一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)槲皮素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)槲皮素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]槲皮素(Quercetin)，又名櫟精，槲皮黃素，Meletin，Sophretin，槲皮素化學(xué)名為3，3' 4，5，7-五羥基黃酮，化學(xué)分子式為C15H1007，相對分子質(zhì)量為302.24。槲皮素及其衍生物廣泛分布于多種植物的葉、花、果實中，多以苷的形式存在，是植物界分布最廣的黃酮類化合物，具有多種生物活性和很高的藥用價值，也是人類飲食中最主要的生物類黃酮之一。其二水合物為黃色針狀結(jié)晶(稀乙醇)，在95-97 °C成為無水物，熔點314 °C(分解)。能溶于冷乙醇(1: 290)，易溶于熱乙醇(1: 23 )，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等，溶于冰醋酸及堿性水溶液顯黃色等，幾乎不溶于水，乙醇溶液味苦。其存在于許多植物的花、葉、果實中，多以甙的形式存在，如蘆丁(蕓香甙)，槲皮甙，金絲桃甙等植物中含量較高。其英文名“Quercetin”最早出現(xiàn)在1857年，其來源于“Quercetin”，意為櫟樹林，是一種天然的生長素極性運輸抑制劑。
[0003]槲皮素不僅在自然界中廣泛分布，其藥理作用也很廣泛，它具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)及心血管保護作用等，且具有延緩白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的作用。槲皮素可通過作用于蛋白激酶和脂質(zhì)激酶信號通路等方式，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。槲皮素的抗氧化作用與分子結(jié)構(gòu)中B環(huán)和位點3的酚羥基基團有關(guān)。
[0004]槲皮素具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外還有降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性、降血脂、擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量等作用，用于治療慢性支氣管炎，對冠心病及高血壓患者也有輔助治療作用。槲皮素能顯著抑制促癌劑的作用、抑制離體惡性細胞的生長、抑制艾氏腹水癌細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成。槲皮素有抑制血小板聚集和5-羥色胺(5-HT)的釋放作用。槲皮素對ADP、凝血酶和血小板活化因子(PAF)誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯抑制作用，其中對PAF的抑制作用最強，槲皮素也能明顯抑制凝血酶誘導(dǎo)的兔血小板3H-5-HT釋放。
[0005]槲皮素不溶于水，故導(dǎo)入親水性基團增加溶解性，便于吸收，從而增強其藥理作用。合成的槲皮素氧乙酸賴氨酸鹽，水溶性增加。經(jīng)臨床試驗證明，用于治療出血性疾病、循環(huán)障礙、動脈粥樣硬化等具有較高療效。
[0006]槲皮素也可以用于其它行業(yè)，作為抗氧化劑，主要用于油脂、飲料、冷飲和肉類加工制劑等。
[0007]工業(yè)上目前傳統(tǒng)的制備槲皮素的方法主要是先通過豆科植物槐(Sophoraflavescens Ait.)的干燥花蕾提取蘆丁，再通過酶水解法、微波水解法、高壓水解法和酸水解法以及報道有催化劑法等來水解蘆丁得到槲皮素，而且酶水解法和催化劑法目前還無法工業(yè)化生產(chǎn)，僅限于理論。用現(xiàn)有技術(shù)制備獲得槲皮素的工藝復(fù)雜，成本高，易生結(jié)構(gòu)異化，如何才能有效地解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，開發(fā)研究出一種具有產(chǎn)業(yè)化前景、生產(chǎn)工藝簡單、經(jīng)濟效益良好、無二次污染等特點的綠色、環(huán)境友好型的全新槲皮素生產(chǎn)和制備技術(shù)是一個亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種全新的槲皮素制備方法，即利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)槲皮素的方法，該方法采用微生物發(fā)酵方法制備槲皮素，與傳統(tǒng)的通過豆科植物槐(Sophora flavescens Ait.)的干燥花蕾提取的方法相比，工藝簡單，成本低，不發(fā)生結(jié)構(gòu)異化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良藥效;采用微生物發(fā)酵法制備槲皮素，微生物培養(yǎng)所用的營養(yǎng)基質(zhì)是工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物，既可以使廢棄物得到有效利用，又能帶來較大的經(jīng)濟效益;反應(yīng)快捷、產(chǎn)物污染小、途徑新，目前尚未有利用微生物發(fā)酵的方法來制備槲皮素的報道。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供了一種利用微生物發(fā)酵的方法制備槲皮素的方法，包括如下步驟:
一種利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)槲皮素的方法，其特征在于:所述微生物為胞外多聚物鞘氨醇單胞菌，所述胞外多聚物鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas 831^311丨86116118)已于2010年4月22日保藏于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.1.6417，
生產(chǎn)槲皮素的步驟如下:
(1)菌株活化
將菌株由斜面轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(2)制備種子液
取步驟(I)中經(jīng)活化后的菌株接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(3)發(fā)酵
將步驟(2)中種子液按體積分數(shù)2%?4%的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，溫度28?31 °C，pH 7.0?7.2，保持溶氧飽和度12%以上，培養(yǎng)5 d，收集發(fā)酵液；
(4)槲皮素的精制
將步驟(4)中的槲皮素發(fā)酵液組分經(jīng)過離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結(jié)晶和干燥后得到精制的槲皮素。
[0010]上述步驟(I)中，固體培養(yǎng)基質(zhì)量組成為:1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06% NH4NO3^0.5% KH2PO4,0.01% MgSO4,1.5% 瓊脂，其余為水。
[0011]上述步驟(2)中，種子培養(yǎng)基質(zhì)量組成為:1%葡萄糖，0.25%酵母粉，0.5%蛋白胨，0.06% NH4NO3^0.5% KH2PO4,0.01% MgSO4，其余為水。
[0012]上述步驟(3)中，培養(yǎng)基質(zhì)量組成為:6%葡萄糖，0.06% NH4NO3,0.5% KH2P04，0.01% MgS04，其余為水。
[0013]上述步驟(3)中，通氣量V:V比0.7-0.9:1，攪拌速度180-190 r/min。
[0014]本發(fā)明中，離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結(jié)晶和干燥屬于現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)產(chǎn)物需要合理選擇;本發(fā)明優(yōu)選將發(fā)酵液收集后，將槲皮素發(fā)酵液組分經(jīng)過離心分為菌體和發(fā)酵液兩部分，過濾得到的菌體采用體積分數(shù)60%乙醇，210W超聲浸提，過濾、收集浸提液，再經(jīng)真空抽濾，合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，減壓濃縮去除乙醇；用乙酸乙酯萃取，濃縮后于4 °C保存?zhèn)溆?；取乙酸乙酯萃取物加甲醇使之溶解，上硅膠柱，用體積比為9.6:0.4比例的氯仿/甲醇洗脫，收集洗脫產(chǎn)物再用Sephadex LH-20，以甲醇作為流動相洗脫，進行進一步純化并結(jié)晶。
[0015]本發(fā)明槲皮素的測定方法:HPLC分析的檢測條件為:ShimadzuODS C18色譜柱(150 mm X4.6 mm, 5 μπι)，柱溫28 °C，流動相為甲醇:0.4%磷酸溶液(￥力)=50:50，進樣量 10 口1^，流速0.8 mL/min，檢測波長360 nm。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果:開創(chuàng)了利用微生物發(fā)酵方法制備槲皮素的規(guī)?；a(chǎn)新途徑;本發(fā)明優(yōu)化了槲皮素的分離純化技術(shù)與工藝參數(shù)，建立了一套下游加工方法，此方法具有工藝簡單，成本低，不發(fā)生結(jié)構(gòu)異化，完整地保持了槲皮素有效成分的原有化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良藥效易于操作等優(yōu)點；同時具有生產(chǎn)周期短，不受氣候和地理環(huán)境條件的限制，易于提取