專利名稱：D-山梨醇脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的D-山梨醇脫氫酶、生產(chǎn)該酶的方法、以及用該酶生產(chǎn)酮糖特別是L-山梨糖的方法。
如上面所提到的，本發(fā)明提供的這種新的D-山梨醇脫氫酶(此后稱之為SLDH)催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化。L-山梨糖是生產(chǎn)維生素C的重要中間體。
催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化的酶是已知的。J.T.Cummins，T.E.King和V.H.Cheldelin(J.Biol.Clem.，224，323-329，1957)曾報道過弱氧化醋桿菌(即弱氧化葡糖桿菌)的無細胞提取物含有三種參與D-山梨醇氧化途徑的酶。已經(jīng)純化其中兩種催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化的酶。其中一種是由T.Sugisawa，T.Hoshino和A.Fujiwara從生黑葡糖桿菌IFO3293的可溶性部分分離出的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(此后稱之為NADP)依懶性L-山梨糖還原酶(Agric.Biol.Chem.，55，2043-2049，1991)，另一種是由E.Shginagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ame yama從弱氧化葡糖桿菌的變種aIFO3254分離出的膜結(jié)合型的D-山梨醇脫氫酶(Agric.Biol.Chem.，46，135-14l，1982)。
但本發(fā)明提供的SLDH在酶的亞單位的結(jié)構(gòu)、分子量、底物特異性和最適pH方面明顯區(qū)別于上述兩種酶。MADP-依懶性L-山梨糖還原酶的分子量是60,000，但由本發(fā)明提供的SLDH的分子量是由分子量為79,000±5,000的同源亞單位組成的，并且不需要NADP催化該反應(yīng)。在另一方面，由E.Shinagawa等人分離的膜結(jié)合型D-山梨醇脫氫酶是由分子量為63,000、51,000和17,000的三種亞單位組成的，并且特異性氧化D-山梨醇，還以與D-山梨醇的反應(yīng)速率的5％氧化D-甘露糖醇，但不氧化D-阿糖醇或赤蘚醇。另外，他們指出該酶的最適pH為4.5，在pH5.0時酶活性是穩(wěn)定的，而在pH7.0時92％的活性喪失。但是，本發(fā)明的SLDH不僅氧化D-山梨醇和D-甘露糖醇，而且還氧化D-阿糖醇和赤蘚醇，其最適pH為6.0，即使在pH8.0時活性也是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的一個目的是提供這種新的純化形式的酶SLDH，該酶作用于D-山梨醇生成L-山梨糖(即催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化)，并具有下述物化性質(zhì)a)分子結(jié)構(gòu)由分子量為79,000±5,000的同源亞單位組成。b)底物特異性作用于多元醇c)最適pH6.0-7.0。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)這種新的酶SLDH的方法，該方法是培養(yǎng)能在細胞中產(chǎn)生SLDH的方法，該方法是培養(yǎng)能在細胞中產(chǎn)生SLDH的屬于葡糖桿菌或醋桿菌屬的微生物、或其突變菌株，破碎細胞，從被破碎的細胞的無細胞提取物中分離和純化該酶，優(yōu)選從微生物的膜部分分離和純化該酶。本發(fā)明還有一個目的是提供用所述酶SLDH制備L-山梨糖的方法。
按照下文的實施例制備的新SLDH的純化樣品的物化性質(zhì)如下1)酶活性本發(fā)明的新的SLDH按照下列反應(yīng)式在電子受體的存在下催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化D-山梨醇＋電子受體→L-山梨糖＋還原型電子受體。
該酶不用氧作為電子受體。通過用氧作為可能的電子受體該酶不具備將D-山梨醇轉(zhuǎn)化成L-山梨糖的催化活性證明了這一點。另外，通過溶解的氧探針進行檢測表明未在反應(yīng)混合物中檢測到氧的消耗。但是，任何能作為電子受體的常用化合物均可與本發(fā)明的酶結(jié)合使用。
可用2，6-二氯靛酚(此后稱之為DCIP)，吩嗪硫酸甲酯(此后稱之為PMS)，鐵氰化物或細胞色素C作為電子受體。
按下述方法進行酶的分析。用于測定D-山梨醇脫氫酶活性的基礎(chǔ)反應(yīng)混合物包括50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，0.25mMDCIP和0.325mM PMS，測試前臨時配制。光路為1-cm的比色池中含有0.4ml基礎(chǔ)反應(yīng)混合物、0.1ml的0.4M D-山梨醇和酶溶液，總體積為0.51ml。對比池中含有除底物外的所有成分。于25℃加入D-山梨醇開始反應(yīng)，于600nm通過DCIP的初始還原速率測定酶的活性。一個酶單位定義為每分鐘催化/微摩爾DCIP還原的酶量。在pH6.0時DCIP的消光系數(shù)為10.8mM-1。2)底物特異性用如上面1)中所述的同樣的酶分析法測定酶的底物特異性，但用各種底物溶液(100mM)代替D-山梨醇。測定結(jié)果示于表1。在測試物中，D-山梨醇、D-阿糖醇、赤蘚醇和甘油被高度氧化，并且在D-山梨醇反應(yīng)速率的49.9和66.6％下D-甘露糖醇和D-阿東糖醇也被氧化。表1.純化的D-山梨醇脫氫酶的底物特異性
a)用從底物D-山梨醇獲得的反應(yīng)速率的百分比表示相對活性。3)最適pH用如上面1)中所述的同樣的酶分析法測定SLDH的反應(yīng)速率與pH間的相互關(guān)系，但用不同的pH和緩沖液。結(jié)果示于表2。酶顯示出最適pH值為6.0-7.0，并且在pH6.0時活性最高。
表2.SLDH活性的最適pH
a)用在pH6.0的磷酸鉀緩沖液中的活性的百分數(shù)表示數(shù)據(jù)。4)pH穩(wěn)定性將酶于4℃在各種pH的緩沖液中放置16小時，然后用如上面1)中所述的酶分析法測定殘余活性。測定結(jié)果示于表3。在pH7.0-9.0之間保持了60％以上的活性。
表3.SLDH活性的pH穩(wěn)定性
a)用在pH8.0的McIlvain緩沖液中的活性的百分數(shù)表示數(shù)據(jù)。5)熱穩(wěn)定性在0.01M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中將酶于各種溫度下保溫5分鐘來測試熱穩(wěn)定性。用如上面1)中所述的酶分析法測定殘余活性，然后將處理后的酶立即在冰水中冷卻。結(jié)果示于表4。在高至35℃時酶穩(wěn)定，但在40、50和60℃保溫后其活性分別喪失約20.70和90％。
表4.SLDH活性的溫度穩(wěn)定性
a)用在20℃下的活性的百分數(shù)表示數(shù)據(jù)。6)最適溫度用如上面1)中所述的同樣的分析法在20-60℃的溫度下測定酶活性。結(jié)果示于表5。在20-40℃酶顯示出最適溫度，并于30℃時活性最高。在45和50℃下觀察其活性分別降低60和70％，在60℃測定無活性。
表5.SLDH活性的最適溫度
a)用在30℃下的活性的百分數(shù)表示數(shù)據(jù)。7)金屬離子和抑制劑的作用通過用如上面1)中所述的同樣的分析法測定活性來檢驗金屬離子和抑制劑對SLDH活性的影響。向基礎(chǔ)反應(yīng)混合物中加入酶溶液后攪拌加入各種金屬溶液，并加入D-山梨醇開始反應(yīng)。如表6中所示，通過加入0.9l和1.79mM Co2+使活性增加了8-17％。但在加入0.9lmM Cu2+和Fe3+的情況下則受到強烈抑制，而加入Zn2+則受到44-68％的抑制?？疾榱烁鞣N抑制劑對活性的影響。如表7所示，鹽酸喹寧和一碘代乙酸鹽的抑制作用分別為25％和75％。
表6.各種金屬對D-山梨醇脫氫酶活性的影響
相對活性以在無表中所示的金屬化合物的情況下獲得的反應(yīng)速率的百分數(shù)表示。
表7.抑制劑對D-山梨醇脫氫酶活性的影響
相對活性以在無表中所示的任何抑制劑的情況下獲得的反應(yīng)速率的百分數(shù)表示。8)底物濃度對反應(yīng)速率的影響測定D-山梨醇的濃度從0.5至80mM變化時的氧化反應(yīng)速度，從而測出D-山梨醇的Km值。以DCIP作為反應(yīng)的電子受體計算的表觀未氏常數(shù)為18mM。9)分子量用體積排阻凝膠柱在280nm通過HPLC測定天然SLDH的分子量，流速為每分鐘1.0ml。純化的SLDH是由在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下分子量為79,000±5,000的同源亞單位組成的。10)純化步驟與已知的純化方法相結(jié)合進行SLDH的純化，例如離子交換色譜、液相色譜、吸附色譜、凝膠-過濾色譜、凝膠-電泳、鹽析和透析。
可通過培養(yǎng)適宜的微生物、破碎細胞并從被破碎細胞的無細胞提取物中優(yōu)選從微生物的膜部分中分離和純化該酶來制備本發(fā)明提供的SLDH。
用于本發(fā)明的微生物是屬于葡糖桿菌和醋桿菌屬的微生物。所說微生物的突變菌株或變種也可用于本發(fā)明。
最優(yōu)選用于本發(fā)明的菌株的例子是白色葡糖桿菌IFO3250、白色葡糖桿菌IFO3251、白色葡糖桿菌IFO3253、Capsulatus葡糖桿菌IFO3462、Cerinus葡糖桿菌IFO3263、Cerinus葡糖桿菌IFO3264、Cerinus葡糖桿菌IFO3265、Cerinus葡糖桿菌IFO3267、Cerinus葡糖桿菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO327l、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO3274、gluconicus葡糖桿菌、IFO3171、gluconicus葡糖桿菌IFO3285、gluconicus葡糖桿菌IFO3286、工業(yè)葡糖桿菌IFO3260、生黑葡糖桿菌IFO3292、生黑葡糖桿菌IFO3293、生黑葡糖桿菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖桿菌IFO3276、氧化葡糖桿菌IFO3189、氧化葡糖桿菌sphaericus亞種IFO12467、roseus葡糖桿菌IFO3990、rubiginosus葡糖桿菌IFO3244、弱氧化葡糖桿菌IFO3130、弱氧化葡糖桿菌IFO3172、弱氧化葡糖桿菌IFO3254、弱氧化葡糖桿菌IFO3255、弱氧化葡糖桿菌IFO3256、弱氧化葡糖桿菌IFO3257、弱氧化葡糖桿菌IFO3258、弱氧化葡糖桿菌IFO3289、弱氧化葡糖桿菌IFO3290、弱氧化葡糖桿菌IFO3291、醋化醋桿菌醋亞種IFO3281、醋化醋桿菌奧爾蘭亞種IFO3259、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO3288、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13772、以及液化醋桿菌IFO12388。可用于本發(fā)明方法的這些微生物包括保存在可發(fā)放給任何需求者的公開保藏單位(培養(yǎng)物保藏中心)，例如日本大阪發(fā)酵研究所(Institute of Fermentation Osaka，Japa)(IFO)。其中，優(yōu)選的微生物弱氧化葡糖桿菌IFO3255已于1995年2月13日按布達佩斯條約保存在德國Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)。給予的保藏號為DSM9715。
微生物可在通氣條件下于補充了適宜營養(yǎng)物質(zhì)的水介質(zhì)中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)可在pH3.5-8.0，優(yōu)選5.0-7.5下進行。培養(yǎng)時間根據(jù)所用微生物和營養(yǎng)介質(zhì)而改變，優(yōu)選約6至100小時。進行培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范圍是約20℃至約40℃，更優(yōu)選約25℃至約35℃。
通常要求培養(yǎng)基中含有這樣的營養(yǎng)物質(zhì)如可固化的碳源；如甘油、D-甘露糖醇、D-山梨醇、赤蘚醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選D-山梨醇、D-甘露糖醇或甘油；可消化的氮源如有機物質(zhì)，例如胨、酵母萃、面包酵母和玉米漿，以及無機物質(zhì)，如硫酸銨、氯化銨、和硝酸鉀；維生素；以及微量元素。
下面簡述培養(yǎng)后從微生物分離和純化SLDH的實施方案。(1)通過離心或過濾從液體培養(yǎng)肉湯中收集細胞。(2)用水、生理鹽水或具有適宜pH的緩沖液洗滌收集的細胞。(3)將洗滌后的細胞懸浮于緩沖液中并用勻漿器、超聲發(fā)生器、弗式壓碎器或用溶菌酶處理等方式破碎細胞得到破碎細胞的溶液。(4)從破碎細胞的無細胞提取物，優(yōu)選從微生物的膜部分分離和純化SLDH。
由本發(fā)明提供的SLDH可用作從D-山梨醇生產(chǎn)L-山梨糖的催化劑。該反應(yīng)應(yīng)當在如磷酸緩沖液、tris緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等溶劑中，在電子受體如DCIP、PMS、鐵氰化物、細胞色素C等的存在下，在pH值為約5.5至約8.0，優(yōu)選從6.0至7.0下進行。進行該反應(yīng)優(yōu)選的溫度范圍是從20℃至約50℃，更優(yōu)選從20℃至40℃。當pH和溫度分別設(shè)置為約6.5-7.5和30℃時，反應(yīng)通常給出特別好的結(jié)果?；谄渌磻?yīng)條件，如酶的量、D-山梨醇、電子受體、pH、溫度或通氣速度，D-山梨醇在約2至24小時之內(nèi)，優(yōu)選在約12小時內(nèi)全部轉(zhuǎn)化為L-山梨糖。溶劑中D-山梨醇的濃度根據(jù)其它反應(yīng)條件而變化，但通常適宜從約10至約300g/L，最優(yōu)選從約10至約200g/L。
除此之外，所培養(yǎng)的細胞還可用于從多元醇生產(chǎn)酮糖，尤其是從D-山梨醇生產(chǎn)L-山梨糖。通過與離心和濃縮這樣的常規(guī)方法相結(jié)合，分離從溶劑中的D-山梨醇生產(chǎn)的L-山梨糖。但是，含未經(jīng)過分離步驟的L-山梨糖的溶劑也可用作用賴希斯坦法工業(yè)化生產(chǎn)維生素C的原料。
在反應(yīng)中，酶也可以與適宜載體的固定化狀態(tài)使用?？墒褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域通常已知的固定化酶的任何方法。例如，酶可以直接結(jié)合于含官能基團的膜、顆?；蚱渌问降臉渲?，其也可以通過含雙官能團的橋連化合物，例如戊二醛，結(jié)合到樹脂上。
下列實施例說明了本發(fā)明。實施例1D-山梨醇脫氫酶的制備(1)弱氧化葡糖桿菌IFO3255的培養(yǎng)由大阪發(fā)酵研究所(IFO)提供弱氧化葡糖桿菌IFO3255(DSM9715)，并用于整個研究過程中。培養(yǎng)基在1升去離水中含有20g D-山梨醇、3g醇母萃、3g牛肉膏、3g玉米漿、10g多聚蛋白胨、1g脲、1g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、以及1g CaCO3。在加入CaCO3前用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.0。搖瓶培養(yǎng)是在旋轉(zhuǎn)振蕩下通氣進行一天，或在30℃于30升發(fā)酵罐中進行21.5小時，以500轉(zhuǎn)/分鐘攪拌和以15升/分鐘通氣。將發(fā)酵液于400xg離心10分鐘除去碳酸鈣，然后于10,000xg使細胞沉淀。將細胞餅用生理鹽水洗滌一次。從而，從20升培養(yǎng)物中獲得了完整的細胞(凈重200g)。將細胞于-20℃冷凍備用。(2)膜部分的制備將細胞(凈重100g)懸浮于200ml 50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并在1400kg/cm2的壓力下通過弗氏壓力細胞壓碎器。離心除去完整的細胞，將上清液(無細胞提取物)于80,000xg離心1小時，該沉淀被認為是膜部分(凈重2.28g)。(3)溶解從弱氧化葡糖桿菌IFO3255(DSM9715)的膜部分分離SLDH。首先用E.Shinagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ameyama報道的方法(Agric，Biol.chem.，46，135-141，1982)溶解SLDH。通過用含有1％Triton X-100、0.1MKCl、0.1M D-山梨醇和約10mg/ml膜蛋白的0.01M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)于5℃處理2小時來進行溶解。但未從膜部分回收到SLDH活性，并且在上述條件下在溶解的上清液和殘余膜部分中均喪失了全部活性。
因此，研究了溶解條件如pH值、緩沖液濃度、洗滌劑和KCl對SLDH活性的影響。如圖8所示，當將膜部分于5℃于含1％Triton X-100和0.04M D-山梨醇的0.05M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中混合2小時，74％的SLDH活性從膜部分回收到溶解的上清液中。酶不與正辛基-β-D-吡喃葡糖苷混溶，并且加入0.1M KCl則活性喪失。
表8.膜結(jié)合型D-山梨醇脫氫酶的溶解
為了從弱氧化葡糖桿菌IFO3255(DSM9715)的膜部分得到用于分離步驟{實施例1-(4)}的SLDH活性部分，將冷凍膜融化并懸浮于緩沖液(pH7.O)中，得到約10mg/ml蛋白，然后加入1％Triton X-100和0.1M D-山梨醇。將懸浮液于180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩2小時，然后于80,000xg離心60分鐘除去沉淀。在溶解的上清液(200ml)中回收到SLDH活性。(4)二乙氨乙基(此后稱之為DEAE)-纖維素柱層析用含0.0SM D-山梨醇和0.1％Triton X-100的緩沖液(pH7.0)平衡并洗滌DEAE-纖維素柱(2.5×30cm)，將從實施例1-(3)獲得的溶解的上清液(200ml)加到柱上。用在同樣緩沖液中的0.1M NaCl進行酶的洗脫。收集具有酶活性的部分。(5)DEAE-Sepharose柱層析將從上述步驟收集的酶部分(125ml)對兩批含0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的1升緩沖液透析，上樣于用同種緩沖液平衡并洗滌過的DEAE-Sepharose柱(1.5×50cm)，用NaCl(0-0.2M)線性梯度洗脫。在NaCl濃度范圍在0.16-0.18M洗脫了主要酶活性。(6)羥基磷灰石柱層析將從上述步驟收集的酶部分(40ml)對兩批含0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的500ml緩沖液透析。將一部分酶(5ml)上樣于平衡的羥基磷灰石柱(2.5×20cm)。在洗滌柱的過程中洗脫酶活性。重復同樣的制備，然后收集具有酶活性的部分。將活性部分對緩沖液透析后總體積為52ml。然后將該部分超濾濃縮至10ml(PM10，Amicon)。(7)Sephacryl HR300柱層析用含0.05M NaCl，0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的緩沖液(pH7.0)平衡Sephacryl HR300柱(1×120cm)，將從上述步驟獲得的一部分酶組分(2ml)上柱并展開。重復該分級分離步驟并合并活性部分。收集對緩沖液(13ml)透析的活性部分并于-80℃保存。
酶的純化步驟總結(jié)示于表9中。
表9.從弱氧化葡糖桿菌IFO3255(DSM9715)純化膜結(jié)合型D-山梨醇脫氫酶
(8)分離出的酶的純化用純化后比活性為45.43單位/mg蛋白(0.2mg/ml)的酶進行下面的分析。
用體積排阻凝膠柱(TSK凝膠G3000 SWXL柱，7.8×300mm)以含0.3M NaCl的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡柱子，通過HPLC(檢測，254μm；流速，1ml/分鐘)測定天然D-山梨醇脫氫酶的分子量。使用的分子量標準品為氰鈷銨(1.35K)、肌紅蛋白(17K)、卵清蛋白(44K)、r-球蛋白(158K)和甲狀腺球蛋白。純化的酶顯示出一個單獨的峰且測定的分子量約為800,000±50,000。
在十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在下，顯示出一條單獨的帶的酶分子量約為79,000±5,000。從這些結(jié)果看出，純化的SLDH含有10個同源亞單位。(9)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定為了鑒定從每種物質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，將分別含有0.04M D-山梨醇、D-甘露糖醇、D-阿糖醇、赤蘚醇、D-阿東糖醇和甘油、以及8mM PMS的反應(yīng)混合物與2.0單位的純化酶于0.2M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中在30℃保溫4小時。用HPLC和薄層色譜法分析反應(yīng)產(chǎn)物。分別從D-山梨醇、D-甘露糖醇、D-阿糖醇、赤蘚醇、D-阿東糖醇和甘油生成了L-山梨糖、D-果糖、D-木酮糖、赤蘚糖、D-核酮糖和二羥基丙酮。實施例2由純化的SLDH生產(chǎn)L-山梨糖將含有0.2ml純化的SLDH(0.04mg蛋白)、0.04ml 0.2MPMS、0.1ml 0.4M D-山梨醇、0.4ml 0.5M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和0.3ml水的反應(yīng)混合物(總體積1.04ml)于30℃緩緩攪拌保溫。結(jié)果，以約1.3mg/小時的速率形成L-山梨糖。實施例3膜結(jié)合型D-山梨醇脫氫酶的分布用本發(fā)明提供的抗SLDH的抗體通過免疫印跡分析檢測膜結(jié)合型D-山梨醇脫氫酶在各種醋酸菌中的分布。將各種醋酸菌的細胞勻漿液用SDS處理，將各種含3-5μg蛋白的溶液20μl加到SDS聚丙烯酰胺凝膠上，然后進行電泳。將凝膠中展開的蛋白條帶電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上并與抗體反應(yīng)。用Bio-Rad的羊抗一兔免疫印跡試劑盒處理硝化纖維素膜，觀察哪種微生物在分子量(MW)為79,000±1,000的位置上顯示出陽性條帶。如表10所示，測試的所有葡糖桿菌菌株和醋化醋桿菌奧爾蘭亞種IFO3259、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO3288和木質(zhì)醋化醋桿菌IFO13772均顯示出陽性條帶。醋化醋桿菌醋亞種IFO3281和液化醋桿菌IFO12388的細胞勻漿液在MW79,000±1,000的位置上顯示出微弱的陽性條帶。
表10.用SLDH的抗體進行免疫印跡分析
+在MW79,000±1,000的位置上明顯檢出交叉條帶。
權(quán)利要求
1.催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化并具有下列物化性質(zhì)的純化形式的D-山梨醇脫氫酶a)分子結(jié)構(gòu)由分子量為79,000±5,000的同源亞單位組成。b)底物特異性作用于多元醇。c)最適pH6.0-7.0
2.根據(jù)權(quán)利要求1的D-山梨醇脫氫酶，其具有下列物化性質(zhì)a)分子結(jié)構(gòu)由分子量為79,000±5,000的同源亞單位組成。b)底物特異性作用于多元醇。c)最適pH6.0-7.0d)pH穩(wěn)定性7.0-9.0e)最適溫度約20-40℃f)抑制作用被Cu2+和Fe3+抑制
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的D-山梨醇脫氫酶，其是從屬于葡糖桿菌或醋桿菌的微生物、或其突變菌株產(chǎn)生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的D-山梨醇脫氫酶，其中的微生物是選自白色葡糖桿菌IFO3250、白色葡糖桿菌IFO3251、白色葡糖桿菌IFO3253、cupsulatus葡糖桿菌IFO3462、Cerinus葡糖桿菌IFO3263、Cerinus葡糖桿菌IFO3264、Cerinus葡糖桿菌IFO3265、Cerinus葡糖桿菌IFO3267、Cerinus葡糖桿菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO3271、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO3274、gluconicus葡糖桿菌IFO3171、gluconicus葡糖桿菌IFO3285、gluconicus葡糖桿菌IFO3286、工業(yè)葡糖桿菌IFO3260、生黑葡糖桿菌IFO3292、生黑葡糖桿菌IFO3293、生黑葡糖桿菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖桿菌IFO3276、氧化葡糖桿菌IFO3189、氧化葡糖桿菌sphaericus亞種IFO1246、roseus葡糖桿菌IFO3990、rubiginosus葡糖桿菌IFO3244、弱氧化葡糖桿菌IFO3130、弱氧化葡糖桿菌IFO3172、弱氧化葡糖桿菌IFO3254、弱氧化葡糖桿菌IFO3255、弱氧化葡糖桿菌IFO3256、弱氧化葡糖桿菌IFO3257、弱氧化葡糖桿菌IFO3258、弱氧化葡糖桿菌IFO3289、弱氧化葡糖桿菌IFO3290、弱氧化葡糖桿菌IFO3291、醋化醋桿菌醋亞種IFO3281、醋化醋桿菌奧爾蘭亞種IFO3259、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO3288、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13772、以及液化醋桿菌IFO12388。
5.生產(chǎn)權(quán)利要求1、2、3和4中任意一項中所定義的D-山梨醇脫氫酶的方法，該方法包括培養(yǎng)能在細胞中產(chǎn)生所說D-山梨醇脫氫酶的屬于葡糖桿菌或醋桿菌屬的微生物或其突變菌株，并從細胞中分離所說的D-山梨醇脫氫酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的微生物是選自白色葡糖桿菌IFO3250、白色葡糖桿菌IFO3251、白色葡糖桿菌IFO3253、capsulatus葡糖桿菌IFO3462、Cerinus葡糖桿菌IFO3263、Cerinus葡糖桿菌IFO3264、Cerinus葡糖桿菌IFO3265、Cerinus葡糖桿菌IFO3267、Cerinus葡糖桿菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO3271、dioxyacetonicus葡糖桿菌IFO3274、gluconicus葡糖桿菌IFO3171、gluconicus葡糖桿菌IFO3285、gluconicus葡糖桿菌IFO 3286、工業(yè)葡糖桿菌IFO3260、生黑葡糖桿菌IFO3292、生黑葡糖桿菌IFO3293、生黑葡糖桿菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖桿菌IFO3276、氧化葡糖桿菌IFO3189、氧化葡糖桿菌sphaericus亞種IFO1246、roseus葡糖桿菌IFO3990、rubiginosus葡糖桿菌IFO3244、弱氧化葡糖桿菌IFO3130、弱氧化葡糖桿菌IFO3172、弱氧化葡糖桿菌IFO3254、弱氧化葡糖桿菌IFO3255、弱氧化葡糖桿菌IFO3256、弱氧化葡糖桿菌IFO3257、弱氧化葡糖桿菌IFO3258、弱氧化葡糖桿菌IFO3289、弱氧化葡糖桿菌IFO3290、弱氧化葡糖桿菌IFO3291、醋化醋桿菌醋亞種IFO3281、醋化醋桿菌奧爾蘭亞種IFO3259、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO3288、醋化醋桿菌木質(zhì)亞種IFO13772、以及液化醋桿菌IFO12388。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其包括培養(yǎng)微生物并破碎細胞，然后從破碎細胞的無細胞提取物中分離和純化D-山梨醇脫氫酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項的方法，其包括在pH3.5至8.0，優(yōu)選5.O至7.5，于通氣條件下在加有適宜營養(yǎng)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中進行微生物培養(yǎng)，溫度范圍為從約20℃至約40℃，優(yōu)選從約25℃至約35℃。
9.從D-山梨醇生產(chǎn)L-山梨糖的方法，其包括在如權(quán)利要求1、2、3和4中任意一項所定義的D-山梨醇脫氫酶和電子受體的存在下，在液體培養(yǎng)基中，于通氣條件下氧化D-山梨醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的從D-山梨醇生產(chǎn)L-山梨糖的方法，其中進行氧化的條件是pH值從約5.5至約8.0，優(yōu)選從6.0至7.0，溫度范圍從約20至約50℃，優(yōu)選從20℃至40℃。
全文摘要
純化形式的D-山梨醇脫氫酶，其催化D-山梨醇向D-山梨糖的氧化，其分子結(jié)構(gòu)包括分子量為79,000±5,000的同源亞單位，對多元醇有底物特異性并且最適pH為6.0-7.0。所說的D-山梨醇脫氫酶可通過下列步驟生產(chǎn)培養(yǎng)在細胞中能產(chǎn)生D-甘露醇脫氫酶的屬于葡糖桿菌或醋桿菌的微生物或其突變菌株；從細胞中分離該酶，如破碎細胞并從破碎后的細胞的無細胞提取物中分離。如此分離的D-山梨醇脫氫酶可用于催化D-山梨醇向D-山梨糖的轉(zhuǎn)化，后者是生產(chǎn)維生素C的重要中間體。
文檔編號C12R1/01GK1141341SQ9610253
公開日1997年1月29日 申請日期1996年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月27日
發(fā)明者星野達雄, 尾島節(jié)子, 杉澤輝秀 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司