中肌醇六磷酸酶分子的添加。相反，本發(fā)明講授了肌醇六磷酸酶分子—優(yōu)選本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子可以被加入到公開的一種試劑(多種)中，以獲得具有加性肌醇六磷酸酶活性的制品。優(yōu)選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子不會(huì)互相抑制，更優(yōu)選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子將具有整體上的加性效應(yīng)，更優(yōu)選地，所述的一種試劑(多種)和加入的肌醇六磷酸酶分子將具有整體上的協(xié)同效應(yīng)。
6.3.10-與維生素D聯(lián)合使用在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)植酸磷的使用和治療和防止動(dòng)物，特別是家禽脛骨軟骨發(fā)育不良的方法(及其產(chǎn)品)，其實(shí)現(xiàn)方法是通過給予動(dòng)物一種含有羥化維生素D3衍生物的飼料組合物。維生素D3衍生物優(yōu)選在飼料中給予動(dòng)物，為了增強(qiáng)植酸磷的使用，該飼料含有較低的鈣和磷水平。相應(yīng)地，維生素D3衍生物優(yōu)選與本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子聯(lián)合使用以進(jìn)一步增強(qiáng)植酸磷的使用。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的文獻(xiàn)包括USPN5,516,525(Edwards等)，和USPN5,366,736(Edwards等)，USPN5,316,770(Edwards等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.11-與產(chǎn)乳酸細(xì)菌聯(lián)合使用在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種獲得食品的方法(及其產(chǎn)品)1)包括可以在生物體內(nèi)以肌醇形式很容易吸收和應(yīng)用的植酸鈣鎂；2)能夠以排泄的方式減少磷；和3)相應(yīng)地可用于改善環(huán)境的污染。所述的食品由含有植酸鈣鎂的谷物，產(chǎn)乳酸微生物和本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子的混合物組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的食品通過將一種含有植酸鈣鎂的谷物(優(yōu)選，如米糠)和一種有效微生物群，該微生物具有嗜酸性的特性，可產(chǎn)生乳酸，而不產(chǎn)生丁酸，沒有致病性，以及一種肌醇六磷酸酶混合產(chǎn)生。有效的微生物組的實(shí)例包括，如屬于放線菌群的鏈霉菌屬(ATCC3004)和屬于乳酸菌群的乳酸桿菌屬(IFO3073)。進(jìn)一步，添加有效微生物群的優(yōu)選的添加量基于谷物原料就細(xì)菌重量而言為0.2wt.％。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的文獻(xiàn)包括JP 08205785(Akahori等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.12-與蛋白酶一起溶解蛋白在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種改善蔬菜蛋白溶解度的方法。更具體地，發(fā)明涉及在蔬菜蛋白來源中溶解蛋白的方法，該法包括用有效量的一種或多種肌醇六磷酸酶—包括本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子—來處理蔬菜蛋白來源，和用有效量的一種或多種蛋白水解酶來處理蔬菜蛋白來源。在另一個(gè)方面，發(fā)明提供了動(dòng)物飼料添加劑，它包括一種肌醇六磷酸酶和一種或多種蛋白水解酶。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特定的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括EP 0756457(WO9528850 A1)(Nielsen和Knap)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生一種植物蛋白制品的方法，該法包括將蔬菜蛋白來源物質(zhì)分散在pH范圍在2至6的水中，并混合本發(fā)明的肌醇六磷酸酶分子。含有可溶性蛋白的酸性提取物被分離，并進(jìn)行干燥產(chǎn)生所需特性的固體蛋白。一種或多種蛋白酶也可以用來改善蛋白的特性。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括USPN3,966,971(Morehouse等)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.13-采用新的肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖三重處理混合肥料在一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明提供了一種方法(及其產(chǎn)品)，以激活土壤和/或混合肥料中惰性磷，提高氮化合物的利用率，并通過在混合肥料中加入三種試劑，肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖來抑制致病霉菌的繁殖。在一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，該法包括的處理混合肥料的方法有1)在媒質(zhì)中加入含肌醇六磷酸酶的微生物—優(yōu)選過度表達(dá)本發(fā)明的新的肌醇六磷酸酶分子的重組宿主—如以100ml媒質(zhì)/100kg濕重混合肥料；2)也可以選擇性的加入一個(gè)含有肌醇六磷酸酶的植物來源—如麥麩—如以0.2至1kg/100kg濕重混合肥料；3)加入一種皂甙來源—如泥煤，艾蒿和絲蘭植物—如以0.5至3.0kg；4)加入含有殼聚糖的物質(zhì)—如蝦，螃蟹等的殼粉—如以100至300g/kg濕重混合肥料。在另一個(gè)非限制性的實(shí)施方案中，使用重組來源和三個(gè)試劑，肌醇六磷酸酶，皂甙和殼聚糖。關(guān)于這種方法的其他細(xì)節(jié)可在公開發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得和/或是專業(yè)技術(shù)人員所了解的。在一個(gè)特殊的非限制性的實(shí)例中，這些公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)包括JP07277865(Toya Taisuke)，但公開發(fā)表的可獲取文獻(xiàn)中的參考資料沒有講授本申請(qǐng)中發(fā)明的分子。
6.3.14-用作雜交探針和擴(kuò)增模板本發(fā)明全長基因的片斷可被用作一個(gè)cDNA或一個(gè)基因組文庫的雜交探針用來分離全長DNA，和分離其他與基因序列高度相似的或相似生物學(xué)活性的DNAs。這種類型的探針具有至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少30個(gè)堿基，可以含有，例如至少50個(gè)或更多的堿基。該探針也可被用來鑒定對(duì)應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄物的一個(gè)DNA克隆，和含有完全基因的一個(gè)基因組克隆或多個(gè)克隆，完全基因包括調(diào)控和啟動(dòng)子區(qū)，外顯子和內(nèi)含子。
本發(fā)明提供了鑒定核酸分子的方法，該分子編碼除SEQ ID NO1外的肌醇六磷酸酶多肽家族成員。在這些方法中，一個(gè)樣品，如一個(gè)核酸文庫，如cDNA文庫，含有一個(gè)編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸，用一個(gè)肌醇六磷酸酶特異探針來篩選，如一個(gè)肌醇六磷酸酶特異的核酸探針。肌醇六磷酸酶特異的核酸探針是可特異與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其互補(bǔ)序列雜交的核酸分子(如含有DNA或RNA核苷酸的分子，或組合物或其修飾物)。發(fā)明的本方法內(nèi)容中的術(shù)語“肌醇六磷酸酶特異探針”，是指與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸或其互補(bǔ)序列結(jié)合，其可檢測(cè)程度超過與編碼其他酶的核酸或其互補(bǔ)序列的結(jié)合。
本發(fā)明加速了肌醇六磷酸酶特異的核酸探針產(chǎn)生。獲得這樣探針的方法可以基于
圖1中顯示的氨基酸序列來設(shè)計(jì)。含有至少12，如至少15，25，35，50，100或150個(gè)核苷酸的探針，可以采用幾種標(biāo)準(zhǔn)方法中的任何一種(見，如Ausubel等，見上)來生產(chǎn)。例如，優(yōu)選地，探針可以采用PCR擴(kuò)增的方法來產(chǎn)生。在這些方法中，引物的設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于肌醇六磷酸酶的保守序列(見
圖1)，可以包括肌醇六磷酸酶特異氨基酸，且得到的PCR產(chǎn)物被用作探針來篩選一個(gè)核酸文庫，如一個(gè)cDNA文庫。
本發(fā)明可用于分離基本類似于編碼如
圖1(SEQ ID NO1)所示的肌醇六磷酸酶的分離核酸分子的核酸序列。分離的核酸序列基本上是相似的，如果(i)它們能夠在嚴(yán)格的條件下與SEQ ID NO1雜交，此后進(jìn)行描述；或(ii)由于基因編碼的退化(如退化為SEQ ID NO1)，它們編碼一個(gè)如SEQ ID NO2中所顯示的肌醇六磷酸酶多肽。
退化的DNA序列編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列，但在核苷酸編碼序列中有一些變異。如此所使用的，“基本相似”是指與本發(fā)明的序列具有相似特性的序列?；鞠嗨频暮塑账嵝蛄锌梢酝ㄟ^雜交或序列對(duì)比來鑒定。基本相似的酶序列可以通過下列方法的一種或多種來鑒定蛋白水解消化，凝膠電泳分析和/或微序列分析。
一種分離編碼肌醇六磷酸酶核酸分子的方法是以天然和人工設(shè)計(jì)的探針采用本領(lǐng)域認(rèn)可的程序(見，如Ausubel等，見上)探測(cè)一個(gè)基因組基因文庫。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員要重視的是，SEQ ID NO1或其片斷(包括至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸)是一個(gè)特別有用的探針。其他用于此目的的特別有用的探針是SEQ ID NO1序列的雜交片斷(即包括至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸酸)。
這些探針可以被、并優(yōu)選地用一種分析檢測(cè)試劑進(jìn)行標(biāo)記，以促進(jìn)探針的識(shí)別。有用的試劑包括但不限于放射活性，熒光染料或能夠催化形成可檢測(cè)產(chǎn)物的酶。這個(gè)探針因此可被用以從其他動(dòng)物來源中分離DNA互補(bǔ)拷貝，或篩選這種來源的相關(guān)序列。
關(guān)于可與在此公開的特異核酸序列雜交的核酸序列，雜交可以在簡(jiǎn)化的嚴(yán)格條件，中等嚴(yán)格條件或十分嚴(yán)格條件下進(jìn)行。作為寡核苷酸雜交的實(shí)例，一種含有固定變性核苷酸的聚合膜首先在一種溶液中預(yù)雜交30分鐘，該溶液包括0.9MNaCl，50mM NaH2PO4，pH7.0，5.0mM Na2EDTA，0.5％SDS，10X Denhardt’s和0.5mg/mL聚核糖腺苷酸。然后將大約2×107cpm(特異活性4-9×108cpm/ug)的32p末端標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到溶液。在孵育12-16小時(shí)后，室溫下在含有0.5％SDS的1XSET(150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.8，1mM Na2EDTA)中洗膜30分鐘，然后在新鮮的1XSET中在Tm-10℃下清洗寡核苷酸探針30分鐘。然后膜暴露于放射自顯影膠片上以檢測(cè)雜交信號(hào)。
發(fā)明的核酸分子可在產(chǎn)生肌醇六磷酸酶基因產(chǎn)物(如肌醇六磷酸酶RNAs和肌醇六磷酸酶多肽)的標(biāo)準(zhǔn)方法中被用作模板。另外，編碼肌醇六磷酸酶多肽(及其片斷)的核酸分子和相關(guān)的核酸—如(1)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽或其片斷(如含有至少12，15，20或25個(gè)核苷酸的片斷)互補(bǔ)，或雜交的序列的核酸；和(2)含有與編碼肌醇六磷酸酶多肽的核酸，或其片斷(如含有至少12，15，20或25個(gè)核苷酸的片斷)互補(bǔ)序列雜交的核酸—可用于方法。例如，如在此所進(jìn)一步詳細(xì)描述的，這樣的核酸分子可用在下列的方法中合成肌醇六磷酸酶核酸的PCR方法，在一個(gè)樣品中檢測(cè)一個(gè)肌醇六磷酸酶核酸存在的方法，鑒定編碼新的肌醇六磷酸酶家族成員的核酸的篩選方法。雜交作用為基礎(chǔ)的應(yīng)用包括南方(Southern)型，北方(Northern)型，RNA保護(hù)和任何將核酸作為雜交合作者的雜交步驟。
本發(fā)明的多核苷酸的片斷或部分可被用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。相應(yīng)地，本發(fā)明酶的片斷或部分可被用于通過肽合成來產(chǎn)生全長的酶；因此，片斷可以用作產(chǎn)生全長酶的中間體。斷裂片斷的大小分離一般采用8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行，如文獻(xiàn)(如Goeddel等，1980)中所描述的。
6.3.15-在定向進(jìn)化中的使用本發(fā)明提供了酶及其片斷，其他衍生物和類似物，和用于定向進(jìn)化的相應(yīng)核苷酸。如在此公開的多數(shù)模板的使用和發(fā)現(xiàn)與單一模板蛋白的定向進(jìn)化相比，可能明顯增加了定向進(jìn)化的潛在產(chǎn)量。因此，發(fā)現(xiàn)的需求是基于這樣的前提，大自然提供了一筆財(cái)富，即在截然不同但相關(guān)的分子分組的成員中具有潛在的難以獲得的或不可預(yù)測(cè)的特性，這些特性的開發(fā)可能極大的促進(jìn)定向進(jìn)化。因此，在一個(gè)方面，相關(guān)但截然不同的分子可能作為一個(gè)所需特性的定向進(jìn)化的唯一起始模板。在另一個(gè)方面，它們可能作為結(jié)構(gòu)—功能資料的儲(chǔ)存庫，這些信息包括但不限于，多種一致的基序。兩種作用都有助于排除邏輯上不切實(shí)際的任務(wù)，這些任務(wù)致力于立即開發(fā)任何給定分子過寬范圍的突變變換。例如，在100個(gè)氨基酸蛋白上的全范圍突變變換，包括超過10130個(gè)可能性(假設(shè)每個(gè)位點(diǎn)有20個(gè)氨基酸可能性)，從實(shí)用性上考慮這個(gè)數(shù)字太大了。
相應(yīng)地，特別是因?yàn)檫壿嬌虾图夹g(shù)上的限制，在進(jìn)行“定向進(jìn)化”時(shí)需要一種方法以發(fā)現(xiàn)和利用多數(shù)具有進(jìn)化前差異的相關(guān)起始模板。這些模板然后進(jìn)行多種誘變處理，包括，通過非限制性實(shí)例的方法，DNA突變發(fā)生和組合酶形成，一種在共同待批的USPN5,830,696(Short等)中進(jìn)一步詳述的方法。
產(chǎn)生的新分子的酶活性然后用多種方法篩選，包括通過非限制性實(shí)例的方法a)分子生物包被；b)重組克隆篩選；和c)提取篩選。
6.3.16-在抗體生產(chǎn)中使用本發(fā)明提供了酶，及其片斷、其他衍生物和類似物，和表達(dá)它們的細(xì)胞，它們可以作為免疫原以產(chǎn)生其抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括了嵌合的，單鏈和人源化抗體，以及Fab片斷，或一個(gè)Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。在本領(lǐng)域已知的各種步驟可被用于這樣的抗體和片斷的產(chǎn)生。
對(duì)應(yīng)于本發(fā)明序列的酶產(chǎn)生的抗體可以通過將酶直接注射給一種動(dòng)物或?qū)⒚附o予一種動(dòng)物來獲得，優(yōu)選非人動(dòng)物。然后這樣獲得的抗體將與酶本身結(jié)合。以這種方式，即使僅編碼酶的一個(gè)片斷的序列也可被用于產(chǎn)生與整個(gè)天然酶結(jié)合的抗體。這種的抗體然后可用于從表達(dá)該酶的細(xì)胞中分離酶。
為了制備單克隆抗體，可以使用任何通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供抗體產(chǎn)物的技術(shù)。實(shí)例包括可以產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975)，三瘤(trioma)技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，77-96頁)。
描述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(USPN4,946,778 Ladner等)可以用來產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性酶產(chǎn)物的單鏈抗體。而且，轉(zhuǎn)基因鼠也可被用來表達(dá)本發(fā)明的免疫原性酶產(chǎn)物的人源化抗體。
產(chǎn)生的抗本發(fā)明酶的抗體可被用于從其他生物體和樣品中篩選相似的酶。這種篩選技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的?？贵w也可被用作探針來篩選從這個(gè)或其他生物體中產(chǎn)生的基因文庫，以便鑒別這個(gè)或交叉的反應(yīng)活性。
在上述系統(tǒng)中產(chǎn)生的多肽的分離和純化可以采用適合特殊系統(tǒng)的常規(guī)方法進(jìn)行。例如，可以使用用于抗體，如單克隆或多克隆抗體，的制備性層析和免疫學(xué)分離。
如上所述，可以用于產(chǎn)生肌醇六磷酸酶特異抗體的抗原包括肌醇六磷酸酶多肽，如任何在
圖1多肽片斷中顯示的肌醇六磷酸酶。用于免疫動(dòng)物的多肽或肽可用標(biāo)準(zhǔn)的重組，化學(xué)合成，或純化方法來獲得。如在本領(lǐng)域中所熟知的，為了增加免疫原性，抗原可以與一種載體蛋白結(jié)合。通常使用的載體包括鑰孔血蘭素(KLH)，甲狀球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，和破傷風(fēng)類毒素。然后偶聯(lián)的肽用來免疫動(dòng)物(如，小鼠，大鼠或兔)。除了這樣的載體，已知的佐劑可以與抗原一起使用來加速強(qiáng)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。
肌醇六磷酸酶特異的多克隆和單克隆抗體可以被純化，例如通過與含有肌醇六磷酸酶多肽，如產(chǎn)生抗體的肌醇六磷酸酶多肽(或其片斷)，的基質(zhì)結(jié)合，并從中洗脫。其他抗體純化和濃縮的方法是本領(lǐng)域所熟知的，可以用本發(fā)明的肌醇六磷酸酶特異抗體進(jìn)行(見，如Coligan等，1996)。
對(duì)應(yīng)于肌醇六磷酸酶特異性抗原的抗遺傳型抗體也包括在本發(fā)明中，并可以采用標(biāo)準(zhǔn)的方法來產(chǎn)生。這些抗體是肌醇六磷酸酶特異性抗體，因此可以模仿肌醇六磷酸酶特異的抗原決定簇。本發(fā)明也包括肌醇六磷酸酶多肽片斷的其他應(yīng)用，該多肽保留了至少一個(gè)肌醇六磷酸酶特異活性或抗原決定簇。肌醇六磷酸酶活性可以通過檢測(cè)肌醇六磷酸酶對(duì)肌醇和游離磷酸的催化來進(jìn)行檢測(cè)。這樣的片斷可容易地通過比較
圖1中發(fā)現(xiàn)的肌醇六磷酸酶序列來鑒定。
在一個(gè)非限制性實(shí)例中，一個(gè)包含如至少8-10個(gè)氨基酸的肌醇六磷酸酶多肽片斷可以用作免疫原來產(chǎn)生肌醇六磷酸酶特異的抗體。片斷可以包含，例如，一個(gè)肌醇六磷酸酶保守的氨基酸序列，這個(gè)氨基酸序列可以包含肌醇六磷酸酶保守的氨基酸。在另一個(gè)非限制性的實(shí)例中，上述的肌醇六磷酸酶片斷可被用于免疫測(cè)定，如ELISAs，來檢測(cè)樣品中肌醇六磷酸酶特異抗體的存在。
6.3.17-在轉(zhuǎn)基因中使用可以使用多種制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。一般來說，可以采用三種這樣的方法。在一種這樣的方法中，一個(gè)處于單倍體核期(一個(gè)“單細(xì)胞胚胎”)的胚胎從雌性中獲得，轉(zhuǎn)基因被微注射到胚胎中，此時(shí)轉(zhuǎn)基因?qū)⒃谌旧w上整合到所得到的成熟動(dòng)物的胚細(xì)胞和體細(xì)胞中。在另一種這樣的方法中，分離胚胎干細(xì)胞，在其中通過電穿孔，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或微注射合并轉(zhuǎn)基因，然后將干細(xì)胞再導(dǎo)入胚胎中，在其中定植，形成種系。哺乳動(dòng)物種屬微注射的方法在美國專利第4,873,191中描述。在另一種這樣的方法中，胚胎細(xì)胞可以用含有轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來感染，其中胚胎的胚細(xì)胞具有在染色體上整合的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是鳥禽類時(shí)，因?yàn)轼B禽類受精卵一般在輸卵管的第一個(gè)24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分裂，由于單倍體核不能進(jìn)入，微注射入受精卵的單倍體核中是有問題的。因此，在總體上述的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染優(yōu)選對(duì)于鳥禽類種屬，例如在美國專利第5,162,215中所述的。但是，如果微注射用于鳥禽類種屬，可以使用Love等(Biotechnology，1994年1月12日)公開發(fā)表的步驟，其中胚胎在前一次產(chǎn)卵2.5小時(shí)后從處死的雌性鳥禽類中獲得，轉(zhuǎn)基因微注射入胚盤的細(xì)胞質(zhì)中，胚胎培養(yǎng)在宿主的殼中直至成熟。當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是?；蜇i時(shí)，微注射可以用卵的不透明來中止，這樣使核很難通過常規(guī)的相差顯微鏡來鑒定。為了克服這樣的問題，可以首先離心卵來分隔單倍體核以便更好的觀察。
發(fā)明中“非人動(dòng)物”指牛，豬，羊和鳥禽類動(dòng)物(如母牛，豬，綿羊，雞)。本發(fā)明的“轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物”是通過將“轉(zhuǎn)基因”導(dǎo)入非人動(dòng)物種系中產(chǎn)生的。在不同發(fā)育期的胚胎靶細(xì)胞可以用于產(chǎn)生靶基因。依靠胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育期來使用不同的方法。受精卵是微注射的最好靶目標(biāo)。將受精卵用作基因轉(zhuǎn)移靶目標(biāo)的主要優(yōu)點(diǎn)是在大多數(shù)情況下，注射的DNA將在首次分裂前整合到宿主基因中(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824438-4442，1985)。其結(jié)果，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的所有細(xì)胞將帶有合并的轉(zhuǎn)基因。一般來說，這也將在轉(zhuǎn)基因有效傳遞到首建者后代中反映，因?yàn)?0％的受精卵將藏有轉(zhuǎn)基因。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”用來描述一種在其所有細(xì)胞內(nèi)包括外源基因物質(zhì)的動(dòng)物。一種“轉(zhuǎn)基因”可以通過交叉配種兩種嵌合體動(dòng)物來產(chǎn)生，該動(dòng)物在復(fù)制中使用的細(xì)胞中包括外源基因物質(zhì)。得到的后代的25％將是轉(zhuǎn)基因的，即在其所有細(xì)胞的兩個(gè)等位基因中均包括外源性基因物質(zhì)，得到動(dòng)物的50％將在其一個(gè)等位基因中包括外源性基因物質(zhì)，25％將不包括外源基因物質(zhì)。
在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的微注射方法中，轉(zhuǎn)基因不要任何載體DNA而被消化和純化，如通過凝膠電泳。優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)啟動(dòng)子，后者與參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白相互作用，最后導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性表達(dá)。在這一方面中使用的啟動(dòng)子包括來自細(xì)胞巨化病毒(CMV)，莫洛尼白血病病毒(MLV)和皰疹病毒，以及那些來自編碼金屬硫蛋白，骨架肌動(dòng)蛋白，P-烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)，磷酸甘油酸鹽(PGK)，DHFR和胸苷激酶的啟動(dòng)子。也可以使用病毒長末端重復(fù)區(qū)(LTRs)的啟動(dòng)子，如羅斯肉瘤病毒。當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物是鳥禽類時(shí)，優(yōu)選的啟動(dòng)子包括雞β-球蛋白基因，雞溶菌酶基因和禽類白細(xì)胞增生病毒。在胚胎干細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中有用的構(gòu)建物將采用本領(lǐng)域中已知的其他調(diào)控元件，如刺激轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件，剪接受體，終止和聚腺苷酸化信號(hào)，和允許翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染也可如上所述用于將轉(zhuǎn)基因?qū)氲揭粋€(gè)非人動(dòng)物中。發(fā)育中的非人胚胎可以在體外培養(yǎng)到胚泡期。在此時(shí)間內(nèi)，分裂球可以是逆轉(zhuǎn)錄感染的目標(biāo)(Jaenich，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260-1264，1976)。分裂球的有效感染可以通過酶性處理去除透明帶來獲得(Hogan等(1986)在處理鼠胚，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。用來導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)典型地是載有轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826927-6931，1985；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 826148-6152，1985)。轉(zhuǎn)染可以通過在產(chǎn)生病毒的細(xì)胞單層上培養(yǎng)分裂球來很容易和有效地獲得。(Van der Putten，見上；Stewart等，EMBO J.6383-388，1987)?？梢赃x擇地，感染可以在后面的時(shí)期進(jìn)行。病毒或產(chǎn)生病毒的細(xì)胞可以被注射到囊胚腔中(D.Jahner等，Nature 298623-628，1982)。大多數(shù)先建立的是轉(zhuǎn)基因的嵌合體，因?yàn)檎蟽H發(fā)生在形成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞亞群中。進(jìn)一步，首建者可能含有各種在基因組不同位置的轉(zhuǎn)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒插入體，一般將在后代中分開。另外，也可能將轉(zhuǎn)基因通過對(duì)發(fā)育中的胚胎進(jìn)行子宮內(nèi)感染導(dǎo)入種系中，雖然有效性較低(D.Jahner等，見前)。
轉(zhuǎn)基因?qū)氲牡谌N類型靶細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ES)。ES細(xì)胞可以從體外培養(yǎng)的預(yù)先植入的胚胎中獲得，并與胚胎融合(M.J.Evans等，Nature292154-156，1981；M.O.Bradley等，Nature 309255-258，1984；Gossler等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 839065-9069，1986；和 Robertson等，Nature322445-448，1986)。轉(zhuǎn)基因可以通過DNA轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)被有效地導(dǎo)入ES細(xì)胞中。這種轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞此后與來自非人動(dòng)物的胚泡結(jié)合。然后ES定植胚胎，并形成所得嵌合體動(dòng)物的種系。(綜述見Jaenisch，R.，Science2401468-1474，1988)。
“轉(zhuǎn)化”指一種通過重組核酸技術(shù)的方法，被導(dǎo)入了(或進(jìn)入其前體細(xì)胞)異源核酸分子的細(xì)胞。“異源”是指一個(gè)核酸序列，來源于其他物種或在其來源形式或細(xì)胞中原本表達(dá)形式上被修飾。
“轉(zhuǎn)基因”指通過技巧插入到一個(gè)細(xì)胞中的DNA任何部分，并成為生物體基因組的一部分(即穩(wěn)定的整合或作為穩(wěn)定的染色體外成分)，該機(jī)體是從該細(xì)胞發(fā)育而來的。這樣一個(gè)轉(zhuǎn)基因可能包括一個(gè)與轉(zhuǎn)基因生物體部分或全部異源(即外來的)的基因，或可代表與生物體內(nèi)源基因同源的一個(gè)基因。包括在這個(gè)定義中的是一個(gè)通過提供一個(gè)RNA序列建立的轉(zhuǎn)基因，該序列被轉(zhuǎn)錄進(jìn)入DNA，然后插入到基因組中。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因包括編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，并包括可在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物中表達(dá)的多核苷酸酸。這里所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”另外包括任何基因組已經(jīng)被改變的生物體，通過體外處理早期胚胎或受精卵，或通過任何轉(zhuǎn)基因技術(shù)，誘導(dǎo)特異基因敲除。在此所用的“基因敲除”是指在體內(nèi)靶向地破壞基因，并完全喪失功能，它可以通過本領(lǐng)域熟悉的任何轉(zhuǎn)基因技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有基因敲除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，靶基因已經(jīng)通過同源性重組將一個(gè)插入部分靶向到該基因而成為非功能性。如此所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括任何本領(lǐng)域熟悉的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，它可以產(chǎn)生一種生物體，該生物體載有一個(gè)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因或其中一個(gè)內(nèi)源基因已變?yōu)椤胺枪δ苄浴被颉扒贸薄?br> 在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的轉(zhuǎn)基因是一個(gè)包括編碼肌醇六磷酸酶或具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)具有如SEQ ID NO1中所示序列的多核苷酸酸或編碼具有如SEQ ID NO2中所示序列的多肽的序列是一個(gè)轉(zhuǎn)基因，如在此所定義的術(shù)語一樣。如果合適，編碼具有肌醇六磷酸酶活性蛋白的DNA序列，但在核酸序列上與因基因組代碼退化者不同，也可在此使用，以可能縮短的形式，等位基因突變體和種間同源物。
在胚胎被微注射，與轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行定植或被與含有轉(zhuǎn)基因的一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(除了在此其他部分闡述的本發(fā)明在禽類的實(shí)例)后，胚胎被植入一個(gè)假孕雌性的輸卵管中。其后代妊娠通過Southern斑點(diǎn)雜交分析檢測(cè)血或采用轉(zhuǎn)基因特異探針檢測(cè)組織樣品。PCR對(duì)這種目的的實(shí)施特別有用。陽性妊娠(G0)進(jìn)行雜交產(chǎn)生后代(G1)，它可以通過組織樣品的Northern斑點(diǎn)雜交來分析轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
因此，本發(fā)明包括增加轉(zhuǎn)基因動(dòng)物磷攝取和/在轉(zhuǎn)基因生物體中減少污染量大約15％，典型的大約20％，更典型的大約20％至大約50％的方法。
考慮在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的動(dòng)物一般被認(rèn)為是家養(yǎng)動(dòng)物，包括寵物(如犬，貓，鳥禽類等)和那些用于食品加工的動(dòng)物，即，鳥禽類如肉食和產(chǎn)蛋雞和火雞，羊如羔羊，牛如肉牛和奶牛，魚和豬。對(duì)于本發(fā)明的目的，當(dāng)這個(gè)動(dòng)物具有異源DNA序列，或一個(gè)或多個(gè)其他的在染色體上整合到動(dòng)物的胚細(xì)胞中的，正常為動(dòng)物內(nèi)源性的DNA(在此全部是指“轉(zhuǎn)基因”)的這些動(dòng)物被稱為“轉(zhuǎn)基因”的。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(包括其后代)也將具有偶然整合到體細(xì)胞染色體上的轉(zhuǎn)基因。
6.3.18-在基因傳遞中的使用在一些情況下，局部輸送和表達(dá)本發(fā)明的肌醇六磷酸酶序列可能是有優(yōu)勢(shì)的(如，在一種特殊的組織或細(xì)胞類型中)。例如，在動(dòng)物消化道中肌醇六磷酸酶或消化性酶的局部表達(dá)將分別有助于，例如，肌醇六磷酸酶和磷的消化和攝取。例如，核酸序列可能直接輸送到唾液腺，組織和細(xì)胞中和/或消化道的上皮細(xì)胞層。這樣的輸送方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括電穿孔，病毒載體和直接DNA攝取。任何具有肌醇六磷酸酶活性的多肽可以在本發(fā)明的方法中應(yīng)用(如，那些在本節(jié)6.3.18中特別描述的，以及在發(fā)明中其他章節(jié)中所描述的)。
例如，本發(fā)明的一個(gè)核酸構(gòu)建物將包括適合在一種宿主組織中攝入靶細(xì)胞形式的核酸分子。核酸分子可能以裸DNA或RNA分子的形式，其中分子可能包括一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因，反義鏈，能夠形成三倍體的鏈，或類似物。一般，核酸構(gòu)建物將包括至少一個(gè)在合適調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制下的結(jié)構(gòu)基因。更常見的是，本發(fā)明的核酸構(gòu)建物將包括加入一個(gè)輸送載體中以提高轉(zhuǎn)染效率的核酸，其中的輸送載體將分散于更大的顆粒中，該顆粒包括一種干燥的親水賦形劑材料。
一種這樣的輸送載體由病毒載體組成，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺相關(guān)病毒，它們已經(jīng)被滅活以防止自我復(fù)制，但保持了與靶宿主細(xì)胞結(jié)合的天然病毒能力，將基因物質(zhì)輸送到靶宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并促進(jìn)結(jié)構(gòu)或已被摻入到顆粒中的其他基因的表達(dá)。介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在Kahn等，(1992)CIRC.RES.711508-1517中描述，它的公開在此加入作為參考。一個(gè)合適的腺病毒基因傳遞在Rosenfeld等(1991)SCIENCE 252431-434中描述，它的公開在此加入作為參考。逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒傳遞系統(tǒng)在Friedman(1989)SCIENCE2441275-1281中均有描述，它的公開在此加入作為參考。
第二種核酸傳遞載體由脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染囊泡組成，包括陰離子和陽離子脂質(zhì)體構(gòu)建物。陰離子脂質(zhì)體的使用需要核酸包被在脂質(zhì)體中。陽離子脂質(zhì)體不需要核酸包被其中，而代之以通過核酸和脂質(zhì)體的簡(jiǎn)單混合就可以形成。陽離子脂質(zhì)體熱烈地結(jié)合到陰性電荷的核酸分子，包括DNA和RNA，產(chǎn)生復(fù)合體，在許多細(xì)胞類型中產(chǎn)生適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染效率。見，F(xiàn)arhood等(1992)BIOCHEM.BIOPHYS.ACTA.1111239-246，它的公開在此加入作為參考。形成脂質(zhì)體囊泡的一種特別優(yōu)選的材料是lipofectin，它由二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二油酸羥丙基-N-三乙氨基乙醇(DOTMA)組成，如在Felgner和Ringold(1989)NATURE 337387-388中所述，它的公開在此引入作為參考。
也可能將這兩種傳遞系統(tǒng)聯(lián)合。例如，Kahn等(1992)，見上，講授了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可與一種陽離子DEAE-葡聚糖囊泡結(jié)合以進(jìn)一步增強(qiáng)轉(zhuǎn)化效率。也可能將核蛋白并入病毒和/或脂質(zhì)體傳遞囊泡中，以進(jìn)一步改善轉(zhuǎn)染效率。見，Kaneda等(1989)SCIENCE 243375-378，它的公開在此引入作為參考。
6.3.19-在飲食輔劑中的使用在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種含有作為單一活性成分或與一種或多種其他制劑和/或酶組合的酶的消化性輔劑(如在待批的申請(qǐng)，美國系列號(hào)第____中所描述的，題目為“飲食輔劑及其使用方法”，2000年5月25日提交，其公開部分在此整體引入作為參考)。在家畜或家養(yǎng)動(dòng)物的消化輔劑中使用酶和其他制劑不僅改善了動(dòng)物的健康和預(yù)期壽命，還有助于增加家畜的健康，并從家畜中產(chǎn)生食品。
目前，一些類型的家畜飼料(如某些家禽飼料)大量地添加了大量礦物質(zhì)(如無機(jī)磷)，酶，生長因子，藥物，和其他輸送給家畜的制劑。這些添加物，例如，可以替代了許多在谷物中存在的卡路里和天然營養(yǎng)物。
通過從飼料本身減少或消除無機(jī)磷添加物和其他添加物(如微量礦物鹽，生長因子，酶，抗生素)，飼料將能夠帶來更多的營養(yǎng)和能量。相應(yīng)地，剩余的飲食中將含有更多可利用的能量。例如，谷物—含油種子餐膳食一般每公斤飲食含有大約3,200kcal可代謝能量，礦物鹽不提供任何可代謝能量。因此去除不需要的礦物質(zhì)，以谷物代替之將增加飲食中可利用的能量。因此本發(fā)明將不同于通常使用的含有肌醇六磷酸酶的飼料。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了一種可以抵抗生物體胃腸道消化的生物相容性物質(zhì)。
在許多生物體中，包括，例如，家禽或鳥類，如，例如雞，火雞，鵝，鴨，鸚鵡，孔雀，鴕鳥，野雞，鵪鶉，鴿，鴯鹋，幾維，潛鳥，澳州鸚鵡，美冠鸚鵡，金絲雀，企鵝，火烈鳥和鴿子，消化道包括儲(chǔ)存和使用硬的生物相容物體(如，巖石和含殼魚的殼)的胗來幫助消化種子或其他鳥食用的種子。這個(gè)生物體大家族的典型的消化道，包括含有稱為嗉囊的袋的食道，食物在其中保存較短的時(shí)間。從嗉囊，食物下移到真正的胃中，或前胃中，在此鹽酸和胃蛋白酶開始消化的過程。下一步，食物轉(zhuǎn)移到胗中，胗為卵圓形、厚壁且具有強(qiáng)有力的肌肉。胗的主要功能是研磨和破碎食物顆?！粋€(gè)通過鳥類吞入小量精細(xì)的碎石和砂礫來輔助的過程。從胗，食物轉(zhuǎn)移到十二指腸中。鳥類的小腸與哺乳動(dòng)物類似。有兩個(gè)大約4-6英寸長的盲袋或盲腸在小腸和大腸的連接處。大腸很短，大多由長度約為3-4英寸的直腸組成。直腸排空到泄殖腔中，糞便通過排泄口排出。
在胗內(nèi)食用的(或另外引入的)和存在的硬質(zhì)、生物相容的物體提供了一個(gè)傳遞各種酶、化學(xué)的、治療性的和抗生素藥劑的有用載體。這些硬物質(zhì)的壽命周期為數(shù)小時(shí)至數(shù)天，并在一段時(shí)間后通過。因此，本發(fā)明提供了包被的、飽和的(如飽和的基質(zhì)和膜)重建飲食輔劑以輸送有用的消化或治療藥物到一種生物體中。這種飲食輔劑包括特定地被生物體攝取以輔助胗內(nèi)消化的物質(zhì)(如巖石或沙礫)。本發(fā)明提供了其上包被或其內(nèi)飽和了藥劑的生物相容物體，它可用于生物體的消化輔劑或用于輸送治療性或藥用物質(zhì)或化學(xué)制劑。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有生物相容成分的飲食輔劑，其生物相容成分設(shè)計(jì)為釋放輔助消化的藥劑，其中生物相容成分設(shè)計(jì)為經(jīng)口食用并在生物體的消化道(如胃)內(nèi)釋放。“生物相容”是指該物質(zhì)在與宿主機(jī)體(如鳥)接觸時(shí)不引起足以導(dǎo)致該物質(zhì)排斥或使其失效的有害反應(yīng)。這種失效性的發(fā)生可通過如，在該物質(zhì)周圍形成纖維性結(jié)構(gòu)限制飽和的藥劑彌散到宿主機(jī)體內(nèi)，或形成因毒性或感染而導(dǎo)致機(jī)體死亡率或發(fā)病率增加的物質(zhì)。生物相容的物質(zhì)可以是非生物可降解的或是生物可降解的。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容的成分對(duì)胃腸道的降解或消化具有抵抗性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容的成分具有巖石或石頭的密度。
用于本發(fā)明的非生物可降解的材料是一種允許飲食輔劑附著或飽和的物質(zhì)。這種非生物可降解的材料包括，例如，熱塑性塑料如丙烯酸類、變性聚丙烯睛、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜和聚偏二氟乙烯。合成橡膠也是可用的材料并包括，例如，聚酰胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚乙烯醇和硅樹脂(如以硅為基礎(chǔ)的或含二氧化硅)。本發(fā)明提供了可以包括這些原料的生物相容的成分，它們可以被諸如混合或?qū)踊孕纬苫旌衔?、聚合物或它們兩者的組合。
如這里所用，一種“生物可降解的”材料是指將在體內(nèi)浸蝕或降解以形成較小化學(xué)物的成分。降解可通過如酶的、化學(xué)的或物理的方法而發(fā)生?？紤]在本發(fā)明中使用的合適的生物可降解材料包括聚(交酯)類、聚(甘油酯)類、聚(乳酸)類、聚(乙醇酸)類、聚原酸酯類、聚醚酯類、聚己酸內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯。這些材料可被混合或?qū)踊孕纬苫旌衔?、聚合物或它們兩者的組合。
幾種不同的生物相容物質(zhì)可同時(shí)地或以各種組合的方式(如，在另一種之前的一種物質(zhì))被攝取或另外提供給同一種生物體。另外，生物相容的物質(zhì)可被設(shè)計(jì)為緩慢通過消化道。例如，大的或脂肪物質(zhì)傾向于更慢地通過消化道，因而可以使用具有大體積的生物相容材料以防止快速通過消化道。這種大物質(zhì)可以是非生物可降解與生物可降解物質(zhì)的結(jié)合體。例如，一種小的非生物可降解的物質(zhì)被生物可降解的物質(zhì)包圍，這樣經(jīng)過一段時(shí)間，生物可降解部分將被降解，使非生物可降解部分得以通過消化道。此外，公認(rèn)的是，任何數(shù)目的調(diào)味料可供給生物相容的物質(zhì)以輔助食用。
任何數(shù)目的試劑單獨(dú)或與其它試劑結(jié)合，可被包被在生物相容的物質(zhì)上，后者包括例如多肽(如酶、抗體、細(xì)胞因子或治療性小分子)和抗生素。特殊的有用試劑的例子列于下面表1和2。還考慮到，細(xì)胞可被封裝進(jìn)本發(fā)明的生物相容材料內(nèi)，并用于輸送酶或治療藥。例如，可以設(shè)計(jì)多孔的物質(zhì)，其孔的大小足以讓細(xì)胞在其中生長和通過，然后這些多孔材料可被服用進(jìn)消化道。例如，生物相容的物質(zhì)可包括大多數(shù)的微生態(tài)環(huán)境(如不同的孔隙度、pH等)以為大多數(shù)細(xì)胞類型提供支持。細(xì)胞可以是經(jīng)基因工程設(shè)計(jì)的以輸送特殊的藥物、酶或化學(xué)藥物到機(jī)體。細(xì)胞可以是真核的或原核的。
表1
表2.治療制劑
某些藥物可被設(shè)計(jì)成在一定的條件下(如在一定的pH下、存在激活劑等)活化或失活。另外，在本發(fā)明的成分中應(yīng)用酶原是有益的。例如，酶原可被一種蛋白酶活化(如在消化道內(nèi)存在的或人工導(dǎo)入機(jī)體消化道的唾液蛋白酶)。預(yù)期，用本發(fā)明的生物相容成分傳遞的藥物可通過添加激動(dòng)劑而被活化或失活，后者可由機(jī)體攝取或另外傳遞給機(jī)體。另一種在消化道內(nèi)控制藥物的機(jī)制是一種環(huán)境敏感劑，它在消化道的適當(dāng)部位被活化。例如，一種藥物可在低pH失活但在中性pH活化。因而，該藥物將在胃管內(nèi)無活性但在腸道內(nèi)活化?？蛇x擇地，藥物可對(duì)存在微生物特異因子(如存在于腸道的微生物)反應(yīng)而變得有活性。
總之，本發(fā)明的潛在益處包括，例如(1)在動(dòng)物(包括魚)每日飼料或谷物中使用礦物補(bǔ)充料(如無機(jī)磷補(bǔ)充劑)、酶或治療藥物的需要減少或可能消除，從而增加飼料中的熱量和營養(yǎng)素，和(2)增強(qiáng)家養(yǎng)和非家養(yǎng)動(dòng)物的健康和生長，包括如家禽、豬、牛、馬、犬和貓科動(dòng)物。
大量的酶可被用于本發(fā)明的方法和成分。這些酶包括食用食物的完全消化或完全代謝、經(jīng)消化道傳遞給動(dòng)物的化合物、前體藥物或其它藥物或化合物的活化或誘導(dǎo)所必需的酶?？杀粋鬟f或摻入本發(fā)明成分中的酶的例子包括，例如，飼料強(qiáng)化酶包括α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶、特別是乳糖酶，肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶、特別是內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纖維素酶，木糖苷酶，半乳聚糖酶、特別是阿拉伯糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖內(nèi)-1，3-β-半乳糖苷酶，葡聚糖內(nèi)切酶、特別是內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶和內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶、特別是果膠酶，果膠甲酯酶，果膠裂合酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖酶，鼠李糖半乳糖酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果膠酸裂合酶，和α-galacturonisidases，甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，樹膠木聚糖酶和脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶和角質(zhì)酶。在SEQ ID NO1和2及下面表3陳述的肌醇六磷酸酶是優(yōu)選的。表3中描述的序列是具有如這里所述的氨基酸取代和核苷酸取代的SEQ ID NO1和2。
表3
用于本發(fā)明的酶可被修飾以增強(qiáng)其活性、輸送、激活和降解。這種修飾可在體內(nèi)或體外進(jìn)行，并使用如下更充分描述的本領(lǐng)域一般知道的方法和步驟。這種方法通常采用自動(dòng)化機(jī)器合成的、或克隆表達(dá)的、或用重組DNA技術(shù)控制的多核苷酸或多肽序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明成分中使用的酶是對(duì)熱穩(wěn)定、耐熱并催化肌醇六磷酸酶水解的肌醇六磷酸酶，即該酶能夠在短暫的(即5至30秒)或較長時(shí)間，如數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)，暴露于50℃以上溫度后復(fù)性或獲得活性。
“飼料”和“食物”分別是指任何天然或人工的飲食、膳食或類似物，或打算或適于分別被動(dòng)物和人類吃、服、攝取的這些膳食的成份。這里所用的“飲食輔劑”是指，例如，含有供給動(dòng)物或機(jī)體治療藥或消化劑藥物的組合物?！帮嬍齿o劑”典型地不是機(jī)體熱量的來源，換句話說，飲食輔劑典型地不是機(jī)體能量的來源，而是在典型的“飼料”或“食物”之外服用的組合物。
藥物或酶(如肌醇六磷酸酶)可分別在體外或體內(nèi)發(fā)揮作用，即在服用前或在機(jī)體的胃或胃管中。而且也可能聯(lián)合作用。
盡管任何酶可被摻進(jìn)飲食輔劑中，這里參考肌醇六磷酸酶作為本發(fā)明方法和成分的范例。本發(fā)明的飲食輔劑包括酶(如肌醇六磷酸酶)?？傮w上，含有肌醇六磷酸酶成分的飲食輔劑為液體或干性的。
液體組分不需要含有除酶(如肌醇六磷酸酶)以外的任何成分，優(yōu)選為高純度形式。然而，通常還加入穩(wěn)定劑如甘油、山梨醇或單丙烯乙二醇。液體組分也可含其它添加劑如鹽、糖、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、蛋白、肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸酶底物)。代表性的液體組分是水或油質(zhì)的淤泥。液體組分可被加入生物相容的成份中以緩慢釋放。優(yōu)選地，酶加入生物相容材料(如生物可降解的或非生物可降解的)的飲食輔劑結(jié)構(gòu)中，包括其中添加了重組體細(xì)胞者，如多孔玻璃細(xì)珠。
干性組分可以是噴霧干燥的組分，在這種情況下該組分不需含干性狀態(tài)的酶以外的任何成分。然而，干性組分通常是所謂的顆粒，易于與食物或塑料混合，或更優(yōu)選地，形成一種預(yù)混合的成分。酶顆粒的粒度大小優(yōu)選為與混合物中其它成分相當(dāng)?；蛘邽閷⒚笓饺雱?dòng)物飼料中提供了一種安全和方便的方法。優(yōu)選地，這些顆粒是生物相容的，更優(yōu)選地，他們是非生物可降解的生物相容顆粒。
被酶包被的凝集顆?？刹捎媚奂夹g(shù)在一種高速剪切混合器內(nèi)制備，吸收顆粒通過具有載體材料核心而制備以吸收/被酶包被。優(yōu)選地，載體材料是生物相容的非生物可降解材料，以模擬動(dòng)物胗內(nèi)石頭和沙礫的作用。用于凝聚技術(shù)的代表性填充材料包括鹽，如硫酸鈉。其它填充料是高嶺土、滑石粉、硅酸鋁鎂和纖維素纖維。粘合劑如糊精也可隨意地包含在凝集顆粒中。載體材料可以是任何生物相容的材料包括生物可降解的和非生物可降解的材料(如巖石、石頭、陶瓷、各種多聚物)。顆粒被覆蓋混合物隨意地包被。這種混合物包括涂布劑，優(yōu)選疏水性涂布劑如氫化棕櫚油和牛脂，如果需要的其它添加劑如碳酸鈣或高嶺土。
此外，飲食輔劑成分(如肌醇六磷酸酶飲食輔劑成分)可含有其它替代物如著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物、其它飼料或食品強(qiáng)化酶等。代表性的添加劑通常包括一種或多種化合物如維生素、礦物或飼料強(qiáng)化酶和適當(dāng)?shù)妮d體和/或賦形劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的飲食輔劑成分另外包括有效量的一種或多種飼料強(qiáng)化酶，特別是下面的飼料強(qiáng)化酶α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶、特別是乳糖酶，其它肌醇六磷酸酶，β-葡聚糖酶、特別是內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)-β-1，3(4)-葡聚糖酶，纖維素酶，木糖苷酶，半乳聚糖酶、特別是阿拉伯糖內(nèi)-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖內(nèi)-1，3-β-半乳糖苷酶，葡聚糖內(nèi)切酶、特別是內(nèi)-1，2-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1，3-α-葡聚糖酶和內(nèi)-1，3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶、特別是果膠酶，果膠甲酯酶，果膠裂合酶，多聚半乳糖醛酸酶，阿拉伯糖酶，鼠李糖半乳糖酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李聚糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶，果膠酸裂合酶，和α-galacturonisidases，甘露聚糖酶，β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白酶，木聚糖酶，arabinoxylanases和脂肪分解酶如脂肪酶、磷脂酶和角質(zhì)酶。
本發(fā)明的飲食輔劑是在進(jìn)食前或同時(shí)補(bǔ)充給單胃動(dòng)物的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的飲食輔劑是與飲食同時(shí)補(bǔ)充給單胃動(dòng)物的。在另一種實(shí)施方案中，飲食輔劑以顆?；蚍€(wěn)定的液體形式添加進(jìn)飲食中。
本發(fā)明的飲食輔劑中，酶的有效劑量是從大約10-20,000；優(yōu)選大約10-15,000，更優(yōu)選大約10-10,000，特別是大約100-5,000，尤其是大約100-2,000FYT/kg飲食輔劑。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶其它特殊用途的實(shí)例是大豆加工和肌醇及其衍生物的生產(chǎn)。
本發(fā)明還涉及一種降低動(dòng)物肥料中肌醇六磷酸鹽水平的方法，這里的動(dòng)物喂食了含本發(fā)明的有效劑量肌醇六磷酸酶的飲食輔劑。如在本申請(qǐng)開始中所闡述的，由此的一個(gè)重要作用是減少了環(huán)境的肌醇六磷酸鹽污染。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，飲食輔劑是磁性載體。例如，一種有酶(如肌醇六磷酸酶)分布在其內(nèi)、其上或其間的磁性載體(如多孔的磁珠)，可分布在一種高肌醇六磷酸鹽的區(qū)域內(nèi)，并在一段時(shí)間后被磁體收集。這種小珠的分布和重回收減少了額外的污染并使小珠可以重新利用。此外，這種磁珠的體內(nèi)應(yīng)用使得飲食輔劑定位于消化道內(nèi)的一點(diǎn)，例如肌醇六磷酸酶活性可以發(fā)揮的地方。例如，在動(dòng)物食用磁載體飲食輔劑后，通過在動(dòng)物胃旁邊并列一種磁體可以將本發(fā)明的含消化酶的飲食輔劑定位在動(dòng)物胃。磁體在一段時(shí)間后可被撤走，使得飲食輔劑通過消化道。此外，磁載體在處死后適合去除或輔助收集。
當(dāng)飲食輔劑是多孔顆粒時(shí)，這種顆粒典型地為期望緩慢釋放的物質(zhì)充滿以形成緩釋顆粒。這種緩釋顆粒不僅可通過將期望釋放的物質(zhì)攝取多孔顆粒而制備，而且可通過將需要的物質(zhì)首先溶入第一分散相而制備。在此情況下，采用要釋放的物質(zhì)首先溶入第一分散相方法而制備的緩釋顆粒也在本發(fā)明的范疇和精神內(nèi)。例如，中空的多孔顆粒可被緩釋物質(zhì)充滿，如醫(yī)用藥、農(nóng)藥或酶。特別是，當(dāng)充滿酶的中空多孔顆粒是由生物可降解的聚合物制造時(shí)，顆粒本身可用作農(nóng)藥或肥料，且它們對(duì)環(huán)境沒有副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，多孔顆粒實(shí)際上是有磁性的。
中空的多孔顆?？杀挥米魃锓磻?yīng)器支架，特別是酶支架。因此，采用緩釋方法制備飲食輔劑是有益的，例如，通過將作用物酶包裹在微囊泡如脂質(zhì)體內(nèi)，藥劑在數(shù)天的過程中從其中釋放，優(yōu)選地大約3-20天。可選擇地，藥物(如酶)可被設(shè)計(jì)為緩慢釋放，例如加入緩釋聚合物中，從中藥物(如酶)劑量在數(shù)天過程中緩慢釋放，例如2至30天，而且其范圍可以與動(dòng)物生命平行。
如本領(lǐng)域已知的，脂質(zhì)體一般來自磷脂或其他脂類物質(zhì)。脂質(zhì)體由分散在水性介質(zhì)中的單-或多層含水液體結(jié)晶形成。任何可形成脂質(zhì)體的非毒性、生理學(xué)可接受和可代謝脂類均可應(yīng)用。本脂質(zhì)體形式的成分除藥物外可包含穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，包括天然和合成的。形成脂質(zhì)體的方法為本領(lǐng)域所知。見，例如，Prescott主編，細(xì)胞生物學(xué)方法，XIV卷，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33頁及以下等。
在制備食品或飼料制劑或添加劑方法中應(yīng)用本發(fā)明的肌醇六磷酸酶也在本發(fā)明的范疇內(nèi)，即肌醇六磷酸酶僅在加工過程中發(fā)揮其肌醇六磷酸酶活性，而在最終食品或飼料產(chǎn)品中沒有活性。例如此方面與生面團(tuán)制作和烘焙相關(guān)。因而，肌醇六磷酸酶或重組體酵母表達(dá)的肌醇六磷酸酶可被加入磁性載體之內(nèi)、之上或之間，分布在生面團(tuán)或食品媒介中，并被磁體收回。
本發(fā)明的飲食輔劑可用生物相容的(如生物可降解的或非生物可降解的)載體單獨(dú)給予動(dòng)物，或與其它消化添加劑一起使用。由此，本發(fā)明的飲食輔劑可以容易地作為頂肥給予，或直接將其混合進(jìn)動(dòng)物飼料，或通過單獨(dú)口服、注射或經(jīng)皮方式與飼料分開供給，或與其它生長相關(guān)的可食用化合物組合，在組合中每種化合物的比例依據(jù)特定的機(jī)體或要解決的問題和所希望的反應(yīng)程度而定。應(yīng)當(dāng)理解，在任何給定情況下給予的特殊飲食劑量將根據(jù)要給予的特定化合物、要處理的問題、受者的狀態(tài)和其它可能改變有效成分活性或受者反應(yīng)的相關(guān)實(shí)際而被調(diào)整，正如本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員所熟知的那樣。大體上，可使用單次每日劑量或分開的每日劑量，如本領(lǐng)域熟知的。
如果與動(dòng)物飼料分開給予，飲食輔劑的形式可通過將其與非毒性藥學(xué)可接受的可食用載體結(jié)合而制成速釋或緩釋劑型，如本領(lǐng)域熟知的。這種可食用載體可以是固體或液體，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆碎片、花生油、橄欖油、芝麻油和丙二醇。如果使用固體載體，化合物的藥劑形式可能是片劑、膠囊、粉劑、錠劑或糖錠或以微型可分散形式的頂肥。如果使用液體載體，藥劑形式可能是軟凝膠膠囊、或糖漿或液體懸液、乳劑或溶液。藥劑形式還可包含佐劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕或乳化劑、溶液輔劑等。它們也可包含其它有治療價(jià)值的物質(zhì)。
因此，本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)包括，例如1)輕松生產(chǎn)帶有生物相容組分的活性成分；2)由于其涉及的聚合物和/或可能使用的活性成分種類而具有多功能性；3)高產(chǎn)量和裝載效率；和4)提供在體內(nèi)釋放活性、完整活性藥物的持續(xù)釋放制劑，因而在延伸的時(shí)間范圍內(nèi)提供活性藥物的控制釋放。此外，另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在機(jī)體消化道內(nèi)(如胃)局部傳遞藥物。如這里所用的短語“包含在其中”代表一種方法，以將藥物設(shè)計(jì)為用于在藥物延伸的時(shí)間范圍內(nèi)控制釋放的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的持續(xù)釋放或緩釋結(jié)構(gòu)中，將使用有效劑量的藥物(如酶或抗生素)。如這里所用的，持續(xù)釋放或緩釋是指藥物在延伸的時(shí)間范圍內(nèi)從一種生物相容的材料中釋放。持續(xù)釋放可以是連續(xù)的或不連續(xù)的、線性的或非線性的，它可以采用一種或多種生物可降解或非生物可降解的結(jié)構(gòu)、裝載藥物、選擇賦形劑或其它修飾而實(shí)現(xiàn)。然而，要認(rèn)識(shí)到，可能希望提供“快速”釋放結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)備一旦被機(jī)體食用就迅速釋放。還要理解，“釋放”并不一定指藥物從生物相容載體中釋放。更確切地，在一個(gè)實(shí)施方案中，緩釋包括存在于生物相容組分上的藥物緩慢激活或連續(xù)激活。例如，肌醇六磷酸酶不必從生物相容組分上釋放而起效。在此實(shí)施方案中，肌醇六磷酸酶在生物相容組分上固定不動(dòng)。
動(dòng)物飼料可以是通常用于滿足動(dòng)物飲食需要的任何含蛋白的有機(jī)膳食。許多這種含蛋白膳食典型地主要包括玉米、大豆粉或玉米/大豆粉混合。例如，喂食家禽的代表性商業(yè)銷售產(chǎn)品包括Land O’Lakes AG Services的家禽飼料產(chǎn)品EggMaker Complete、和Agwa，Inc的產(chǎn)品Country Game&Turkey Grower(也見PhilipMinnaar和Maria Minnaar的The Emu Farmer的手冊(cè))。這些商業(yè)銷售的產(chǎn)品都是動(dòng)物飼料的代表性例子，本飲食輔劑和/或肌醇六磷酸酶可被摻入其中以減少或消除在這種組成中需要攝入的磷、鋅、鎂和鐵的補(bǔ)充量。
本發(fā)明可應(yīng)用于許多動(dòng)物的飲食，這里定義為包括哺乳動(dòng)物(包括人)、家禽和魚。特別是，該飲食可被用于商業(yè)上重要的哺乳動(dòng)物如豬、牛、綿羊、山羊、實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物(大鼠、小鼠、倉鼠和沙鼠)、被毛動(dòng)物如貂和狐貍、動(dòng)物園動(dòng)物如猴和猿、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物如貓和狗。代表性的商業(yè)上重要的鳥禽類包括雞、火雞、鴨、鵝、野雞、鴯鹋、鴕鳥、潛鳥、幾維、鴿子、鸚鵡、澳洲鸚鵡、大冠鸚鵡、金絲雀、企鵝、火烈鳥和鵪鶉。商業(yè)養(yǎng)殖的魚如鱒魚也受益于這里公開的飲食輔劑。其它能受益的魚包括，例如食用魚(特別是在魚池或魚缸培育環(huán)境下，如熱帶魚)、金魚和其它觀賞性鯉魚、鯰魚、鱒魚、鮭魚、鯊魚、鷂魚、比目魚、鰨魚、羅非魚、青鳉、虹鳉、任一種帆鰭鱸、新月魚、劍尾魚、斑魚和泥鰍。
除非另外聲明，如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatus，1989描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。下面的實(shí)例是想舉例說明，并不是限制本發(fā)明。雖然實(shí)例中描述的方法是可被用以執(zhí)行本發(fā)明某一方面者的代表，但本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法也可使用。
實(shí)例1肌醇六磷酸酶的分離、細(xì)菌表達(dá)和純化大腸桿菌B基因組DNA從Sigma獲得(目錄號(hào)#D-2001)，St.Louis，New Jersey.下面的引物用于對(duì)直接來自基因組DNA基因的PCR擴(kuò)增。
5’引物 gtttctgaattcaaggaggaatttaaATGAAAGCGATCTTAATCCCATT(SEQIN NO3)；和3’引物 gtttctggatccTTACAAACTGCACGCCGGTAT(SEQ IN NO4)PCR反應(yīng)中的Pfu聚合物酶和擴(kuò)增按照制造商手冊(cè)進(jìn)行(Stratagene CloningSystems，Inc.，La Jolla，CA)。
PCR產(chǎn)物被純化，純化的產(chǎn)物和pQE60載體(Qiagen)均按照制造商手冊(cè)用EcoRI和BglII限制性核酸內(nèi)切酶(New England Biolabs)消化。用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行過夜進(jìn)行連接反應(yīng)以產(chǎn)生pQE60。
擴(kuò)增的序列在框架內(nèi)插入編碼RBS的序列中。然后，連接反應(yīng)的混合物通過電穿孔被用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/pREP4(Qiagen，Inc.)。M15/pREP4含質(zhì)粒pREP4的多個(gè)拷貝，后者表達(dá)lacI阻遏物，還賦予卡那霉素抗性(Kanr)。質(zhì)粒DNA被分離并通過限制性分析確認(rèn)。含所需構(gòu)建物的克隆在補(bǔ)充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基內(nèi)過夜生長。O/N培養(yǎng)物被用來以1∶100至1∶250的比例接種給大培養(yǎng)基。該細(xì)胞生長至光密度600(O.D.600)0.4至0.6之間。然后加入IPTG(“異丙基-B-D-硫基半乳糖苷”)至終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物、清除P/O先導(dǎo)而誘導(dǎo)基因表達(dá)的增加。細(xì)胞再生長3至4小時(shí)。然后通過離心收獲細(xì)胞。
上面陳述的引物序列還可通過上面描述的雜交技術(shù)用于從沉淀物質(zhì)中分離靶基因。
根據(jù)上面的講述，對(duì)本發(fā)明的許多修改和變化是可能的，因此，在所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可不特定描述實(shí)施。還要理解，雖然本發(fā)明已經(jīng)如上被進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但前面的描述是舉例說明，并不是限制本發(fā)明的范圍。另一方面，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和修改在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它這里提到的文獻(xiàn)被整體引用作為參考。
本發(fā)明也提供從所有其它大腸桿菌菌株(是有毒或無毒，包括K12，W，C)以及所有細(xì)菌分離和應(yīng)用肌醇六磷酸酶分子(核酸及其編碼的酶)。這些包括所有屬于以下的已知種屬和菌株棲熱袍菌屬(Thermotogales)綠色非硫磺細(xì)菌藻青菌屬&葉綠體低G+C革蘭氏—陽性細(xì)菌梭菌屬高G+C革蘭氏—陽性細(xì)菌Gytophaga/屈撓細(xì)菌/類桿菌屬組絲狀桿菌(Fibrobacteria)Spriochaetes浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)/衣原體屬組紫色細(xì)菌(Proteobacteria)包括以下亞門δ&ε，包括乙酸氧化脫硫單胞菌(Desulfuromonas acetoxidans)可變脫硫八疊球菌(Desulfosarcina variabilis)斯氏蛭弧菌侵蝕侏囊菌(Nannocystis exedens)橙色標(biāo)樁菌(Stigmatella aurantiaca)黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)sp.卵硫菌(Thiovulum sp.)空腸彎曲桿菌產(chǎn)琥珀酸沃林菌幽門纏繞桿菌α包括Methylobacterium extorquens印度拜葉林無氏菌(Beijerinckia indica)普通生絲微菌(Hyphomicrobium vulgare)土壤膨脹桿菌流產(chǎn)布氏桿菌五日熱羅卡利馬體海紅菌(Rhodopseudomonasmarina subsp.agilis)Zea mays-線粒體立式立克次體立式埃里希體尖音庫蚊沃爾巴克氏體(Wolbachia pipientis)邊緣無形體長赤細(xì)菌(Erythrobacter longus)需鹽紅螺菌(Rhodospirillum salexigens)莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)γ包括沙氏外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii)酒色著色菌(Chromatium vinosum)甲烷甲基單胞菌(Methylomonas methanica)
人心桿菌嗜麥芽黃單胞菌伯氏柯克斯體嗜肺軍團(tuán)菌嗜肺亞屬線型海洋螺菌(Oceanospirillum linum)乙酸鈣不動(dòng)桿菌綠膿假單胞菌流感嗜血桿菌副溶血弧菌普通變形桿菌胡蘿卜歐文菌大腸桿菌包括β包括齒蝕艾肯菌淋病奈瑟球菌Vitreoscilla stercoraria青色素桿菌糞產(chǎn)堿桿菌膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)睪丸酮假單胞菌歐洲亞硝化單胞菌迂回螺菌這種肌醇六磷酸酶分子可用已知的方法從這些細(xì)菌中分離，包括庫篩選方法如表達(dá)篩選，雜交方法，PCR(如，見Sammbrook，1989)。
7.引用的文獻(xiàn)(本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)的講授內(nèi)容在這里以文獻(xiàn)整體加入作為參考，除非另外說明。)Association of Official Analytical ChemistsOfficial Methods of Analysis.Associatoinof Official Analytical Chemists，Washingtong，DC.，1970.Ausubel FM等。分子生物學(xué)現(xiàn)代方法。Greene Publishing Assoc.，Media，PA.1987，1989，1992.Barnes WM從λ噬菌體模板高保真和高產(chǎn)量的對(duì)直至35-kb DNA的PCR擴(kuò)增。
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Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser20 25 30gtg gtg att gtc agt cgt cat ggt gtg cgt gct cca acc aag gcc acg 144Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr35 40 45caa ctg atg cag gat gtc acc cca gac gca tgg cca acc tgg ccg gta 192Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val50 55 60aaa ctg ggt tgg ctg aca ccg cgn ggt ggt gag cta atc gcc tat ctc 240Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu65 70 75 80gga cat tac caa cgc cag cgt ctg gta gcc gac gga ttg ctg gcg aaa 288Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys85 90 95aag ggc tgc ccg cag tct ggt cag gtc gcg att att gct gat gtc gac 336Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp100 105 110gag cgt acc cgt aaa aca ggc gaa gcc ttc gcc gcc ggg ctg gca cct 384Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro115 120125gac tgt gca ata acc gta cat acc cag gca gat acg tcc agt ccc gat 432Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln 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1.改善含肌醇六磷酸鹽食品營養(yǎng)價(jià)值的方法，包括以下步驟用實(shí)質(zhì)上純的肌醇六磷酸酶與所述的含肌醇六磷酸鹽的食品接觸，該肌醇六磷酸酶具有選自SEQ ID NO2的氨基酸序列，使得所述實(shí)質(zhì)上純的肌醇六磷酸酶催化無機(jī)磷從所述的含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中釋放。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的實(shí)質(zhì)上純肌醇六磷酸酶是通過含編碼肌醇六磷酸酶的核酸的重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的，該核酸具有選自下述序列的核苷酸序列a)SEQ ID NO1，和b)SEQ ID NO1其中T也可以是U；其中編碼肌醇六磷酸酶的核酸的表達(dá)導(dǎo)致所述實(shí)質(zhì)上純的肌醇六磷酸酶的產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無機(jī)磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，發(fā)生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之前。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無機(jī)磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，發(fā)生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之后。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無機(jī)磷從所述含肌醇六磷酸鹽食品中的肌醇六磷酸鹽中的釋放，部分發(fā)生于所述含肌醇六磷酸鹽食品被接受生物體攝取之前，部分發(fā)生于攝取之后。
6.權(quán)利要求2所述方法中使用的重組表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的重組表達(dá)系統(tǒng)包含在宿主細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)編碼具有SEQ ID NO2所述氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列，其中編碼所述的酶的核苷酸序列可操作地與所述宿主細(xì)胞內(nèi)可運(yùn)行的轉(zhuǎn)錄控制序列相連。
7.一個(gè)載體，包括權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)。
8.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述控制序列包括結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述控制序列包括組織特異的啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
11.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
12.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
13.權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的核苷酸序列之前是可操作地連接在所述核苷酸序列上的編碼一個(gè)信號(hào)肽的多核苷酸序列。
14.權(quán)利要求13所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述的信號(hào)肽是來自煙草的PR蛋白PR-S信號(hào)肽。
15.經(jīng)修飾的含有權(quán)利要求6所述表達(dá)系統(tǒng)的原核細(xì)胞。
16.經(jīng)修飾的含有權(quán)利要求6所述表達(dá)系統(tǒng)的真核細(xì)胞。
17.經(jīng)修飾的含有權(quán)利要求6所述表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞、植物部分或植物。
18.一種產(chǎn)生含微生物肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料的方法，包括a)在所述核苷酸序列被表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的植物細(xì)胞、植物部分或植物；和b)將所述的植物細(xì)胞、植物部分或植物轉(zhuǎn)變成適合動(dòng)物飼料的組分。
19.動(dòng)物飼料組合物，其包括權(quán)利要求17所述的植物種子、植物細(xì)胞、植物部分或植物與含肌醇六磷酸鹽的食品的混合物。
20.一種能夠通過外源肌醇六磷酸酶的活性增強(qiáng)消化而受益的治療人或動(dòng)物的方法，該方法包括給予所述的人或動(dòng)物一定量的轉(zhuǎn)基因植物的植物種子、植物細(xì)胞、植物部分或植物，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)修飾含有一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)以在所述人或動(dòng)物消化道內(nèi)提供有效量的肌醇六磷酸酶活性，表達(dá)編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸序列。
21.轉(zhuǎn)基因的非人生物體，其基因組包括編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的異種核酸序列，其中所述的轉(zhuǎn)基因?qū)е录〈剂姿崦付嚯牡谋磉_(dá)。
22.一種產(chǎn)生變異體的方法，包括獲得核酸，該核酸包括SEQ ID NO1中所述的序列，基本上與其相同的序列，與其互補(bǔ)的序列，包含其至少30個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，和包含SEQ ID NO1互補(bǔ)序列的至少30個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；和修飾所述序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸成為另一個(gè)核苷酸，刪除所述序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或添加給所述序列一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由選自下面的方法引導(dǎo)的錯(cuò)誤傾向PCR、移動(dòng)、寡核苷酸定向突變、組合PCR、有性PCR突變、體內(nèi)突變、盒式突變、循環(huán)集合突變、指數(shù)集合突變、位點(diǎn)特異的突變、連接重裝、GSSM和它們?nèi)魏蔚慕M合。
24.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由錯(cuò)誤傾向PCR引導(dǎo)的。
25.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由移動(dòng)引導(dǎo)的。
26.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由寡核苷酸定向突變引導(dǎo)的。
27.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由組合PCR引導(dǎo)的。
28.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由有性PCR突變引導(dǎo)的。
29.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由體內(nèi)突變引導(dǎo)的。
30.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由盒式突變引導(dǎo)的。
31.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由循環(huán)集合突變引導(dǎo)的。
32.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由指數(shù)集合突變引導(dǎo)的。
33.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述修飾是由位點(diǎn)特異的突變引導(dǎo)的。
34.具有其上儲(chǔ)存有下列核酸序列的計(jì)算機(jī)可讀媒體SEQ ID NO1中所述的核酸序列和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列和基本上與其相同的序列。
35.包括處理器和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存裝置的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中所述的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存裝置上儲(chǔ)存有SEQ ID NO1中所述的核酸序列和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列和基本上與其相同的序列。
36.權(quán)利要求35所述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，進(jìn)一步包括序列比較算法和其上至少儲(chǔ)存了一個(gè)參考序列的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存裝置。
37.權(quán)利要求36所述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中序列比較算法包括表示多形性的計(jì)算機(jī)程序。
38.權(quán)利要求35所述的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，進(jìn)一步包括鑒別所述序列特征的識(shí)別器。
39.一種將第一序列與參考序列或序列數(shù)據(jù)庫比較的方法，其中所述的第一序列是SEQ ID NO1中所述的核酸序列，和基本上與其相同的序列，或SEQ ID NO2中所述的多肽序列，和基本上與其相同的序列，該方法包括通過使用比較序列的計(jì)算機(jī)程序讀取第一序列和參考序列或序列數(shù)據(jù)庫；和用計(jì)算機(jī)程序確定第一序列和參考序列或序列數(shù)據(jù)庫之間的不同。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中確定第一序列和參考序列之間的不同包括鑒別多形性。
全文摘要
來源于大腸桿菌B的純化重組肌醇六磷酸酶。酶的分子量大約為47.1千道爾頓且有肌醇六磷酸酶活性。此酶可以從天然或重組宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生,可以用于幫助需要的肌醇六磷酸鹽消化。尤其是,本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可以在食品中應(yīng)用以改善富含肌醇六磷酸鹽成分的喂養(yǎng)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1351666SQ00808022
公開日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月25日
發(fā)明者J·M·肖特, K·A·克雷茨 申請(qǐng)人:戴弗薩公司