專利名稱：結(jié)腸特異性基因及蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最新鑒別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途。本發(fā)明還涉及抑制本發(fā)明的這些多核苷酸的功能和產(chǎn)生的方法。
胃腸道是每年在美國發(fā)生的新診斷的癌癥和致命癌癥(男人比女人的數(shù)量要高一些)兩者的最普通的位點。結(jié)腸癌在美國的發(fā)生率逐漸增加，而胃癌則減少，小腸癌稀有。胃腸癌的發(fā)生率隨地理位置變化。胃癌在日本普遍在美國不普遍。而結(jié)腸癌在日本不普遍在美國普通。環(huán)境病原學(xué)因子由統(tǒng)計數(shù)據(jù)(顯示移居至高-風(fēng)險區(qū)的人承擔(dān)高的風(fēng)險)強烈地表明。表明胃癌的一些病原學(xué)因子包括黃曲霉毒素、由在污染食品中存在的黃曲霉形成的致癌因子、煙熏魚、酒精和維生素A和鎂缺陷。膳食高脂肪和低的大(和可能的)甾醇代謝降解產(chǎn)物可能是結(jié)腸癌的病因。一些疾病可以預(yù)示著癌癥，例如，惡性貧血預(yù)示著胃癌，未治療非熱帶口炎性腹瀉和免疫缺陷預(yù)示著淋巴瘤和癌，潰爛和肉芽腫結(jié)腸炎、分離的息肉遺傳性家族息肉病預(yù)示著結(jié)腸癌。
結(jié)腸最普通的腫瘤是腺瘤息肉。在結(jié)腸原發(fā)性淋巴瘤很少，在小腸中常見。
腺瘤息肉是最普通的良性胃腸腫瘤。它們在整個GI道中發(fā)生，最一般地在結(jié)腸和胃部，在男性中比在女性中更常見。它們可以單一的或者更常見的是多重的，無蒂的或有蒂的。它們可以遺傳，如同在家族息肉病和Gardener’s綜合癥中，這主要涉及結(jié)腸。結(jié)腸癌的發(fā)展在家族息肉病中普遍。息肉經(jīng)常造成流血，可以隱藏或者是顯露，但是很少造成疼痛除非癥狀復(fù)雜。一種不太常見的乳頭狀的腺瘤僅在結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)，也可以引起電解質(zhì)喪失和類粘蛋白流出。
惡性腫瘤包括結(jié)腸癌可以是滲透的或者是植外的，同時最一般地發(fā)生于直腸乙狀結(jié)腸之中。因為上行結(jié)腸的內(nèi)含物為液態(tài)，在這個區(qū)域中的癌通常不造成阻礙，但是病人在病程后期易于出現(xiàn)貧血，腹腔疼痛，或者腹腔團塊或可觸知的團塊。
結(jié)腸腫瘤的預(yù)后取決于腸壁入侵的程度區(qū)域淋巴節(jié)介入和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的存在。直腸和下行結(jié)腸癌的預(yù)后意想不到地十分好。在結(jié)入侵發(fā)展之前，對早期切除，80至90％的治愈率是可能的。由于這一原因，當(dāng)不能解釋的貧血、隱藏的胃腸流血或在腸道習(xí)慣方面改變在以前健康的病人中發(fā)展時，必須特別注意排除這種疾病。在其擴散到淋巴結(jié)之前完全除去病灶對結(jié)腸癌病人提供了生存的最好機會。通過潛隱性出血病人中的血篩選檢測導(dǎo)致最高5年的存活。
臨床懷疑的惡性損傷通?？梢越?jīng)放射線學(xué)檢測。不到1cm的息肉容易被錯過，尤其是在乙上面的狀結(jié)腸中在憩室病的存在中。在食道、胃部或結(jié)腸中的臨床懷疑和放射線學(xué)檢測的損傷可以由纖維光學(xué)內(nèi)窺鏡檢查與直接活組織檢查和營養(yǎng)學(xué)進行的組織學(xué)組織診斷結(jié)合證實。結(jié)腸鏡檢查是檢測結(jié)腸疾病所利用的另一個方法。尚不能由X光預(yù)見的良性和惡性息肉經(jīng)常用結(jié)腸鏡檢查檢測。此外，在X光上具有一種損傷的患者經(jīng)常在結(jié)腸鏡檢查上有另外的損傷。然而，乙狀結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)大約50％的結(jié)腸腫瘤。
檢測結(jié)腸癌的上述方法有一些缺點，通過以上描述的所有方法，小的結(jié)腸腫瘤可以被錯過。檢測結(jié)腸癌的重要性對預(yù)防轉(zhuǎn)移也極端重要。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長度足以特異性地與從本發(fā)明的人類結(jié)腸特異性基因轉(zhuǎn)錄的RNA雜交或者與相應(yīng)于這種RNA的DNA雜交的核酸分子。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種通過檢測來源于宿主的樣品中的從本發(fā)明的人類結(jié)腸特異性基因轉(zhuǎn)錄的RNA或者相應(yīng)于這種RNA的DNA的存在，來診斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的方法和產(chǎn)品。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種通過檢測來源于宿主的樣品中的相應(yīng)于本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因的多肽的改變的水平來診斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的方法和產(chǎn)品。所述多肽提高的水平指示結(jié)腸癌診斷。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其反義類似物和其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了由所說多核苷酸編碼的新的多肽以及其生物學(xué)活性的并且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法，該方法包括在促進所說的蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞，隨后回收所說的蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了對這些多肽特異性的抗體。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的多肽治療結(jié)腸癌的方法和使用所說的多肽篩選與該多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如為抑制或激活本發(fā)明的多肽受體的化合物。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了篩選與所說的多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如為抑制或激活本發(fā)明的多肽的化合物。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸體外用于與科學(xué)研究、DNA合成及DNA載體的人工合成有關(guān)的目的的方法。
從本文的教導(dǎo)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
下列附圖用來說明本發(fā)明的實施方案，而無意于用它們來限制本發(fā)明權(quán)利要求所包括的范圍。


圖1顯示了相應(yīng)于本申請中公開的人類結(jié)腸特異性基因的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。使用了氨基酸標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫。
術(shù)語“結(jié)腸特異性基因”指這種基因首先在來源于結(jié)腸的組織中表達，并且這種基因可以在來源于非結(jié)腸組織的細(xì)胞中表達。然而這種基因在來源于結(jié)腸組織中的表達明顯高于非結(jié)腸組織中的表達。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽或由1995年4月28日以保藏號ATCC 97129保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因的多核苷酸是從人結(jié)腸癌cDNA文庫中分離的。該多核苷酸包含一個編碼158個氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的開放讀框。該多核苷酸顯示出來源于菱形斑紋響尾蛇的半乳糖特異性凝集素的同源性(具有36％的相同性和54％的相似性)，與人類胰腺結(jié)石蛋白質(zhì)前體具有30％的相同性和52％的相似性。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，其可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1(SEQ ID NO1)所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其可以和圖1(SEQ ID NO1)的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導(dǎo)或分泌序列或蛋白原序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加的編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術(shù)語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1(SEQ ID NO1)中所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。本領(lǐng)域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，而實質(zhì)上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中所說的成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中與幫助從宿主細(xì)胞表達和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作為分泌序列在控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運中起作用的前導(dǎo)序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主細(xì)胞切割形成成熟形式的多肽的前導(dǎo)序列。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是添加有附加的5’氨基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的就是有活性的成熟蛋白。這樣，本發(fā)明的多核苷酸例如可以編碼一種成熟蛋白或編碼具有原序列的蛋白質(zhì)或編碼既有原序列又有前序列(presequence)(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其提供來純化融合進標(biāo)記的成熟多肽，或例如當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。所說的HA標(biāo)記相應(yīng)于來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一種表位(Wilson，I.等，細(xì)胞，37767(1984))。
術(shù)語“基因”是指和產(chǎn)生多肽鏈有關(guān)的DNA區(qū)段；其包括在編碼區(qū)前面的和后面的區(qū)(前導(dǎo)區(qū)和尾隨序列)以及在各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
全長結(jié)腸特異性基因片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長基因和與此基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針優(yōu)選地是具有至少30個堿基，并且可以含有，例如50個或更多的堿基。所說的探針也可以用于鑒別相應(yīng)于全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和基因組克隆或含有包含調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整的結(jié)腸特異性基因的克隆。篩選的實例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針來分離基因的編碼區(qū)。具有互補于本發(fā)明的基因序列之序列的標(biāo)記可以用來篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，以確定探針和哪些文庫成員雜交。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(如果兩個序列之間具有至少70％，優(yōu)選地具有至少90％，更優(yōu)選地具有至少95％的等同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“嚴(yán)格條件”指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選地具有至少97％的同源性時雜交才可以發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質(zhì)上保持與由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20個堿基，優(yōu)選地是至少30個堿基，更優(yōu)選地是至少50個堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作圖1(SEQ ID NO1)多核苷酸的探針，例如用于回收多核苷酸或作為診斷探針或作為PCR引物。
這樣，本發(fā)明涉及與編碼圖1(SEQ ID NO2)多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，優(yōu)選地至少90％相同性并且更優(yōu)選地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(這種片段具有至少30個堿基，優(yōu)選地至少50個堿基)和這些多核苷酸編碼的多肽。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國際承認(rèn)的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定保持。這些保持物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對保藏材料的任何制造、使用或銷售需要經(jīng)過許可，在此未給予任何這樣的許可。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，該多核苷酸優(yōu)選地具有與以下序列雜交并且與以下具有至少70％的相同性的至少10個堿基對，所述序列是從人類基因轉(zhuǎn)錄的RNA(或相應(yīng)的DNA)，所說的基因具有與圖1(SEQ ID NO1)的DNA序列的編碼序列至少90％相同的編碼序列。
這樣，如上所述的雜交的多核苷酸序列可以用來雜交到它們所相應(yīng)的人類基因上，和用來檢測所述人類基因的表達，以用于此后描述的診斷測定中。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了用于在宿主中檢測結(jié)腸癌微轉(zhuǎn)移的診斷測定法。雖然申請人不希望將本發(fā)明的推論限制在任何特定的理論上，但可以相信在宿主細(xì)胞中本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因(而不是來源于結(jié)腸的那些)的活性轉(zhuǎn)錄的存在是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移指示性的。這是真實的，因為盡管結(jié)腸特異性基因在身體的所有細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，但是在非有病的個體中其轉(zhuǎn)錄成mRNA，cDNA以及表達產(chǎn)物主要限制在結(jié)腸中。然而，如果存在結(jié)腸癌，結(jié)腸癌細(xì)胞從癌向其它細(xì)胞遷移，以使這些其它細(xì)胞以較高的水平活化轉(zhuǎn)錄和表達結(jié)腸特異性基因，所述水平高于通常在非有病個體中通常發(fā)現(xiàn)的，即轉(zhuǎn)錄高于在健康個體的非結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)的。正是在不是來源于結(jié)腸的那些細(xì)胞中檢測到這種增強的轉(zhuǎn)錄或增強的蛋白質(zhì)表達才是指示結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。
在這樣一種診斷測定的一個例子中，通過與探針雜交檢測在來源于不是結(jié)腸組織的樣品中的RNA序列。所說的樣品包含核酸或核酸混合物，其中至少之一懷疑包含從本發(fā)明的人類結(jié)腸特異性基因轉(zhuǎn)錄的RNA(或相應(yīng)的cDNA)。這樣，例如，在確定細(xì)胞中特異性RNA的存在的測定形式中，最初的RNA是從細(xì)胞分離的。
樣品可以從來源于不是結(jié)腸的組織的細(xì)胞獲得，包括但不限于血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料。在從非結(jié)腸細(xì)胞獲得的樣品中使用這種方法檢測從本發(fā)明的人類結(jié)腸特異性基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的增強在本文的教導(dǎo)下完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
mRNA的分離包括經(jīng)裂解細(xì)胞和進行示差離心分離總細(xì)胞RNA。一旦分離總RNA，通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的腺苷酸殘基形成的幾乎在每一種真核mRNA分子3’末端發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾分離mRNA。由脫氧胸苷組成的寡核苷酸[oligo(dT)]連接到纖維素上，并且oligo(dT)-纖維素被填充到小柱中。當(dāng)總細(xì)胞RNA制備物流過這樣一個柱時，mRNA分子通過poly(A)尾結(jié)合到oligo(dT)上，而剩下的RNA流過柱。然后從柱洗脫mRNA并收集。
檢測從編碼本發(fā)明的多肽的本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因或其片段轉(zhuǎn)錄的分離的mRNA的一個例子包括用設(shè)計用來與待檢測的mRNA雜交的特定的寡核苷酸探針篩選所收集的mRNA。所述寡核苷酸探針包含與至少一部分從一種或多種本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因或其片段轉(zhuǎn)錄的分離的mRNA(或從這種RNA產(chǎn)生的cDNA)雜交的多核苷酸序列。所述的多核苷酸序列至少70％相同于從本發(fā)明的人類結(jié)腸特異性基因或其片段轉(zhuǎn)錄的分離的mRNA(或從這種RNA產(chǎn)生的cDNA)并與其雜交，所述的基因具有外顯子并包括與圖1的DNA序列(SEQID NO1)具有至少90％，優(yōu)選地至少95％，最優(yōu)選地至少97％的相同性的DNA。
也應(yīng)認(rèn)識到可以用分析上可檢測的試劑標(biāo)記這些探針，并且優(yōu)選地是如此。有用的試劑包括但不限于放射性，熒光染料或能夠催化形成可檢測產(chǎn)物的酶。
檢測互補于mRNA序列的多核苷酸(cDNA)的一個例子是采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR是用于特異性擴增DNA或者RNA的一種十分有力的方法(Saiki等，自然，234163-166(1986))。這種技術(shù)的一種應(yīng)用是使以低拷貝數(shù)存在的核酸序列達到可檢測水平的核酸探針技術(shù)。H.A.Erlich編輯的《(PCR技術(shù)原理和在DNA擴增上的應(yīng)用》(Stockton出版社，USA，1989)中，和M.A.Inis(編者)在PCR方案(學(xué)術(shù)出版社，San Diego，USA，1990)中描述了這一方法的許多診斷和科學(xué)應(yīng)用。
RT-PCR是將PCR與逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種從相應(yīng)mRNA分子產(chǎn)生cDNA分子的酶。這是重要的，因為PCR擴增核酸分子，特別是DNA，這一DNA可以從由來源于宿主的樣品中分離的mRNA產(chǎn)生。
RT-PCR診斷測定的一個特定的例子涉及從宿主組織移取樣品。這種樣品將來源于不是結(jié)腸的組織，例如血液。因此，這樣的診斷測定的例子包括全血梯度分離有核的細(xì)胞，總RNA抽提，總RNA的RT-PCR和PCR產(chǎn)物的凝膠電泳。PCR產(chǎn)物包含互補于從本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因或其片段轉(zhuǎn)錄的RNA的cDNA。更具體地說，獲得血液樣品，將全血與磷酸緩沖鹽水合并，離心，以及小心抽吸淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞層，再次用磷酸緩沖液鹽水稀釋并再離心。棄去上清液，含有有核的細(xì)胞的沉淀用于用如制造者(Tel-Test Inc.，F(xiàn)riendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
用對本發(fā)明的DNA序列高度特異性的DNA序列制備寡核苷酸引物和探針。所述探針長度至少為10個堿基對，優(yōu)選地至少30個堿基對，可以是至少50個堿基對或更多。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)和PCR擴增依次進行無須中斷。在PCR期間使用Taq聚合酶，濃縮PCR產(chǎn)物，使整個樣品在包含溴化乙錠的Tris-硼酸鹽-乙二胺四乙酸瓊脂糖凝膠上電泳。
按照本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了一種通過檢測來源于不是結(jié)腸的組織的生物樣品中本發(fā)明的特異性多肽的改變的水平診斷結(jié)腸疾病(例如結(jié)腸癌)的方法。本發(fā)明的結(jié)腸特異性多肽的提高的水平指示相應(yīng)的結(jié)腸特異性基因產(chǎn)物的活性轉(zhuǎn)錄和表達。用于檢測得自宿主的樣品中結(jié)腸特異性多肽的水平的分析方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，所說的方法包括放射免疫測定、競爭結(jié)合測定、Western印跡分析、ELISA測定和“夾心”測定。生物樣品可以包括但不限于組織提取物、細(xì)胞樣品或生物體液，然而，按照本發(fā)明，生物樣品具體來說不包括結(jié)腸組織或細(xì)胞。
ELISA測定(Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)代方案，1(2)，第6章(1991))最初包括制備對本發(fā)明的結(jié)腸特異性多肽特異性的抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。此外，制備單克隆抗體的報道抗體。將可檢測的試劑和報道抗體結(jié)合，所說的試劑如放射性、熒光或者在這一實例中是辣根過氧化物酶。由宿主獲得樣品，并將其在與樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過和非特異性蛋白質(zhì)(如BSA)一起溫育，將覆蓋皿中任何游離的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。接下來，將單克隆抗體在皿中溫育，在此期間單克隆抗體和結(jié)合到聚苯乙烯皿上的本發(fā)明任何多肽結(jié)合。用緩沖液將所有未結(jié)合的單克隆抗體洗掉。此時，將和辣根過氧化物酶連接的報道抗體放入皿中，結(jié)果導(dǎo)致報道抗體和任何結(jié)合到結(jié)腸特異性基因多肽上的單克隆抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的報道抗體洗掉。接著向皿中加入過氧化物酶底物，和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，在給定時間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的結(jié)腸特異性多肽的量。
也可以使用競爭測定，其中將對結(jié)腸特異性多肽特異性的抗體連接到固體支持物上，然后，標(biāo)記結(jié)腸特異性多肽，使標(biāo)記的多肽和來源于宿主的樣品通過固體支持物，經(jīng)例如液體閃爍層析檢測的標(biāo)記的量可以與樣品中結(jié)腸特異性多肽的量相關(guān)聯(lián)。
“夾心”測定類似于ELISA測定。在“夾心”測定中，將本發(fā)明的多肽通過固體支持物并連接到結(jié)合在固體支持物上的抗體上。然后將第二抗體連接到結(jié)腸特異性多肽上。使標(biāo)記的并且對第二抗體特異性的第三抗體通過固體支持物并連接到第二抗體上，可以定量結(jié)合的量。
在可替性方法中，使用結(jié)腸特異性多肽的標(biāo)記抗體。在一步測定中，將靶分子(如果其存在)固定化并且與標(biāo)記的抗體一起溫育。標(biāo)記的抗體結(jié)合到固定化的靶分子上。在洗滌除去未結(jié)合的分子后，檢測樣品中標(biāo)記的存在。在兩步測定中，將固定化的靶分子與非熒光素標(biāo)記抗體一起溫育。然后，使靶分子-標(biāo)記抗體復(fù)合物(如果其存在)結(jié)合到對未標(biāo)記的抗體是特異性的第二標(biāo)記抗體上。洗滌樣品，檢測樣品中標(biāo)記的存在。
對用于標(biāo)記的標(biāo)記物的選擇隨應(yīng)用而變化，然而，標(biāo)記物的選擇易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。這些標(biāo)記的抗體可以用于免疫測定以及組織學(xué)應(yīng)用中，以檢測蛋白質(zhì)的存在。標(biāo)記的抗體可以是多克隆的或者單克隆的。
非結(jié)腸細(xì)胞中結(jié)腸特異性基因的活性轉(zhuǎn)錄(其大于通常發(fā)現(xiàn)的)的存在(存在mRNA，cDNA或者表達產(chǎn)物的改變的水平)是存在已轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的重要的指示，因為結(jié)腸癌細(xì)胞遷移到總的循環(huán)中。因此，這一現(xiàn)象可以具有重要的臨床暗示，因為治療局部腫瘤的方法完全不同于治療轉(zhuǎn)移的腫瘤的方法。
以上所描述的方法也可以用于檢測在化療前所保存的骨髓是否由結(jié)腸癌細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移所污染。在測定中，從骨髓分離血液細(xì)胞，并且按如上所述處理。這一方法使得人們可以測定所保存的骨髓是否在化療之后仍然適合于移植。
對結(jié)腸特異性多肽特異性的抗體(例如單克隆抗體)也可以用于導(dǎo)向結(jié)腸癌細(xì)胞，例如，在導(dǎo)向相互作用劑方法中，這些藥劑在接觸結(jié)腸癌細(xì)胞時消滅它們。這是真實的，因為所述抗體對首先在結(jié)腸中表達的結(jié)腸特異性多肽是特異性的，相互作用劑與抗體的連接會引起相互作用劑被直接攜帶到前列腺。
這種類型的抗體也可以用來進行體內(nèi)造影，例如通過標(biāo)記的抗體，以促進掃描骨盆區(qū)和結(jié)腸。一種造影方法包括將待造影的任何結(jié)腸腫瘤細(xì)胞與用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的抗結(jié)腸特異性抗體接觸。所述方法在使標(biāo)記抗體結(jié)合到任何接觸特異性多肽的條件下進行。在一個特定的例子中，抗體與結(jié)腸(例如結(jié)腸癌細(xì)胞)相互作用，使結(jié)腸造影和基于這種接觸的可見的熒光被增強，使得可以測定結(jié)腸的疾病或非疾病狀態(tài)。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的結(jié)腸特異性基因多肽或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這些多肽的片段、類似物和衍生物。
術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”，當(dāng)有關(guān)圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進而產(chǎn)生活性的成熟多肽激活。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說的圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基取代)并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的氨基酸殘基；或(ii)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基；或(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)這樣一種，其中附加氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)或分泌序列或用來純化成熟多肽的序列或原序列。通過本文的闡述，可以認(rèn)為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，并且優(yōu)選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質(zhì)性的。
術(shù)語“分離的”意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因為這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括圖1的多肽(SEQ ID NO2)特別是成熟多肽以及和圖1的多肽(SEQ ID NO2)具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更優(yōu)選地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最優(yōu)選地是95％的相似性(最好是90％相同性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這些多肽的部分通常包含至少30個氨基酸，并且優(yōu)選地是至少50個氨基酸。
如本領(lǐng)域所熟知的，兩個多肽之間的“相似性”是通過比較一個多肽和另一個多肽序列的氨基酸序列和其保守氨基酸取代來確定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分通過肽合成可以用于產(chǎn)生相應(yīng)的全長多肽；因此，此片段可以用作產(chǎn)生全長多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)產(chǎn)生的，所說的載體可以是克隆載體或表達載體。該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細(xì)胞可以在修飾得適于激活啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增結(jié)腸特異性基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度和pH值等，是以前用于表達選擇的宿主細(xì)胞的那些，對普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和假狂犬病病毒。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領(lǐng)域已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
在表達載體中的所說的DNA序列是可操作地連接到適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)mRNA合成表達控制序列(啟動子)上的。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40啟動子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯幼踊蚩刂菩蛄械妮d體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞，如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動物細(xì)胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過本文的闡述，對適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，該載體已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包含可操作連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD1O、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體都可以使用，只要它們在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區(qū)。兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對適當(dāng)?shù)妮d體與啟動子的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平之內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞)，或低等真核細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)，或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞)?？梢杂闪姿徕}轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來以常規(guī)方式產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生。
蛋白質(zhì)可以在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡卤磉_。采用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達載體。
高等真核生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點后側(cè)100至270bp上的SV40增強子、細(xì)胞肥大病毒早期啟動子增強子、復(fù)制起點后側(cè)上的多形瘤增強子以及腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體包括復(fù)制起點和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表達基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質(zhì)包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或簡化純化步驟。
通過將帶有合適的翻譯起始和終止信號的編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與功能性啟動子一起插入可操作讀框中來構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點，以在宿主來保證保持載體和需要時提供擴增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種(雖然其它的也可以選擇來使用)。
作為一個代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”片段與適當(dāng)?shù)膯幼雍痛磉_的結(jié)構(gòu)序列組合。
在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保持所形成的粗產(chǎn)物用于進一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍-融循環(huán)、聲處理、機械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細(xì)胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達相容載體的細(xì)胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達載體包含復(fù)制起點、適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
結(jié)腸特異性基因多肽可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標(biāo)記序列融合的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細(xì)菌宿主的情況下，標(biāo)記序列的一個例子是可以由載體(優(yōu)選地是pQE-9載體)提供的六組氨酸標(biāo)記，其提供來純化融合進標(biāo)記的成熟多肽，或例如當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。所說的HA標(biāo)記相應(yīng)于來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的一種表位(Wilson，I.等，細(xì)胞，37767(1984))。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)產(chǎn)生的。依據(jù)重組產(chǎn)生方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了可以用于篩選抑制本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因或結(jié)腸特異性蛋白質(zhì)的作用的治療劑的測定法。一種測定利用這些蛋白質(zhì)的還原酶功能。本發(fā)明公開了用于選擇以足夠的親和性與結(jié)腸特異性基因蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以阻止它們的生物學(xué)功能的治療劑的方法。所述方法包括各種測定法，包括競爭測定法，其中蛋白質(zhì)固定化在支持物上，并同時或先后與天然底物和標(biāo)記的治療劑接觸，以確定治療劑是否以足以阻止所說的蛋白質(zhì)與其底物結(jié)合的方式有效地與天然底物競爭。
在另一個實施方案中，將底物固定化在支持物上，與標(biāo)記的結(jié)腸特異性多肽和治療劑(或非標(biāo)記的蛋白質(zhì)和標(biāo)記的治療劑)兩者接觸，確定結(jié)合到底物上的結(jié)腸特異性多肽的量與沒有添加治療劑的測定比較是否降低。所述的結(jié)腸特異性多肽可以用抗體標(biāo)記。
在另一個這樣的篩選測定的例子中，本發(fā)明提供了表達本發(fā)明的結(jié)腸特異性多肽的哺乳動物細(xì)胞或膜制劑，其是在待篩選的化合物存在下在有利于氧化還原反應(yīng)的條件(其中氫和氧形成水)下與同時經(jīng)歷氧化和還原的成分一起溫育的，所述成分例如一起形成水的氫和氧，其中的氫可以被放射活性物(例如氚)標(biāo)記。然后可以測定化合物阻斷這一相互作用的能力。
本發(fā)明提供了鑒別本發(fā)明的多肽之受體的方法?？梢杂迷S多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法鑒別編碼所說受體的基因。所述方法如配體淘選和FACS分選(Coligan等，免疫學(xué)當(dāng)代方案，1(2)，第5章，(1991))。優(yōu)選地，使用表達克隆，其中從對所述多肽反應(yīng)性的細(xì)胞制備多聚腺苷酸RNA，將從這一RNA產(chǎn)生的cDNA文庫分成小集合體，用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或?qū)λ龆嚯姆欠磻?yīng)性的其它細(xì)胞。使生長在載波片上的標(biāo)記后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞暴露在本發(fā)明的多肽下，所述多肽可以由多種方法(包括碘化或引入位點特異性蛋白質(zhì)激酶的位點)標(biāo)記。在固定和溫育后，將載波片進行放射自顯影分析。鑒別陽性集合體，制備亞集合體，用交互式亞集合和再篩選方法再轉(zhuǎn)染，最終產(chǎn)生編碼推定的受體的單克隆。
受體鑒別的另一種方法是可以將標(biāo)記的多肽與表達受體分子的細(xì)胞膜和抽提制劑光親和連接，經(jīng)PAGE分離交聯(lián)材料，并對X-光膠片曝光。可以切下包含所述多肽受體的標(biāo)記復(fù)合物，分離成肽片段進行蛋白質(zhì)微測序。從微測序獲得的氨基酸序列用于設(shè)計一套篩選cDNA文庫簡并寡核苷酸探針，以鑒別編碼推定的受體的基因。
此外，因為本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因和基因產(chǎn)物是生長調(diào)節(jié)物，所述多肽的興奮劑和拮抗劑可以通過這樣一種測定法來測定，其中包括將包含多肽受體的膜制劑與待篩選的化合物組合，并且測定從受體產(chǎn)生的信號。在測定拮抗劑的情況下，將本發(fā)明的多肽添加到測定中，然后可以測定化合物競爭結(jié)合位點(即，不從受體產(chǎn)生信號)的能力。
結(jié)腸特異性多肽的潛在的拮抗劑包括以上描述的抗體和抗獨特型抗體，或者在某些情況下包括結(jié)合到其上的寡核苷酸。
另一個潛在的拮抗劑化合物是采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體，其針對結(jié)腸特異性多肽以阻止轉(zhuǎn)錄。反義技術(shù)可以通過三螺旋形成或反義DNA或RNA來控制基因的表達，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來設(shè)計長度約10至40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設(shè)計成與轉(zhuǎn)錄所涉及的基因區(qū)互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，241456，(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，進而阻止結(jié)腸特異性多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為結(jié)腸特異性基因多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細(xì)胞中，以便可以體內(nèi)表達反義RNA和DNA，抑制結(jié)腸特異性多肽的產(chǎn)生。
潛在的拮抗劑也包括小分子，這些小分子結(jié)合并占據(jù)結(jié)腸特異性多肽的活性位點，從而使活性位點不能接近底物，使正常的生物學(xué)活性被阻斷。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
所述的拮抗劑可以用于治療結(jié)腸癌，因為它們以足以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞存活所必需的天然功能的方式影響結(jié)腸特異性多肽的功能。拮抗劑可以用于與藥學(xué)上可接受的載體組合，例如如此后所描述的。
本發(fā)明的多肽和拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包含治療有效量的所說多肽或拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。其配方應(yīng)該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。與這種容器相關(guān)聯(lián)的可以是管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品的政府機構(gòu)的同意。此外，所述的藥物組合物可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口頭、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、肛門內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
結(jié)腸特異性基因多肽和多肽形式的興奮劑和拮抗劑，可以依據(jù)本發(fā)明通過體內(nèi)表達這樣的多肽來利用，這常被稱作“基因治療”。
這樣，例如，可以體外對患者細(xì)胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進行基因工程操作，用工程細(xì)胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可以用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細(xì)胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對細(xì)胞進行基因工程操作，以便體內(nèi)表達多肽。如本領(lǐng)域已知的，可以將產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒(含有編碼本發(fā)明多肽的RNA)的產(chǎn)生細(xì)胞施用于患者，以便體內(nèi)將細(xì)胞基因工程化并體內(nèi)表達所說的多肽。經(jīng)本發(fā)明的描述，通過這種方式施用本發(fā)明多肽的這些或其它方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的。例如，工程化細(xì)胞的表達載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，如可以在與合適的運送載體組合后用于體內(nèi)工程化細(xì)胞的腺病毒。
可以得自上文描述的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和乳房腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個或多個啟動子?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；和人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術(shù)，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它任何啟動子(例如真核細(xì)胞啟動子，如包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細(xì)小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下。可以使用的合適的啟動子包括但不限于腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或異源啟動子(如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導(dǎo)的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以便形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞系(Miller、人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內(nèi)容本文一并參考)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域任何已知的方法用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。另外，反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以包囊在脂質(zhì)體中，或和脂類偶合，然后施用到宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生感染性的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然后可以使用這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達編碼所述多肽的核酸序列。可被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因作為診斷劑。例如，某些疾病產(chǎn)生遺傳缺陷基因。本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因在結(jié)腸癌中超量表達。本發(fā)明的結(jié)腸特異性基因中的突變可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測?？梢詮幕颊叩牟皇墙Y(jié)腸的細(xì)胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸(基因組DNA，mRNA等)?；蚪MDNA可以直接用于檢測，或在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用于相同的目的。作為一個例子，可以用與本發(fā)明的核酸互補的PCR引物鑒別和分析本發(fā)明的結(jié)腸特異性多肽中的突變。例如，可以通過與正常遺傳型比較的擴增產(chǎn)物大小上的改變來檢測缺失或插入。點突變可以經(jīng)擴增的DNA與放射性標(biāo)記的結(jié)腸特異性RNA或放射性標(biāo)記的反義DNA序列雜交鑒別。
另一個用于篩選在PCR擴增后DNA特定區(qū)段中的突變的成熟方法是單鏈形成多態(tài)性(SSCP)分析。經(jīng)再擴增10個循環(huán)摻入32P-dCTP制備用于SSCP的PCR產(chǎn)物，以適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化產(chǎn)生200-300bp片段，由加熱至85℃5分鐘變性。然后投入至冰中。接著在非變性凝膠(5％甘油，5％丙烯酰胺)中進行電泳(Glavac，D.和Dean，M.，人類突變，2404-414(1993))。
通過直接的DNA測序方法揭示參照基因和“突變體”間的序列差異。此外，克隆的DNA區(qū)段(segment)可以用作探針以檢測特異性DNA區(qū)段。當(dāng)和PCR結(jié)合時，這種方法的敏感性大大提高。例如，將測序引物和雙鏈的PCR產(chǎn)物或由改良的PCR方法產(chǎn)生的單鏈模板分子一起使用。通過常規(guī)的放射標(biāo)記核苷酸方法或具有熒光標(biāo)記的自動測序方法確定序列。
基于DNA序列差異的遺傳試驗可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上的區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點或部分融化溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。此外，可以按DNA遷移模式的變化測定序列改變，特別是小的缺失。
也可以由核酸酶保護測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護和S1保護以及化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交、核糖核酸酶保護、化學(xué)裂解、直接DNA測序、或使用限制酶(例如，限制片段長度多形性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
本發(fā)明的序列對染色體鑒別也有價值。所說的序列特異性地導(dǎo)向單個人染色體的特定位置，并與之雜交。此外，也需要鑒別染色體上的特定位點。極少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多形性)的染色體標(biāo)識試劑現(xiàn)在可用來標(biāo)記染色體位置。在關(guān)聯(lián)與疾病有關(guān)基因的那些序列中，按照本發(fā)明的染色體的DNA作圖是重要的第一步。
簡言之，可以通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)對染色體序列作圖。3’未翻譯區(qū)的計算機分析用來迅速選擇引物，該引物不跨越一個以上的基因組DNA中的外顯子，否則使擴增方法復(fù)雜化。然后，這些引物用于經(jīng)PCR篩選包含單獨的人染色體的體細(xì)胞雜合子。僅包含相應(yīng)于引物的人基因的那些雜種產(chǎn)生擴增片段。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是指定特定DNA到特定染色體的快速方法。利用本發(fā)明及相同的寡核苷酸引物，可以由一組特定染色體的片段或一組大的基因組克隆以類似的方式獲得亞定位?？梢灶愃频赜糜趯ζ淙旧w作圖的其它作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選染色體預(yù)篩選和經(jīng)雜交預(yù)選擇以構(gòu)建染色體特異性-cDNA文庫。
在一個步驟中，中期染色體涂片的cDNA克隆的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的染色體位置。這一技術(shù)可以與短至50或60堿基的cDNA一起使用。這種技術(shù)的綜述，參見Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列定位至精確的染色體位置上，染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，在人中的孟德爾式遺傳中找到(可聯(lián)機到Johns Hopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)文庫上使用)。然后，基因和已定位到相同的染色體區(qū)的疾病之間的相互關(guān)系經(jīng)連鎖分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑒別。
接著，有必要確定感染和未感染個體之間cDNA或基因組序列中的不同。如果在某些或全部感染個體中觀察到突變，但在任何正常個體中觀察不到，則所述的突變很可能是疾病的病因。
采用現(xiàn)有分辨率的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)，精確定位到與疾病相關(guān)的染色體區(qū)上的cDNA可能是50和500之間的潛在致病基因的一個(這假定1兆堿基作圖分辨率，每20kb一個基因)。
所說的多肽，其片段或衍生物或類似物，或表達它們的細(xì)胞可以用作免疫原由此產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈和人化的抗體以及Fab片段，或Fab表達文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域中已知的各種方法可以用于產(chǎn)生這樣的抗體和片段。
可以通過對動物直接注射多肽或?qū)游?優(yōu)選地是非人動物)施用多肽獲得抗相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽產(chǎn)生的抗體。然后如此獲得的抗體結(jié)合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個片段的序列也可以用于產(chǎn)生結(jié)合全部天然多肽的抗體。用這種抗體從表達多肽的組織中分離多肽。
對于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供由傳代細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、三瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當(dāng)今免疫學(xué)，472)和EB病毒-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
所描述的有關(guān)單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)(美國專利4,946,778)可以用來產(chǎn)生抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可以利用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生抗體。
所述的抗體也可以用于導(dǎo)向結(jié)腸癌細(xì)胞，例如，在導(dǎo)向相互作用劑這些藥劑在接觸結(jié)腸癌細(xì)胞時消滅它們方法中。這是真實的，因為所述抗體對本發(fā)明的結(jié)腸特異性多肽是特異性的，相互作用劑與抗體的連接會引起相互作用劑被直接攜帶到結(jié)腸。
這種類型的抗體也可以用來進行體內(nèi)造影，例如通過標(biāo)記的抗體，以促進掃描骨盆區(qū)和結(jié)腸。一種造影方法包括將待造影的任何結(jié)腸腫瘤細(xì)胞與用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記的抗結(jié)腸特異性抗體接觸。所述方法在使標(biāo)記抗體結(jié)合到任何接觸特異性多肽的條件下進行。在一個特定的例子中，抗體與結(jié)腸(例如結(jié)腸癌細(xì)胞)相互作用，使結(jié)腸造影和基于這種接觸的可見的熒光被增強，使得可以測定結(jié)腸的疾病或非疾病狀態(tài)。
將參照以下實施例進一步描述本發(fā)明。然而應(yīng)該清楚本發(fā)明不限于這些實施例。除非特別指明，所有分?jǐn)?shù)或數(shù)量均指重量。
為了有利于理解下列實施例，以下描述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！庇汕懊娴男憄和/或后續(xù)的大寫字母和/或數(shù)字指定。本文的起始質(zhì)粒是市售的、公眾可無限制獲得的或是可以按已出版的方法從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。此外，所描述的質(zhì)粒的等同質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，對普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的“消化”指以限制性內(nèi)切酶催化切割DNA，這種限制性內(nèi)切酶僅作用在DNA一定的序列上。本發(fā)明所有的各種限制酶是市售的，如普通技術(shù)人員所知采用它們的反應(yīng)條件，輔因子和其它需要。為了分析的目的，一般地是在約20微升緩沖液中使用1微克質(zhì)粒或DNA片段以及約2單位的酶。為了分離用于質(zhì)粒構(gòu)建體之DNA片段的目的，一般是在較大體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的緩沖液和底物的量由制造者規(guī)定。通常使用37℃約1小時的培養(yǎng)時間，但可以按照供應(yīng)者的說明變化。在消化之后，反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，84057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝膠進行切割片段的大小分離。
“寡核苷酸”指單鏈多脫氧核苷酸鏈或兩條互補的多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學(xué)合成的。這樣合成的寡核苷酸沒有5’磷酸，因此若不在激酶存在下用ATP添加磷酸時，其不連接另一個寡核苷酸。合成的寡核苷酸將連接沒有去磷酸化的片段。
“連接”指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.等，Id.，p.146)。除非提供其它方式，可以采用已知緩沖液和條件用每0.5微克大約等摩爾量的待連接的DNA片段10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)進行連接。除非有其它說明，按Graham，F(xiàn).和van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)的描述進行轉(zhuǎn)化。
實施例1測定結(jié)腸特異性基因的轉(zhuǎn)錄為了評估結(jié)腸特異性基因RNA的活性轉(zhuǎn)錄存在或不存在，以標(biāo)準(zhǔn)的靜脈穿刺術(shù)用肝素化管獲得大約6ml靜脈血液。將全血與相等體積的磷酸緩沖鹽水混合，然后在15ml聚苯乙烯試管中的8mlFicoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上分層。于5℃在1800Xg下梯度離心20分鐘。小心吸取淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞層(約5ml)，在50ml試管中用磷酸鹽緩沖鹽水再稀釋至50ml，再一次于5℃在1800Xg下離心20分鐘。棄去上清液，含有有核的細(xì)胞的沉淀用于用如制造者(Tel-Test Inc.，F(xiàn)riendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
為了測定來源于感興趣基因的mRNA的量，設(shè)計與從人類基因(其編碼部分包括圖1的DNA序列)轉(zhuǎn)錄的mRNA序列具有相同性的探針。將這一探針與抽提的RNA混合，混合的DNA與RNA于-70℃下用乙醇沉淀15分鐘。將沉淀重懸于雜交緩沖液中并溶解。在72℃的水浴中將包含混合物的試管溫育10-15分鐘，以使DNA變性。將試管迅速轉(zhuǎn)移至所需雜交溫度的水浴中。雜交溫度取決于DNA的G+C含量。進行雜交3小時。添加0.3ml核酸酶-S1緩沖液，并且充分混合。加入50μl4.0M醋酸銨和0.1M乙二胺四乙酸停止反應(yīng)。用苯酚/三氯甲烷抽提混合物，加入20μg載體tRNA，用等體積的異丙醇進行沉淀。將沉淀溶解在40μl的TE(pH7.4)中，在堿性瓊脂糖凝膠上電泳。電泳后，對RNA微測序，以證實核苷酸序列(更詳細(xì)的描述參見Favaloro，J.等，酶學(xué)方法，65718(1980))。
將兩個寡核苷酸引物用于擴增從以上方法分離的序列。5’引物20個核苷酸長，3’引物是分離的mRNA的3’末端的互補序列。按分離mRNA常規(guī)設(shè)計引物，在Perkin Elmer 9600 PCR儀(Emeryville，CA)中不間斷地進行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)和PCR擴增。將在20μl焦碳酸二乙酯處理過的水中的400ng總RNA置于65℃的水浴中5分鐘。在添加PCR試劑之前在冰上迅速冷卻。50μl總PCR體積由以下成分組成2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)；2單位禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)；dCTP，dATP，dGTP和dTTP(Perkin Elmer)各200μM；引物各18pM；10mMTris-HCl；50mM KCl和2mM MgCl2(PerkinElmer)。PCR如下循環(huán)1為42℃15分鐘，然后97℃15秒鐘(1個循環(huán))；循環(huán)2為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃30秒鐘(15個循環(huán))；循環(huán)3為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘(10個循環(huán))；循環(huán)4為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘(8個循環(huán))；循環(huán)5為72℃15分鐘(1個循環(huán))；最后的循環(huán)是在4℃下保持直到樣品從儀器中取出。經(jīng)真空離心將50μl樣品濃縮成10μl，然后將樣品在含溴化乙錠的薄的1.2％Tris-硼酸鹽-乙二胺四乙酸瓊脂糖凝膠上電泳。預(yù)期大小的條帶表明這一基因存在于組織中。在沉淀中的RNA的量可以用多種方法定量，例如，可以稱量。
經(jīng)微測序證實PCR產(chǎn)物核苷酸序列。按照制造者的描述用QiagenPCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)純化PCR產(chǎn)物。按照應(yīng)用生物系統(tǒng)(Foster CA)的描述在Perkin-Elmer 9600 PCR儀中用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle測序試劑盒對1μgPCR產(chǎn)物進行PCR測序。按照廠商的描述用Centri-Sep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)純化測序產(chǎn)物。然后用ABI型373A DNA測序系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))以及Macintosh IIci計算機分析這一產(chǎn)物。
實施例2細(xì)菌表達和純化結(jié)腸特異性基因蛋白質(zhì)以及用于制備單克隆抗體利用PCR寡核苷酸引物起始擴增編碼本發(fā)明的多肽的DNA序列ATCC#97129，所說的引物相當(dāng)于加工過的蛋白質(zhì)的5’序列(減去信號肽序列)和所述基因的3’的載體序列。將相應(yīng)于DNA序列的附加核苷酸分別加入到5’和3’序列中。所說的5’寡核苷酸引物GCAGGATCCTGGCTTCCAGAAGCATG(BAMHI)(SEQ ID NO3)可以含有例如限制性內(nèi)切酶位點，接著由加工過的蛋白質(zhì)的假定的末端氨基酸開始的編碼序列的核苷酸。3’序列TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC(ASP718)(SEQ ID NO4)可以包含例如與限制酶位點互補的序列，并且也接著編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸序列的核苷酸。所說的限制性內(nèi)切酶位點相應(yīng)于在細(xì)菌表達載體例如pQE-32(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)上的限制性內(nèi)切酶位點。pQE-32編碼抗生素抗性(Ampr)、細(xì)菌的復(fù)制起點(ori)、IPTG可調(diào)節(jié)的啟動子操縱子(P/O)、核糖體結(jié)合位點(RBS)、6-組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點。然后用相應(yīng)于包含在引物序列中的限制酶位點的限制酶消化pQE-9。將擴增的序列連接到pQE-9中并將其插入到帶有編碼組氨酸標(biāo)記和RBS之序列的框架中。然后通過Sambrook等(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，例如M15/rep 4(Qiagen)。M15/rep4包含質(zhì)粒pREP4的多拷貝，這種質(zhì)粒表達lacI阻遏物，同時賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過轉(zhuǎn)化體在LB平板上的生長能力鑒定轉(zhuǎn)化體，并篩選出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。通過限制分析分離并確認(rèn)質(zhì)粒DNA。將含有所需構(gòu)建體的菌落在補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜(O/N)生長。將O/N培養(yǎng)物以1∶100至1∶250的比率用于接種大體積培養(yǎng)物。細(xì)胞生長至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間時，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物，清除P/O，增加基因表達。將細(xì)胞再培養(yǎng)3至4小時。通過離心收獲細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀溶解在6M鹽酸胍離液劑中。澄清后，在允許含有6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在鎳-螯合物柱中通過層析從溶液中純化溶解的蛋白質(zhì)(Hochuli，E.等，層析法雜志411177-184(1984))。將蛋白質(zhì)以6M鹽酸胍(pH值5.O)從柱中洗脫下來，為了復(fù)性，調(diào)至3M鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mM谷胱甘肽(還原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在溶液中溫育12小時后，將蛋白質(zhì)對10mM磷酸鈉透析。
以這種方式純化的蛋白質(zhì)可以用作表位產(chǎn)生對這種蛋白質(zhì)特異性的單克隆抗體。針對多肽和分離的蛋白質(zhì)的單克隆抗體可以經(jīng)直接將多肽注射到動物中或者經(jīng)向動物施用多肽獲得。如此獲得的抗體將結(jié)合蛋白質(zhì)本身。然后，通過使用例如ELISA測定，這種抗體可以用于從表達該多肽的組織分離蛋白質(zhì)。
實施例3經(jīng)由基因治療的表達從患者中經(jīng)皮膚活組織檢查獲得成纖維細(xì)胞。將得到的組織放置在組織培養(yǎng)基中并將其分成小塊。將小組織塊放置在濕組織培養(yǎng)瓶的表面，每瓶放置大約10塊。將瓶倒轉(zhuǎn)，蓋緊，在室溫下過夜。在室溫下放置24小時后，將瓶旋轉(zhuǎn)過來，組織塊仍然固著在燒瓶底部，加入新鮮培養(yǎng)基(如Ham’s F12培養(yǎng)基，其中含有10％FBS、青霉素和鏈霉素)。然后，在37℃下培養(yǎng)大約1周。此時，加入新鮮培養(yǎng)基，以后每隔幾天換一次培養(yǎng)基。又培養(yǎng)2周之后，出現(xiàn)單層的成纖維細(xì)胞。將單層細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并放入在大瓶中。
將pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))(其兩側(cè)是Moloney鼠肉瘤病毒的長末端重復(fù)區(qū))用EcoRI和HindIII消化，之后用牛犢腸磷酸酶處理。在瓊脂糖凝膠上分級分離線性載體，并用玻璃珠純化。
利用PCR引物擴增編碼本發(fā)明的多肽的cDNA，所說的引物分別相應(yīng)于5’和3’末端序列。5’引物包含EcoRI位點，3’引物包含HindIII位點。在T4DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒線性骨架和EcoRI和HindIII片段一起加入。在適于這兩種片段連接的條件下，保持得到的反應(yīng)混合物。用連接混合物轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后將細(xì)菌HB101在含卡那霉素的瓊脂中平板上涂布，以確認(rèn)載體中是否含有正確插入的感興趣基因。
將兼嗜性pA317或GP+aml2包裝細(xì)胞在Dulbecco改進的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)(含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素)中組織培養(yǎng)至其鋪滿。然后將含有所說的基因的MSV載體加入到培養(yǎng)基中，并用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。此時，包裝細(xì)胞產(chǎn)生含有所說的基因的感染性病毒顆粒(此時，包裝細(xì)胞稱為生產(chǎn)細(xì)胞)。
將新鮮培養(yǎng)基加入到轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中，隨后，在鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm平板上收獲培養(yǎng)基。通過微孔濾膜過濾含有感染性病毒顆粒的用過的培養(yǎng)基，以除去脫附的(detached)生產(chǎn)細(xì)胞，然后用這種培養(yǎng)基感染成纖維細(xì)胞。從亞鋪滿成纖維細(xì)胞的平板中除去培養(yǎng)基，并迅速地用來源于生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)基替換。將此培養(yǎng)基除去，以新鮮培養(yǎng)基代替。如果病毒的滴度很高，事實上所有的成纖維細(xì)胞都將被轉(zhuǎn)染，而不需要選擇。如果病毒的滴度很低，有必要利用具有選擇性標(biāo)記如neo或his的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
然后將工程化的成纖維細(xì)胞注射到宿主中，或單獨或在cytodex 3微載體珠上生長至鋪滿再注射。此時，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
實施例4利用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達結(jié)腸特異性基因多肽利用PCR寡核苷酸引物擴增編碼全長蛋白質(zhì)的DNA序列，ATCC#97129，所說引物相應(yīng)于所說基因的5’和3’序列5’引物具有序列5′ATCGGGATCCGCCATCATGGCTTCCAGAAGCATGCG(SEQ ID NO5)，包含BamHI限制位點(粗體)，接著為代表在真核細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的有效信號的6個核苷酸(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950(1987))，其后為結(jié)腸特異性基因的頭20個核苷酸(轉(zhuǎn)錄起始密碼子“ATG”有下劃線)。
3’引物具有序列5′TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC3’(SEQ ID NO6)，包含限制性內(nèi)切酶Asp718的切割位點和互補于結(jié)腸特異性基因3’-非翻譯序列的5個核苷酸。用市售試劑盒(“Geneclean”BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增的序列。然后將所說的片段用核酸內(nèi)切酶BamHI和Asp718消化，并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段指定為F2。
使用載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)由桿狀病毒表達系統(tǒng)表達結(jié)腸特異性蛋白質(zhì)(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過程的方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)的試驗站公報1555)。這種表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾核型多角病毒(AcMNPV)強多角體蛋白啟動子，其后面是限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和Asp718的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側(cè)是用于細(xì)胞介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列?？梢杂煤芏嗥渌臈U狀病毒載體代替pRG1，所說的載體如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
用限制酶消化所說的質(zhì)粒，然后由本領(lǐng)域已知的方法利用牛犢腸磷酸酶使質(zhì)粒去磷酸化。然后用市售試劑盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA命名為V2。
用T4DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5c細(xì)胞(Stratagene克隆系統(tǒng)，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并利用酶BamHI和Asp718鑒別含有帶結(jié)腸特異性基因的所說質(zhì)粒(pBac-結(jié)腸特異性多肽)的細(xì)菌。通過DNA測序確認(rèn)所克隆的片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國科學(xué)院學(xué)報，847413-7417(1987))將5μg質(zhì)粒pBac-結(jié)腸特異性多肽與1.0μg市售的線性桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pBac結(jié)腸特異性基因在含有50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉(zhuǎn)染試劑和90微升Grace’s的培養(yǎng)基后，混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL1711)中，所說細(xì)胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上。來回?fù)u動平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)27小時。5小時后，從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，添加1微升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。一點改變是使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍的噬斑。(“噬斑測定”的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南9-1O頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于包含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendcrf管中。經(jīng)簡短離心除去瓊脂，將包含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
使Sf9細(xì)胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長。在感染復(fù)數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-結(jié)腸特異性基因感染細(xì)胞。6小時后，除去培養(yǎng)基，用SF900II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。感染72小時后在低滲磷酸鹽緩沖液中進行細(xì)胞裂解，從感染細(xì)胞純化結(jié)腸特異性蛋白質(zhì)，并進一步經(jīng)離子交換層析、篩選層析和反相層析純化。
在以上所述的教導(dǎo)下，本發(fā)明的許多改良和變化是可能的，因此，在附屬權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以以不同于以上特定描述的方式實施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI，ET AL.(ii)發(fā)明名稱人類結(jié)腸特異性基因(iii)序列數(shù)6個(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)ZIP07068(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸磁盤(B)計算機IBM PS/2(c)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(Vi)當(dāng)前申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(Vii)在先申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORYD.
(B)登記號36,134(c)卷號/文檔號325800-(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1114個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GCACGAGGCC AAACAGATTT GCAGATCAAG GAGAACCCAG GAGTTTCAAA GAAGCGCTAG 60TAAGGTCTCT GAGATCCTTG CACTAGCTAC ATCCTCAGGG TAGGAGGAAG ATGGCTTCCA 120GAAGCATGCG GCTGCTCCTA TTGCTGAGCT GCCTGGCCAA AACAGGAGTC CTGGGTGATA 180TCATCATGAG ACCCAGCTGT GCTCCTGGAT GGTTTTACCA CAAGTCCAAT TGCTATGGTT 240ACTTCAGGAA GCTGAGGAAC TGGTCTGATG CCGAGCTCGA GTGTCAGTCT TACGGAAACG 300GAGCCCACCT GGCATCTATC CTGAGTTTAA AGGAAGCCAG CACCATAGCA GAGTACATAA 360GTGGCTATCA GAGAAGCCAG CCGATATGGA TTGGCCTGCA CGACCCACAG AAGAGGCAGC 420AGTGGCAGTG GATTGATGGG GCCATGTATC TGTACAGATC CTGGTCTGGC AAGTCCATGG 480GTGGGAACAA GCACTGTGCT GAGATGAGCT CCAATAACAA CTTTTTAACT TGGAGCAGCA 540ACGAATGCAA CAAGCGCCAA CACTTCCTGT GCAAGTACCG ACCATAGAGC AAGAATCAAG 600ATTCTGCTAA CTCCTGCACA GCCCCGTCCT CTTCCTTTCT GCTAGCCTGG CTAAATCTGC 660TCATTATTTC AGAGGGGAAA CCTAGCAAAC TAAGAGTGAT AAGGGCCCTA CTACACTGGC 720TTTTTTAGGC TTAGAGACAG AAACTTTAGC ATTGGCCCAG TAGTGGCTTC TAGCTCTAAA 780TGTTTGCCCC GCCATCCCTT TCCACAGTAT CCTTCTTCCC TCCTCCCCTG TCTCTGGCTG 840TCTCGAGCAG TCTAGAAGAG TGCATCTCCA GCCTATGAAA CAGCTGGGTC TTTGGCCATA 900AGAAGTAAAG ATTTGAAGAC AGAAGGAAGA AACTCAGGAG TAAGCTTCTA GACCCCTTCA 960GCTTCTACAC CCTTCTGCCC TCTCTCCATT GCCTGCACCC CACCCCAGCC ACTCAACTCC 1020TGCTTGTTTT TCCTTTGGCC ATAGGAAGGT TTACCAGTAG AATCCTTGCT AGGTTGATGT 1080GGGCCATACA TTCCTTTAAT AAACCATTGT GTAC 1114(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度158個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu5 10 15Ala Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys20 25 30Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe35 40 45Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser50 55 60Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu65 70 75Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln80 85 90Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp95 100 105Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly110 115 120Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn125 130 135Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg Gln140 145 150His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro15權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括選自下組的成員(a)一種編碼包含SEQ ID NO2所示的1至158位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)一種編碼由包含在ATCC 97129號保藏物中的DNA編碼的成熟多肽的多核苷酸；(c)一種能夠與(a)或(b)的多核苷酸雜交，并且與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％的相同性的多核苷酸；和(d)一種(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，該多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2所示的1至158位氨基酸的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸具有與選自下組的成員雜交并且與選自下組的成員具有至少70％的相同性的至少10個堿基對(a)從人類基因轉(zhuǎn)錄的RNA，所說的基因包括與選自由SEQ IDNO1組成的組的DNA具有至少90％的相同性的DNA；以及(b)相應(yīng)于(a)的RNA的DNA。
5.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
6.一種用權(quán)利要求5的載體經(jīng)基因工程操作的宿主細(xì)胞。
7.一種產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞表達由所說的DNA編碼的多肽。
8.一種產(chǎn)生能夠表達多肽的細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求5的載體對細(xì)胞進行基因工程操作。
9.一種由權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的多肽，其包括選自下組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；(ii)一種由ATCC 97129號保藏物之cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
10.一種權(quán)利要求9的多肽的興奮劑。
11.一種權(quán)利要求9的多肽的拮抗劑。
12.一種治療需要抑制結(jié)腸特異性基因蛋白質(zhì)之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求11的拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所說的拮抗劑是一種多肽，并且其中所說的治療有效量的拮抗劑是通過對患者提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達所說的多肽來施用的。
14.一種治療需要結(jié)腸特異性基因蛋白質(zhì)之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權(quán)利要求9的多肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所說的治療有效量的多肽是通過對患者提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達所說的多肽來施用的。
16.一種篩選化合物以鑒別權(quán)利要求9的多肽的拮抗劑的方法，該方法包括在有利于氧化還原反應(yīng)的條件下，在待篩選的化合物存在下將所說的多肽與同時進行氧化和還原的組分組合；和測定所說化合物抑制所說反應(yīng)的能力。
17.一種診斷宿主中結(jié)腸疾病的方法，該方法包括測定來源于宿主非結(jié)腸組織樣品中人類基因的轉(zhuǎn)錄，所說的基因具有這樣的編碼部分，其包括與選自由SEQ ID NO1的DNA組成的組的DNA具有至少90％的相同性的DNA，其中所說的轉(zhuǎn)錄指示宿主中的結(jié)腸疾病。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說的轉(zhuǎn)錄通過檢測從所說的人類基因轉(zhuǎn)錄的RNA的改變的水平的存在來測定。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所說的轉(zhuǎn)錄通過檢測互補于從所說的人類基因轉(zhuǎn)錄的RNA的DNA的改變的水平的存在來測定。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所說的轉(zhuǎn)錄通過檢測所說的人類基因之表達產(chǎn)物的改變的水平的存在來測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了人類結(jié)腸特異性基因多肽和編碼這些多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法。本發(fā)明也公開了將這種多核苷酸和多肽用作結(jié)腸癌診斷標(biāo)記和用作確定結(jié)腸癌是否已轉(zhuǎn)移之藥劑的方法。本發(fā)明也公開了對結(jié)腸特異性基因多肽特異性的抗體,其可以用于導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞和用作結(jié)腸癌疫苗的一部分。本發(fā)明還公開了篩選所述多肽的興奮劑和拮抗劑的方法以及所述拮抗劑的治療用途。
文檔編號C12R1/19GK1194009SQ95197931
公開日1998年9月23日 申請日期1995年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者丹尼爾·R·索佩特, 李毅, 帕特里克·J·迪龍 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司