專利名稱：微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α，ω-二羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物同步發(fā)酵正烷烴生產(chǎn)長鏈α，ω-二元酸，尤其是發(fā)酵正十二烷(nC12)，高產(chǎn)十二碳二元酸(DC12)的方法。
長鏈二元酸是合成香料、尼龍工程塑料、熱熔膠、樹脂、耐寒性增塑劑等的重要原料。DC12是合成高級(jí)尼龍工程塑料尼龍12，尼龍1212和服裝用高檔尼龍熱熔膠的重要原料。尼龍12是目前國際上開發(fā)出來碳鏈最長，質(zhì)量最好，價(jià)格最高，年產(chǎn)量達(dá)到5萬噸的高級(jí)尼龍工程塑料。尼經(jīng)12是1966年由德國HüLs公司和瑞士Emser公司投產(chǎn)，后來法國、日本、美國也均有生產(chǎn)，他們多采用純化學(xué)方法，以丁二烯為原料，在高溫、高壓，催化劑條件下，經(jīng)過七個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)步驟生產(chǎn)的，步驟多，收率低，成本高，我國目前還不能生產(chǎn)。如果以DC12為原料合成尼龍12，只需經(jīng)過四個(gè)反應(yīng)步驟，條件溫和，步驟少，收率高，成本低，是競爭力最強(qiáng)的的合成方法。而DC12自然界中不存在，化工上又難以合成，因此，利用微生物特異的氧化能力，在常溫常壓下轉(zhuǎn)化石油中的正十二烷，生產(chǎn)DC12，開辟DC12的新來源，為尼龍12、尼龍1212和服裝用高檔熱熔膠的工業(yè)生產(chǎn)提供物美價(jià)廉的重要原料。
在專利文獻(xiàn)中，有從正十二烷發(fā)酵生產(chǎn)十二碳二元酸的實(shí)驗(yàn)例，但都是實(shí)驗(yàn)室水平。在US 4339536中，有生產(chǎn)DC12的實(shí)驗(yàn)例，但只達(dá)到45g/L水平，在CN1071951A中，其實(shí)驗(yàn)例2是異步發(fā)酵生產(chǎn)DC12，在3L自動(dòng)控制罐內(nèi)DC12達(dá)到102g/L，轉(zhuǎn)化率為75％。
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH-2-48，是以一株氧化正烷烴生產(chǎn)混合二元酸的熱帶假絲酵母(參見《微生物學(xué)報(bào)》20(1)88-93，1980)為出發(fā)菌株，通過亞硝酸和紫外線的多次反復(fù)誘變篩選培育出來的，能從C11-C17的各種單一正烷烴和混合正烷烴，尤其是正十二烷，高產(chǎn)出地生產(chǎn)相應(yīng)鏈長的二元酸。熱帶假絲酵母UH-2-48(以下簡稱UH-2-48)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0239。
本發(fā)明的種子培養(yǎng)基(1)10Be′糖度的麥芽汁加2％瓊脂制成的固體斜面；(2)10Be′糖度的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3)烷烴種子培養(yǎng)基包含KH2PO26-12g/L，酵母膏3-8g/L，蔗糖3-8g/L，玉米漿3-8g/L尿素3-6g/L，重蠟40-70ml/L，自來水配制，自然PH。
培養(yǎng)種子的過程為取一接種環(huán)UH-2-48酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上(15×180試管，每支裝6-7ml培養(yǎng)基，滅菌后放成斜面)，于29-30℃培養(yǎng)40小時(shí)。取一支上述培養(yǎng)好的UH-2-48菌種全部刮入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于29-30℃220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)40-48小時(shí)，作為搖瓶發(fā)酵種子或取兩支上述培養(yǎng)好的UH-2-48菌種全部刮入裝有500mL培養(yǎng)基的5000ml三角瓶中，于200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床29-30℃培養(yǎng)4-48小時(shí)，作為一級(jí)種子罐的種子。
用本發(fā)明的UH-2-48菌株生產(chǎn)長鏈二元酸，特別是十二碳二元酸的具體方法是把培養(yǎng)好的經(jīng)過鏡檢，沒有雜菌的菌種液接入PH5.5-9.0，最好是6.-6.8的含有15-30％(V/V)的C11-C17正烷烴和85-70(V/V)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽6-14g/L，最好為7-10g/L，氯化鈉0.5-2.0g/L，酵母膏1-6g/L，最好為3-5g/L，玉米漿0.5-2g/L，尿素0.5-2.5g/L，最好為1.0-2.0g/L，二甲基亞砜10-20ml/L，消泡劑400-1200PPm，重蠟或蔗糖15-30g/L及一些其他公知的營養(yǎng)源，在PH6.0-7.5下將上述混合物在25-34℃，最好在27-31℃通氣發(fā)酵72-170小時(shí)。在40或48小時(shí)之內(nèi)，體系PH控制在6.0-6.8，以菌體生長為主，同時(shí)產(chǎn)生一定數(shù)量的二元酸，48小時(shí)后，體系PH控制7.0-7.8之間，以發(fā)酵產(chǎn)酸為主。從72小時(shí)開始，每天補(bǔ)加一定量正烷烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終＞5％(V/V)。堿金屬磷酸鹽可從KH2P4，NaH2PO4，K2HPO4或Na2HPO4中選一種。
發(fā)酵結(jié)束后，加入適量的水，加堿至PH10-13，加熱至80-95℃，進(jìn)行破乳分層，上層殘油回收再用，放出中間清液，下層菌體層再處理一次或壓濾，合并清液，加入適量活性炭在85-90℃脫色30分鐘，除去活性炭后，脫色液加熱至70-80℃，加HCl或H2SO4至PH4-5進(jìn)行酸化結(jié)晶，冷卻至30℃，壓濾，空氣吹干，60-70℃烘干，得白色二元酸。
用本發(fā)明的UH-2-48菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)C11-C17的各種單-二元酸和混合二元酸。其中在3噸發(fā)酵罐內(nèi)，從nC12發(fā)酵生產(chǎn)DC12時(shí)，發(fā)酵130小時(shí)，產(chǎn)酸量高達(dá)145g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90％，后處理總收率達(dá)到80％以上，DC12純度達(dá)到95％以上。
實(shí)例1.
(1)取一接種環(huán)UH-2-48菌種，涂布在Ф15×180大試管麥芽汁固體斜面上，30℃培養(yǎng)兩天。
(2)取上述菌種一支，接入裝有25ml烷烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃在200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)46小時(shí)。烷烴種子培養(yǎng)基中KH2PO48g/L，酵母膏3g/L，玉米漿3g/L，蔗糖5g/L，尿素3g/L，重蠟50m/L，自來水配制，PH5.0，110℃滅菌30分鐘。
(3)在裝有15ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，接入3.5mL上述種子液，在200轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時(shí)用NaOH調(diào)一次PH至7.5-8.0。發(fā)酵培養(yǎng)基中含KH2PO48g/L，酵母膏2g/L，玉米漿1g/L，Nacl 1g/L，尿素1.2g/L，重蠟30ml/L，nC12200mL/L，自來水配制，PH7.3，在110℃滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用6moLHcl調(diào)PH至3.用乙醚提取，除去乙醚，得白色結(jié)晶，用標(biāo)準(zhǔn)NaoH溶液滴定，計(jì)算二元酸含量。結(jié)果DC12產(chǎn)量為61.6g/L，DC12純度97.83％。
實(shí)例2.
按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nC11結(jié)果DC11產(chǎn)量為46.5g/L，DC11純度為98.58％。
實(shí)例3.
按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nC14，不加重蠟，結(jié)果DC14產(chǎn)量72.3g/L，純度96.88％。
實(shí)例4.
按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nC17，DC17產(chǎn)量為54.1g/L，純度為97.27％。
實(shí)例5.
(1)種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法和發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)例1。
(2)把2000ml培養(yǎng)兩天，OD(×30，620nm)為0.61，PH3.8，健壯，無雜菌的UH-2-48種液接入裝有350L種子培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌40分鐘的500L種子罐中，29℃350轉(zhuǎn)/分，罐壓0.8kg/cm2，通氣量1∶0.8，培養(yǎng)48小時(shí)，作為發(fā)酵的種子。
(3)把(2)中培養(yǎng)的，健壯，無雜菌的350L種液接入裝有1800L發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121℃滅菌40分鐘的3000L發(fā)酵罐中，30℃，200轉(zhuǎn)/分，罐壓1kg/cm2，通氣量1∶0.7，開始時(shí)，nC12240kg，40小時(shí)內(nèi)，體系PH控制在6.0-6.8，菌體迅速生長，也產(chǎn)生33.3g/L DC12，然后控制體系PH為7.0-7.8，繼續(xù)發(fā)酵90小時(shí)，每天補(bǔ)加一定量正烷烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終＞5％(V/V)。發(fā)酵130小時(shí)，DC12含量為145g/L，轉(zhuǎn)化率90％。發(fā)酵結(jié)束后，總體積2000L，加入一定量自來水，加熱至80℃調(diào)PH10，放入靜置分層罐分層一天，回收上層殘油70kg，下層菌層通過壓濾除去菌體，濾清液與中層清液合并，加入0.7％活性炭，90℃脫色20分鐘，壓濾除去活性炭，脫色清液打入結(jié)晶罐中，加熱至70℃，加入濃HCl調(diào)PH至4，冷卻至室溫，板框壓濾，空氣吹干，固形物在60℃烘干，得白色DC12247kg，后處理總收率85％，純度97.1％。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)α.ω-十二碳二羧酸的方法，其特征在于以正十二烷為基質(zhì)的培養(yǎng)基中，用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)UH-2-48，即CGMCC NO.0239發(fā)酵，然后回收所形成的二元酸。
2.熱帶假絲酵母(Candida Tropicalis)UH-2-48，即CGMCCNO.0239菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物同步發(fā)酵生產(chǎn)長鏈α，ω-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)十二碳二元酸(DC
文檔編號(hào)C12P7/44GK1130685SQ9511743
公開日1996年9月11日 申請(qǐng)日期1995年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月9日
發(fā)明者陳遠(yuǎn)童, 郝秀珍, 方心芳 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所