專利名稱：D-泛酸內(nèi)酯水解酶和編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于D，L-泛酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分(opticalresolution)的新的酶及編碼該酶的基因，該拆分是通過(guò)D-選擇性不對(duì)稱水解進(jìn)行的。本發(fā)明主要涉及具有來(lái)自尖鐮孢(FusariumOxysporum)的天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性的蛋白質(zhì)以及編碼它們的基因。再詳細(xì)點(diǎn)說(shuō)，本發(fā)明涉及含有編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列的DNA；以及用該DNA轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；用宿主細(xì)胞制造D-泛酸內(nèi)酯水解酶的方法；還涉及這些蛋白質(zhì)以及宿主細(xì)胞的用途。
D-泛酸內(nèi)酯是制造醫(yī)學(xué)上或生理學(xué)上有用的重要的維生素D-泛酸以及雙泛酰硫乙胺的中間體。以前，D-泛酸內(nèi)酯是通過(guò)光學(xué)拆分化學(xué)方法合成的D，L-泛酸內(nèi)酯制造的。然而，這個(gè)方法的缺點(diǎn)是需要價(jià)格高的奎寧、番木鱉堿等拆解試劑，D-泛酸內(nèi)酯的回收也不容易。為了解決這樣的問(wèn)題，本發(fā)明人于特開(kāi)平3-65198號(hào)以及特開(kāi)平4-144681號(hào)公報(bào)中提出了通過(guò)酶的不對(duì)稱水解光學(xué)拆分D，L-泛酸內(nèi)酯的方法。
即D-泛酸內(nèi)酯的制造方法和利用下列各屬微生物制造D-泛酸水解酶的方法。這些菌屬是鐮孢屬、柱孢屬(Cylindrocarpon)、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬(Nectoria)、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬。D-泛酸內(nèi)酯的制造方法的特征是，從上列各菌屬中選出具有水解內(nèi)酯能力的微生物，利用該微生物，有選擇地不對(duì)稱水解D，L-泛酸內(nèi)酯中的D-體，使它生成D-泛酸，分離該泛酸，將它轉(zhuǎn)換成D-泛酸內(nèi)酯。
但是這里提到的很多微生物未必都有可直接用于工業(yè)上的水解活性。為了使這些微生物具有的酶活性達(dá)到工業(yè)上可應(yīng)用的水平，需要就培養(yǎng)條件、活性誘導(dǎo)條件等進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的煩瑣而艱難的研究。由于這些微生物是真菌，菌體呈現(xiàn)出帶有各式各樣形態(tài)的菌絲狀。與具有單一形態(tài)的細(xì)菌等相比，存在著制備利于工業(yè)上生產(chǎn)用的固定化菌體相當(dāng)困難的問(wèn)題。還存在從菌體精制酶時(shí)，D-泛酸內(nèi)酯水解酶的回收率也相當(dāng)?shù)偷葐?wèn)題。
本發(fā)明的目的是解決這些問(wèn)題，通過(guò)改變D-泛酸內(nèi)酯水解酶本身使酶的活性急劇上升。就是說(shuō)，本發(fā)明弄清了編碼天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶，例如來(lái)源于尖鐮孢的天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因以及編碼具有與該酶同等活性的蛋白質(zhì)的基因，提供用含有編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞，以及提供用該宿主細(xì)胞制造這種蛋白質(zhì)的方法，還提供這些蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞的用途等。
本發(fā)明人考慮到如果從具有上述水解內(nèi)酯能力的微生物分離出編碼D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因，利用分離出的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因，開(kāi)發(fā)出效率高而且更有利于生產(chǎn)的D-泛酸內(nèi)酯生產(chǎn)系統(tǒng)，不僅可以解決上述各種各樣的問(wèn)題，而且有利于帶有更新功能的具有水解內(nèi)酯能力的酶的開(kāi)發(fā)以及使用了這種酶的技術(shù)開(kāi)發(fā)的很多方面。特別是本發(fā)明人成功地從可以生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的鐮孢屬微生物，如尖鐮孢中分離出了編碼具有水解D-泛酸內(nèi)酯活性的水解酶的新的基因，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及如下一些內(nèi)容具有天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性或同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或它的鹽，該蛋白質(zhì)的特征的部分多肽或它的鹽，編碼酶或蛋白質(zhì)的基因，例如，DNA、RNA等；利用基因重組技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行重組獲得含有該基因的載體或質(zhì)粒；用這樣的載體等轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，制造該蛋白質(zhì)或它的鹽的方法；利用基因操作獲得的宿主細(xì)胞和重組蛋白質(zhì)或它的鹽等進(jìn)行D、L-泛酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分，合成D-泛酸內(nèi)酯的方法以及稱之為固定化酶的生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯系統(tǒng)的手段。
本發(fā)明中給出了理想的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽，其特征是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上具有與該序列同等的氨基酸序列。
本發(fā)明主要是提供如下一些物質(zhì)及方法。
(1)具有天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性、或是實(shí)質(zhì)上具有與該酶同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或它的鹽；(2)上述第(1)項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，其中具有天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的蛋白質(zhì)來(lái)源于屬于下列各屬的微生物，即鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周剌座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬，節(jié)皮菌屬；(3)上述(1)記載的蛋白質(zhì)，其中具有天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的蛋白質(zhì)來(lái)自鐮孢屬微生物；(4)上述第(1)-(3)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或具有與該序列實(shí)質(zhì)上同等的氨基酸序列的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽；(5)上述第(1)-(4)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，其特征是在原核生物中表達(dá)外源性DNA序列獲得的產(chǎn)物；(6)上述第(1)-(5)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，其特征是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或具有與該序列實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列；(7)上述第(1)-(6)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)的部分多肽或它的鹽；(8)核酸，其特征是具有編碼上述第(1)-(7)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或它的部分多肽的堿基序列；(9)上述第(8)項(xiàng)記載的核酸，其特征是具有在序列表中序列號(hào)2表示的堿基序列中具有可譯框架部分或具有與該框架實(shí)質(zhì)上同等活性的堿基序列；(10)載體，其特征是含有上述第(8)或(9)項(xiàng)中記載的核酸；(11)轉(zhuǎn)化體，其特征是含有上述第(10)項(xiàng)記載的載體；(12)上述第(1)-(7)項(xiàng)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或它的部分多肽的制造方法，其特征是在適合增殖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述第(11)項(xiàng)記載的轉(zhuǎn)化體，使它生成含有作為重組蛋白質(zhì)的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或其鹽的上述第(1)-(7)項(xiàng)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或它的部分多肽；(13)D-泛酸內(nèi)酯的制造方法，該方法是利用上述第(1)-(7)項(xiàng)中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其部分多肽或上述第(11)項(xiàng)記載的轉(zhuǎn)化體通過(guò)D，L-泛酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分來(lái)制造D-泛酸內(nèi)酯。
更具體地講，本發(fā)明提供具有序列表中序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1給出了通過(guò)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的消化多肽的解析得到的氨基酸序列。
圖2給出了對(duì)應(yīng)于D-泛酸內(nèi)酯水解酶的消化多肽的cDNA氨基酸序列的部位。
圖3給出了以D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因組DNA為模板的PCR中使用的引物的結(jié)構(gòu)。
圖4給出了用于構(gòu)建D-泛酸內(nèi)酯水解酶表達(dá)載體的PCR中使用的引物的結(jié)構(gòu)。
圖5給出了D-泛酸內(nèi)酯水解酶的氨基酸序列和編碼該酶的堿基序列。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供了如下一些技術(shù)和方法，即編碼天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶，例如來(lái)源于尖鐮孢的天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或者是編碼實(shí)質(zhì)上具有與該酶同等活性的蛋白質(zhì)的基因的克隆、鑒定、特征序列的確定(測(cè)序)、該基因與表達(dá)載體的重組等操作，使用含有編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后培養(yǎng)、增殖，用該宿主細(xì)胞制造該蛋白質(zhì)、以及提供這些蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞的用途。以下按順序予以詳細(xì)地說(shuō)明。本發(fā)明還提供利用編碼上述D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的各種手段，利用如此分離得到的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因，提供效率高而且利于生產(chǎn)的D-泛酸內(nèi)酯水解酶生產(chǎn)系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及如下一些內(nèi)容具有天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性或是實(shí)質(zhì)上具有同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或它的鹽、該蛋白質(zhì)的特征部分多肽或它的鹽；編碼它們的基因、例如DNA、RNA等；利用基因重組技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行重組，獲得含有該基因的載體或質(zhì)粒；用這樣的載體等轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，制造該蛋白質(zhì)或它的鹽的方法；利用基因操作獲得的宿主細(xì)胞和重組蛋白或它的鹽等進(jìn)行D、L泛酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分，合成D-泛酸內(nèi)酯的方法以及稱之為固定化酶的生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯的系統(tǒng)方法。
本發(fā)明具體地說(shuō)明了理想的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽，其特征是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上具有與其同等的氨基酸序列，但本發(fā)明的D-泛酸內(nèi)酯水解酶包括任何具有水解D-泛酸內(nèi)酯能力的含有新的氨基酸序列的酶。只要是具有相當(dāng)?shù)乃釪-泛酸內(nèi)酯的活性的酶就可以。最理想的本發(fā)明的D-泛酸內(nèi)酯水解酶是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上具有與其同等和/或同一氨基酸序列的酶。
本發(fā)明的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因例如可用如下方法克隆。而基因重組技術(shù)如以下一些文獻(xiàn)報(bào)道的例如T.Maniatis et al.，“MolecularCloning”，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.T.(1989)；日本生化學(xué)會(huì)編、“續(xù)生的化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、基因研究法II”、東京化學(xué)同人(1986)；日本生化學(xué)會(huì)編、“新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))”東京化學(xué)同人(1992)；R.Wued.，“Methods in Enzymology”，Vol.68，Academic Press，NewYork(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100&101，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“ Methods inEuzymology”，Vol.153，154&155，Academic Press，New York(1987)。使用上述文獻(xiàn)記載的方法或其引文中記載的方法或是實(shí)質(zhì)上與這些方法相同的方法或是改進(jìn)方法可以進(jìn)行基因重組操作。這些方法和手段可以進(jìn)行改進(jìn)使其適合于本發(fā)明的目的。
1)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的部分基因組DNA的克隆破碎經(jīng)培養(yǎng)得到的尖鐮孢菌體，按常規(guī)方法將染色體DNA離心分離后，分解除去RNA、除去蛋白質(zhì)、精制DNA成分。關(guān)于這些操作參照“植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)農(nóng)村文化社、252頁(yè)”。若是具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的屬于鐮孢屬的微生物，用作DNA源最合適。作為鐮孢屬微生物例如可以用尖鐮孢IFO5942、半裸鐮孢(FusariumSemitectam)IFO30200等。
同樣，屬于柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂霉屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬的各種微生物中具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物也可用作DNA源。例如Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤倉(cāng)赤霉(Gibberella fujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)IFO4626，米根霉(Rhizopus Oryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，鏈孢粘帚霉(Gliocladium Catenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectria elegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露濕漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脈孢菌(Neurospora Crassa)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813，柄銹生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨頭霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。其中“IFO”代表財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所〔(郵序列號(hào)532)大阪市淀川區(qū)十三本町二丁日17番85號(hào)〕，這里給出的號(hào)碼代表財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所的目錄序列號(hào)。
2)探針的制作根據(jù)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的內(nèi)部多肽的氨基酸信息制備合成寡核苷酸引物。例如，根據(jù)從上述微生物中具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯酶水解能力的微生物純化D-泛酸內(nèi)酯水解酶的內(nèi)部多肽的氨基酸信息可以合成寡核苷酸引物。典型的情況是，根據(jù)氨基酸序列，制備簡(jiǎn)并的引物?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法制備引物，例如，使用DNA自動(dòng)合成裝置，按照磷酸二酯法，磷酸三酯法，亞磷酸酰胺方法等就可合成引物。具體來(lái)說(shuō)，將尖鐮孢IFO5942于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從培養(yǎng)得到的菌體純化D-泛酸內(nèi)酯水解酶，根據(jù)需要，用肽水解酶等切斷純化的酶，然后收集該酶內(nèi)部多肽的氨基酸序列的信息。從得到的氨基酸信息制備理想的合成的寡核苷酯引物。利用這一引物，再以D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因組DNA為模板，就可進(jìn)行PCR反應(yīng)了。PCR反應(yīng)可按著本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法或是按實(shí)質(zhì)上與該方法同樣的方法或改進(jìn)的方法進(jìn)行。例如可根據(jù)R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；Henry.a.Erlich，PCR Technology，Stockton Press等記載的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)?？墒褂檬惺鄣脑噭┖谢蛟噭┻M(jìn)行反應(yīng)。
對(duì)得到的擴(kuò)增的DNA片段測(cè)序，確認(rèn)含有與純化酶內(nèi)部多肽的氨基酸序列相同的堿基序列，然后用同位素標(biāo)記作成探針，用于以后的實(shí)驗(yàn)等。堿基序列的測(cè)定可用雙脫氧法，例如M13雙脫氧法、Maxam-Gilbert法等進(jìn)行。有時(shí)可以用市售的測(cè)序試劑盒，例如Taq染色引物循環(huán)測(cè)序試劑盒等，或是用堿基序列自動(dòng)測(cè)定儀，例如用熒光DNA測(cè)序儀進(jìn)行。為了用放射性同位素標(biāo)記探針，可以使用市售的標(biāo)記試劑盒，例如隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannhaim)等來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。
3)D-泛酸內(nèi)酯水解酶cNDA的克隆a)mRNA的制備和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建破碎培養(yǎng)得到的尖鐮孢菌體，按AGPC法提取全部RNA，再用適當(dāng)?shù)姆椒?，例如用寡dT纖維素柱純化mRNA。典型的純化mRNA操作可根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法或?qū)嵸|(zhì)上與該方法同樣的方法或是改進(jìn)方法進(jìn)行，也可按下列文獻(xiàn)記載的方法，例如胍-氯化銫法、硫氰酸胍法、苯酚法等方法進(jìn)行mRNA的純化，所說(shuō)的文獻(xiàn)是T.Maniatis etal.，“Molecular Cloning”，2nd Ed.，Chapter 7.Cold Spring HarborLaboratory Cold Spring Harbor，N.T.(1989)；L.grossman et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.12，Part A&B，Academic Press，NewYork(1968)S.L.Berger et al.，ed.，“Methods in Enzymology”Vol.152，p.33&p.215，Academic Press，New York(1987)；Biochemistry185294-5299，1979。根據(jù)需要，使用寡(dT)纖維素柱等對(duì)總RNA進(jìn)行分級(jí)純化，可得到聚(A)mRNA。而若是屬于鐮孢屬的具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物用作mRNA源最合適。作為鐮孢屬微生物可以使用尖鐮孢IFO5942，半裸鐮孢(Fusarium Semitectam)IFO30200等微生物。
同樣屬于下列各屬的具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物也可用作mRNA源。這些微生物為柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬。相應(yīng)可用作mRNA源的微生物可例舉如下Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤倉(cāng)赤霉(Gibberellafujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，產(chǎn)黃青霉(Penicilljum chrysogenum)IFO4626，米根霉(RhizopusOryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，鏈孢粘帚霉(GliocladiumCatenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectriaelegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露濕漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脈孢菌(NeurosporaCrass)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813，柄銹生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨頭霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。
用所得mRNA作模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶等合成cDNA。運(yùn)用mRNA和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA是用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法或?qū)嵸|(zhì)上與該方法同樣的方法或是改進(jìn)的方法進(jìn)行。也可用文獻(xiàn)H.Land et al.，“NucleicAcid Res.”，Vol.9，2251(1981)U.Gubler et al.，“Gene”，Vol.25，263-269(1983)，S.L.Berger et al.ed.，“Methods in Enzymology”Vol.152，p.307，Academic Press，New York(1987)記載的方法進(jìn)行。將得到的cDNA插入到市售的噬菌體載體中，然后用常規(guī)方法進(jìn)行包裝。以這樣制備的cDNA為主體構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
b)D-泛酸內(nèi)酯水解酶cDNA的克隆用上述包裝的cDNA文庫(kù)感染宿主細(xì)胞，利用噬斑雜交篩選得到陽(yáng)性噬斑。對(duì)得到的菌落測(cè)序，通過(guò)研究氨基酸序列可以確認(rèn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因已被克隆。除使用噬菌體載體之外，為了進(jìn)行大腸桿菌等宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以使用，例如鈣法、銣/鈣法等本領(lǐng)域公知的方法或?qū)嵸|(zhì)上與該方法同樣的方法進(jìn)行(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，Vol.166，p.557(1983)等)。
以制備的cDNA為模板也可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。典型的情況是可以使用上述2)中得到的引物。
用于重組D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的質(zhì)粒，只要是在基因工程中常用的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細(xì)胞、酵母等真核細(xì)胞)中可以表達(dá)該DNA的質(zhì)粒，無(wú)論什么樣的質(zhì)粒都可以。在這樣的序列內(nèi)，例如，有可能導(dǎo)入適合于在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼以及設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶作用部位。還應(yīng)包含為使目的基因容易表達(dá)的調(diào)控序列、啟動(dòng)序列等，以及含有在連接目的基因中起作用的接頭、銜接子等，以及控制抗生素耐性的、或是控制代謝的序列，用于選擇的序列等。
理想的情況是可以使用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，例如，在大腸桿菌為宿主細(xì)胞的質(zhì)粒中，可使用trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、ipp啟動(dòng)子λ噬菌體PL啟動(dòng)子等。若是以酵母作為宿主細(xì)胞可使用GAL1、GAL10啟動(dòng)子等。
以大腸桿菌作為宿主細(xì)胞的質(zhì)粒例舉如下pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3z、pGEM-4Z、pGEM-5zf(-)、pBluescript KSTM(stratagene)等。適合于在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒載體有pAS、pKK223(pharmacia)、pMC1403、pMC931、pKC30等。而以酵母作為宿主細(xì)胞的質(zhì)粒有YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體等，例如pGPD-2等載體。作為宿主細(xì)胞，是大腸桿菌時(shí)，例如來(lái)自大腸桿菌K12菌株的NM533 XLI-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。
本發(fā)明的基因工程技術(shù)中可以運(yùn)用本領(lǐng)域已知的和廣泛應(yīng)用的限制性酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA修飾、分解酶(該酶可將DNA片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和轉(zhuǎn)換以適合于克隆)、DNA聚合酶、末端核苷酸基轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶等。限制性內(nèi)切酶在R.J.Roberts，Nucleic Acids Res.Vol.13，P165(1985)；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring，New York，1982等例舉了一些，而逆轉(zhuǎn)錄酶，例如有來(lái)自鼠莫洛尼式白血病病毒(MMLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，來(lái)自禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，特別是RNaseH缺損體等最好用。DNA聚合酶，例如有大腸桿菌DNA聚合酶、作為其衍生物的克列諾片段、大腸桿菌噬菌體T4 DNA聚合酶、大腸桿菌噬菌體T7DNA聚合酶、耐熱菌DNA聚合酶等。
末端核苷酸基轉(zhuǎn)移酶如R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymolo-gy”、Vol.100.p.96，Academic Press.New York(1983)中記載的可在3’-OH末端加脫氧核苷酸(dNMP)的Td Tase等。DNA修飾、分解酶有內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶等，例如蛇毒磷酸酯酶、脾臟磷酸酯酶、大腸桿菌DNA內(nèi)切核酸酶I、大腸桿菌DNA內(nèi)切核酸酶III、大腸桿菌DNA內(nèi)切核酸酶VII、λ內(nèi)切核酸酶、DNase I、核酸酶SI、微球菌核酸酶等。作為DNA連接酶，例如大腸桿菌DNA連接酶、T4 DNA連接酶等。
而適合于克隆DNA基因構(gòu)建DNA文庫(kù)的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC等載體，理想的是來(lái)自λ噬菌體的載體，例如，Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASH11，λFIXII、λEMBL3、λZAP11TM(stratagene)。
另外，根據(jù)與本發(fā)明相關(guān)的D-泛酯內(nèi)酯水解酶的基因堿基序列，采用基因工程中常用的方法對(duì)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的氨基酸序列中適當(dāng)進(jìn)行1個(gè)至幾個(gè)以上的氨基酸置換、缺失、插入、轉(zhuǎn)移或添加，導(dǎo)入變異可以制造相應(yīng)變異的蛋白質(zhì)。這些變異、變換、修飾方法在以下文獻(xiàn)中都有記載，即日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)編“續(xù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、基因研究法II”p105(廣瀨進(jìn))、東京化學(xué)同人(1986)；日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)編“新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2、核酸III(重組DNA技術(shù))”、p233(廣瀨進(jìn))東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methodsin Enzymology”Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press.New York(1983)；J.A.wells et al.，“Gene”Vol.34，p.315(1985)；T.Grundstroem et al.“Nucleic AcidsRes.”Vol.13.p.3305(1985)；J.Taylor et al.，“Nucleic Acids Res.”Vol.13，p.8765(1985)R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，“Gene”Vol.44，p.177(1986)。例如利用合成寡核苷酸等進(jìn)行的指定位置的變異導(dǎo)入法(特異部位的變異導(dǎo)入法)Kunkel法、dNTP[αs]法(Eckstein)法、利用亞硫酸或亞硝酸等的指定區(qū)域變異導(dǎo)入法等方法。
而得到的本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過(guò)化學(xué)上的手法對(duì)它含有的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，或使用肽酶、例如胰蛋白酶、糜蛋白酶，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、內(nèi)切肽酶、外切肽酶等酶進(jìn)行修飾，或是部分降解生成蛋白質(zhì)的衍生物。而用基因重組法制造蛋白質(zhì)時(shí)，可以融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)，也可以使其在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)變加工成實(shí)質(zhì)上與天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶具有同等的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)?？梢允褂没蚬こ趟Ｓ玫娜诤戏ǎ@樣融合的蛋白質(zhì)可以利用其融合部位通過(guò)親和層析等方法純化。有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾、轉(zhuǎn)換等可以參考例如日本生物化學(xué)學(xué)會(huì)編“新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1、蛋白質(zhì)VIII，蛋白質(zhì)工程，”東京化學(xué)同人(1993)，利用文獻(xiàn)記載的方法或引用的文獻(xiàn)中記載的方法以及實(shí)質(zhì)與這些方法同樣的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的修飾和轉(zhuǎn)換。
這樣一來(lái)，本發(fā)明的產(chǎn)物在同一性方面有1個(gè)以上的氨基酸殘基與天然的產(chǎn)物不同，也可以是有一個(gè)以上的氨基酸殘基的位置與天然的不同。所以本發(fā)明的D-泛酸內(nèi)酯水解酶包括天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶中缺失了1個(gè)以上的特有氨基酸殘基的該酶缺失類似物(例如缺失1-80個(gè)，理想的缺失1-60個(gè)，再好些的缺失1-40個(gè)，更理想的是缺失1-20個(gè)，特別理想的是缺失1-10個(gè)氨基酸殘基)，還包括有一個(gè)以上的特有氨基酸殘基被其它殘基置換的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的置換類似物(例如，有1-80個(gè)，理想一點(diǎn)的1-60個(gè)，再理想的1-40個(gè)，更理想的1-20個(gè)，特別理想的是有1-10個(gè)被置換)，還包括在天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶上附加上一個(gè)以上的氨基酸殘基的該酶的附加類似物(例如加上1-80個(gè)，理想的1-60個(gè)，再理想些1-40個(gè)，更理想的1-20個(gè)，特別理想的是加1-10個(gè)氨基酸殘基)。含有天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶的特征結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)物也包括在本發(fā)明內(nèi)。還可舉出具有相同性質(zhì)的D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的產(chǎn)物。
如果維持著天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的特征結(jié)構(gòu)域，象上面講到的變異體全都包括在本發(fā)明中。我們認(rèn)為實(shí)質(zhì)上具有與天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)或含有其中一部分結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物也可包括在本發(fā)明中，而實(shí)質(zhì)上具有與天然D-泛酸內(nèi)酯水解酶同等生物學(xué)活性的產(chǎn)物也可認(rèn)為包括在本發(fā)明中。也可以是天然產(chǎn)生的一種變異體。本發(fā)明的D-泛酸內(nèi)酯水解酶可以按如下說(shuō)明的那樣進(jìn)行分離純化。一方面本發(fā)明包括編碼上述的多肽的DNA序列，而且包括編碼有全部天然特性的或是有部分特性的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的多肽及其類似物或衍生物的DNA序列。該D-泛酸內(nèi)酯水解酶的堿基序列可以被修飾(例如，添加、刪除、置換等)，這樣被修飾的產(chǎn)物也可以包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的DNA序列提供了有關(guān)迄今為止人們還不知道的D-泛酸內(nèi)酯水解酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列的信息，所以這樣的信息的利用也包括在本發(fā)明中。信息利用指的是，例如編碼D-泛酸內(nèi)酯水解酶及其相關(guān)蛋白質(zhì)的微生物，理想的是具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物的基因組DNA和cDNA的分離以及檢測(cè)用探針的設(shè)計(jì)等。具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物有屬于下列各屬的微生物，如鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬。
本發(fā)明的DNA序列可以用作例如編碼D-泛酸內(nèi)酯水解酶及其相關(guān)蛋白質(zhì)的具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物，特別是以鐮孢屬為首的微生物的基因組DNA和cDNA的分離和檢測(cè)用的探針。分離基因時(shí)，可以利用PCR法以及用了逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的PCR法(RT-PCR法)。按照已被克隆、被確定了序列的D-泛酯內(nèi)酯水解酶的cDNA序列推測(cè)的氨基酸序列選擇其特征的序列區(qū)域，設(shè)計(jì)DNA引物并進(jìn)行化學(xué)合成，利用得到的DNA引物運(yùn)用PCR法、RT-PCR法、及其它方法，可進(jìn)行D-泛酸內(nèi)酯水解酶DNA及其相關(guān)DNA的分離和檢測(cè)等。
就象上面說(shuō)明的那樣，按照本發(fā)明，可以提供將D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因及其重組DNA分子移入宿主細(xì)胞中，使D-泛酸內(nèi)酯水解酶表達(dá)，得到想要的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的方法。根據(jù)本發(fā)明也可提供實(shí)質(zhì)上可表達(dá)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因的重組體或轉(zhuǎn)染子及其制造方法和它的用途。
另一方面，可以認(rèn)為本發(fā)明是涉及有可能在大腸桿菌等原核生物或真核生物表達(dá)的DNA和RNA等核酸，這些DNA和RNA是編碼具有D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的蛋白質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)上與該酶具有同等活性的蛋白質(zhì)或它的鹽；最理想的是編碼來(lái)自于尖鐮孢的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽；或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中的一部分或全部的多肽。而這樣的核酸，特別是DNA可以是(a)可以編碼序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列的堿基序列或與該序列互補(bǔ)的序列。(b)可以與(a)的DNA序列或它的片段雜交的序列，以及(c)可以與(a)或(b)序列雜交的具有簡(jiǎn)并密碼的序列。用這樣的核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化使本發(fā)明的表達(dá)多肽的大腸桿菌等原核生物或真核生物也成了本發(fā)明的特征。
按照本發(fā)明，將編碼具有D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性的蛋白質(zhì)的DNA或?qū)嵸|(zhì)上與該蛋白質(zhì)具有同等活性的蛋白質(zhì)的DNA，或是含有可能表達(dá)該DAN的載體等的DNA導(dǎo)入具有生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性能力的微生物，例如導(dǎo)入屬于鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪枝孢屬、節(jié)皮菌屬的微生物中，就可以得到改變了生產(chǎn)D-泛酸內(nèi)酯水解酶能力的微生物。作為這樣的微生物，例如有尖鐮孢IFO5942，半裸鐮孢IFO30200，Cylindrocarpon tonkinense IFO30561，藤倉(cāng)赤霉(Gibberella fujikuroi)IFO6349，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)IFO4033，產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)IFO4626，米根霉(Rhizopus Oryzae)IFO4706，Volutella buxi IFO6003，鏈孢粘帚霉(Gliocladium Catenulatum)IFO6121，Euotium chevalieri IFO4334，Nectria elegans IFO7187，Schizophyllum Commune IFO4928，露濕漆斑菌(Myrothecium rovidum)IFO9531，粗糙脈孢菌(Neurospora Crassa)IFO6067，Acremonium fusidioides IFO6813.柄銹生座孢(Tuberculina persicina)IFO6464，李克梨頭霉(Absidialichtheimi)IFO4009，Sporothrix schenckii IFO5983 Verticilliummalthousei IFO6624，Arthroderma uncinatum IFO7865等。
轉(zhuǎn)化的方法有用適當(dāng)?shù)募?xì)胞壁溶解酶制備原生質(zhì)體化的細(xì)胞，然后在氯化鈣、聚乙二醇存在下使DNA接觸上述制備的原生質(zhì)體化的細(xì)胞，或是用電穿孔法(例如E.Neumann et al.，“EMBO J”，Vol.1，pp.841(1982)等)，顯微注射法，以及基因槍導(dǎo)入法等方法。
酶可以從各種原料，例如細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)破碎物等，轉(zhuǎn)化細(xì)胞等產(chǎn)酶材料用如下眾所周知的方法純化得到，這些方法是硫酸銨沉淀等鹽析法、葡聚糖凝膠過(guò)濾法、使用例如帶有二乙基氨基乙基或羧甲基等的載體的離子交換層析法、使用例如帶有丁基、辛基、苯基等疏水性基團(tuán)的載體的疏水性層析法、色素凝膠層析法、電泳法、透析、限外過(guò)濾法、親和層析法、高速液相層析法等。如果得到的是包涵體，可以在鹽酸胍，尿素等變性劑存在下，甚至根據(jù)需要，在2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑存在下對(duì)包涵體進(jìn)行處理，使其變成有活性的酶。也可將產(chǎn)酶細(xì)胞原封不動(dòng)地用作酶。而固定化酶是用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法將酶或產(chǎn)酶細(xì)胞固定化了的產(chǎn)物。酶的固定化是通過(guò)稱之為共價(jià)結(jié)合法和吸附法的載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法等方法進(jìn)行的。例如，根據(jù)需要，可使用戊二醛、六甲撐二異氰酸酯、六甲撐二異硫氰酸酯等縮合劑進(jìn)行酶的固定化。還有通過(guò)聚合反應(yīng)使單體凝膠化的單體法，從通常的單體聚合成大分子的予聚合法，使多聚體凝膠化的聚合物法，還有使用聚丙烯酰胺的固定化，使用藻酸、膠原、明膠、瓊脂、κ-角叉菜膠等天然高分子的固定化，使用光固化樹(shù)脂、聚氨酯聚合物等合成高分子的固定化。而微生物的培養(yǎng)以及通過(guò)使用水解酶進(jìn)行D-泛酸內(nèi)酯的不對(duì)稱水解，將內(nèi)酯類化合物光學(xué)拆分以及對(duì)于生成物的處理，可以按特開(kāi)平3-65198號(hào)和特開(kāi)平4-144681號(hào)公報(bào)記載的那樣進(jìn)行。
例如，收集于液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌，然后加入D、L-泛酸內(nèi)酯水溶液(2-60％濃度)，把pH調(diào)至6-8，于10℃-40℃條件下反應(yīng)數(shù)小時(shí)至一天。反應(yīng)結(jié)束后，分離菌體，使用有機(jī)溶劑(醋酸乙酯那樣的酯類、苯那樣的芳香族烴類、氯仿那樣的鹵化碳烴類等最理想)萃取分離反應(yīng)液中未反應(yīng)的L-泛酸內(nèi)酯，而水相中殘存的D-泛酸通過(guò)在鹽酸酸性條件下加熱使其內(nèi)酯化，再通過(guò)上述的有機(jī)溶劑萃取就可得到生成的D-泛酸內(nèi)酯。而轉(zhuǎn)化菌的處理菌體(即，作成干燥菌體或固定化菌體等)以及從轉(zhuǎn)化菌獲得的酶和固定化酶等也可以同樣進(jìn)行。
通過(guò)利用上述的本發(fā)明的各種狀態(tài)，可作為有關(guān)利用以D-泛酸內(nèi)酯水解為首的內(nèi)酯水解酶的酶的不對(duì)稱水解的內(nèi)酯類化合物的光學(xué)拆分法的合成研究的有用手段，或是可以提供適用于其它用途的各種技術(shù)手段。以下給出實(shí)施例，具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制，所以應(yīng)該理解源于本發(fā)明說(shuō)明書(shū)思想的各種各樣的實(shí)施狀態(tài)都是可能的。另外，說(shuō)明書(shū)和圖中用縮略號(hào)表示堿基和氨基酸等，這是根據(jù)IUPAC-IUB Commission on biochemical Nomenclature或根據(jù)本領(lǐng)域習(xí)慣用語(yǔ)的意思表示的。當(dāng)在氨基酸中存在光學(xué)異構(gòu)體時(shí)，只要是不特別指定的都表示L-型。
帶有導(dǎo)入下述實(shí)施例1中得到的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的載體(PFLC40E)的大腸桿菌JM109(EJM-ESE-1)，從平成7年8月30日起(原保藏日)保藏于茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵編號(hào)305)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)(保藏號(hào)FERM P-15141)，于平成8年8月28日由原保藏轉(zhuǎn)換成根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏，以保藏號(hào)FERM BP-5638保藏在NIBH。
實(shí)施例以下給出實(shí)施例，具體地說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明不受實(shí)施例的限制，應(yīng)包含各種各樣的形式。
實(shí)施例11)純化酶的氨基酸序列的確定將按特開(kāi)平4-144681號(hào)實(shí)施例1制備的冷凍干燥的D-泛酸內(nèi)酯水解酶14.3nmol(亞基分子量為6萬(wàn))溶解于含有8M尿素的50mMTris-HCl(pH9.0)44μl中，37℃變性1小時(shí)。再向該溶液中加入44μ150m M Tris-HCl(pH9.0)溶液使尿素濃度變成4M，然后添加12μl(0.144nmol，E/S＝1/100)的12nmol/ml的賴氨酰內(nèi)肽酶(和光純藥)，于30℃消化12小時(shí)。得到的消化肽在反相柱(Nakarari Tesuku)上進(jìn)行分離、利用ABI社477A蛋白質(zhì)測(cè)序儀進(jìn)行了氨基酸的序列分析。
分離條件柱Cosmosil 5C 18-AR(4.6×250mm)流速1ml/min溫度35℃檢測(cè)波長(zhǎng)210nm洗脫液A，0.1％TFA(三氟乙酸)B，0.1％TFA/80％CH3CN洗脫條件A→B的梯度洗脫(15％/min)氨基酸序列分析的結(jié)果如圖1和圖2所示。
2)基因組DNA的制備a)D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因組DNA的抽提法利用減壓過(guò)濾收集對(duì)數(shù)增殖后期的菌體，將菌體放入液氮里，用韋林式攪切器將菌體破碎，將達(dá)到一定細(xì)度的菌體移入研缽，邊加液氮邊研磨。然后研好的菌體懸浮于70℃保溫的2×CTAB液(2％CTAB(溴化十六烷基三甲基銨，Sigma)、0.1M Tris-HCl，pH8.0，1.4m NaCl，1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮，sigma)中，于65℃溫育3-4小時(shí)。離心分離，上清依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿處理，最后用異丙醇使DNA沉淀。用70％乙醇洗凈，風(fēng)干后，溶解于TE(Tris-10mM-EDTA 1mMpH7.8)。用核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1分解RNA，再依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿處理，進(jìn)行除去蛋白質(zhì)的操作。最后用等體積的異丙醇使DNA沉淀。用70％乙醇洗凈，風(fēng)干后溶解于TE液中，制得基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。
b)D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的擴(kuò)增根據(jù)D-泛酸內(nèi)酯水解酶內(nèi)部多肽的氨基酸序列的信息(圖1、圖2)分別合成對(duì)應(yīng)于N-末端氨基酸序列的有意義鏈的有意義引物和對(duì)應(yīng)于內(nèi)部多肽序列的反意義鏈的反意義引物(圖3)。
以D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因組DNA為模板，在下列條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增可按照例如R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；PCRTechnology，Stockton Press(1989)等文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行。通過(guò)PCR擴(kuò)增可得到大約1kb的擴(kuò)增的DNA片段。
PCR條件染色體DNA 2.5μg有意義引物 250pmol(參考圖3)反意義引物 250pmol(參考圖3)dNTP(2mM) 5μlTth聚合酶緩沖液(X10) 5μlTthDNA聚合酶(東洋紡) 3unitsH2O合計(jì)50μl92℃/1分鐘、55℃/1分鐘、73℃/3分鐘共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
將得到的擴(kuò)增的DNA片段測(cè)序，轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了D-泛酸內(nèi)酯水解酶內(nèi)部多肽的部分氨基酸序列的部位。
3)cDNA的制備a)mRNA的制備收集對(duì)數(shù)增殖前期的菌體，立即于液氮中冷凍破碎后按AGPC(Acid Guanidinium thiocyanate Phenol Chloroform)法(例如，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，Vol.No.15p99(1991))抽提總RNA。將得到的總RNA加到聚dT-纖維素柱(Pharmacia)進(jìn)行純化。
b)cDNA文庫(kù)的制備以得到的mRNA為模板，用cDNA rapido銜接子連接模式(cDNArapido adaptor ligation module，cDNA Synthesis module RPN1256，1994Pharmacia社(Amersham International pic))合成cDNA。
c)D-泛酸內(nèi)酯水解酶cDNA的克隆用cDNA文庫(kù)感染宿主大腸桿菌，通過(guò)噬斑雜交得到陽(yáng)性噬斑，雜交用的探針是以含有尖鐮孢的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的大約1kb的片段為模板，用多引物法進(jìn)行標(biāo)記制備。對(duì)得到的克隆進(jìn)行測(cè)序，轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，結(jié)果可以判明成功地克隆了上述的D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的全長(zhǎng)。
這樣一來(lái)得到了序列號(hào)2表示的堿基序列。由該堿基序列編碼的與序列號(hào)1表示的氨基酸序列有相同性的序列并不存在于NBRF(National Biomedical Research Foundation)蛋白質(zhì)序列資料庫(kù)中，所以帶有這一堿基序列的DNA被認(rèn)為是全新的序列。
確定了堿基序列的cDNA中其N(xiāo)末端部分缺失一部分，沒(méi)有起始密碼，可以通過(guò)PCR法構(gòu)建重新插入了起始密碼的表達(dá)載體(命名為PFLC40E)。
制備帶有圖4表示的限制酶切位點(diǎn)的有意義和反意義引物的合成寡核苷酸，用這些引物在以下條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增例如可按R.Saiki.et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saili，et al.，Science.Vol.239，pp.4891(1988)；PCR Technology，Stockton Press(1989)等文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行。
PCR條件總DNA(cDNA) 10μg有意義引物0.1nmol(參考圖4)反意義引物0.1nmol(參考圖4)dNTP(2mM) 10μlTth聚合酶緩沖液(X10) 10μlTthDNA聚合酶4unitsH2O合計(jì)100μl94℃/1分鐘， 55℃/1分鐘，75℃/3分鐘；共進(jìn)行30循環(huán)。
這樣制備的PCR產(chǎn)物，其兩端分別帶有EcoR1和Xba1限制酶切位點(diǎn)，所以用各限制酶(EcoR1(寶酒造)和Xbal(寶酒造))處理，與pUC18進(jìn)行連接反應(yīng)(寶酒造連接試劑盒)，構(gòu)建表達(dá)載體(PFLC40E)。
接下來(lái)按照“ Molecular Cloning”Second ed.，1989，ed.by J.Sambrook et al.，Cold Spring Habor Laboratory Press記載的方法用上面構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)化工作。該轉(zhuǎn)化體在含有50mg/l的氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基(色氨酸1.5％，酵母抽提液1％，NaCl0.5％)上進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化處理按氯化鈣法進(jìn)行。
這樣得到的重組大腸桿菌在含有50mg/l的氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)基10ml試管中予培養(yǎng)，這個(gè)予培養(yǎng)液(計(jì)100μl)作為菌種在與予培養(yǎng)液有相同組成的本培養(yǎng)液100ml中進(jìn)行了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、以及異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)添加時(shí)間的研究。培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。培養(yǎng)后將得到的菌體超聲破碎，用離心的上清測(cè)定D-泛酸內(nèi)酯水解酶的活性。在最適條件下的比活是2.25U/mg。D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性測(cè)定在以下條件下進(jìn)行的，以1分鐘內(nèi)水解1μmol的D-泛酸內(nèi)酯的酶活作為1個(gè)活性單位(unit)。向10％濃度的D-泛酸內(nèi)酯的0.5M PIPES緩沖液(pH7.0)200μl加入50μl酶液，于30℃反應(yīng)120分鐘后再加入250μl的2mMEDTA甲醇溶液，終止反應(yīng)。然后用HPLC(Nucleosil 5C184.6×150mm、洗脫液為10％甲醇、流速1ml/min、檢測(cè)波長(zhǎng)230nm)求出反應(yīng)終止液的水解率。例如如果水解率為1％，則相應(yīng)的1ml酶液的活性就是1.6×102U/ml。
用PFLC40E轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109是在2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。加入IPTG使最終濃度為2mM。
aIPTG于培養(yǎng)開(kāi)始的同時(shí)加入到2×YT培養(yǎng)基中。
bIPTG是在培養(yǎng)開(kāi)始后4小時(shí)加入到2×YT培養(yǎng)基中。
進(jìn)行SDS-PAGE的結(jié)果檢測(cè)出了離心沉淀的不溶性組分中的濃的予想分子量的粗帶，進(jìn)行印跡，通過(guò)Edman降解法分析其N(xiāo)末端的氨基酸序列的結(jié)果表明該蛋白的序列與D-泛酸內(nèi)酯水解酶的序列一致。因此可以認(rèn)為D-泛酸內(nèi)酯水解酶cDNA在這個(gè)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中雖然有一部分D-泛酸內(nèi)酯水解酶是以可溶性形式表達(dá)的，但大部分是以包涵體形式表達(dá)的。含有導(dǎo)入了上述D-泛酸內(nèi)酯水解酶基因的載體(PFLC 40E)的大腸桿菌JM109(EJM-ESE-1)保藏于茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵編號(hào)305)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏號(hào)為FERM PB-5638〔平成7年8月30日(原保藏日)保藏的保藏號(hào)是FERMP-15141(微工研菌寄第P-15141號(hào)原保藏)，于平成8年8月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約提出了保藏的移管申請(qǐng)〕。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，編碼天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶例如編碼來(lái)自尖鐮孢的天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或編碼實(shí)質(zhì)上具有與該酶同等活性的蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚了。有望在用含有編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，再用該宿主細(xì)胞制造該蛋白質(zhì)的方法方面，以及在用這些蛋白和用宿主細(xì)胞制造D-泛酸內(nèi)酯的用途方面有飛躍的發(fā)展。還有可能通過(guò)D-泛酸內(nèi)酯水解酶本身的改變使酶的活性急劇上升。序列表〔序列號(hào)1〕序列的長(zhǎng)度380序列類型氨基酸拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類多肽序列Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Gln Ile Ile Asp Gln Lys Ser Phe Asn1 5 10 15Val Leu Lys Asp Val Pro Pro Pro Ala Val Ala Asn Asp Ser Leu Val20 25 30Phe Thr Trp Pro Gly Val Thr Glu Glu Ser Leu Val Glu Lys Pro Phe35 40 45His Val Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Val Ile Gly Lys Asp Pro Ser50 55 60Leu Thr Leu Ile Ala Thr Ser Asp Thr Asp Pro Ile Phe His Glu Ala65 70 75 80Val Val Trp Tyr Pro Pro Thr Glu Glu Val Phe Phe Val Gln Asn Ala85 90 95Gly Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Leu Asn Lys Ser Ser Ile Ile Gln100 105 110Lys Ile Ser Leu Lys Glu Ala Asp Ala Val Arg Lys Gly Lys Gln Asp115 120 125Glu Val Lys Val Thr Val Val Asp Ser Asn Pro Gln Val Ile Asn Pro130 135 140Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Phe Ala Gly Glu Gly145 150 155 160Gln Gly Asp Asp Val Pro Ser Ala Leu Tyr Leu Met Asn Pro Leu Pro165 170 175Pro Tyr Asn Thr Thr Thr Leu Leu Asn Ash Tyr Phe Gly Arg Gln Phe180 185 190Asn Ser Leu Asn Asp Val Gly Ile Asn Pro Arg Asn Gly Asp Leu Tyr195 200 205Phe Thr Asp Thr Leu Tyr Gly Tyr Leu Gln Asp Phe Arg Pro Val Pro210 215 120Gly Leu Arg Asn Gln Val Tyr Arg Tyr Asn Phe Asp Thr Gly Ala Val225 230 235 240Thr Val Val Ala Asp Asp Phe Thr Leu Pro Asn Gly Ile Gly Phe Gly245 250 255Pro Asp Gly Lys Lys Val Tyr Val Thr Asp Thr Gly Ile Ala Leu Gly260 265 270Phe Tyr Gly Arg Asn Leu Ser Ser Pro Ala Ser Val Tyr Ser Phe Asp275 280 285Val Asn Gln Asp Gly Thr Leu Gln Asn Arg Lys Thr Phe Ala Tyr Val290 295 300Ala Ser Phe Ile Pro Asp Gly Val His Thr Asp Ser Lys Gly Arg Val305 310 315 320Tyr Ala Gly Cys Gly Asp Gly Val His Val Trp Asn Pro Ser Gly Lys325 330 335Leu Ile Gly Lys Ile Tyr Thr Gly Thr Val Ala Ala Asn Phe Gln Phe340 345 350Ala Gly Lys Gly Arg Met Ile Ile Thr Gly Gln Thr Lys Leu Phe Tyr355 360 365Val Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Leu Tyr Asp370 375 380〔序列號(hào)2〕序列的長(zhǎng)度1140序列類型核酸鏈數(shù)2條鏈拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類cDNA起源生物名尖鐮孢IFO5942序列GCTAAGCTTCCTTCTACGGCTCAGATTATTGATCAGAAGTCGTTCAATGTCTTGAAGGAT60GTGCCACCTCCTGCAGTGGCCAATGACTCTCTGGTGTTCACTTGGCCTGGTGTAACTGAG120GAGTCTCTTGTTGAGAAGCCTTTCCATGTCTACGATGAAGAGTTTTACGATGTAATTGGA180AAAGACCCCTCTTTGACCCTCATCGCAACATCGGACACCGACCCAATCTTCCATGAGGCT240GTCGTATGGTATCCTCCTACTGAAGAGGTGTTCTTTGTGCAGAATGCTGGCGCTCCTGCC300GCAGGCACTGGCTTGAACAAGTCTTCCATCATTCAGAAGATTTCCCTCAAGGAGGCCGAT360GCTGTTCGCAAGGGCAAGCAGGATGAGGTCAAGGTCACAGTTGTTGACTCGAACCCTCAG420GTTATCAACCCAAATGGTGGTACTTACTACAAGGGCAACATCATCTTCGCTGGTGAGGGC480CAAGGCGACGATGTTCCCTCTGCGCTGTACCTCATGAACCCTCTCCCTCCTTACAACACC540ACCACCCTTCTCAACAACTACTTCGGTCGCCAGTTCAACTCCCTCAACGACGTCGGTATC600AACCCCAGGAACGGTGACCTGTACTTCACCGATACCCTCTACGGATATCTCCAAGACTTC660CGTCCTGTTCCTGGTCTGCGAAACCAGGTCTATCGTTACAACTTTGACACTGGCGCTGTC720ACTGTTGTCGCTGATGACTTTACCCTTCCCAACGGTATTGGCTTTGGCCCCGACGGCAAG780AAGGTTTATGTCACCGACACTGGCATCGCTCTCGGTTTCTACGGTCGCAACCTCTCTTCT840CCCGCTTCTGTTTACTCTTTCGACGTGAACCAGGACGGTACTCTTCAGAACCGCAAGACC900TTTGCTTATGTTGCCTCATTCATCCCCGATGGTGTCCACACTGACTCCAAGGGTCGTGTT960TATGCTGGCTGCGGTGATGGTGTCCATGTCTGGAACCCCTCTGGCAAGCTCATCGGCAAG1020ATCTACACCGGAACGGTTGCTGCTAACTTCCAGTTTGCTGGTAAGGGAAGGATGATAATT1080ACTGGACAGACGAAGTTGTTCTATGTCACTCTAGGGGCTTCGGGTCCCAAGCTCTATGAT1140
權(quán)利要求
1.一種具有天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶活性或?qū)嵸|(zhì)上具有與該酶同等活性或具有與該酶同等的一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或它的鹽。
2.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)，其特征是它來(lái)源于屬于下列各屬的微生物鐮孢屬、柱孢屬、赤霉屬、曲霉屬、青霉屬、根霉屬、周刺座霉屬、粘帚霉屬、散囊菌屬、叢赤殼屬、裂盾菌屬、漆斑菌屬、脈孢菌屬、支頂孢屬、銹生座孢屬、犁頭霉屬、孢子絲菌屬、輪技孢屬和節(jié)皮菌屬。
3.權(quán)利要求1記載的蛋白質(zhì)，其特征是該天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶來(lái)自鐮孢屬微生物。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，是具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上具有與該序列同等的氨基酸序列的D-泛酸內(nèi)酯水解酶或它的鹽。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，是在原核生物中表達(dá)外源性DNA序列獲得的產(chǎn)物。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列或?qū)嵸|(zhì)上具有與該序列同等的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)的部分多肽或它的鹽。
8.具有編碼權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或它的部分多肽的堿基序列的核酸。
9.權(quán)利要求8記載的核酸，其特征是在序列表中序列號(hào)2表示的堿基序列中具有可譯框架部分或?qū)嵸|(zhì)上具有與該框架部分同等活性的堿基序列。
10.含有權(quán)利要求8或9中記載的核酸的載體。
11.含有權(quán)利要求10中記載的載體的轉(zhuǎn)化體。
12.包括D-泛酸內(nèi)酯水解酶或其鹽的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或它的部分多肽的制造方法，其特征是，在適合增殖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求11記載的轉(zhuǎn)化體，以重組蛋白的形式生成包括D-泛酸內(nèi)酯水解酶或其鹽的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)或其部分多肽。
13.D-泛酸內(nèi)酯的制造方法，其特征是使用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)記載的蛋白質(zhì)、其部分多肽或權(quán)利要求11記載的轉(zhuǎn)化體，通過(guò)D、L-泛酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分來(lái)制造D-泛酸內(nèi)酯。
全文摘要
本發(fā)明提供用于通過(guò)D、L-泛酸內(nèi)酯的D-型選擇性的不對(duì)稱水解進(jìn)行光學(xué)拆分的一種新的酶以及編碼該酶的基因。本發(fā)明闡明了編碼天然的D-泛酯內(nèi)酯水解酶的基因，例如來(lái)自尖鐮孢的天然的D-泛酸內(nèi)酯水解酶的基因或者是編碼實(shí)質(zhì)上具有與該酶同等活性的蛋白質(zhì)的基因，同時(shí)提作用含有編碼該蛋白質(zhì)堿基序列的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞再用該宿主細(xì)胞制造該蛋白質(zhì)的方法，還提供這些蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞的用途。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1166182SQ96191238
公開(kāi)日1997年11月26日 申請(qǐng)日期1996年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月13日
發(fā)明者坂本惠司, 山田秀明, 清水昌, 小林達(dá)彥 申請(qǐng)人:富士藥品工業(yè)株式會(huì)社