專利名稱：一種基于酶水解提取馬鈴果中它勃寧的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提取生物堿它勃寧的新工藝，具體為一種基于酶水解提取馬鈴果中它勃寧的新工藝。
背景技術(shù)：
它勃寧(Tabersonine)又稱為柳葉水甘草堿，分子式為C21H24N202。其具有降壓、抗腫瘤、降血糖、利尿等作用，以及用于中風(fēng)后遺癥、缺血性高血壓腦病、神經(jīng)性心動(dòng)過速和其他植物神經(jīng)功能紊亂等多種疾病的治療。另外，它勃寧還廣泛用于合成抗癌藥物長春西汀。目前，它勃寧產(chǎn)品主要是通過從有關(guān)植物里提取獲得。中國發(fā)明專利《一種柳葉水甘草堿的制備工藝》(授權(quán)公告號CN101250188B)和中國發(fā)明專利《一種從馬鈴果中提取它勃寧的方法》(申請?zhí)?01010609832. 5)均提到夾竹桃科植物柳葉水甘草葉、橢圓葉水 甘草種子、長春花種子中都含有它勃寧，但含量較低。而非洲夾竹桃植物沃坎加樹種子(又名非洲伏康樹、非洲馬鈴果)中有較高的它勃寧生物堿含量。有關(guān)馬鈴果中它勃寧的提取，早在1973年美國專利(US3758478)公開了夾竹桃科植物種子提取它勃寧的方法。該發(fā)明專利提取馬鈴果中它勃寧的主要步驟包括原料粉碎、先后采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇等溶劑進(jìn)行提取，提取液經(jīng)酸洗、堿洗后用苯、乙醚、或者氯仿等進(jìn)行反復(fù)萃取。該工藝的主要缺點(diǎn)在于(I)產(chǎn)品收率和純度較低，每公斤馬鈴果原料僅能提取到20克純度為75% 80%的它勃寧粗品；(2)提取過程繁瑣、耗時(shí)較長，而且涉及大量有機(jī)溶劑，其中苯和氯仿等都是對人體有毒的溶劑；(3)酸水洗滌過程中存在嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致部分有效成分的浪費(fèi)以及增加工業(yè)化生產(chǎn)放大的困難。2008年，西安皓天生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司申請的發(fā)明專利《一種柳葉水甘草堿的制備工藝》，該專利在2011年獲得了授權(quán)(授權(quán)公告號CN101250188B)。該發(fā)明專利的主要步驟包括原料的粉碎、用3 4倍體積的石油醚或者正己烷回流提取3 5次、鹽酸水溶液酸化、大孔樹脂吸附、乙醇洗脫、最后經(jīng)過濃氨水等堿化和正己烷萃取得到產(chǎn)品。此工藝在生產(chǎn)中有好的操作性，但該工藝不可避免的存在如下缺點(diǎn)(I)回流過程石油醚等有機(jī)溶劑的用量很大；(2)提取過程耗時(shí)較長，采用樹脂吸附和解吸附需要的時(shí)間較長，間接的增加了生產(chǎn)成本。同時(shí)，樹脂使用和再生也會(huì)導(dǎo)致廢水量的增加；(3)此發(fā)明的收率仍然較低，每公斤非洲馬鈴果原料的它勃寧提取率僅為I. 6%左右。2010年，陜西嘉禾植物化工有限責(zé)任公司申請了發(fā)明專利《一種從馬鈴果中提取它勃寧的方法》(申請?zhí)?01010609832. 5)，將有機(jī)溶劑回流提取改為酸水提取，然后將提取液堿化，再用有機(jī)溶劑萃取，最后經(jīng)結(jié)晶干燥得到它勃寧。該工藝將提取收率增加到3%左右，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。然而，該工藝也存在有機(jī)溶劑用量較大、廢水較多的缺點(diǎn)，另外在提取液堿化之后需要靜置過夜等步驟，因而提取需要耗費(fèi)的時(shí)間較長。綜上所述，目前所有公開的發(fā)明專利都存在有機(jī)溶劑用量大、提取耗時(shí)長的缺點(diǎn)。到目前為止，除上述專利外，國內(nèi)外尚未見到其他文獻(xiàn)報(bào)道馬鈴果中生物堿它勃寧的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種制備工藝簡單、有機(jī)溶劑用量少、更加經(jīng)濟(jì)環(huán)保，而且提取耗時(shí)較少、提取成本相對較低，基本無三廢排放的采用生物酶輔助水解提取馬鈴果中它勃寧的低成本新工藝，以克服現(xiàn)有工藝過程提取耗時(shí)較長、消耗大量有機(jī)溶劑、產(chǎn)品收率還有待于進(jìn)一步提聞的問題。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的之總體技術(shù)構(gòu)想是首先將馬鈴果粉碎備用；然后采用石油醚適量進(jìn)行脫脂；脫脂過濾后再在緩沖溶液體系中進(jìn)行酶解預(yù)處理，從而使植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、有利于增加下一步生物堿它勃寧的釋放率；也既是在酶解液過濾后的濾渣再采用低級醇進(jìn)行提取目標(biāo)產(chǎn)物；醇提取液減壓蒸濃縮后得到黃色粘性物質(zhì)；最后將黃色油狀物用進(jìn)行降溫、靜置析出結(jié)晶即為它勃寧產(chǎn)品。有鑒于上述構(gòu)想，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的之具體技術(shù)方案是
一種基于酶水解提取馬鈴果中它勃寧的新工藝，以非洲馬鈴果為原料，經(jīng)粉碎、脫月旨、酶解、提取、濃縮、干燥結(jié)晶等步驟，從而獲得純度高于98%的它勃寧產(chǎn)品。其創(chuàng)新點(diǎn)在于I.所述粉碎步驟是將干燥的馬鈴果種子采用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎到20 400目，其中粉碎到20 100目提取效果最佳。2.所述脫脂步驟采用石油醚為溶劑，脫脂過程加入石油醚的量為馬鈴果粉末的質(zhì)量的I 5倍，溫度為20 80°C，其中在25 50°C時(shí)脫脂效果較好。3.所述酶解步驟為脫脂后的馬鈴果殘?jiān)M(jìn)行酶解，其中酶解體系為pH值3 6的緩沖體系，所述緩沖液可為檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、或者直接采用硫酸、或者鹽酸、磷酸等調(diào)節(jié)體系的PH值。所述酶解過程酶解液的量為馬鈴果原料質(zhì)量的I 30倍，添加酶量為O. 05% 5. 0%，酶解溫度為30 60°C，酶解時(shí)間為O. 5 15h。所述酶解過程添加的酶可以是綠色木霉纖維素酶、里氏木霉纖維素酶、黑曲霉纖維素酶、或者纖維素酶與果膠酶的混合物、纖維素酶與半纖維素酶的混合物，或者是上述所有酶的固定化酶。4.上述3步酶解后的固定化酶可以循環(huán)使用，游離酶可以通過膜分離的方法進(jìn)行回收再利用。5.所述提取步驟為將上述3步酶解后過濾，濾渣采用50% 95%低級醇進(jìn)行提取，其中低級醇為乙醇時(shí)效果最佳，提取溫度為45 75°C。加入醇溶液的量為馬鈴果粉末重量的I 10倍，提取次數(shù)為I 5次。并將提取液過濾合并所獲的濾液。6.所述濃縮步驟為減壓蒸至獲得黃色油狀液體，濃縮溫度為40 70°C。7.所述結(jié)晶步驟為降溫結(jié)晶法，可以是在室溫條件下自然降溫，或者在4°C條件下自然降溫。本發(fā)明按照上述技術(shù)方案實(shí)施，可見其工藝流程簡單，與已有專利相比明顯石油醚和正己烷等有機(jī)溶劑的用量少，而且廢水少，基本無三廢排放，同時(shí)提取耗時(shí)也較短。從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。與目前已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，主要體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)I.運(yùn)用生物酶預(yù)處理原料破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得后續(xù)它勃寧生物堿釋放率提高，提取過程它勃寧的收率增加，提取率高于3. 2%。2.與現(xiàn)有技術(shù)相比，整個(gè)提取過程使用石油醚、正己烷等有機(jī)溶劑用量大大減少，因而提取過程對環(huán)境友好且對人體無毒、無三廢排放。3.由于經(jīng)過酶的預(yù)處理，提取的時(shí)間明顯縮短，過程簡單而且容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化放大。


圖I本發(fā)明一種具體實(shí)施工藝流程與現(xiàn)有技術(shù)流程比較圖2由專利工藝獲得產(chǎn)品與本發(fā)明一種實(shí)施方式所獲它勃寧產(chǎn)品及標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜比較(其中A為專利201010609832. 5實(shí)施例工藝產(chǎn)品，B為本發(fā)明所獲產(chǎn)品，C為標(biāo)準(zhǔn)品)
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施方式
的描述，對本發(fā)明從馬鈴果里提取生物堿它勃寧的工藝作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I如圖I工藝流程所示，取IOKg馬鈴果種子粉碎至60目，加入IOL石油醚脫脂，過濾后殘?jiān)?0L醋酸緩沖液(pH = 5. O)和0.2%的纖維素酶，在501下攪拌211，過濾后殘?jiān)?5L乙醇(90%)分兩次提取，提取液合并后在50°C下減壓蒸餾濃縮，得到黃色油狀物，油狀物自然冷卻結(jié)晶得到淡黃色粉末O. 32Kg，收率3. 2 %、含量為99. I %。所得產(chǎn)品采用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品以及采用專利(申請?zhí)?01010609832. 5)的實(shí)施例方法獲得的產(chǎn)品進(jìn)行對照分析，結(jié)果如圖2，表明提取產(chǎn)品純度較高且結(jié)構(gòu)合理。實(shí)施例2取IOKg馬鈴果種子粉碎至40目，加入12L石油醚脫脂，過濾后殘?jiān)?0L檸檬酸緩沖液(pH = 4. 5),0. 15%的纖維素酶和O. 05%的果膠酶，在50°C下攪拌3h，過濾后殘?jiān)?0L乙醇(85%)分兩次提取，提取液合并后在55°C下減壓蒸餾濃縮，得到黃色油狀物，油狀物在4°C下自然冷卻結(jié)晶得到淡黃色粉末O. 33Kg，收率3. 3 %、含量為99. 2 %。實(shí)施例3取IOKg馬鈴果種子粉碎至100目，加入15L石油醚脫脂，過濾后殘?jiān)?0L醋酸緩沖液(pH = 4. 5),0. 35%的纖維素酶和O. 15%的半纖維素酶，在45°C下攪拌1.5h，過濾后殘?jiān)?7L乙醇(80%)分三次提取，提取液合并后在45°C下減壓蒸餾濃縮，得到黃色油狀物，油狀物在室溫下自然冷卻結(jié)晶得到淡黃色粉末O. 325Kg，收率3. 25%、含量為99. O %。
權(quán)利要求
1.一種基于酶水解提取馬鈴果中的生物堿它勃寧的新工藝，其特征在于包括以下步驟(I)粉碎和脫脂 將干燥的馬鈴果種子粉碎至20 400目，添加I 5倍石油醚進(jìn)行脫脂，脫脂溫度為20 60。。。
(2)酶解 脫脂后的馬鈴果粉末過濾，然后在PH值為3 6的緩沖溶液體系中進(jìn)行酶解。
(3)提取 將酶解后的酶解液過濾除去液體。酶解后的馬鈴果粉末用I 10倍體積的低級醇進(jìn)行提取I 5次。
(4)減壓蒸餾濃縮、干燥結(jié)晶 將上述(3)步得到的提取醇液合并，減壓蒸餾濃縮得到黃色油狀物，冷卻結(jié)晶得到淡黃色粉末為它勃寧產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其中(I)粉碎和脫脂步驟中所述脫脂溶劑為石油醚。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其中(2)酶解步驟所述酶解體系的緩沖液可為醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、鹽酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、磷酸鹽緩沖液，而緩沖液加量則為馬鈴果粉末量的I 30倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其中(2)酶解步驟所述酶解過程的用酶可為綠色木霉纖維素酶、黑曲霉纖維素酶、里氏木霉纖維素酶、或者它們的固定化酶；或者是上述纖維素酶分別與果膠酶、半纖維素酶的組合；所述酶解溫度為40 6(TC,酶解攪拌速度為20 200rpm,加酶量為O. 05% 5%，酶解時(shí)間為O. 5 15h。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述，其中提取步驟(3)中所述低級醇可為50% 95%的甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、或正丁醇，最佳為50% 95%的乙醇。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，其公開了一種基于酶水解提取馬鈴果中它勃寧的新工藝，以克服現(xiàn)有提取技術(shù)有機(jī)溶劑消耗量大、提取耗時(shí)長、收率低的問題。具體以馬鈴果為提取原料，首先將馬鈴果粉碎、石油醚脫脂，然后將脫脂后的原料在緩沖溶液中酶解，酶解后的殘?jiān)玫图壌继崛。崛∫汉喜⒑笥脺p壓蒸餾濃縮，得到黃色油狀物經(jīng)冷卻、結(jié)晶干燥后得到它勃寧，產(chǎn)品收率大于3.2％，含量達(dá)99％以上。本發(fā)明運(yùn)用酶解技術(shù)使植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)更疏散，增加它勃寧生物堿的釋放率，大大縮短提取時(shí)間和減少有機(jī)溶劑的用量，從而降低提取成本。本發(fā)明具有工藝簡單快速、提取過程有機(jī)溶劑用量少，提取收率高、無三廢排放的特點(diǎn)。
文檔編號C07D471/20GK102816160SQ201210165108
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者李良智, 周罡, 錢瑋, 胡翠英, 扶教龍, 邱業(yè)先 申請人:蘇州科技學(xué)院