專利名稱：：巨噬細(xì)胞來源的趨化因子和趨化因子類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：大體來說，本發(fā)明是有關(guān)趨化因子的，更具體而言是純化和分離編碼一種新的人C-C趨化因子的多核苷酸，純化和分離由該多核苷酸編碼的趨化因子蛋白，以及新的趨化因子蛋白的重組體生產(chǎn)的材料和方法。背景趨化因子，也稱作“胞間分泌因子”和“SIS細(xì)胞因子”，組成一族小的分泌蛋白(例如、70-100個氨基酸和8-10千道爾頓)，它吸引和活化白細(xì)胞，從而輔助免疫系統(tǒng)的激活和調(diào)節(jié)。“趨化因子”的名字來自趨化性的細(xì)胞因子，因這些蛋白能刺激白細(xì)胞的趨化性。確實，趨化因子可能構(gòu)成炎性細(xì)胞進(jìn)入病理組織的主要吸引分子。一般參考巴格歐利尼等，免疫學(xué)進(jìn)展，5597-179(1994)。雖然白細(xì)胞有豐富的趨化因子，不同的趨化因子在大量的組織中也表達(dá)。同上雜志，表2。以前確認(rèn)的趨化因子，互相之間一般具有20-70％的氨基酸同一性，含4個高度保守的半胱氨酸殘基。根據(jù)前二個半胱氨酸的相對位置，趨化因子可進(jìn)一步分為二個亞族?！癈-X-C”或“α”亞族，編碼的基因位于人第4號染色體上，前二個半胱氨酸被一個氨基酸隔開?！癈-C”或“β”亞族，編碼的基因位于人17號染色體上，前二個半胱氨酸是相鄰的。X-射線晶體學(xué)和NMR對不同的趨化因子研究表明，在每一族中，第一和第三個半胱氨酸形成第一條二硫鍵，第二和第四個半胱氨酸形成第二條二硫鍵，強烈地影響蛋白的天然構(gòu)象。僅在人類中，已描述了每一趨化因子亞族有近十個不同的序列。二類亞族的趨化因子具有20-25個氨基酸的特征性前導(dǎo)序列。C-X-C趨化因子，包括IL-8，GROα/β/γ，血小板堿性蛋白，血小板因子4(PF4)，IP-10和其它種類；當(dāng)比較任二個氨基酸序列時(除GROα/β/γ成員間，互相有84-88％的同一性外)，享有大約25％-60％的同一性。大多數(shù)C-X-C趨化因子(不包括IP-10和血小板因子4)在前二個半胱氨酸殘基上游，有一個共同的E-L-R三肽基序(motif)；它們是嗜中性粒細(xì)胞的強刺激因子，引起快速的形態(tài)變化，趨化性，呼吸爆發(fā)和脫?；?。這些效應(yīng)由七個跨膜域的，視紫紅質(zhì)樣的G蛋白偶聯(lián)受體所介導(dǎo)；對IL-8特異的受體已被赫爾姆斯等，科學(xué)，2531278-80(1991)克隆出來，而識別IL-8，GRD和NAP2的相似受體(77％的同一性)已由墨菲和蒂菲尼，科學(xué)，2531280-83(1991)克隆。逐步地去除某一C-X-C趨化因子，包括IL-8，的N端氨基酸序列，與活性的顯著增加有關(guān)。C-C趨化因子包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1α和MIP-1β，單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白1，2和3(MCP-1/2/3)，RANTES，I-309和其它種類，互相之間享有25％-70％氨基酸同一性。所有前已確認(rèn)的C-C趨化因子能活化單核細(xì)胞，引起鈣流和趨化性。更為選擇性的效應(yīng)是對淋巴細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞對RANTES有最佳反應(yīng)。迄今為止，五個具七個跨膜域G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體已被克隆，包括識別MIP-1α和RANTES的C-C趨化因子受體-1(CCR1)(內(nèi)特等，細(xì)胞，72415-425(1993))，識別MCP-1的CCR2受體(查羅等，美國國家科學(xué)院院報，912752-56(1994))；識別eotaxin的CCR3(康帕蒂爾，生物化學(xué)雜志，27016491(1995))；識別MIP-1α、RANTES和MCP-1的CCR4(普安等，生物化學(xué)雜志，27019495(1995))；和識別MIP-1α、MIP-1β和RANTES的CCR5(薩姆森等，生物化學(xué)，353362(1996))。在不同的病理狀態(tài)下，許多趨化因子，特別是IL-8的作用已有充分的文獻(xiàn)記載。一般可參見巴格歐利尼等，同前，表7。如牛皮癬與IL-8的過量產(chǎn)生相關(guān)，不同的研究觀察到風(fēng)濕病、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)的患者，其發(fā)炎的關(guān)節(jié)滑液有高水平的IL-8。盡管比IL-8的作用了解得少，在病理狀態(tài)下C-C趨化因子的作用也有記載。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑液中，MCP-1的濃度比其它關(guān)節(jié)炎患者高。單核吞噬細(xì)胞的MCP-1依賴性內(nèi)流是特發(fā)性肺纖維化形成的重要事件。C-C趨化因子在進(jìn)入動脈粥樣硬化區(qū)的單核細(xì)胞募集中的作用，目前已引起廣泛的興趣，在巨噬細(xì)胞豐富的動脈壁區(qū)而不是一般的動脈組織中，已檢測到MCP-1增強性表達(dá)。MCP-1在惡性細(xì)胞中的表達(dá)顯示抑制這些細(xì)胞體內(nèi)成瘤的能力。(見美國專利號5,179,078，在此引入作為參考)。因而有必要對另外的C-C趨化因子予以確認(rèn)，描述其特征，進(jìn)一步說明這個分子重要家族在病理狀態(tài)中的作用，和應(yīng)用衍生于趨化因子的產(chǎn)物，對這些病理狀態(tài)進(jìn)行改進(jìn)治療。已表明C-C亞族的趨化因子可用于醫(yī)學(xué)成像，如對感染，炎癥位點和其它具有C-C趨化因子受體分子的位點進(jìn)行成像。如見昆克爾等，美國專利號5,413,778，在此引入作為參考。此種方法涉及的步驟是，用人工識別技術(shù)(如見美國專利號4,965,392和5,037,630，在此引入作為參考)，把標(biāo)記劑(如放射性同位素)化學(xué)附著在C-C趨化因子上，讓受試者用藥學(xué)可接受的載體服用標(biāo)記的趨化因子，使標(biāo)記的趨化因子在靶位積累，對標(biāo)記的趨化因子在體內(nèi)靶位成像。本領(lǐng)域需要有另外新的C-C趨化因子，以增加醫(yī)學(xué)成像工具的有效貯存。也已表明C-C趨化因子RANTES、MIP-α和MIP-1β是人T細(xì)胞對人免疫缺陷病毒(HIV)的抑制效應(yīng)的主要介導(dǎo)者，HIV導(dǎo)致引起人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。這些趨化因子顯示抑制HIV特異株感染培養(yǎng)T細(xì)胞系，具有劑量依賴性[科克希等，科學(xué)，2701811(1995)]。不過，并不是所有受試的病毒株對這種抑制作用有相同的敏感性；因而需要有另外的C-C趨化因子用作HIV株的抑制劑。更為一般來說，由于趨化因子作為趨化性和炎癥介導(dǎo)者的重要性，有必要確認(rèn)和分離新的趨化因子家族成員，以方便炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。例如，促進(jìn)炎癥的物質(zhì)可促進(jìn)傷口愈合或加速比如從肺炎狀態(tài)的恢復(fù)，發(fā)炎對消除感染的重要的。炎癥的調(diào)節(jié)對具明顯炎癥的病理狀態(tài)同樣重要。節(jié)段性回腸炎，表現(xiàn)為腸所有層的慢性炎癥，疼痛和腹瀉，就是這樣的一種病理狀態(tài)。對節(jié)段性回腸炎藥物治療的失敗率相當(dāng)高，該病即使病人接受外科手術(shù)后也常復(fù)發(fā)。對新的趨化因子的確認(rèn)、分離和特性分析有利于炎癥調(diào)節(jié)。同樣地，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)可促使任一種病理狀態(tài)的緩和或消失。由于白細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)在細(xì)胞介導(dǎo)的免應(yīng)答中的重要作用，以及趨化因子在白細(xì)胞趨化性中的確定作用，有必要識別和分離新的趨化因子，以方便于免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。另外，趨化因子的表達(dá)，炎癥的條件和疾病狀態(tài)之間的確定關(guān)系，可把趨化因子和能與趨化因子起特異免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)，用作診斷和預(yù)后的指征；有必要識別和分離新的趨化因子，以方便作診斷和預(yù)后的指征。除能吸引和活化白細(xì)胞外，某些趨化因子，比如IL-8，能影響非白細(xì)胞性細(xì)胞的增殖。見塔斯切爾，皮膚病研究雜志，99294-298(1992)。有必要識別和分離新的趨化因子，以促進(jìn)這些細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。為前所提的所有理由，需要有重組生產(chǎn)新發(fā)現(xiàn)的趨化因子的方法，該法促進(jìn)涉及趨化因子和趨化因子抑制劑的臨床應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明提供新的純化和分離多核苷酸和多肽的方法，以滿足以上所概括的一種或更多種的需求。例如，本發(fā)明提出的純化和分離的多核苷酸(即，DNA和RNA，正義和反義鏈)，它編碼一種新的C-C亞族的人趨化因子，在此命名為“來自巨噬細(xì)胞的趨化因子”或“MDC”。本發(fā)明優(yōu)選的DNA序列包括基因組和cDNA序列，以及化學(xué)合成的DNA序列。cDNA核苷酸序列，命名為MDCcDNA，編碼該趨化因子，列于SEQIDNO1中，該序列包括5′和3′非編碼序列。本發(fā)明優(yōu)選的DNA包含SEQIDNO1的20-298位核苷酸，該核苷酸組成MDC的編碼序列。MDC蛋白在氨基端包含推測的24個氨基酸的信號序列。本發(fā)明優(yōu)選的DNA組成SEQIDNO192-298的核苷酸，這些核苷酸包含推測的成熟(分泌)MDC蛋白的編碼序列，沒有信號序列。趨化因子MDC的氨基酸序列列于SEQIDNO2中。除上述的多核苷酸外，本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸包括能編碼列于SEQIDNO2中的氨基酸序列，它與前幾節(jié)描述的僅由于眾所周知的遺傳密碼簡并的多核苷酸不同。同樣地，因為SEQIDNO2的24個氨基酸(-24至-1位)組成能裂解產(chǎn)生成熟的MDC趨化因子的公認(rèn)的信號肽，優(yōu)選的多核苷酸包括編碼SEQIDNO2的1-69氨基酸的部分。這樣，優(yōu)選的多核苷酸是純化的多核苷酸，它編碼的多肽含包括SEQIDNO21-69位氨基酸的氨基酸序列。應(yīng)用本發(fā)明的多核苷酸時可用作雜交探針，識別和分離編碼人MDC的基因組DNA，該基因可能含C-C趨化因子基因特有的三個外顯子/二個內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(貝巴格歐利尼等，同上)；識別和分離與MDC同源的編碼非人蛋白的DNA序列；識別與MDC相似的人和非人的趨化因子，以及識別表達(dá)MDC的細(xì)胞和該蛋白表達(dá)的條件。本發(fā)明的雜交探針也有診斷用途，如篩選諸如結(jié)腸組織的人組織的炎癥。更具體而言，使用MDC多核苷酸雜交探針的雜交研究能區(qū)別節(jié)段性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸組織(MDC雜交檢測上皮，固有層，佩耶(payer’s)斑和平滑肌)與正常人結(jié)腸組織(上述背景下不會雜交)。一般來說，本發(fā)明的MDCcDNA至少有約14個最好約18個核苷酸的連續(xù)部分，對用作本發(fā)明的雜交探針是有用的。這樣，在一實施方案中，本發(fā)明包括的DNA含SEQIDNO1或相應(yīng)的非編碼互補鏈的核苷酸序列的連續(xù)部分，該部分至少含18個核苷酸，該DNA能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與人MDC基因的編碼或非編碼鏈雜交。本發(fā)明的雜交探針作診斷用途時，更為可取的是表現(xiàn)為對MDC基因序列的雜交專一性。這樣，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明雜交探針DNAs在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不會與其它的人趨化因子基因雜交(如，MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因等)。另一方面，本發(fā)明提供純化的多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下能與SEQIDNO1的DNA的非編碼鏈雜交。同樣地，本發(fā)明提供的純化的多核苷酸，要不是遺傳密碼的冗佘性(redundancy)，在嚴(yán)格條件下能與SEQIDNO1的DNA的非編碼鏈雜交。示范性的嚴(yán)格雜交條件如下在5×SSC，20mM磷酸鈉，pH6.8，50％甲酰胺中，42℃雜交，在0.2×SSC中42℃下清洗。本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，依據(jù)被雜交序列的長度和GC核苷酸堿基的含量變化實驗條件，是合乎需要的，有確定這些變化的公式[如見，圣姆布魯克等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989).]。另一方面，本發(fā)明包括摻入了本發(fā)明DNA的質(zhì)粒和病毒DNA載體，包括上述或本文其它地方描述的DNA的任一種。優(yōu)選的載體包括表達(dá)載體，在表達(dá)載體中，摻入的編碼MDC的cDNA可操作地與內(nèi)源或異源的表達(dá)控制序列相連。以上表達(dá)載體可進(jìn)一步包括操作性地連接編碼MDCDNA序列的編碼多肽的DNA序列，這種載體可表達(dá)產(chǎn)生含重要的MDC多肽的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明包括用本發(fā)明的DNA或載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的宿主細(xì)胞中，能表達(dá)由本發(fā)明的DNA或載體所編碼的成熟的MDC多肽。本發(fā)明的DNA，載體和宿主細(xì)胞，對如本發(fā)明的MDC多肽的大量重組生產(chǎn)是有用的。這些方法也在本發(fā)明之中。例如，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)MDC的方法，其中本發(fā)明的宿主細(xì)胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，從細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離MDC蛋白。再一方面，本發(fā)明包括純化和分離MDC多肽的方法。優(yōu)選肽是純化的趨化因子多肽，具有包含SEQIDNO2的1-69位氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽可從天然的材料中純化，但優(yōu)選，應(yīng)用本發(fā)明的DNAs，載體和/或宿主，用重組方法生產(chǎn)，或化學(xué)合成。本發(fā)明純化的多肽，根據(jù)所選的宿主細(xì)胞、重組生產(chǎn)的方法、分離方法、處理過程、貯存緩沖液等情況，可以是糖基化或非糖基化的，水溶或不溶，氧化的，還原的等。此外，本發(fā)明的一個方面包括MDC多肽類似物，其中是從本發(fā)明MDC多肽的一個或多外氨基酸殘基添加，缺失或取代而成，類似物保留C-C趨化因子特有的一個或多個生物學(xué)活性。MDC的小有利于以上多肽類似物的化學(xué)合成，用本文描述的許多活性測定的方法，篩選具M(jìn)DC的生物活性(如誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化性的能力，抑制單核細(xì)胞趨化性的能力)的類似物。替代方法是這些多肽類似物可用熟知的方法重組產(chǎn)生，如對本發(fā)明編碼MDC的DNA定點突變。有關(guān)的方面，本發(fā)明包括從本發(fā)明的MDC多肽的一或更多個氨基酸殘基被添加、缺失或取代的多肽類似物，該類似物缺乏C-C趨化因子或MDC的生物學(xué)活性，但能競爭性或非競爭性地抑制MDC多肽和C-C趨化因子受體的結(jié)合。這樣的多肽是有用的，如用于調(diào)節(jié)宿主內(nèi)源性MDC的生物學(xué)活性，也可用于上述醫(yī)學(xué)影像方法。MDC的某些特殊的類似物可設(shè)計作調(diào)節(jié)MDC的結(jié)構(gòu)、分子間結(jié)合特性和生物學(xué)活性。例如，可特別地設(shè)計缺失氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)的類似物(截短)改變MDC的結(jié)構(gòu)和功能。另外，可特別地設(shè)計下列單氨基酸改變體(單獨或結(jié)合)(1)非堿性氨基酸分別替換SEQIDNO2的24和27位的堿性精氨酸和/或賴氨酸；(2)帶電荷的或極性氨基酸(如絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸)替換SEQIDNO230位的酪氨酸，替換SEQDNO2的59位的色氨酸，和/或SEQIDNO260位的纈氨酸；和(3)用堿性或不帶電荷的小氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替換SEQIDNO250位的谷氨酸。具有這些氨基酸改變的特殊類似物包括在下面的通式中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的氨基酸可選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的氨基酸可獨自地選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的氨基酸可獨自地選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中50位的氨基酸可獨自地選自谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位氨基酸可獨自地選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中60位氨基酸可獨自地選自纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。這些MDC多肽類似物可特別地設(shè)計以調(diào)節(jié)MDC對趨化因子受體和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、紅細(xì)胞趨化因子受體)的結(jié)合特性，這些特性在MDC呈遞給其受體時認(rèn)為是重要的。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的MDC多肽類似物包括SEQIDNO25的1-69的氨基酸。已合成的下述另外的類似物，也成為本發(fā)明的方面(a)包含鑒定為SEQIDNO30的1-70位的氨基酸序列的多肽；(b)包含鑒定為SEQIDNO2的9-69位的氨基酸序列的多肽；(c)包含鑒定為SEQIDNO31的1-69位的氨基酸序列的多肽；(d)包含鑒定為SEQIDNO32的1-69位的氨基酸序列的多肽。相關(guān)的方面是本發(fā)明提供純化和分離編碼以上MDC多肽類似物的多核苷酸的方法，這些多核苷酸對如重組方法生產(chǎn)MDC多肽類似物；把以上多核苷酸與質(zhì)粒和病毒載體連接，用該DNA或載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化原核和真核宿主細(xì)胞是有用的。另一方面本發(fā)明包括能和本發(fā)明的MDC多肽和多肽類似物起免疫反應(yīng)的抗體物質(zhì)(例如，單克隆和多克隆抗體，單鏈抗體，嵌合或人源化抗體等)。以上抗體對諸如純化本發(fā)明的多肽，如用熟知的ELISA技術(shù)定量測定宿主內(nèi)源性的MDC和調(diào)節(jié)MDC對其受體的結(jié)合是有用的。本發(fā)明進(jìn)而包括生產(chǎn)本發(fā)明抗體物質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明重組的MDC多肽和多肽類似物象抗體一樣可用于結(jié)合反應(yīng)，以識別表達(dá)MDC受體的細(xì)胞和用標(biāo)準(zhǔn)的克隆表達(dá)技術(shù)，分離編碼受體的多核苷酸。這些MDC多肽，MDC多肽類似物和MDC受體多肽對MDC趨化因子活性的調(diào)節(jié)，多肽和化學(xué)性的(如小分子)MDC激動劑和拮抗劑的鑒別是有用的。本發(fā)明的另一方面是有關(guān)本發(fā)明的MDC多肽和多肽類似物的藥學(xué)應(yīng)用。例如，已表明MDC能調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化性。特別地，MDC能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化性和抑制單核細(xì)胞趨化性。因而一方面本發(fā)明包括調(diào)節(jié)(如上調(diào)或下調(diào))哺乳類宿主的白細(xì)胞趨化性的方法，含給哺乳類宿主服用本發(fā)明的MDC多肽和多肽類似物的步驟、其中MDC多肽或MDC多肽類似物能調(diào)節(jié)宿主白細(xì)胞的趨化性。在優(yōu)選的方法中，白細(xì)胞是單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。例如，服用實驗確定的MDC劑量(如在藥學(xué)可接受的載體中)，以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化性或抑制單核細(xì)胞趨化性，而使用抑制性的MDC多肽類似物獲得相反的效果。另一方面，本發(fā)明提供減輕病人炎性狀態(tài)的方法，該狀態(tài)的特征至少是(i)單核細(xì)胞向所述的病人炎癥位點趨化或(ii)成纖維細(xì)胞增殖之一，該方法包括給病人服用MDC治療有效量的步驟。在一實施方案中，MDC治療有效量是能抑制單核細(xì)胞趨化性的量。在另一實施方案中，MDC治療有效量是能抑制成纖維細(xì)胞增殖的量。這些治療有效量是用公認(rèn)技術(shù)的劑量反應(yīng)分析實驗確定的。作為附加的內(nèi)容，本發(fā)明提供含本發(fā)明MDC多肽或多肽類似物在藥學(xué)可接受的載體中的藥學(xué)組合物。同樣地，本發(fā)明有相關(guān)的根據(jù)本發(fā)明作如炎性疾病狀態(tài)的疾病狀態(tài)治療的組合物應(yīng)用方法。在一實施方案中，炎性疾病狀態(tài)的特征是單核細(xì)胞向病態(tài)的病人中的炎性位點趨化。在另一實施方案中，炎性疾病狀態(tài)的特征是具病態(tài)病人的成纖維細(xì)胞增殖。前述的內(nèi)容和大量的附加內(nèi)容從下列附圖和詳述中更為明顯。附圖簡述圖1是人MDC(SEQIDNO2)的氨基酸序列和其他以前已描述的人C-C趨化因子的氨基酸序列比較，這些趨化因子是MCP-3[凡戴姆等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，17659(1992)](SEQIDNO18)；MCP-1[馬特蘇雪瑪?shù)?，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1691485(1989)](SEQIDNO19)；MCP-2(成熟態(tài))[凡戴姆等，同前，常等，國際免疫學(xué)，1388(1989)](SEQIDNO20)；RANTES[施查爾等，免疫學(xué)雜志，1411018(1988)](SEQIDNO21)；MIP-1β[布朗等，免疫學(xué)雜志，142679(1989)](SEQIDNO22)；MIP-1α[內(nèi)高等，分子細(xì)胞生物學(xué)，103646(1990)](SEQIDNO23)；和I-309[米勒等，免疫學(xué)雜志，1432907(1989)](SEQIDNO24)。斜杠“/”表示公認(rèn)的信號肽被切割的位點。插入破折號使序列美觀整齊。圖2是描述在一趨化性分析中，增加MDC濃度對人單核細(xì)胞遷移的趨化影響圖(用熒光單位計量)。實心圓圈表示來自THP-1細(xì)胞系的單核細(xì)胞的應(yīng)答?？招牧庑伪硎緦﹃栃詫φ眨湍妇厶腔罨?2AS)的應(yīng)答。圖3是描述增加MDC濃度對人多形核(pmn)白細(xì)胞遷移的趨化影響圖(用熒光單位)計量。實心圓圈表示對MDC的應(yīng)答，空心菱形表示對陽性對照IL-8的應(yīng)答。圖4是描述增加MDC濃度對巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞遷移的趨化影響圖(用熒光單位計量)。實心圓圈表示來自THP-1細(xì)胞系的巨噬細(xì)胞對MDC的應(yīng)答?？招膱A表示來自THP-1細(xì)胞系的單核細(xì)胞對MDC的應(yīng)答。圖5是描述增加MDC濃度對豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞遷移的趨化影響圖(用熒光單位計量)。實心圓圈表示巨噬細(xì)胞對MDC的應(yīng)答?？招娜切伪硎緦﹃栃詫φ盏慕湍妇厶腔罨?ZAS)的應(yīng)答。圖6是描述增加MDC濃度，對由MCP-1誘導(dǎo)的THP-1單核細(xì)胞遷移的抑制趨化性影響圖(用熒光單位計量)。實心圓圈表示MDC抑制趨化的效果，趨化性已被MCP-1誘導(dǎo)出來?？招膱A圈表示在對照實驗中，僅用基本培養(yǎng)基(RPMI加0.2％BSA(RBSA)，無MCP-1)時，MDC抑制趨化的效果。X軸上的零點相應(yīng)于沒有任何MDC時，細(xì)胞對MCP-1和RBSA的應(yīng)答。圖7是描述增加MDC濃度對成纖維細(xì)胞增殖的影響圖(用每分計數(shù)(cpm)計量)。實心圓圈表示用純化的從CHO細(xì)胞重組生產(chǎn)(參考實施例10F)的MDC的增殖反應(yīng)?？招膱A圈表示用化學(xué)合成的MDC(參考實施例11)的反應(yīng)。圖8是用圖表示哺乳類表達(dá)載體pDC1的結(jié)構(gòu)。發(fā)明詳述用下列的實施例闡述本發(fā)明，有關(guān)的人cDNA命名為MDCcDNA，所編碼的新的C-C趨化因子命名為MDC(為“來源自巨噬細(xì)胞的趨化因子”)。更為詳細(xì)地，實施例1描述從人巨噬細(xì)胞cDNA文庫中分離部分MDCcDNA。實施例2描述用從實施例1來的cDNA作探針，從cDNA文庫中分離另外的cDNA，這些cDNA之一含全長的MDC編碼序列。另外，實施例2提出復(fù)合的MDCcDNA核苷酸序列和由此編碼趨化因子(MDC)的推導(dǎo)性氨基酸序列的特征。在實施例3中，描述的實驗顯示在不同的人組織中MDC基因表達(dá)的水平。觀察到最強的MDC基因表達(dá)在胸腺，而可檢出的最弱表達(dá)在脾和肺組織。實施例4更為詳細(xì)地描述了在單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞過程中，和誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞樣的細(xì)胞類型時MDC基因的表達(dá)。由于在實施例3中MDC基因表達(dá)在胸腺和脾中檢出，原位雜交研究可進(jìn)一步對MDC基因在這些組織中表達(dá)進(jìn)行定位。另外，原位雜交顯示了MDC基因高表達(dá)在腸組織和節(jié)段性結(jié)腸炎之間的相關(guān)性。這些原位雜交實驗在實施例5中描述。實施例6描述MDC作為GST融合蛋白在原核細(xì)胞中的重組生產(chǎn)，和融合蛋白的切割以及重組MDC純化的方法。實施例7描述用于重組MDC蛋白表達(dá)的替代性DNA構(gòu)體的構(gòu)建方法和描述用這種構(gòu)體轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主生產(chǎn)MDC的方法。實施例8提供實驗方案對在實施例7中描述生產(chǎn)的重組MDC進(jìn)行純化。實施例9和10提供實驗方案分別在酵母和哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行MDC重組生產(chǎn)。此外，實施例10提供純化重組MDC的方案。實施例11描述用多肽合成方法生產(chǎn)MDC和MDC多肽類似物。實施例12-17提供方案測定MDC生物學(xué)活性。例如，實施例12提供MDC對嗜堿細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞影響的測定法。實施例13描述MDC對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和粒細(xì)胞的化學(xué)引誘和細(xì)胞活化特性的測定法。實施例14-17提供體內(nèi)測定MDC生物學(xué)活性的案方。實施例14提供MDC抑制腫瘤生長的測定法。實施例15和16提供方案測定分別經(jīng)腹腔和皮下注射的MDC活性。實施例18提供方案產(chǎn)生和MDC起特異免疫反應(yīng)的單克隆抗體。剩下的實施例提供另外的MDC活性測定法。例如，實施例19提供鈣流測定法，以測定MDC誘導(dǎo)細(xì)胞活化的能力。實施例20提供方法測定MDC抗HIV增殖的影響。實施例21說明MDC抗成纖維細(xì)胞增殖的影響。實施例22提供體外MDC對其他細(xì)胞類型增殖的影響的方法。實施例23提供體內(nèi)方法測定MDC抗成纖維細(xì)胞增殖的影響。實施例24提供方法識別MDC調(diào)節(jié)因子。實施例1部分C-C趨化因子cDNA的分離新的C-C趨化因子的部分cDNA按下法分離。PolyA+RNA從來源自外周血單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中收獲。雙鏈，平末端cDNA用體外遺傳拷貝試劑盒(圣地亞哥，CA)產(chǎn)生，在插入哺乳表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen)前，把BstXI修飾子連接到cDNA上[見特喬爾克等，自然，374549-552(1995)]。藍(lán)XL1大腸桿菌(stratagene，LaJolla，CA)用質(zhì)粒cDNA經(jīng)電穿孔方法轉(zhuǎn)化，植到含100μg/ml羧芐青霉素的986個平板上(約每板3000個轉(zhuǎn)化體)。37℃生長過夜后，每板的細(xì)菌刮下形成986個細(xì)菌庫。用大量微制備DNA純化系統(tǒng)(普洛麥格，麥迪遜，WI)，根據(jù)廠家的說明書，把質(zhì)粒DNA從986個細(xì)菌庫中逐個分離。純化的質(zhì)粒DNA庫按下法進(jìn)一步鑒定，用于分離單個的DNA克隆來自各個庫的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化藍(lán)XL1大腸桿菌細(xì)胞，植板，按上法生長過夜。隨機挑選各個轉(zhuǎn)化體，在添加羧芐青霉素的3mlLB培養(yǎng)基中生長過夜，質(zhì)粒純化用Wizard微制備純化系統(tǒng)(普洛麥格)，作如下改動250mg硅藻土(西格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，MO)加到廠家提供的DNA結(jié)合樹脂中。純化的質(zhì)粒DNA在自動測序儀型號373(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特城，CA)上測序，所用的引物是JHSP65′GACACTATAGAATAGGGC3′(SEQIDNO3)該引物能與質(zhì)粒載體pRc/CMV載體鄰近克隆位點的部分雜交。各個cDNAs的核苷酸和推導(dǎo)出的氨基酸序列與核苷酸和肽數(shù)據(jù)庫比較，以確定編碼蛋白的哪一個克隆與已知的炎性介導(dǎo)分子相似。序列比較于1994年12月14日由布賴斯特國家中心生物技術(shù)信息網(wǎng)絡(luò)服務(wù)部(e-mail“blast@ncbi.nlm.nih.gov”)進(jìn)行，用艾爾茲邱爾等，分子生物學(xué)雜志，215403-410(1990)的排列算法。序列分析顯示所分離的巨噬細(xì)胞cDNA的一個克隆的一部分，稱為pMP390，含基因序列和前已確認(rèn)的趨化因子基因，包括人MCP-3基因和大鼠MIP-1β基因，有約60-70％的同一性。pMP390的2.85kbcDNA插入片段亞克隆到pBluescriptSK-載體中(Stratagene，LaJollaCA)，從便完全測序。從多聚-A尾巴開始的整套缺失體，用普洛麥格的去-堿基系統(tǒng)(promega′sErase-a-BaseSystem)(MadisonWI)消化形成。缺失質(zhì)粒重新環(huán)化?？寺∵M(jìn)大腸桿菌中，純化，測序用如下表示的M13，T3.1和T7.1引物(SEQIDNO4)M135′GTAAAACGACGGCCAGT3′(SEQIDNO5)T3.15′AATTAACCCTCACTAAAGGG3′(SEQIDNO6)T.7.15′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′這pMP390cDNA全序列相當(dāng)于SEQIDNO1的73-2923位的核苷酸部分(相當(dāng)于SEQIDNO2-6-69位的推導(dǎo)氨基酸序列)。與數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行最原始比較的序列相當(dāng)于SEQIDNO173-610位核苷酸。實施例2含完整MDC編碼序列的另外的cDNA克隆的分離用實施例1分離的pMP390cDNA克隆，從同樣的人巨噬細(xì)胞cDNA文庫中分離另外的cDNA克隆，這些另外的cDNA含另外的5′序列，能編碼完整的來自巨噬細(xì)胞的趨化因子的氨基酸序列。首先，從來自巨噬細(xì)胞cDNA文庫(實施例1)的986個質(zhì)粒DNA庫中，取40個用PCR篩選，以鑒別感興趣的含另外cDNA克隆的庫。根據(jù)實施例1獲得的pMP390cDNA序列，構(gòu)建合成寡核苷酸PCR引物390-1F(稱作SEQIDNO7)和390-2R(SEQIDNO8)，以擴增部分由pMP390編碼的趨化因子基因的211個堿基對序列390-1F5′TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG390-2R5′CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA3′引物390-1F相應(yīng)于SEQIDNO1的91-116位核苷酸，前有限制內(nèi)切酶XbaI的識別位點，4個附加的堿基便于該酶切割；引物390-2R與SEQIDNO1的301-279位核苷酸互補，加有酶BamHI的識別位點，4個附加的堿基位于側(cè)翼。如XbaI和BamHI切點便于獲得片段的克隆。對每一被選的質(zhì)粒庫用50μlPCR反應(yīng)混合液，含0.2μg質(zhì)粒DNA；1.5mM氯化鎂；50mM氯化鉀；10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8.4；0.2mM每一種dNTP；每一引物10μg/ml和0.5μlTaq聚合酶(5U/μl)(伯林格曼海姆生物化學(xué)公司(BMB)，Indianapolis，IN)。反應(yīng)在94℃溫育4分鐘，然后94℃變性15秒，60℃退火15秒和72℃延伸30秒，循環(huán)30次。PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過2％瓊脂糖凝膠(生命技術(shù)公司，Gaithersburg，MD)，在0.5XTBE緩中液中電泳[圣姆布魯克等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)]，用溴化乙錠觀察。篩選的40個質(zhì)粒庫中，6個產(chǎn)生一條相當(dāng)于預(yù)期的230個堿基對的PCR片段的強帶(預(yù)期的PCR片段包括趨化因子基因序列211bp，及側(cè)翼的XbaI和BamHI限制性位點)，表明存在一或更多個含與pMP390有關(guān)的基因序列的質(zhì)粒。為分離以上相關(guān)的克隆，從6個陽性的質(zhì)粒庫中選三個等份電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌XL-IBlue細(xì)胞中，細(xì)胞鋪于平板上，按實施例1描述的方法生長過夜。克隆轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，按下列標(biāo)準(zhǔn)步驟準(zhǔn)備雜交(圣姆布魯克等，同前)。篩選膜的放射性標(biāo)記的MDC探針按下法制備含MDCcDNA的2.85kbDNA片段從pMP390中用限制酶消化切得，在TAE緩沖液中用瓊脂糖凝膠電泳純化(圣姆布魯克等，同前)電洗脫，苯酚和氯仿抽提，乙醇沉淀。純化片段(250ng)用隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒(BMB)，按廠家推薦的方法標(biāo)記。標(biāo)記探針過G-50快速旋(QuickSpin)轉(zhuǎn)柱(BMB)純化。膜和每分鐘計數(shù)(cpm)為5×107的探針，在40-50ml的溶液中，42℃溫育16小時，溶液含50％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，5×SSC(1倍SSC為0.15M氯化鈉，15mM檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉，pH6.5和0.1mg/ml剪切的鮭魚精子DNA(西格瑪，圣路易斯MO)。雜交后，膜在0.2×的SSC中洗三次，在0.2％SDS中55℃洗30分鐘。為顯影雜交結(jié)果，洗過的膜在kodak(羅徹斯特，NK)XAR-5自放射顯影片上，用LighteningPlus增感屏(DuPont，DE)-80℃曝光過夜。PCR用于篩選50個雜交細(xì)菌克隆。50個含3901F和390-2R引物的PCR反應(yīng)按上述方法建立，模板DNA用從來自50個克隆的細(xì)菌代替。開始時，反應(yīng)液94℃變性8分鐘。然后，按上法進(jìn)行35個擴增循環(huán)。一個單克隆產(chǎn)生預(yù)期的230個堿基對的產(chǎn)物；含這克隆的質(zhì)粒命名為pMP390-12。感興趣的另外MDCcDNA，用特異對pMP390插入片段的5′端的探針，克隆雜交識別。探針按下法制備含pMP390cDNA(SEQIDNO1的91-298位核苷酸)編碼區(qū)的211個堿基和鄰近3′非編碼區(qū)的163個堿基的DNA片段，按上述方法用PCR產(chǎn)生，用60ng的pMP390cDNA作模板和合成的寡核苷酸390-1F(SEQIDNO7)和390-4R(SEQIDNO9)作引物390-4R5′AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG3′引物390-4R含BamHI限制性位點及互補于SEQIDNO1461-442位的核苷酸的序列。PCR產(chǎn)物按上述方法電泳純化，50ng純化片段用隨機引物DNA標(biāo)記制劑盒(BMB)標(biāo)記，過G-50快速旋轉(zhuǎn)柱(BMB)純化。膜按上述方法用該片段探測，在0.4×SSC和0.2％SDS中48℃，洗30分鐘，共三次。放射自顯影按上述方法進(jìn)行。5個雜交克隆被檢出，命名為MP390A，MP390B，MP390C，MP390D和MP390E。這5個克隆和一個用pMP390-12轉(zhuǎn)化的克隆被分離和繁殖，用Wizard微量制備DNA純化系統(tǒng)(普洛麥格，麥迪遜，WI)，附加按實施例1所述的硅藻土進(jìn)行質(zhì)粒純化。質(zhì)粒DNA在應(yīng)用生物系統(tǒng)型號373的自動測序儀上測序，用合成引物390-3R(SEQIDNO10)390-3R5′AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC3′引物390-3R與SEQIDNO1的266-246堿基互補，含一個HindIII限制內(nèi)切酶切點和在5′端4個附加的堿基對。設(shè)計該引物能與引物390-2R上游和SEQIDNO1216位核苷酸下游退火，216位點在能編碼本發(fā)明的趨化因子的基因組DNA中有一內(nèi)含子[見戴諾夫等，免疫學(xué)雜志，1521182-1189(1994)]。六個克隆中，pMP390-12和pMP390B克隆含最大的附加5′編碼序列，每一克隆在以前所獲的cDNA克隆pMP390的序列上游額外延長72個核苷酸。復(fù)合的DNA序列，在此命名為MDCcDNA，由pMP390和pMP390-12cDNA序列組合后產(chǎn)生。趨化因子MDC的這個2923個堿基對的復(fù)合cDNA序列和推定的氨基酸序列，分別列于SEQIDNOs1和2中。推定的氨基酸序列和已知的趨化因子序列人工比較顯示MDCcDNA序列編碼一種新型的C-C趨化因子，長為93個氨基酸，和其它C-C趨化因子享有28-34％的氨基酸同一性(圖1和表1)<p>重要的是，具趨化因子特征的四個半胱氨酸殘基在MDC中是保守的。五個附加的殘基在圖1顯示的8個序列中也完全保守。93個氨基酸的MDC序列的前24個氨基酸是明顯疏水的，與決定信號切割的Von.Heijne規(guī)則[核苷酸研究，144683-90(1986)]相一致。這些特征和圖1的多肽比較集中表明MDCcDNA編碼的24個氨基酸的信號肽能被切割，產(chǎn)生在SEQIDNO21位以甘氨酸殘基開始的MDC成熟態(tài)分子。該預(yù)測按以下實施例10描述的，在哺乳動物細(xì)胞重組產(chǎn)生的MDC蛋白的直接測序所證實。MDC復(fù)合的cDNA序列表明在SEQIDNO1序列上預(yù)定為甲硫氨酸密碼子上游的延伸了19個核苷酸，和終止密碼子下游延伸了2.6kb。實施例3MDC基因在人組織中表達(dá)的確定進(jìn)行RNA印跡分析確定MDC基因表達(dá)的組織。實施例2中提到的放射性標(biāo)記的pMP3905′片段(相當(dāng)于編碼公認(rèn)的MDC成熟態(tài)的MDCcDNA區(qū)段，外加相連的3′非編碼區(qū)的163個堿基)，用作探針檢測含來自不同正常人組織的RNA的多組織RNA印跡(Clontech，PaloAlto，CA)。使用前將探針煮沸變性，根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行雜交。用2個增感屏-80℃曝光5天進(jìn)行放射自顯影。觀察到最大的MDC基因表達(dá)是胸腺，在脾和肺組織有可檢測的較弱表達(dá)。來自小腸組織的MDC表達(dá)甚至更低，在腦，結(jié)腸、心臟、腎、肝、卵巢、胰腺、胎盤、前列腺、骨骼肌、睪丸或外周血白細(xì)胞，未檢測到表達(dá)。實施例4巨噬細(xì)胞成熟過程中的MDC基因表達(dá)因為編碼MDC的cDNAs從人巨噬細(xì)胞cDNA文庫中分離、所以要檢查單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞過程中MDC基因表達(dá)。A.來自單個供體的人單核細(xì)胞培養(yǎng)在系列組織培養(yǎng)板中，0、2、4或6天后從一板中收集細(xì)胞。一般參見埃爾斯特等，免疫學(xué)雜志，1401618-1624；特喬爾克等，同上。在這些條件下，4-6天單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞[斯坦福萊尼等，生物化學(xué)雜志，2659682-9687(1990)]。從每一時間點收集的細(xì)胞中分離RNA(每道10μg)，準(zhǔn)備RNA印跡，用上述放射性標(biāo)記的pMP390片段探查。來自新鮮分離的單核細(xì)胞的RNA中，未檢測到雜交信號，而培養(yǎng)6天后分化成巨噬細(xì)胞的細(xì)胞，產(chǎn)生非常強的信號。培養(yǎng)4天的細(xì)胞產(chǎn)生較弱的信號，而培養(yǎng)2天的細(xì)胞產(chǎn)生的信號，只有膜被延長曝光時間后才可見。B.為進(jìn)一步證實在分化的人巨噬細(xì)胞中的MDC的表達(dá)，培養(yǎng)上清液用按以下實施例18所述產(chǎn)生的抗MDC的單克隆抗體western印跡分析。幾塊板的人巨噬細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(0.5ng/ml，R&amp;DSystem，Minneapolis，Minnesota)存在下，生長在塑料上分化8天。移去分化的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，重加同樣的培養(yǎng)基或含低密度脂蛋白(LDL，西格瑪)，氧化的LDL(按馬爾頓等，生物化學(xué)雜志，26613901(1991)的方法，溫育在5μMCuSO4·5H2O中氧化)或地塞米松(6nM，西格瑪化學(xué)公司)。每一處理進(jìn)行三天后，取培養(yǎng)液，加鹽酸調(diào)pH為6.8，過肝素-葡聚糖CL-6B柱(發(fā)瑪西亞，Piscataway，NJ)。用含0.2M氯化鈉的20mM三羥甲基氨基甲烷，pH8洗柱，含0.6M氯化鈉的20mM三羥甲基氨基甲烷pH8的溶液洗脫。洗脫的物質(zhì)在18％的丙烯酰胺SDS-PAGE膠(NOVEX)中分級分離，電印跡到PVDF膜上(Millipore，BedfordMA)。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(圣姆布魯克等)，膜被封閉，清洗和與抗MDC的單克隆抗體反應(yīng)。在每一個分析的培養(yǎng)液中，MDC蛋白在約0.5μg/ml濃度下被檢出，由此確認(rèn)在分化的人巨噬細(xì)胞中MDC的表達(dá)。MDC的表達(dá)也在人上皮細(xì)胞系中做了分析。結(jié)腸上皮T84細(xì)胞系(ATCC#CCL-248)培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO，GaithersburgMD)中，肺上皮A549細(xì)胞系(ATCC#CCL-185)培養(yǎng)在F12培養(yǎng)基中。篩選細(xì)胞中存在的MDCmRNA和培養(yǎng)基中的MDC蛋白，按上述用于巨噬細(xì)胞的方法進(jìn)行。在這些細(xì)胞系中任一方法均未檢出MDC的表達(dá)。此外，T84細(xì)胞系的試樣用腫瘤壞死因子α(5ng/ml，PeproTech，RockyHill，NewJersey)，腫瘤壞死因子-β(1ng/ml，R&amp;DSystems)，或干擾素-γ(200U/ml，PeproTech)，單獨或與100ng/ml的重組MDC(來自CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞，見實施例10)合用，處理一天。A549細(xì)胞系試樣用50ng/mlPMA(西格瑪化學(xué)公司)處理0、1、3、5或7天。當(dāng)用上述RNA印跡法篩選時，對T84或A549細(xì)胞的這些處理沒有一個能檢出MDCmRNA的表達(dá)。C.MDC基因在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的進(jìn)一步檢測用1％DMSO(西格瑪化學(xué)公司)或50ng/mlPMA(西格瑪)處理人細(xì)胞系HL60進(jìn)行。用DMSO處理誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化成粒細(xì)胞樣表型，而PMA誘導(dǎo)HL60分化成巨噬細(xì)胞譜系[帕魯塞等，血液，58836-843(1981)]。RNA從未處理細(xì)胞或用DMSO或PMA處理一天或三天的細(xì)胞中分離，電泳(每道10μg)和印跡。RNA的Northern印跡探測用實施例3所述的放射性標(biāo)記的pMP3905′片段。PMA處理三天后，HL60細(xì)胞明顯地表達(dá)MDCmRNA，盡管表達(dá)水平明顯地比培養(yǎng)6天后的巨噬細(xì)胞表達(dá)水平低(見上)。處理一天后或未處理的細(xì)胞未見到表達(dá)。此外，用DMSO處理一或三天，沒有可檢測的MDC表達(dá)被誘導(dǎo)出來。實施例5原位雜交因為MDC基因表達(dá)在胸腺和脾中檢測到，進(jìn)行原位雜交以定位這些組織的信息來源。此外，原位雜交用于確定MDC基因表達(dá)與節(jié)段性回腸炎有關(guān)的腸組織炎癥相關(guān)性。為產(chǎn)生放射性標(biāo)記的原位雜交探針，含MDC編碼區(qū)的DNA片段(SEQIDNO1的91-301位核苷酸)亞克隆到pBluescriptSK-載體中。使用T3和T7RNA多聚酶(BMB)，按廠家的說明，把35S-UTP摻入到互補于基因每條鏈的RNA轉(zhuǎn)錄本中。正常人脾、胸腺和結(jié)腸組織樣品，以及節(jié)段性回腸炎患者的結(jié)腸組織樣品，從國家疾病研究交換處(Philadelphia，PA)獲取。組織供體如下正常胸腺19歲男性高加索人，死于機動車禍，尸檢時取組織；正常脾51歲黑人男性，死于腦出血，尸檢時取組織；正常結(jié)腸黑人女性，手術(shù)時取組織；節(jié)段性回腸炎的結(jié)腸1號女性，種族不詳，46歲，潰瘍性結(jié)腸炎患者，手術(shù)時取組織；節(jié)段性回腸炎的結(jié)腸2號18歲男性，種族不詳，節(jié)段性回腸炎，手術(shù)時取組織。除了前面的分析外，從一病人做扁桃體切除術(shù)時切取的炎性扁桃體組織，用相當(dāng)于SEQIDNO1的677-1042位的核苷酸的MDCcDNA非編碼部分探查。這部分經(jīng)MDCcDNA克隆的PCR擴增產(chǎn)生，所用的引物為390-7F(SEQIDNO26)和390-8R(SEQIDNO27)390-7F5′-TATTGGATCGGTTCTAGCTCCGTGTTCTCC3′390-8R5′-CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC3′片段亞克隆到pBluescriptSK-載體中，以產(chǎn)生上述的RNA探針。前段所述的組織樣品按下法制備作原位雜交。組織樣品包埋在“OCT”化合物中(Miles，Inc.，Elkhart，IN)，用恒冷切片機(cryostat)2800E(Leica)切6微米厚的切片。組織切片粘附在用Vectabond(Vector實驗室，伯林格姆，CA)包被的載片上，固定在4％多聚甲醛中4℃20分，酒精脫水，用70％甲酰胺和2×SSC70℃變性。雜交反應(yīng)用放射性標(biāo)記的合適探針的有義或反義鏈，載片溫育在雜交水溶液中55℃16小時進(jìn)行，水溶液含50％甲酰胺，0.3M氯化鈉，20mM三羥甲基氨基甲烷pH7.5，10％硫酸葡聚糖，1×Denhardt’s溶液，100nM＝硫蘇糖醇和5mMEDTA。雜交后，載片在4×SSC和10mMDTT中室溫溫育一小時。然后在2×SSC中室溫；1×SSC60℃；最后在0.1×SSC中室溫洗載片。樣品用乙醇脫水，然后涂KodakNTB2攝影乳膠，空氣干燥2小時，4℃曝光11天，顯影，用蘇木精/伊紅復(fù)染。觀察反義鏈(任一探針)的雜交反應(yīng)顯示MDC基因在正常人胸腺的整個皮質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，濾泡有弱雜交信號。MDC在胸腺中表達(dá)可能顯示MDC有T淋巴細(xì)胞發(fā)育作用。在正常人脾中表達(dá)定位在紅髓細(xì)胞中，而很少的信號在白髓中檢測到。在發(fā)炎的扁桃體中高表達(dá)定位在上皮區(qū)，盡管炎性細(xì)胞似乎浸潤了整個組織樣品。來自節(jié)段性回腸炎患者的結(jié)腸樣品在上皮，固有層，佩耶斑和平滑肌細(xì)胞中顯示雜交反應(yīng)。相反，正常人結(jié)腸在上述細(xì)胞中未顯示雜交反應(yīng)。在節(jié)段性回腸炎患者的結(jié)腸觀察到的MDC表達(dá)類型與巨噬細(xì)胞特異基因，血小板活化因子乙酰解酶(PAF-AH)[特杰爾克等，同前]的表達(dá)緊密相關(guān)。該結(jié)果，結(jié)合實施例4顯示的數(shù)據(jù)，表明在病原性炎癥中巨噬細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)MDCcDNA。此外，在節(jié)段性回腸炎病的結(jié)腸組織樣品的MDC鑒定顯示MDC水平(如在病人血液，糞便樣品，和/或腸缺損中)與病人的病態(tài)或臨床預(yù)后有診斷相關(guān)性。實施例6重組MDC的生產(chǎn)為產(chǎn)生重組MDC蛋白，編碼公認(rèn)是蛋白成熟態(tài)的序列用PCR擴增，克隆到pGEX-3X(發(fā)瑪西亞，Piscataway，NJ)載體中。設(shè)計pGEX載體能產(chǎn)生包括由載體編碼的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和由插入載體克隆位點的DNA片段編碼的蛋白的-種融合蛋白。實施例2描述的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件再次用于擴增MDCcDNA片段，用引物390-2R和390-FX2(SEQIDNO11)5′TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-FX2含BamHI限制性位點，接著是編碼凝血酶切割位點的序列[常等，歐洲生物化學(xué)雜志，151217(1985)]，接著是SEQIDNO1的92-115堿基。凝血酶切割位點如下亮氨酸-纈氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸、其中甘氨酸和脯氨酸MDC成熟態(tài)的前二個殘基。用凝血酶處理重組融合蛋白預(yù)期切割融合蛋白的精氨酸-甘氨酸鍵，從GST融合蛋白中釋放成熟的趨化因子。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，用BamHI核酸內(nèi)切酶消化，克隆到pGEX-3X的BamHI位點上。該pGEX-3X/MDC構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞(Stratagene，LaJollaCA)中，分離各個轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)。來自不同轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA被純化，部分用自動測序儀測序，所用的引物GEX5(SEQIDNO12)，能與pGEX-3X載體近BamHI克隆位點雜交GEX55′GAAATCCAGCAAGTATATAGCA3′用該引物獲得的序列證實存在以合適方向插入的所需MDC片段。GST-MDC融合蛋白的誘導(dǎo)獲取是把轉(zhuǎn)化的XL-1Blue細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中(添加羧芐青霉素)在37℃下培養(yǎng)，至波長600nM為0.4的合適密度，接著進(jìn)一步在0.25-1mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(西格瑪化學(xué)公司，圣路易斯MO)下溫育4小時。在細(xì)菌中以不溶性的包含體產(chǎn)生的融合蛋白，按下法純化。細(xì)胞離心收獲；用0.15M氯化鈉，10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8，1mMEDTA清洗；用0.1mg/ml溶菌酶(西格瑪化學(xué)公司)室溫處理15分鐘。超聲澄清裂解產(chǎn)物，細(xì)胞碎片12,000xg離心10分鐘形成沉淀。含融合蛋白的沉淀重懸在50mM三羥甲基氨基甲烷，pH8，和10mMEDTA中，鋪展在50％甘油上，6000xg離心30分鐘。沉淀重懸在無Mg++和Ca++的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。融合蛋白仍處于不溶狀態(tài)，約為蛋白質(zhì)量的80-90％，在變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，以相對分子量33KD遷移。按考馬斯染色判斷蛋白產(chǎn)量，約每升大腸桿菌培養(yǎng)物100mg。融合蛋白受凝血酶消化，從成熟的MDC蛋白切割GST。消化液(0.5mlPBS中，20-40μg融合蛋白，20-30單位凝血酶(4000U/mg西格瑪))室溫溫育16-48小時，上到變性的SDS-PAGE膠中分離反應(yīng)產(chǎn)物。將凝膠浸在0.4M氯化鉀中顯現(xiàn)GST和MDC蛋白帶，分別以約26KD和7KD的片段遷移。7KDSDS-PAGE片段的特性用部分氨基酸序列分析證實。首先，蛋白從膠上切下，電洗脫到25mM的三羥甲基氨基甲烷堿和20mM甘氨酸中，收集到ProSpin柱(應(yīng)用生物系統(tǒng)，福斯特城，CA)中的PVDF膜上。上樣進(jìn)行自動序列分析(應(yīng)用生物系統(tǒng)型號473A，福斯特城，CA)，結(jié)果產(chǎn)生15個殘基的序列信息，該序列準(zhǔn)確地對應(yīng)于MDC預(yù)定成熟態(tài)的預(yù)期N端(SEQIDNO2，氨基酸殘基1-15)。實施例7細(xì)菌MDC表達(dá)載體的構(gòu)建編碼預(yù)定成熟MDC蛋白的MDCcDNA部分克隆到含阿拉伯糖啟動子和pelB前導(dǎo)序列的質(zhì)粒中[見貝特等，科學(xué)，2401041-43(1988)]。更具體地說，MDCcDNA按實施例2所述的PCR法擴增，用約0.1μgpMP390-12作模板和合成的寡核苷酸引物390-2R和390-Pel(SEQIDNO13)390-Pel5′ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-Pel含一個NcoI限制性位點，接著是二個胞嘧啶殘基，然后是SEQIDNO1的92-115位堿基。預(yù)期的232bp的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，用NcoI和BamHI消化，和阿拉伯糖操縱子及pelB前導(dǎo)序列(貝特等，同前)一起克隆到pUC19載體(新英格蘭生物實驗室，倍維菜，MA)中。得到的構(gòu)建體，命名為P2-390，編碼pelB前導(dǎo)序列(由載體編碼)的融合部分為成熟的MDC蛋白。這構(gòu)建體的序列用自動序列測定法證實，用引物Ara1(SEQDNO28)和Ara2(SEQIDNO29)，引物能與載體克隆位點鄰近部分退火。Ara15′GCGACTCTCTACTGTTTCTC3′Ara25′-CACAGGAAACAGCTATGACC3′用標(biāo)準(zhǔn)操作法，質(zhì)粒P2-390轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MC1061株中，挑選產(chǎn)生MDC的氨芐青霉素抗性克隆?？寺∨囵B(yǎng)在3升發(fā)酵器(Applikon，福斯特城，CA)中，MDC的產(chǎn)生加50％阿拉伯糖至終濃度0.1％時被誘導(dǎo)出來。在阿拉伯糖存在下溫育一天后，收獲細(xì)胞。Western印跡顯示MDC存在在細(xì)胞中的水平約每克濕細(xì)胞4μg，分泌到培養(yǎng)基的水平為約1μg/ml。實施例8從細(xì)菌和培養(yǎng)基中純化重組MDC下面的實驗方案純化實施例7所述產(chǎn)生的重組MDC。分泌的重組MDC蛋白從細(xì)菌培養(yǎng)基中純化，如可采用過去描述過的純化重組產(chǎn)生的RANTES趨化因子[庫那等，免疫學(xué)雜志，149636-642(1992)]，MGSA趨化因子[赫魯克等，生物化學(xué)雜志，268541-46(1993)]，和IP-10趨化因子(在昆蟲細(xì)胞中表達(dá))[塞萊斯等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1781127-1132(1993)]的方法。實施例9MDC在酵母中的重組生產(chǎn)下面的方案進(jìn)行MDC在酵母中重組表達(dá)和重組MDC的純化。MDCcDNA的編碼區(qū)從pMP390-12用PCR擴增，所用的引物是含存在引物390-1F和390-2R的MDCcDNA序列的合成寡核苷酸。編碼酵母pre-pro-alpha前導(dǎo)序列的DNA從酵母基因組DNA在PCR反應(yīng)液中擴增，用含α接合因子基因的1-20位堿基為一引物，另一引物是與該基因255-235位堿基互補的序列[科簡和赫斯科威茲，細(xì)胞，30933-943(1982)]。pre-pro-alpha前導(dǎo)編碼序列和MDC編碼序列片段連接到含酵母乙醇脫氫酶(ADH2)啟動子的質(zhì)粒中，以使啟動子指導(dǎo)由pre-pro-alpha因子融合成熟MDC多肽組成的融合蛋白的表達(dá)。在羅斯和布洛奇，MethEnz.185234-279，D.Goeddel，ed.，科學(xué)出版公司，圣地亞哥，CA(1990)的方法指導(dǎo)下，載體進(jìn)一步包括克隆位點下游的ADH2轉(zhuǎn)錄終止子，酵母“Z-微?！睆?fù)制起點，酵母leu-2d基因，酵母REP1和REP2基因，大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因和大腸桿菌復(fù)制起點。β內(nèi)酰胺酶和leu-2d基因分別在細(xì)胞和酵母中選擇表達(dá)。leu-2d基因也有利于增加質(zhì)粒在酵母中的拷貝數(shù)，誘導(dǎo)高水平的表達(dá)。REP1和REP2基因編碼涉及質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)節(jié)的蛋白。前段所述的DNA構(gòu)建體，用已知的方法如乙酸鋰處理[斯蒂斯等，Meth.Enz.同上，pp.280-297]轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞。ADH2啟動子誘導(dǎo)依賴于生長培養(yǎng)基中葡萄糖耗竭[普賴斯等，基因，55287(1987)]。pre-pro-alpha序列影響融合蛋白從細(xì)胞中分泌。同時，酵母KEX2蛋白把pre-pro序列從成熟的MDC趨化因子上切割下來[皮特等，美國國家科學(xué)院院報，815330-5334(1984)]。另外，用商業(yè)化的表達(dá)系統(tǒng)，如Pichia表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen，圣地亞哥，CA)，按廠家的說明進(jìn)行MDC在酵母中重組表達(dá)。該系統(tǒng)也依賴pre-pro-alpha序列指導(dǎo)分泌，但插入片段的轉(zhuǎn)錄由甲醇誘導(dǎo)的酒精氧化酶(AOX1)啟動子所驅(qū)動。分泌的MDC從酵母生長培養(yǎng)基中純化，如用從細(xì)菌和哺乳細(xì)胞上清純化MDC的方法(見實施例8和10)。實施例10MDC在哺乳動物細(xì)胞中重組生產(chǎn)按下列步驟MDC在哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)。A.表達(dá)載體390HXE的合成MDCcDNA的截短譯本按實施例2所述的PCR法合成，用pMP390-12作模板和合成的寡核苷酸390RcH和390RcX作引物。(SEQIDNO14)390RcH5′GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA(SEQIDNO15)390RcX5′TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG引物390RcH含HindIII限制性位點，接著是SEQIDNO1的1-20位堿基；引物390RcX含XbaI限制性位點，接著是與SEQIDNO1的403-385位堿基互補的序列。預(yù)期的423bp的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳純化，克隆到HindIII/XbaI消化的pRc/CMV載體中((InVitrogen，圣地亞哥CA)允許在哺乳細(xì)胞中直接表達(dá)的載體)。得到的質(zhì)粒，命名為390HXE，含SEQIDNO1的1-403位堿基。插入的序列用自動測序法證實，所用的引物是DC03(SEQIDNO16)和JHSP6。DC035′CGAAATTAATACGACTCACT3′引物DC03能與pRc/CMV載體鄰近克隆位點的序列退火。B.表達(dá)載體390HmX的合成另一個MDCcDNA構(gòu)建體用PCR產(chǎn)生，用pMP390-12作模板，引物是390RcH和390mycRX(SEQIDNO17)。390mycRX5′TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTATTGAGAAT3′引物390mycRX含XbaI限制性位點，互補于編碼“myc”表位序列[富爾克斯等，生物技術(shù)，13422-427(1992)]的序列，和互補于SEQIDNO1的298-278位堿基的序列。該反應(yīng)擴增出預(yù)期的354bp片段，該片段含SEQIDNO1的1-298位堿基和在MDC羧基端融合“myc”表位。這表位能用于方便作免疫沉淀，親和純化和western印跡法檢測MDC-myc融合蛋白。片段克隆到pRc/CMV以產(chǎn)生390HmX質(zhì)粒。插入的序列用引物DC03，自動測序法證實。C.MDC在293T和NS0細(xì)胞中表達(dá)二種轉(zhuǎn)染方案用于表達(dá)上述A.和B.亞部分的二個MDCcDNA構(gòu)建體瞬間轉(zhuǎn)染到人胚腎293T細(xì)胞系和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞系(ECACC85110503)。293T細(xì)胞的瞬間轉(zhuǎn)染用陳和歐克雅瑪，生物技術(shù)，6632-638(1988)和分子細(xì)胞生物學(xué)，872745-2752(1987)的磷酸鈣沉淀方法進(jìn)行。細(xì)胞和上清于轉(zhuǎn)染后四天收集。Northern印跡的準(zhǔn)備是來自每一細(xì)胞裂解物的4μg總RNA，用PCR制備的放射性標(biāo)記的MDC片段探查。標(biāo)記反應(yīng)的模板是前述的用引物390-1F和390-4R(見實施例2)擴增pMP390產(chǎn)生的PCR片段。約30ng該片段用于PCR反應(yīng)，反應(yīng)液含如下1.5mM氯化鎂，50mM氯化鉀，10mM三羥甲基氨基甲烷，pH8.4，0.2mM脫氧腺苷酸三磷酸，0.2mM脫氧胸苷三磷酸，0.2mM脫氧鳥苷三磷酸，1μM脫氧胞苷三磷酸，50μCiα32P-脫氧胞苷三磷酸(DuPont/NewEnglandNuclear，波士頓MA)，2.5UTaq聚合酶和10μg/ml每一引物390-1F和390-2R。反應(yīng)液在94℃加熱變性4分鐘，接著按實施例2所述方法擴增15個循環(huán)。探針過G-25快速旋轉(zhuǎn)柱(BMB)純化。雜交條件在實施例2中已述。膜接著在0.5×SSC中洗和42℃2％SDS中洗30分鐘。放射自顯影在-80℃用一個增感屏進(jìn)行16小時。MDCDNA構(gòu)建體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中高表達(dá)，在非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測不出來。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體，NS0細(xì)胞在D-MEM(Gibco)中生長到80％匯合密度，離心收集，用PBS清洗。20μg質(zhì)粒DNA用ScaI限制酶(BMB)切成線性，加到細(xì)胞上，在一0.4cm間隙(gap)小杯(BioRad，HerculesCA)中冰上溫育15分鐘。細(xì)胞電穿孔用1.5千伏3微法的二次脈沖。細(xì)胞稀釋到20mlD-MEM中，5％CO237℃中培養(yǎng)24小時，用含800μg/mlgeneticin的D-MEM不同的稀釋度植到96孔板中篩選。含單個抗藥克隆的孔在選擇性培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)?？俁NA按前段所述的Northem印跡法分析。MDC的信息只在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中可見。MDC從哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化，如采用純化重組TCA3趨化因子[威爾遜等，免疫學(xué)雜志，1452745-2750(1990)]，或下面F亞部分所述的方法。D.MDC在CHO細(xì)胞中表達(dá)用引物390RcH和390RcX(SEQIDNOs14和15)，按上述A亞部分所述的方法，PCR擴增MDCcDNA克隆的1-403位堿基。片段克隆到表達(dá)載體pDC1的HindIII和XbaI位點之間，pDC1是pUC19的衍生體，含驅(qū)動插入片段表達(dá)的巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動子。更具體地說，pDC1載體，圖示在圖8中，衍生自pRc/CMV和pSV2-dhfr(ATCC載體#37146)。載體pDC1與哺乳表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen，圣地亞哥)相似，除了在新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因部位，pDC1攜帶鼠二氫葉酸脫氫酶(dhfr)基因為選擇標(biāo)志。在pDC1中靶基因的轉(zhuǎn)錄在CMV強啟動子控制之下。見斯特恩伯格等，病毒學(xué)雜志，49190-199(1984)。此外，來自牛生長激素基因[古德溫和羅特曼，生物化學(xué)雜志，26716330-16334(1992)]的多腺苷化序列接在靶基因的3′端。dhfr表達(dá)盒[薩伯拉曼尼等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1854-864(1981)]允許缺乏有功能的dhfr基因的細(xì)胞選擇pDC1。用CaCl2溫育和熱休克的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(圣姆布魯克等)，XL-1藍(lán)細(xì)菌(Stratagene)用pDC1/MDC轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體生長在含100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。從單獨轉(zhuǎn)化克隆來的質(zhì)粒DNA，用普羅麥格(promega)WizardMaxiprep系統(tǒng)(麥迪遜，WI)分離，其序列用引物390-IF和390-2R自動測序證實。質(zhì)粒用PvuI內(nèi)核酸酶(BoehringerMannheim)經(jīng)限制性消化成線性，該酶在載體序列中僅切割一次。用于MDC生產(chǎn)的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系是DG-44，缺失dhfr基因產(chǎn)生。見厄洛伯等，細(xì)胞，33405(1983)。電穿孔時，107的這些CHO細(xì)胞用PBS清洗，重懸浮在1mlPBS中，和25μg被線性化的質(zhì)?；旌?，轉(zhuǎn)移到一0.4cm小杯中。懸液用BioradGenePulser(Richmond，CA)在290伏，960微法下電穿孔。轉(zhuǎn)化體生長在含10％透析胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)，缺次黃嘌呤和胸腺嘧啶的α-培養(yǎng)基(Cat.NO.12000，Gibco，Gaithersburg，MD)中選擇。來自幾百個轉(zhuǎn)化克隆的細(xì)胞混合，重新在含20nM氨甲喋呤(西格瑪，圣路易斯，MO)的α-培養(yǎng)基中庫存和再接種。分離在這輪選擇中存活的克隆，在含20nM氨甲喋呤的α-培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。E.作蛋白測序用的MDC的純化轉(zhuǎn)染的CHO克隆在α-培養(yǎng)基中，生長在塑料組織培養(yǎng)皿上到約90％匯合密度，在那時培養(yǎng)基用含0.2％-1.0％FBS的P5培養(yǎng)基更換。P5培養(yǎng)基由以下表2(以預(yù)先混合的粉末購自Hyclone，LoganUT)所列的組分組成，添加以下額外的組分(1)3g/l碳酸氫鈉(西格瑪，圣路易斯，MO)；(2)2μg/l亞硒酸鈉(西格瑪)；(3)1％大豆水解物(QuestIntemational，Naarden，TheNetherlands)；(4)1×硫酸亞鐵/EDTA溶液(西格瑪)；(5)1.45ml/lEX-CYTEVLE溶液(Bayer，Kankakee，IL)；(6)10μg/ml重組胰島素(Nucellin，EliLily，Indianapolis，IN)；(7)0.1％普盧蘭尼克F-68(西格瑪)；(8)30μg/ml甘氨酸(西格瑪)；(9)50μM乙醇胺(西格瑪)；(10)1mM丙酮酸鈉(西格瑪)；培養(yǎng)額外的二天后，每一上清等分級分和等體積的丙酮混合。沉淀的蛋白離心沉淀，在18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸膠(NOVEX)中分級分離，印跡到PVDF膜上(Millipore，貝德福德，MA)。結(jié)合在膜上的MDC用粗制備的抗MDC的單克隆抗體(按實施例18所述制備)檢出。分泌高水平MDC蛋白(約1μg/ml)的克隆細(xì)胞，用0.5％胰蛋白酶和5.3mMEDTA(GIBCO)的溶液處理，從板上分離，用于加10％胎牛血清(FBS)的α-培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。過8天時間，加5倍體積的P5培養(yǎng)基到培養(yǎng)物中。加聚乙二醇(MW8000，UnionCarbide，Danbury，CY)到培養(yǎng)血清至20％(重量/體積)，蛋白從培養(yǎng)血清中沉淀，在18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸膠中分離，在CAPS緩沖液(3-[環(huán)己胺基]-1-丙磺酸，pH10.4)(西格瑪，圣路易斯，MO)中電轉(zhuǎn)離到PVDF膜上(Millipore，貝德福德，MA)。切下膜上的一條帶，用產(chǎn)生抗MDC單克隆抗體(見實施例18)的雜交瘤細(xì)胞系的上清，蛋白印跡法檢測MDC。以表觀分子量6.4KD遷移的反應(yīng)帶從膜的殘余部分切下。用自動測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，型號473A，福斯特城，CA)，測定蛋白N端的序列是GPYGANMEDS。這序列與SEQIDNO2的1-10位殘基相同，與MDC預(yù)定成熟態(tài)的N端一致。F.作生物學(xué)測定用的MDC的純化作較大規(guī)模的培養(yǎng)生長，表達(dá)MDC的CHO細(xì)胞在α-培養(yǎng)基中，生長在組織培養(yǎng)板上至80％匯合密度，用胰蛋白酶和EDTA處理，細(xì)胞從板上分離，在加1％FBS的P5培養(yǎng)基中，以3×105細(xì)胞/ml的密度37℃重懸在螺口培養(yǎng)瓶中。需要時添加P5/1％FBS培養(yǎng)基，保持細(xì)胞密度在1×106～3×106范圍。經(jīng)11天培養(yǎng)后，細(xì)胞通過過濾從培養(yǎng)基中分離。調(diào)培養(yǎng)基的pH至6.8，培養(yǎng)基過肝素-葡聚糖CL-6B柱(法瑪西亞，Piscataway，NJ)。用0.2M氯化鈉的磷酸鉀緩沖液，pH7，清洗后，柱用0.2-0.7M氯化鈉的線性梯度溶液洗脫。分離的級分用SDS-PAGE分析，考馬斯染色確定哪一部分含MDC。約在0.6M氯化鈉中，MDC從柱上洗脫。混合含MDC的級分，用能濾過(cutoff)分子量3KD的濾膜在攪拌室腔(Stirred-cellChamber)中(Amicon，Beverly，MA)超過濾濃縮。加辛基葡糖苷(終濃度10mM，BoehringerMannheimBiochemicals)到濃縮的MDC中，接著過SephacrylHR100柱(法瑪西亞，Piscataway，NJ)級分用SDS-PAGE分析，以確定MDC的存在。MDC蛋白的終產(chǎn)量約為每升培養(yǎng)上清0.1mg，按考馬斯染色判斷估計，其純度在95％以上。實施例11肽合成法生產(chǎn)MDC和MDC類似物MDC和MDC多肽類似物用肽化學(xué)合成法制備，所用的技術(shù)已成功用于其他趨化因子如IL-8[克洛克-李威斯等，生物化學(xué)雜志，26623128-34(1991)]和MCP-1的生產(chǎn)。這些方法具有優(yōu)勢是因為對象趨化因子這樣的短序列的蛋白，它們快速，可靠，能選擇性地導(dǎo)入新的，非天然的氨基酸和其它化學(xué)修飾物。例如，MDC和MDC類似物的化學(xué)合成，可用優(yōu)化的逐步固相法[舒諾齊等，Int.J.Pept.ProteinRes.，40180(1992)]根據(jù)梅里菲爾德[J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]的叔丁氧羰基化學(xué)原理，在應(yīng)用生物系統(tǒng)430A肽合成儀(福斯特城，CA)上進(jìn)行。用反相的HPLC純化蛋白，其標(biāo)準(zhǔn)方法的特征包括電噴射質(zhì)譜學(xué)和核磁共振?；瘜W(xué)合成的MDC與重組MDC的成熟態(tài)一致，由SEQIDNO2的1-69位殘基組成。幾種方法用于化學(xué)合成的MDC與實施例10所述的CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的重組MDC相比較。在變性SDS-PAGE(18％三羥甲基氨基甲烷甘氨酸凝膠，NOVEX)中，化學(xué)合成的MDC的遷移率與重組MDC相同。此外，在蛋白印跡分析中，用以下實施例18所述的抗細(xì)菌產(chǎn)生的MDC的單克隆和多克隆抗體，這些蛋白反應(yīng)相似。在用抗MDC的單克隆抗體免疫沉淀分析中，化學(xué)合成的MDC也以重組MDC相同的方式表現(xiàn)。這些研究顯示化學(xué)合成MDC的變性和非變性結(jié)構(gòu)與重組MDC的這些結(jié)構(gòu)相似。以下的MDC類似物也已化學(xué)合成1)“MDC(n+1)”(SEQIDNO30)由亮氨酸接著是SEQIDNO2的1-69位殘基組成。2.“MDC(9-69)”由SEQIDNO2的9-69位殘基組成。3.“MDC-yl”(SEQIDNO31)由SEQIDNO2的1-69位殘基組成，其中有如下替換59-60位殘基(Trp-Val)用Tyr-Leu序列取代。4.“MDC-eyfy”(SEQIDNO32)由SEQIDNO2的1-69位殘基組成，其中有如下替換28-31位殘基(His-Phe-Tyr-Trp)用Glu-Tyr-Phe-Tyr序列取代，此序列來自趨化因子RANTES的氨基酸序列(SEQIDNO21的26-29位于殘基)。預(yù)期類似物“MDC(n+1)”，“MDC(9-69)”和“MDC-yl”是MDC活性的拮抗劑，通過競爭性地結(jié)合識別MDC的相同受體而抑制MDC活性。另外的可能是類似物能和天然的MDC形成異二聚體產(chǎn)生抑制作用?！癕DC-eyfy”類似物的可能活性包括前述類似物的MDC抑制作用。相反，“MDC-eyfy”表現(xiàn)為天然MDC相似的特性。該類似物的其他活性可能包括趨化因子RANTES的典型功能，如淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞或嗜酸性細(xì)胞的趨化性。另外，可特別地設(shè)計下列單氨基酸變異體(單獨或結(jié)合)(1)非堿性氨基酸分別替換SEQIDNO224和27位的堿性精氨酸和/或賴氨酸；(2)帶電荷的或極性氨基酸(如絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或半胱氨酸)替換SEQIDNO230位的酪氨酸，替換SEQIDNO259位的色氨酸、和/或SEQIDNO260位的纈氨酸；(3)堿性或不帶電荷的小氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替換SEQIDNO250位的谷氨酸。具有這些氨基酸改變的特殊類似物包括在下表中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTYrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的氨基酸可選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的氨基酸可獨立地選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的氨基酸可獨立地選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中50位的氨基酸可獨立地選自谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位的氨基酸可獨自地選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中60位的氨基酸可獨立地選自纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。這些MDC多肽類似物可特別地設(shè)計調(diào)節(jié)MDC對趨化因子受體和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、紅細(xì)胞趨化因子受體)的結(jié)合特性，這些特性在MDC呈遞給其受體時認(rèn)為是重要的。如前面實施例所述的重組技術(shù)也可設(shè)計作制備MDC多肽類似物。更具體地說，用熟知的技術(shù)如定點突變和聚合酶鏈反應(yīng)修飾編碼MDC的多核苷酸，以編碼感興趣的多肽類似物。一般參見圣姆布魯克等，同前，第15章。修飾過的多核苷酸重組表達(dá)，按前面實施例所述的方法純化重組的MDC多肽類似物。MDC或MDC多肽類似物對涉及炎癥過程的一種或更多種細(xì)胞類型(如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或其他細(xì)胞)的化學(xué)引誘和/或活化細(xì)胞的特性，通過確認(rèn)的已用于許多其它的趨化因子的技術(shù)分析。在前面實施例所述的一種或更多種方法純化和分離的天然MDC、重組MDC或MDC多肽類似物、或合成的MDC或合成的MDC多肽類似物、按下面所述的關(guān)于MDC的實施例分析其活性。實施例12MDC對嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞作用的測定分析MDC對嗜堿性細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的影響，如用韋伯等，免疫學(xué)雜志，1544166-4172(1995)所述的測定MCP-1/2/3活性的方法。用這些方法，測定細(xì)胞胞液游離鈣的變化和前炎性(proinflammatory)介質(zhì)(如組胺和白三烯)的釋放。阻斷趨化因子介導(dǎo)的這些種類細(xì)胞的活化涉及遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)的處理，在遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)中，前炎性介質(zhì)的分泌起重要的作用[韋伯等，同上]。實施例13MDC對人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘和細(xì)胞活化特性的分析MDC對人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞影響的評價，如用戴維等，免疫學(xué)雜志，1535376-5383(1995)描述的評價鼠TCA3誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的方法。在上述研究中測定的活化指數(shù)包括因整合素活化增加對纖維蛋白原的粘附，化學(xué)趨化性，誘導(dǎo)活性氮中間體，呼吸爆發(fā)(超氧化物和過氧化氫的產(chǎn)生)，和在細(xì)胞松馳素B存在下溶菌酶和彈性蛋白酶的胞吐作用。如同戴維等討論一樣，這些活性與白細(xì)胞對炎癥應(yīng)答的不同階段有關(guān)。白細(xì)胞的這種應(yīng)答，按斯普林杰，細(xì)胞，76301-314(1994)的綜述，涉及白細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，通過內(nèi)皮層的遷移，對趨化因子源的趨化性和炎性介質(zhì)特定位點的釋放。在這些階段的任一個涉及MDC會是臨床介入，調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答的重要靶點。用一公認(rèn)技術(shù)的趨化反應(yīng)測定法，為修改的Boyden室法，被測的白細(xì)胞在室溫下和Calcein溫育20分鐘標(biāo)記上熒光。標(biāo)記細(xì)胞用無血清的RPMI洗二次，重懸于含2mg/ml的BSA的RPMI中，然后定量加到室的上孔中，上孔與下孔被聚碳酸酯膜(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)分開。用與白細(xì)胞相同的培養(yǎng)基稀釋的MDC，以不同濃度加到下孔中。室在37℃下溫育2小時。方法的結(jié)束部分是未遷移穿過膜的細(xì)胞，在用PBS洗膜和橡皮刮刀(policeman)刮后移開。遷移過膜的細(xì)胞在熒光板讀數(shù)計(Cytofluor，MilliporeInc，波士頓，MA)中讀取每孔的熒光值定量。使用公認(rèn)技術(shù)的方法，進(jìn)行一系列實驗以確定MDC的趨化特性。開始時，測定人單核細(xì)胞對MCD的反應(yīng)。MDC對多形核白細(xì)胞(粒細(xì)胞)趨化反應(yīng)的影響也作了檢測。已經(jīng)證實C-C趨化因子MCP-1，引起單核細(xì)胞募集和活化，但誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的能力顯得有限。MCP-1不能吸引巨噬細(xì)胞似乎與分化過程有關(guān)當(dāng)單核細(xì)胞分化時，逐漸降低細(xì)胞對MCP-1的應(yīng)答[戴赫爾姆和斯坦克斯，細(xì)胞因子，7436-440(1995)]。MCP-1的生物學(xué)活性似乎與趨化因子的表達(dá)相關(guān)，在單核細(xì)胞中存在的MCP-1mRNA，當(dāng)這些細(xì)胞分化時降低。MCD的表達(dá)類型似乎與所述的MCP-1的情況相反，當(dāng)單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞時，MDCmRNA的數(shù)量增加。為確定是否該表達(dá)類型與對MDC的生物學(xué)應(yīng)答相關(guān)，比較了MDC對單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移的影響。在趨化性和抑制趨化性的測定中，分析了許多不同類型的白細(xì)胞。用本領(lǐng)域已知的方法[戴赫爾姆等，美國病理學(xué)雜志，135571-580(1989)]，從外周血中分離了人單核和多形核白細(xì)胞。其次，使用了人單核細(xì)胞系，THP-1(從ATCCRockville，MD)獲取，在含10％FBS和青霉素/鏈霉素的RPMI中維持培養(yǎng))。THP-1能以單核細(xì)胞的形態(tài)培養(yǎng)，或用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)處理能誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞[戴赫爾姆和斯坦克斯，細(xì)胞因子，7436-440(1995)]。一些實驗用單核的THP-1細(xì)胞，其他實驗單核THP-1細(xì)胞和乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)溫育分化成巨噬細(xì)胞。第三，豚鼠腹膜巨噬細(xì)胞基本按尤悉穆拉，免疫學(xué)雜志，1505025-5032(1993)的方法得到。簡言之，收獲細(xì)胞前二天，給動物腹腔注射3％無菌的硫羥乙酸(thioglycollate)(DIFCO)用含1mMEDTA和0.1％葡萄糖的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗，從腹腔獲取巨噬細(xì)胞。細(xì)胞離心洗一次，然后用于以下所述的趨化性測定。趨化活性測定，用上述制備的細(xì)胞，基本上按戴赫爾姆和斯坦克斯，Cytometry，19366-369(1995)所述的方法，用96-孔室(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)以及細(xì)胞用熒光染料，Calcein(分子探針，Eugene，OR)進(jìn)行。測定時所用的聚碳酸酯膜是無PVP的(NeuroprobeInc.)；用于不同類型細(xì)胞的膜孔大小是單核細(xì)胞和THP-1細(xì)胞為5μm，多形核白細(xì)胞為3μm，豚鼠巨噬細(xì)胞為8μm。5萬個Calcein標(biāo)志的細(xì)胞重懸在含2mg/mlBSA的RPMI培養(yǎng)基中，放入上孔。MDC或其他測試物質(zhì)用含BSA的RPMI稀釋(如，MDC終濃度為25、50、100、250ng/ml)，放入下孔中。接著37℃溫育2小時，擦去仍在膜上的未遷移細(xì)胞，然后讓膜空氣干燥。這些測定的對照是含BSA的RPMI為陰性對照，50ng/mlMCP-1和1％酵母聚糖活化血清(ZAS，按[戴赫爾姆和利威斯，美國病理學(xué)雜志，126464-474，(1987)]所述的方法制備)用作陽性對照。細(xì)胞的遷移率在熒光板讀數(shù)計(Cytofluor，MilliporeInc.Bedford，MA)上定量，遷移的細(xì)胞數(shù)以熒光單位表示。抑制活性測定中，在室上孔的細(xì)胞懸浮在不同濃度(0.005、0.05、0.5、5.0和5ng/ml)的MDC中。室的下孔注滿僅為培養(yǎng)基或培養(yǎng)基加趨化因子，MCP-1或酵母聚糖活化血清(ZAS)。比較缺MDC時遷移到MCP-1或ZAS的細(xì)胞數(shù)與增加MDC濃度遷移的細(xì)胞數(shù)，估計抑制率。細(xì)胞的制備和測定的定量嚴(yán)格按上述趨化測定方法操作。遷移的細(xì)胞數(shù)以熒光單位表示。如圖2所示，MDC不能誘導(dǎo)來自THP-1的單核細(xì)胞遷移，但在10～100ng/ml濃度內(nèi)較明顯地抑制單核細(xì)胞的遷移。其它C-C趨化因子，如MCP-1和RANTES，在該濃度范圍典型地誘導(dǎo)最大的單核細(xì)胞趨化性。如圖3所示，濃度為0.001～100ng/ml的MDC對粒細(xì)胞遷移率沒有凈影響。除了缺乏對粒細(xì)胞趨化性影響外，MDC與其它前述的C-C趨化因子相似。巨噬細(xì)胞和單核THP-1細(xì)胞對MDC的應(yīng)答用圖4表示。巨噬細(xì)胞(實心圓圈)以劑量依賴的方式向MDC遷移，最適活性為50ng/ml。巨噬細(xì)胞對較高濃度(100ng/ml)的MDC趨化應(yīng)答的降低反映了細(xì)胞的脫敏作用，這是大多數(shù)趨化因子在高濃度時的特征[福爾克和列納德，InfectInmunol.32464-468(1981)]。不過，單核THP-1細(xì)胞(空心圓圈)沒有向MDC遷移。MDC對巨噬細(xì)胞的趨化活性進(jìn)一步用激活的豚鼠腹腔巨噬細(xì)胞的實驗證實。濃度為100～500ng/ml的MDC誘導(dǎo)豚鼠巨噬細(xì)胞以劑量依賴性遷移(圖5)。誘導(dǎo)豚鼠巨噬細(xì)胞遷移所需的濃度約為對人細(xì)胞(圖4)起作用濃度的10倍。對其它物種人趨化因子的最高生物活性所需的濃度，MCP-1有相似的差別，該結(jié)果已由尤悉穆拉，免疫學(xué)雜志，1505025-5032(1993)報道。這些實驗結(jié)果表明MDC的生物學(xué)活性與單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化有聯(lián)系。與MCP-1相比[尤悉穆拉，免疫學(xué)雜志，1505025-5032(1993)]，MDC誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞而不是單核細(xì)胞的趨化性。MDC吸引巨噬細(xì)胞的能力顯示該趨化因子可能在誘導(dǎo)組織巨噬細(xì)胞的病灶性累積中起作用。組織巨噬細(xì)胞在特殊區(qū)域的累積在肉芽腫形成中是重要的，肉芽腫形成時肺巨噬細(xì)胞包圍和包裹異物或相對非破壞性的細(xì)菌病原如分支桿菌而起作用[亞當(dāng)斯，美國病理學(xué)雜志，84164-191(1976)]。在某些情況下如關(guān)節(jié)炎，已了解巨噬細(xì)胞的累積是有害的，具有破壞性。MDC能促進(jìn)巨噬細(xì)胞趨化性顯示本發(fā)明的MDC抑制劑有治療效用，以預(yù)防、降低或消除巨噬細(xì)胞在組織中累積。圖2表示的用人單核細(xì)胞的趨化性測定結(jié)果暗示MDC能抑制細(xì)胞遷移。如圖6所示(MDC為0ng/ml)缺乏MDC時，單核THP-1細(xì)胞向MCP-1的遷移。不過，當(dāng)細(xì)胞和MDC存在時，對MCP-1的趨化應(yīng)答(實心圓圈)降低。濃度為0.005-0.5ng/ml的MDC抑制單核細(xì)胞對MCP-1的趨化應(yīng)答。盡管MDC抑制單核細(xì)胞對MCP-1的趨化應(yīng)答，在存在或缺乏MDC時，從向僅為培養(yǎng)基(空心圓圈，RPMI含BSA)遷移的細(xì)胞數(shù)看，MDC對趨化動力學(xué)或隨機遷移都沒有明顯的影響。MDC對單核細(xì)胞趨化性的抑制活性顯示MDC在處理幾種慢性炎性病態(tài)(動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、肺纖維化)的治療效用，在這些病態(tài)中，單核細(xì)胞的趨化性似乎起重要的病原作用。增強MDC在以上疾病中的活性可導(dǎo)致降低單核細(xì)胞對組織的遷移性，從而減少疾病癥狀的嚴(yán)重程度。實施例14MDC體內(nèi)腫瘤生長抑制作用的測定MDC抑制腫瘤生長特性的分析，如修改自蘭寧等，免疫學(xué)雜志，1534625-4635(1995)所述的分析鼠TCA3的抑制腫瘤特性的方法。編碼MDC的cDNA電穿孔法轉(zhuǎn)染進(jìn)來自骨髓瘤的J558細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)。篩選MDC產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)，采用實施例18細(xì)述的抗MDC的單克隆抗體。來自產(chǎn)生MDC克隆的一千萬細(xì)胞的團塊皮下注射到BALB/c小鼠的右下四分體中。為了比較，一千萬非轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射到對照鼠中。比較兩組腫瘤形成的速度和發(fā)生率確定MDC抑制腫瘤生長的功效。隨后和腫瘤細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞浸潤物的特點用組織學(xué)方法辨認(rèn)。此外，重組MDC(20ng)和非轉(zhuǎn)化J558細(xì)胞混合，注射(20ng/天)到形成自以上細(xì)胞的腫瘤中，以分析給與外源的MDC對腫瘤細(xì)胞的影響。實施例15腹膜內(nèi)注射測定按洛等，免疫學(xué)雜志，1534616-4624(1994)所述的方法，通過注射1-1000ng純化的MDC到小鼠或其它動物(如兔或豚鼠)的腹膜內(nèi)腔中，確定體內(nèi)對MDC起應(yīng)答的細(xì)胞。注射后，白細(xì)胞從外周血和腹膜腔中分離，用DiffQuick試劑盒(Baxer，McGraw，IL)染色識別。白細(xì)胞的全貌是在不同時間估計不同細(xì)胞類型出現(xiàn)的動力學(xué)測定。在單獨的實驗中，抗MDC(實施例18)的中和抗體和MDC一起注射，以證實白細(xì)胞的浸潤是由于MDC的活性所致。實施例16體內(nèi)活性測定-皮下注射MDC化學(xué)引誘物特性的體內(nèi)測定，采用梅拉等，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1781913-1921(1993)所述的方案。重組MDC(10-500pmol/點)注射到合適的哺乳動物如狗或兔的皮下。在4-24小時，組織法估計注射點的細(xì)胞浸潤。用直接抗MDC的抗體免疫組織化學(xué)法證實存在MDC。細(xì)胞浸潤物的特點用Baxer’sDiffQuick試劑盒染色識別。實施例17脊髓抑制活性測定MDC脊髓抑制活性的測定，注射MDC到小鼠或另外的哺乳動物(如兔、豚鼠)中，如用梅茲等，免疫學(xué)雜志，1491004-1009(1992)所述的測定MIP-1α的脊髓抑制作用的方法進(jìn)行。單劑量0.2-10μg的重組MDC靜脈注射到C3H/HeJ小鼠中(杰克遜實驗室，BarHarborME)。測定在股骨髓和脾中髓樣祖細(xì)胞的循環(huán)效率(cyclingrate)確定趨化因子的骨髓抑制效應(yīng)。祖細(xì)胞生長和分裂的抑制作用在臨床上與對接受化學(xué)治療或放射治療的病人的處理有關(guān)。以上趨化因子處理的脊髓保護效應(yīng)已由達(dá)洛普等，血液，792221(1992)在臨床前模型中闡明。以前述對趨化因子衍生物白細(xì)胞介素-8(IL-8)和血小板因子4(PF-4)相同的方式，體外測定法也用于測定MDC對脊髓抑制的影響。見戴利等，生物化學(xué)雜志，2702382(1985)。簡言之，為估計粒-巨噬前體細(xì)胞，在缺乏(對照)或存在MDC時，低密度(少于1.077g/cm)的正常人骨髓細(xì)胞植板于含10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)，100units/ml的重組人GM-CSF(R&amp;DSystems，Mineapolis，MN)，50ng/ml重組人青灰(Steel)因子(ImmunexCorp，Seattle，WA)，0.3％的瓊脂培養(yǎng)基中。為估計紅系粒細(xì)胞髓系巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GEMM)和紅系簇形成單位(BFU-E)，在存在重組人紅細(xì)胞生成素(1-2units/ml)及與50ng/ml青灰因子合用下，細(xì)胞生長在含0.9％甲基纖維素的培養(yǎng)基中。在37℃低氧(5％)培養(yǎng)14天后，數(shù)個板上得到了集落。GM-CSF和青灰因子或紅細(xì)胞生成素和青灰因子的合用使能檢出大集落(通常＞1000細(xì)胞/克隆)，這些集落來自粒細(xì)胞髓系集落形成單位(CFU-GM)，CFU-GEMM和BFU-E的早，更不成集的子集合。實施例18抗人MDC的抗體A.單克隆抗體重組MDC，按實施例6所述的切割GST-MDC融合蛋白的方法產(chǎn)生，用于免疫小鼠，以產(chǎn)生單克隆抗體。此外，不同的小鼠用相當(dāng)于MDC成熟態(tài)N端(SEQIDNO21-12位殘基)的化學(xué)合成肽段免疫。肽在應(yīng)用生物系統(tǒng)型號473A肽合成儀(福斯特城，CA)合成，按廠家介紹的方法，連接到鑰孔_血藍(lán)素(Pierce)上。開始注射時，約10μgMDC蛋白或連接肽用弗氏完全佐劑乳化，皮下注射。間隔2-3周后，附加量的MDC蛋白用弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射。在最后灌注增強(prefusionboost)前，從免疫小鼠中取出血清樣品。這些血清用western印跡法分析，以證實其和MDC蛋白的反應(yīng)性。為灌注增強，小鼠用在PBS中的MDC液注射，四天后殺死小鼠取出脾臟。脾放在10ml無血清的RPMI1640中，在二片玻璃顯微鏡載片磨砂端研磨浸在添加2mML-谷氨酸、1mM丙酮酸鈉，100units/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(RPMI)(Gibco，加拿大)的無血清RPMI1640中的脾，形成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液用無菌的70目Nitex細(xì)胞濾過器(strainer)(BectonDickinson，Parsippany，NewJersey)過濾，離心200g5分鐘洗二次，重懸沉淀在10ml無血清RPMI中。取自三次未做過實驗的Balb/c小鼠的胸腺細(xì)胞，以相似的方法制備用作滋養(yǎng)層。NS-1骨髓瘤細(xì)胞，融合前在含10％胎牛血清(FBS)(Hyclone實驗室，Inc，Logan，Utah)的RPMI中維持其對數(shù)期三天，200g，5分鐘離心收集，按前段所述的方法洗沉淀二次。將脾細(xì)胞(2×108)和4×107NS-1細(xì)胞混合，離心，吸去上清。輕敲離心管移動細(xì)胞沉淀，加2ml37℃的PEG1500(50％在75mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸中(Hepes))(BoehringerMannheim)，攪拌1分鐘以上，接著加14ml無血清RPMI，7分鐘以上。加另外的16mlRPMI，細(xì)胞用200g離心10分鐘。去上清液后，沉淀重懸在含15％FBS、100μM次黃嘌呤鈉，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸腺嘧啶核苷(HAT)(Gibco)，25untis/ml白細(xì)胞介素-6(BoehringerMannheim)和1.5×106胸腺細(xì)胞/ml的200mlRPMI中，植板于10個Corning平底96孔培養(yǎng)板(Corning，Corning紐約)中。融合后第2，4和6天，從融合板的孔中移去100μl培養(yǎng)基，重加100μl新鮮培養(yǎng)基。在第8天，按下列檢測存在能結(jié)合MDC的鼠IgG的ELISA法篩選融合細(xì)胞。Immulon4板(Dynatech，Cambridge，MA)用稀釋在25mM三羥甲基氨基甲烷，pH7.5中每孔100ng的MDC，37℃包被2小時。吸去包被液，每孔加200μl封閉液[稀釋在CMF-PBS中0.5％魚皮明膠(西格瑪)]，37℃溫育30分鐘。吸去封閉液，加50μl培養(yǎng)上清。37℃溫育30分鐘后，用含0.05％吐溫20(PBST)的PBS洗三次，加50μl以1∶7000稀釋在PBST中偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG(fc)辣根過氧化酶(杰克遜免疫研究，西格羅夫，賓夕法尼亞)。將板按上法溫育，用PBST洗4次，加100μl在100mM檸檬酸鹽，pH4.5中含1mg/ml鄰苯二胺(西格瑪)和0.1μl/ml30％過氧化氫組成的底物液。5分鐘后，加50μl15％的硫酸終止顏色反應(yīng)。在板讀數(shù)儀(Dynafech)上讀A490值。選出的融合細(xì)胞稀釋在96孔板中克隆二次，5天后可數(shù)每孔的克隆數(shù)。由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體用Isostrip系統(tǒng)(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)同型化?？筂DC的抗體，用western印跡法抗上述在大腸桿菌或哺乳CHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組MDC，進(jìn)一步確定其特點。為準(zhǔn)備印跡，約3μl沉淀細(xì)胞(產(chǎn)生MDC的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，產(chǎn)生MDC的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞；未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(對照)；和未轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(對照))溶解在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和DTT(二硫蘇糖醇)的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備緩沖液中(圣姆布魯克等)。煮沸后，裂解液通過變性SDS-PAGE(18％丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷甘氨酸凝膠，NOVEX)分級分離，電印跡到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA)。MDC單克隆抗體用PBS稀釋到0.7μg/ml，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(圣姆布魯克等)，用于蛋白印跡。作為另外的對照，進(jìn)一步測試單克隆抗體對人皮膚、扁桃體和胸腺的全組織裂解液的蛋白印跡帶的交叉反應(yīng)性。有一抗MDC的單克隆抗體，命名為單克隆抗體191D，它與細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的重組MDC有強烈反應(yīng)。而且，該抗體顯示對所試的細(xì)菌、CHO哺乳動物細(xì)胞系或全部人組織非常小背景反應(yīng)性。此外，該抗體表現(xiàn)為按照標(biāo)準(zhǔn)的免疫沉淀方法(圣姆布魯克等)，能免疫沉淀來自CHO的重組MDC。產(chǎn)生單克隆抗體191D(命名為雜交瘤191D)的雜交瘤細(xì)胞系，按照布達(dá)佩斯特條約的條款(ATCC保藏日期1996年6月4日；ATCC登記號HB-12122)，存放在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)中，12301ParklawnDriVe，RockVilleMD20852(美國)。保藏材料的存活性不應(yīng)僅理解為當(dāng)在違反任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法授予的權(quán)利時的通行證。B.多克隆抗體抗MDC的多克隆抗體，按照標(biāo)準(zhǔn)方案(圣姆布姆克等)，在兔中產(chǎn)生。上述以GST融合蛋白產(chǎn)生的重組MDC用PBS稀釋，弗氏完全佐劑乳化，皮下注射到兔中。間隔3-6周，另外稀釋在PBS中的MDC用弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射到相同的兔子中。第三次免疫后10天，從兔中抽取血清，用10倍的含0.5％吐溫20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液稀釋(TBS-T，圣姆布姆克等)，通過上述抗重組MDC的蛋白印跡法定性。實施例19鈣流測定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化，為趨化因子細(xì)胞活化的指標(biāo)，用公認(rèn)技術(shù)的鈣流測定法在幾個細(xì)胞系中進(jìn)行了監(jiān)測，細(xì)胞在室溫下溫育在1ml含1μMFura-2/AM(分子探針，Eugene，OR)的完全培養(yǎng)基中30分鐘，洗一次，以～106細(xì)胞/ml重懸在D-PBS中。2ml懸浮細(xì)胞放在位于熒光計(AMINCO-BowmanSeries2，羅徹斯特，NY)內(nèi)37℃下不斷攪拌的小杯中。胞內(nèi)鈣濃度用熒光表示，這是以0.5秒間隔轉(zhuǎn)換340nm和380nm的激發(fā)波長時，在發(fā)射波長510nm處所測定的熒光值。從340nm到380nm激發(fā)波長的發(fā)射比率相當(dāng)于胞內(nèi)鈣水平。該測定測量的細(xì)胞系包括如下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染公認(rèn)的趨化因子受體基因V28[萊普特等，基因，163295-299(1995)]的人胚腎HEK-293細(xì)胞系；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染趨化因子受體基因CCR5的HEK-293細(xì)胞[塞姆森等，生物化學(xué)，353362-3367(1995)；也見共同擁有，共同未決的美國專利申請，流水號08/575,967，提交日期1995年12月20日，在此引入?yún)⒖?，公開趨化因子材料和方法，包括CCR5(在那認(rèn)作“88C”)]，人單核THP-1細(xì)胞系，人肺上皮A-549細(xì)胞系；人成纖維IMR-90細(xì)胞系。這些細(xì)胞對重組MDC蛋白應(yīng)答時均沒有鈣流。作為陽性對照，HEK-293轉(zhuǎn)染細(xì)胞對凝血酶有強烈反應(yīng)，提示測定是有效的。此外，THP-1細(xì)胞對終濃度為25ng/ml購買的趨化因子MCP-1和MCP-3(Peprotech，RockyHill，NJ)有強烈反應(yīng)。對A-549或IMR-90細(xì)胞系，未測定另外的刺激。實施例20HIV增殖的抑制作用幾種CC趨化因子涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的增殖，HIV是人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的誘發(fā)因素。見科克希等，科學(xué)，2701811(1995)。MDC抗HIV增殖的活性用科克希等所述的方法測量，在該方法中，CD4+T細(xì)胞用HTV株急性感染，在不同濃度的MDC存在下培養(yǎng)。三天后，往細(xì)胞中加含新鮮稀釋MDC的培養(yǎng)基。感染后5～7天，HIV水平用商業(yè)化的ELISA檢測盒(科爾特，邁阿密，F(xiàn)L)，檢測培養(yǎng)上清存在的HIVp24抗原測量。檢測了抗MDC的抗體中和由人淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抑制活性的能力(科克希，同上)此外，在HIV抑制測定中，化學(xué)合成的MDC類似物(實施例11)或重組方法產(chǎn)生的類似物的功效也進(jìn)行了測試。實施例21MDC對成纖維細(xì)胞增殖的影響除了能吸引和活化白細(xì)胞外，一些趨化因子如IL-8，表明能影響非白細(xì)胞性的細(xì)胞增殖[見達(dá)斯悉爾，J.Invest.Dermatol.，92294-298(1992)]。整個機體的成纖維細(xì)胞對大多數(shù)組織的完整性是重要的。成纖維細(xì)胞增殖對傷口愈合和對損傷的反應(yīng)是必不可少的，但在慢性炎性疾病如肺纖維化的情況下，也是有害的[番恩，炎癥免疫學(xué)，Elsevier(1983)，pp.121-162)]。體外細(xì)胞增殖測定用于估計MDC對成纖維細(xì)胞增殖的影響。人成纖維細(xì)胞(CRL-1635)從ATCC獲得，在含10％FBS和1％抗生素的DMEM中維持培養(yǎng)。增殖測定的操作和定量，按本領(lǐng)域由戴赫爾姆和番恩，美國病理學(xué)雜志，134355-363(1989)前述的方法。簡言之，第一天，在含10％FBS的DMEM中，2.5×103細(xì)胞/孔種到96孔板上。第二天植板24小時后，細(xì)胞上的培養(yǎng)基換成無血清的DMEM。第3天培養(yǎng)基從細(xì)胞中移去，代之以含0.4％FBS稀釋有MDC的DMEM。第5天每孔加1微居里的3H胸腺嘧啶核苷，繼續(xù)溫育5小時。把細(xì)胞收獲到玻璃纖維濾膜上。細(xì)胞增殖率以摻入到成纖維細(xì)胞中的3H胸腺嘧啶核苷的cpm表示。該測定的對照包括測定所用的基本培養(yǎng)基，含0.4％FBS的DMEM作陰性對照，含10％FBS的DMEM作陽性對照。如圖7所示，MDC處理以劑量依賴方式降低成纖維細(xì)胞的增殖。用從CHO細(xì)胞純化的MDC(實心圓圈)和化學(xué)合成的MDC(空心圓圈)觀察到相似的成纖維細(xì)胞增殖抑制作用。MDC抗成纖維細(xì)胞增殖的效應(yīng)顯示有治療用途，用MDC處理如肺纖維化和腫瘤疾病，這些疾病中，增強或失控的細(xì)胞增殖是主要特征。實施例22細(xì)胞增殖測定測定MDC對上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖的影響，用本領(lǐng)域熟知的如戴赫爾姆等，美國病理學(xué)雜志，134355-363(1989)所述的方法和“免疫學(xué)現(xiàn)代方法”書中3-4節(jié)，“淋巴細(xì)胞功能體外測定”由威利和桑斯(1992)所寫的生長因子活性測定法。在這些方法中，測量了細(xì)胞生長的增強和抑制作用和生長因子的釋放。MDC對上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的測定，用上述對成纖維細(xì)胞(實施例21)相同的步驟。用外周血淋巴細(xì)胞，測定對T細(xì)胞增殖的影響。單核細(xì)胞按戴赫爾姆等，美國病理學(xué)雜志，135571-580(1989)所述的方法，從外周血中分離；細(xì)胞重懸在含10％FBS的RPMI中，在塑料培養(yǎng)瓶中溫育過夜。淋巴細(xì)胞仍懸浮在這些培養(yǎng)物中，離心培養(yǎng)液得到。10萬個淋巴細(xì)胞接種到96孔板的一孔中，在含1μg/ml植物血球凝集素(PHA)加或不加50、125、250或500ng/mlMDC的培養(yǎng)基(RPMI加10％FBS)中培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)最后18小時，加1微居里的3H-胸腺嘧啶核苷。收獲細(xì)胞，增殖率按實施例21所述的用于成纖維細(xì)胞的方法表示。測定MDC對巨噬細(xì)胞增殖的影響，用按上述實施例13中獲得的激活的豚鼠腹腔巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞以每孔10萬個細(xì)胞的密度在含10％FBS的RPMI中，植到96孔板中，溫育2小時使細(xì)胞貼壁。然后移去培養(yǎng)基，代以加或不加50、125、250或500ng/ml的MDC的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞和MDC溫育3天，按上述用于淋巴細(xì)胞的方法測定增殖率。趨化因子介導(dǎo)的這些類型細(xì)胞的增殖控制，在損傷后加強組織修復(fù)和在慢性炎癥反應(yīng)如牛皮癬、纖維化、動脈粥樣硬化和腫瘤疾病中限制這些細(xì)胞增殖時，有治療意義。實施例23成纖維細(xì)胞增殖的體內(nèi)測定體內(nèi)測定MDC對成纖維細(xì)胞抗增殖的影響，用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法，如番恩和方托恩，美國病理學(xué)雜志，50587-591(1984)的報道方法，該法用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型。該模型特征明確，允許在疾病的整個階段估計成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成。簡言之，把大鼠分為4個處理組1)對照，給予生理鹽水氣管內(nèi)注射；2)鹽水注射大鼠，再接受每天腹腔注射鹽水中的500ngMDC；3)博萊霉素處理，給予1.5mg/kg博萊霉素(Calbiochem，PaloAlto，CA)氣管內(nèi)注射；4)博萊霉素處理大鼠再給予每天腹腔注射500ngMDC。開始?xì)夤茏⑸浜?、7、14、21和28天，每組殺三只大鼠。取肺，每個肺葉樣品作組織學(xué)檢查和膠原含量測定。實施例24MDC調(diào)節(jié)因子測定MDC活性的調(diào)節(jié)因子(modulator)，對MDC在其中起作用的疾病或疾病癥狀的處理可能是有用的。以上調(diào)節(jié)因子要么是MDC結(jié)合的激動劑或是拮抗劑。以下的受體結(jié)合測定提供方法識別以上的MDC調(diào)節(jié)因子。MDC用可檢測的標(biāo)記物如125I、3H、14C、生物素或銪標(biāo)記。含MDC受體的細(xì)胞膜制備自對MDC有應(yīng)答的自然細(xì)胞，如人巨噬細(xì)胞、佛波酯激活的THP-1細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞系或豚鼠巨噬細(xì)胞。(替代的方法是當(dāng)以上MDC受體cDNA被鑒定和克隆時，從轉(zhuǎn)染MDC受體cDNA的細(xì)胞中制重組受體制備物)。例如，膜制品暴露在125I標(biāo)記的MDC中，在合適的條件下溫育(如37℃10分鐘)。然后在濾膜上真空過濾收集任何方式結(jié)合125I-MDC的膜，清洗移去未結(jié)合的125I-MDC。然后把膜放到液體閃爍分光光度計中定量和結(jié)合MDC有關(guān)的放射性。MDC結(jié)合的特異性可在增加未標(biāo)記MDC的數(shù)量的情況下，重復(fù)前面的方法，測定競爭性地結(jié)合到受體的水平證實。這些結(jié)合測定也能用于識別MDC受體結(jié)合的調(diào)節(jié)因子。前面的受體結(jié)合測定也可作如下修改進(jìn)行除標(biāo)記MDC外，待定的MDC調(diào)節(jié)因子放到膜制品中。在這改變的測定方法中，膜有關(guān)的標(biāo)記物增加水平(數(shù)量)顯示待定的調(diào)節(jié)因子是MDC結(jié)合的活化因子；膜有關(guān)的標(biāo)記物降低水平(數(shù)量)顯示待定的調(diào)節(jié)因子是MDC受體結(jié)合的抑制劑。該測定方法能用于從大量的化合物或天然產(chǎn)物中識別MDC結(jié)合的特異活化劑和抑制劑。同時快速地篩選大量調(diào)節(jié)因子候選化合物是特別希望的。如上述闡明的MDC的生物學(xué)功能，表明有幾方面的臨床用途。一般來說，趨化因子吸引和活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(巴格歐里尼等，同上)，MDC特別地吸引巨噬細(xì)胞和抑制單核細(xì)胞趨化性。這樣在病原性炎性固定點的MDC表達(dá)，可通過補充另外的巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞到疾病位點，活化已經(jīng)存在的白細(xì)胞，或誘導(dǎo)白細(xì)胞仍在疾病位點而加重病態(tài)。因而，抑制MDC的化學(xué)引誘活性可望減輕有害的炎性過程。有意義的是上述方法的潛在好處已在涉及IL-8的實驗中被直接闡明，IL-8是吸引和活化中性粒細(xì)胞的C-X-C細(xì)胞趨化因子。直接抗IL-8的抗體具有極強的能力。抑制由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病[哈拉達(dá)等，Leukoc.Biol.56559(1994)]?？赏鸐DC的抑制作用在假定巨噬細(xì)胞起作用的疾病如節(jié)段性回腸炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或動脈粥樣硬化中，具有相似的效果。可供選擇的是，增加MDC的影響可能在以上疾病中具有有益的作用，因為已經(jīng)表明趨化因子在傷口愈合和血管生成中有正作用。這樣，外源的MDC或MDC激動劑可能在促進(jìn)以上疾病恢復(fù)中是有益的。此外，闡明C-C趨化因子MIP-1α(梅茲等，同上)的骨髓抑制效應(yīng)表明MDC可能有相似的活性。由MDC或MDC激動劑提供的以上活性，對接受化學(xué)療法或放射療法的病人產(chǎn)生實際的益處，降低治療對病人髓樣祖細(xì)胞的有害影響。也可證明MDC或MDC激動劑在治療腫瘤時有臨床的重要性，如已表明C-C趨化因子TCA3能抑制小鼠的腫瘤形成(見蘭寧等，同上)。MDC可直接或間接地抑制腫瘤形成而起作用，如吸引和活化不同的非特異效應(yīng)細(xì)胞到腫瘤位點或激活特異的抗腫瘤免疫。MDC抗成纖維細(xì)胞增殖的效應(yīng)顯示MDC在治療諸如肺纖維化和腫瘤這些疾病的治療用途，這些疾病中，增強或失控的細(xì)胞增殖是主要的特征。當(dāng)本發(fā)明按特別的實施方案描述時，可以理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員會想到變化的和修改的方法。因此，本發(fā)明只受所附權(quán)利要求中限制因素的限制。序列表(1)總的信息(i)申請人Godiska，Ronald；Gray，PatrickW.(ii)發(fā)明題目巨噬細(xì)胞來源的趨化因子和趨化因子類似物(iii)序列數(shù)32(iv)通信地址(A)收信人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray&amp;Borun(B)街道6300SearsTower，233SouthWackerDrive(C)城市芝加哥(D)州伊利諾斯(E)國家美利堅合眾國(F)郵區(qū)60606-6402(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/558,658(B)提交日期1995年11月16日(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/479,620(B)提交日期1995年6月7日(viii)委托人/代理人信息(A)姓名Gass，DavidA.(B)登記號38,153(C)參考/檔案號27866/33318(ix)電訊信息(A)電話312/474-6300(B)傳真312/474-0448(C)用戶電報25-3856(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度2923堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置20..298(ix)特征(A)名稱/鍵mat_肽(B)位置92..298(xi)序列描述SEQIDNO1GAGACATACAGGACAGAGCATGGCTCGCCTACAGACTGCACTCCTGGTTGTC52MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValVal-24-20-15CTCGTCCTCCTTGCTGTGGCGCTT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GGCGCCAACATGGAA36(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO14GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA30(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長度29堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO15TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG29(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO16CGAAATTAATACGACTCACT20(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長度67堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO17TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTAT60TGAGAAT67(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長度99氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“HuMCP-3”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO18MetLysAlaSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuThrAlaAlaAla-20-15-10PheSerProGlnGlyLeuAlaGlnProValGlyIleAsnThrSerThr-515ThrCysCysTyrArgPheIleAsnLysLysIleProLysGlnArgLeu10152025GluSerTyrArgArgThrThrSerSerHisCysProArgGluAlaVal303540IlePheLysThrLysLeuAspLysGluIleCysAlaAspProThrGln455055LysTrpValGlnAspPheMetLysHisLeuAspLysLysThrGlnThr606570ProLysLeu75(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長度99氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵字misc_特征(D)其它信息“HuMCP-1”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO19MetLysValSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuIleAlaAlaThr-20-15-10PheIleProGlnGlyLeuAlaGlnProAspAlaIleAsnAlaProVal-515ThrCysCysTyrAsnPheThrAsnArgLysIleSerValGlnArgLeu10152025AlaSerTyrArgArgIleThrSerSerLysCysProLysGluAlaVal303540IlePheLysThrIleValAlaLysGluIleCysAlaAspProLysGln455055LysTrpValGlnAspSerMetAspHisLeuAspLysGlnThrGlnThr606570ProLysThr75(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長度76氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“HuMCP-2”(xi)序列描述SEQIDNO20GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle151015AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr202530AsnIleGlnCysProLysGluAlaValIlePheLysThrLysArgGly354045LysGluValCysAlaAspProLysGluArgTrpValArgAspSerMet505560LysHisLeuAspGlnIlePheGlnAsnLeuLysPro657075(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長度91氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“RANTES”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO21MetLysValSerAlaAlaAlaLeuAlaValIleLeuIleAlaThrAla-20-15-10LeuCysAlaProAlaSerAlaSerProTyrSerSerAspThrThrPro-515CysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLys10152025GluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPhe303540ValThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp455055ValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer6065(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長度91氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“MIP-1β”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO22MetLysLeuCysValThrValLeuSerLeuLeuMetLeuValAlaAla-20-15-10PheCysSerProAlaLeuSerAlaProMetGlySerAspProProThr-515AlaCysCysPheSerTyrThrArgGluAlaSerSerAsnPheValVal10152025AspTyrTyrGluThrSerSerLeuCysSerGlnProAlaValValPhe303540GlnThrLysArgSerLysGlnValCysAlaAspProSerGluSerTrp455055ValGlnGluTyrValTyrAspLeuGluLeuAsn6065(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長度92氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“MIP-1α”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..70(xi)序列描述SEQIDNO23MetGlnValSerThrAlaAlaLeuAlaValLeuLeuCysThrMetAla-20-15-10LeuCysAsnGlnPheSerAlaSerLeuAlaAlaAspThrProThrAla-51510CysCysPheSerTyrThrSerArgGlnIleProGlnAsnPheIleAla152025AspTyrPheGluThrSerSerGlnCysSerLysProGlyValIlePhe303540LeuThrLysArgSerArgGlnValCysAlaAspProSerGluGluTrp455055ValGlnLysTyrValSerAspLeuGluLeuSerAla606570(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長度96氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息“I-309”(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..73(xi)序列描述SEQIDNO24MetGlnIleIleThrThrAlaLeuValCysLeuLeuLeuAlaGlyMet-20-15-10TrpProGluAspValAspSerLysSerMetGlnValProPheSerArg-515CysCysPheSerPheAlaGluGlnGluIleProLeuArgAlaIleLeu10152025CysTyrArgAsnThrSerSerIleCysSerAsnGluGlyLeuIlePhe303540LysLeuLysArgGlyLysGluAlaCysAlaLeuAspThrValGlyTrp455055ValGlnArgHisArgLysMetLeuArgHisCysProSerLysArgLys606570(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長度93氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵蛋白質(zhì)(B)位置1..69(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息提示/＝“24位的氨基酸選自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息提示/＝“27位的氨基酸分別選自賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息/提示＝“30位的氨基酸分別選自酪氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息/提示＝“50位的氨基酸分別選自谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸和丙氨酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息/提示＝“59位氨基酸選自色氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_特征(D)其它信息/提示＝“60位氨基酸選自丙氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(xi)序列描述SEQIDNO25MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO26TATTGGATCCGTTCTAGCTCCCTGTTCTCC30(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO27CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC31(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO28GCGACTCTCTACTGTTTCTC20(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO29CACAGGAAACAGCTATGACC20(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長度70氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO30LeuGlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAsp151015TyrValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrp202530ThrSerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArg354045AspLysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIle505560LeuAsnLysLeuSerGln6570(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長度69氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO31GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTyrLeuLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)長度69氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO32GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysGluTyrPheTyrThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65</tables>關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)權(quán)利要求1.編碼具有SEQIDNO2的巨噬細(xì)胞來源的趨化因子(MDC)氨基酸序列的多肽的純化多核苷酸。2.權(quán)利要求1的為DNA的多核苷酸。3.權(quán)利要求2的具有SEQIDNO1的20-298位核苷酸的DNA。4.編碼MDCSEQIDNO2的1-69位氨基酸的純化多核苷酸。5.權(quán)利要求4的為DNA的多核苷酸。6.權(quán)利要求5的具有SEQIDNO1的92-298位核苷酸的DNA。7.選自如下的純化的多核苷酸(a)SEQIDNO1的DNA；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與SEQIDNO1的DNA非編碼鏈雜交的多核苷酸；(c)由于遺傳密碼的冗余性，在嚴(yán)格條件下能與SEQIDNO1的DNA非編碼鏈雜交的多核苷酸；和(d)與SEQIDNO1的DNA編碼相同的多肽的多核苷酸。8.權(quán)利要求7的為DNA的多核苷酸。9.編碼具有SEQIDNO25氨基酸序列的多肽的純化多核苷酸。10.權(quán)利要求9的為DNA的多核苷酸。11.編碼SEQIDNO25的1-69位氨基酸的純化的多核苷酸。12.權(quán)利要求11的為DNA的多核苷酸。13.選自如下的純化的多核苷酸(a)權(quán)利要求12的DNA；(b)在嚴(yán)格條件下能與權(quán)利要求12雜交的多核苷酸；和(c)由于遺傳密碼的冗余性，在嚴(yán)格的條件下能與權(quán)利要求12的DNA雜交的多核苷酸。14.權(quán)利要求13的為DNA的多核苷酸。15.包含權(quán)利要求2、5、8、10、12或14的DNA的載體。16.權(quán)利要求15的為表達(dá)載體的載體，其中DNA能可操作地與表達(dá)控制DNA序列連接。17.以一種可在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)MDC的方式用權(quán)利要求2或5的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。18.產(chǎn)生MDC的方法，所述的方法包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞和從所述的細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離MDC。19.以一種可在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)MDC多肽類似物的方式由權(quán)利要求10或12的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。20.產(chǎn)生MDC多肽類似物的方法，所述的方法包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞和從所述的細(xì)胞或培養(yǎng)基分離MDC多肽類似物。21.具有SEQIDNO25的氨基酸序列的純化多肽。22.權(quán)利要求21的具有SEQIDNO2的氨基酸序列的純化多肽。23.具有SEQIDNO25的1-69位氨基酸的純化多肽。24.根據(jù)權(quán)利要求23具有SEQIDNO2的1-69位氨基酸的純化多肽。25.選自如下的多肽(a)包含鑒定為SEQIDNO30的1-70位的氨基酸序列的多肽；和(b)包含鑒定為SEQIDNO2的9-69位的氨基酸序列的純化多肽；和(c)包含鑒定為SEQIDNO31的1-69位識別的氨基酸序列的多肽；和(d)包含鑒定為SEQIDNO32的1-69位識別的氨基酸序列的多肽。26.編碼權(quán)利要求25的多肽的多核苷酸。27.權(quán)利要求26的是DNA的多核苷酸。28.包含權(quán)利要求27的DNA的載體。29.用權(quán)利要求27的DNA以一種可在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多肽的方式穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。30.一種與權(quán)利要求21，22，23，24或25的多肽特異反應(yīng)的抗體。31.根據(jù)權(quán)利要求30為單克隆抗體的抗體。32.產(chǎn)生權(quán)利要求31的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。33.包含按權(quán)利要求30抗體的多克隆抗血清。34.和MDC起特異反應(yīng)的抗體。35.在哺乳動物宿主中調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化性的方法，它包括如下步驟(a)給所述的哺乳動物宿主施用權(quán)利要求21、22、23、24或25的多肽，其中所述的多肽在所述的宿主中能調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化性。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述的白細(xì)胞選自單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。37.減輕病人炎癥疾病的方法，所述的疾病其特征至少是(i)在所述的病人中單核細(xì)胞向炎癥位點趨化或(ii)成纖維細(xì)胞增殖中之一，所述的方法包括如下步驟(a)給病人施用治療有效量的MDC。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的治療有效量的MDC是能抑制單核細(xì)胞趨化性的量。39.按權(quán)利要求37的方法，其中所述的治療有效量的MDC是能抑制成纖維細(xì)胞增殖的量。40.包含SEQIDNO1核苷酸序列的一個連續(xù)部分或與其互補的非編碼鏈的DNA，所述的連續(xù)部分包含至少18個核苷酸，所述的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能和人MDC基因雜交。41.權(quán)利要求40的DNA，其中所述的DNA在所述的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，不能與選自MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因的人趨化因子基因雜交。42.在藥學(xué)上可接受的載體中包含權(quán)利要求21，22，23，24或25的多肽的藥用組合物。43.權(quán)利要求42的組合物在治療炎性疾病狀態(tài)中的用途。44.權(quán)利要求43的用途，其中所述的炎性疾病狀態(tài)其特征在于在具有所述疾病狀態(tài)的病人中，單核細(xì)胞向炎癥位點趨化。45.按權(quán)利要求43的用途，其中所述的炎性疾病狀態(tài)其特征在于具有所述疾病狀態(tài)的病人中，成纖維細(xì)胞增殖。46.鑒定具有MDC調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，包括步驟(a)提供包含MDC受體的第一和第二受體組合物；(b)提供包含可檢測標(biāo)記的MDC的對照組合物；(c)提供包含可能檢測標(biāo)記的MDC和進(jìn)一步包含所述化合物的測試組合物；(d)在MDC能與MDC受體結(jié)合的情況下，用對照組合物接觸第一受體組合物；(e)在MDC能與MDC受體結(jié)合的情況下，用檢測組合物接觸第二受體組合物；(f)洗去第一和第二受體組合物，以移去未與MDC受體結(jié)合的可檢測標(biāo)記的MDC；(g)在所述的第一和第二受體組合物中測定可檢測標(biāo)記的MDC；和(h)鑒定含MDC調(diào)節(jié)活性的化合物，其中MDC調(diào)節(jié)活性與被可檢測標(biāo)記的MDC在所述的第一和第二受體組合物中的差異有關(guān)。全文摘要本發(fā)明提供了編碼一種新的稱為MDC的人巨噬細(xì)胞來源的趨化因子及其多肽類似物的純化和分離的多核苷酸序列。還提供了重組生產(chǎn)該趨化因子，和純化和分離的趨化因子蛋白，以及多肽類似物的材料和方法。文檔編號C12N15/19GK1163635SQ96190875公開日1997年10月29日申請日期1996年6月7日優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日發(fā)明者R·戈迪斯卡,P·W·格雷申請人:艾科斯有限公司