專利名稱：液化淀粉的方法
本申請是1995年3月9日提出的美國專利申請序列號08/401,325的部分接續(xù)申請，該申請全部內(nèi)容被并入本文作參考。
本發(fā)明涉及在將谷物淀粉轉(zhuǎn)化為諸如葡萄糖、果糖和酒精等下游產(chǎn)品時對α-淀粉酶的應(yīng)用進行改進。特別地，本發(fā)明涉及在液化前或液化中從顆粒狀淀粉中將一種酶抑制組分除去和/或使其失活的方法。
長久以來，諸如玉米的谷物就被用作淀粉的來源。將淀粉分離和純化以用于工業(yè)生產(chǎn)的一種眾所周知的方法是濕磨法。該方法已經(jīng)發(fā)展成為一種高度專門化和完整的系統(tǒng)，其設(shè)計目的就是要使谷粒中的主要組分盡可能完全地分離(參見Stanley A.Watson，StarchChemistry & Technology，Vol.II，Industrial Aspects，Academic Press，New York，1967，pp.30-51)。
在通常的濕磨法中，用于生產(chǎn)淀粉產(chǎn)品的干燥谷物首先要經(jīng)過一個稱作“浸泡”的步驟。在浸泡過程中，谷物處于逆向水流中，這樣可以從谷物顆粒中分離出許多可溶物，包括肌醇六磷酸酯和肌醇六磷酸、糖類、鹽類和蛋白質(zhì)。從浸泡水中分離出被浸泡的谷物，然后使其經(jīng)過一個機械破碎和研磨步驟。隨后使用浮選和離心技術(shù)將胚芽從淀粉、纖維和蛋白質(zhì)中分離出去。所得到的胚乳(淀粉)、纖維和蛋白質(zhì)的稀漿隨后被進一步研磨和過濾以分離出纖維。最后，根據(jù)密度的不同，通過逆流沖洗和離心將蛋白質(zhì)及與胚乳有關(guān)的組分分離以從蛋白質(zhì)/谷蛋白物流中分離出淀粉。然后對所分離的淀粉進行徹底的沖洗以除去任何非顆粒狀的與淀粉有關(guān)的可溶物，諸如可溶的無機鹽以及肌醇六磷酸酯和肌醇六磷酸的鹽類。所得到的產(chǎn)物是一種高度純化的不可溶顆粒狀淀粉的稀漿，它被用作轉(zhuǎn)化為果糖的起始物質(zhì)。
通常，淀粉至果糖的生產(chǎn)過程包括四個步驟顆粒狀淀粉的液化，將液化后的淀粉糖化為葡萄糖，純化，以及異構(gòu)化為果糖。淀粉液化步驟的目的是將淀粉聚合物顆粒的高濃度懸浮液轉(zhuǎn)化為一種低粘度的可溶性短鏈長糊精的溶液。該步驟對于用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備簡便地處理以及有效地轉(zhuǎn)化為葡萄糖和其它糖類是很必要的。為了使顆粒狀淀粉液化，有必要通過升高顆粒狀淀粉的溫度至大約72℃以上以使顆粒糊化。加熱步驟在瞬間使不可溶的淀粉顆粒破裂以產(chǎn)生水溶性的淀粉溶液。然后用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)將被增溶化的淀粉溶液液化。
通常的酶促液化過程包括通過加入氫氧化鈣、氫氧化鈉或碳酸鈉，將顆粒狀淀粉稀漿的pH值調(diào)整在6.0至6.5之間，這是從地衣型芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)中提取的α-淀粉酶的最適pH值。加入氫氧化鈣的優(yōu)點是它還能夠提供鈣離子，而該離子可以穩(wěn)定α-淀粉酶防止它失活。加入α-淀粉酶后，將懸浮液泵送通過一個蒸汽噴管，使其溫度在瞬間內(nèi)升到80℃～115℃。淀粉馬上糊化，而且由于α-淀粉酶的存在，它被α-淀粉酶通過對(1-4)糖苷鍵的隨機水解而解聚，成為一種容易用泵輸送的流體物質(zhì)。
在第二種液化過程中，將α-淀粉酶加入淀粉懸浮液，將該懸浮液在80-100℃下保溫以部分水解淀粉顆粒，在高于大約105℃的溫度下將部分水解的淀粉懸浮液泵送通過一個噴管以使任何剩余的顆粒狀結(jié)構(gòu)完糊化。在糊化的淀粉冷卻后，第二次α-淀粉酶的加入可以使淀粉進一步水解。
液化過程的第三種方法被稱作干磨法。在干磨法中，將谷物整體研磨并與水結(jié)合。使用浮選分離或等效的技術(shù)將胚芽選擇性地除去。所得到的混合物，其中含有淀粉、纖維、蛋白質(zhì)和谷物的其它組分，被用α-淀粉酶液化。當(dāng)使用干磨法時，本領(lǐng)域的一般操作是在較低的溫度下進行酶促液化。通常，在將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糊精方面，低溫液化的效果被認為要比高溫液化差。
一般情況下，完成糊化后，在α-淀粉酶存在的情況下將淀粉溶液在高溫下保存，直至達到10-20的DE值，通常需要1-3小時的時間。葡萄糖值(DE)是計量全部還原糖濃度的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，它以D-葡萄糖的干重為計算基準(zhǔn)。沒有水解的顆粒狀淀粉的DE值基本為零，而D-葡萄糖的DE值被定義為100。
含有α-淀粉酶的淀粉溶液所能承受的最高溫度取決于所得到的酶的微生物來源以及α-淀粉酶分子的分子結(jié)構(gòu)。由枯草桿菌(B.subtilis)或解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的野生菌株所生產(chǎn)的α-淀粉酶的使用溫度通常不高于大約90℃，因為高于那個溫度會極快地導(dǎo)致它熱失活，而由地衣型芽孢桿菌的野生菌株所生產(chǎn)的α-淀粉酶可在高達大約110℃的溫度下使用。
已知淀粉和鈣離子的存在能穩(wěn)定α-淀粉酶以防止其失活。盡管如此，還是在pH高于6的條件下使用α-淀粉酶以防止其快速失活。在低溫下，即使pH值低至5，來自地衣型芽孢桿菌的α-淀粉酶也表現(xiàn)出了對淀粉底物的極好的水解活性。然而，當(dāng)用于淀粉水解的酶處于一般的噴射溫度下，例如在102℃至109℃之間，pH值就必須至少維持在5.7以上以防止其極其快速的失活?？上У氖?，對pH值的要求使得操作范圍十分地狹小，因為pH值高于6.0會產(chǎn)生不希望的副產(chǎn)物，例如麥芽寡糖類。因此，在實際上液化pH值必須維持在5.9和6.0之間以得到令人滿意的水解淀粉的產(chǎn)量。
涉及液化pH值的另一個問題是，需要將淀粉懸浮液的pH值從大約為4，即來自于濕磨階段的玉米淀粉懸浮液的pH值，升高到5.9-6.0。這種pH調(diào)節(jié)需要高費用地加入能中和酸的化學(xué)物質(zhì)，而且還需要對最終的淀粉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行額外的離子交換精制以除去該化學(xué)物質(zhì)。而且液化后的下一步驟通常是將液化淀粉糖化為葡萄糖，需要4-4.5的pH值；因此pH必須從5.9-6.0調(diào)低至4-4.5；這就需要額外的化學(xué)物質(zhì)的加入和精制步驟。
就象普遍存在于許多植物種子中一樣，肌醇六磷酸，肌醇的六磷酸酯也以肌醇六磷酸鹽的形式存在于谷粒中，例如鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽。正如上面所提到的，通常認為在進行進一步處理前，大部分存在于玉米顆粒中的肌醇六磷酸都在浸泡過程中從顆粒中浸出，并將從液化的物流中除去。令人驚奇的是，如下所述，申請人發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過了浸泡和徹底的清洗后，一種形式的肌醇六磷酸酯好象還存在于顆粒狀淀粉中。盡管不想被理論所束縛，申請人還是相信剩余的肌醇六磷酸酯實際上被束縛在淀粉顆粒中，因而在徹底清洗過程中也不能從淀粉中分離。
在美國專利5,322,778中，pH值在4.0至6.0之間的液化是通過向液化稀漿中加入抗氧化劑，如亞硫酸氫鹽及其鹽、抗壞血酸及其鹽、異抗壞血酸，或加入酚類抗氧化劑，如丁基化鄰甲氧基苯酚、丁基化羥基甲苯或α-生育酚來實現(xiàn)的。
在美國專利5,180,669中，pH值在5.0至6.0之間的液化是通過向研磨后的淀粉稀漿中加入碳酸根離子實現(xiàn)的，其用量超過了使溶液得到緩沖所需的量。由于碳酸根離子的加入導(dǎo)致了pH值的升高，通常通過加入氫離子使稀漿得到中和，例如加入諸如鹽酸或硫酸的無機酸。
在PCT公開No.WO 94/02597中，描述了一種氧化穩(wěn)定性得到改善的變異的α-淀粉酶，其中的一個或多個蛋氨酸被除半胱氨酸或蛋氨酸之外的任何氨基酸所取代。
在PCT公開No.94/18314中，描述一種氧化穩(wěn)定性得到改善的變異的α-淀粉酶，其中的一個或多個蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸或酪氨酸殘基被一種不可氧化的氨基酸所取代。
在PCT公開No.WO 91/00353中，對與液化有關(guān)的問題的解決是通過對α-淀粉酶進行遺傳工程改造完成的，其特性包括改進了的熱、酸和堿的穩(wěn)定性。
在美國專利4,914,029中，向玉米浸泡液中加入肌醇六磷酸酶以減少玉米浸泡液中肌醇六磷酸的量，從而在動物飼料中更有效地利用了玉米浸泡液。
盡管現(xiàn)有技術(shù)中取得了一些進展，但還需要開發(fā)一種在低pH值水平使用商用α-淀粉酶進行淀粉液化的有效方法。類似地，在本領(lǐng)域中也需要開發(fā)一種能夠在高溫下進行干磨谷物的液化的方法。然而，上述任何方法都不能提供這些優(yōu)點，即能夠?qū)⒁环N組分除去和/或使其失活，而該組分導(dǎo)致了參與低pH值淀粉液化的酶無效或不存在。另外，上述任何方法都不能提供一種適應(yīng)性強的液化方法，該方法不需要加入抗氧化劑或中和用的酸，也不需要制備經(jīng)遺傳工程改造的酶或發(fā)現(xiàn)一種具有異常低的pH穩(wěn)定性的新的α-淀粉酶。
本發(fā)明的一個目的是使用易得的α-淀粉酶的突變型或野生型進行有效的低pH值淀粉液化。
本發(fā)明的另一個目的是將存在于顆粒狀淀粉中的酶抑制組分除去和/或使其失活，該組分主要會導(dǎo)致低pH值下α-淀粉酶液化的無效。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種液化淀粉的方法，該方法不用加入昂貴的抗氧化劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種液化淀粉的簡單和有效的方式，它允許在方法中進行變通，而且不需要使用經(jīng)遺傳工程改造的α-淀粉酶。
本發(fā)明提供了一種液化淀粉的方法，它包括如下步驟在液化淀粉之前或在液化淀粉的同時處理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制組分失活和/或?qū)⑵涑?，從而得到處理后的淀粉；向處理后的淀粉中加入?淀粉酶；使處理后的淀粉在一定的溫度下反應(yīng)一段時間，該溫度對處理后的淀粉的液化有利。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了一種組合物，它包括α-淀粉酶和液態(tài)淀粉的混合物，其pH值小于5.7，該組合物或者含有失活了的酶抑制組分，或者基本上不含酶抑制失活組分。
正如下面的更為詳細的介紹中所指出的，本發(fā)明的實施使得商業(yè)淀粉液化方法具有了重要的優(yōu)點。盡管不希望被理論所束縛，申請人還是相信他們所發(fā)現(xiàn)的存在于顆粒狀淀粉中的一種特定的組分是導(dǎo)致與使用α-淀粉酶在低pH值下液化淀粉有關(guān)的問題的原因，而以前并沒有將該特定組分鑒定為其中的一種組分。通過對所分離的組分進行元素分析，該組分似乎含有某種形式的肌醇六磷酸酯。對這種導(dǎo)致低pH值液化問題的組分的令人驚奇的鑒定，使得將這種化合物失活和/或?qū)⑵涑コ蔀榭赡埽瑥亩軌蚴褂靡阎暮丸b定過的α-淀粉酶在低至4.5的pH值下對顆粒狀淀粉進行有效的液化。如下所示，申請人的發(fā)明第一次提供了一種在低pH值下液化淀粉的方法，它可以應(yīng)用包括α-淀粉酶的商業(yè)上適用的系統(tǒng)。另外，本發(fā)明不需要使用經(jīng)過特別設(shè)計的具有異常低的pH穩(wěn)定性的突變型或野生型的酶或諸如加入抗氧化劑或酸中和劑這樣的昂貴的方法。
參照下面的詳細描述以及所附的圖表就能夠?qū)Ρ景l(fā)明本身及其更進一步的目的和附帶的優(yōu)點有很好的了解。
“液化”表示一種過程，通過它淀粉轉(zhuǎn)化成了短鏈和較低粘度的糊精。通常，該過程包括淀粉的糊化，在糊化的同時或之后加入α-淀粉酶。
“浸泡液”表示一種液體，它來自浸泡過程中被浸泡的谷物顆粒。浸泡液中含有谷物中的大部分可溶性組分。
“顆粒狀淀粉”或“淀粉顆?！北硎疽环N食用谷物的水不溶性組分，在通過浸泡、機械粉碎、分離、篩分、逆流沖洗和離心這些典型的谷物濕磨法步驟除去了外殼、纖維、蛋白質(zhì)、胚芽和可溶物后，它仍保持原狀。顆粒狀淀粉由完整的淀粉顆粒組成，該顆粒幾予完全由質(zhì)密的淀粉分子(即支鏈淀粉和直鏈淀粉)組成。在玉米中，顆粒狀淀粉組分占淀粉的大約99％；剩下的1％由與顆粒緊密相聯(lián)的蛋白質(zhì)、灰份、纖維和痕量組分組成。顆粒狀淀粉的質(zhì)密結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了α-淀粉酶水解淀粉的能力。淀粉的糊化被用來破壞顆粒以形成一種可溶性的淀粉溶液并促進酶促水解。
“淀粉溶液”表示可溶于水的糊化的淀粉，它來自對顆粒狀淀粉的加熱。在將顆粒加熱到大約72℃以上后，顆粒狀淀粉分解成為一種疏松淀粉分子的液體混合物。舉例來說，在黃色臼齒型玉米中該混合物含有大約75％的支鏈淀粉和25％的直鏈淀粉，在水中形成了一種粘稠的溶液。在形成葡萄糖或果糖的商業(yè)生產(chǎn)中，是將淀粉溶液液化以形成一種可溶的糊精溶液。
“酶抑制組分”或“EIC”表示顆粒狀淀粉中的一種組分，其作用是在低pH值液化時抑制α-淀粉酶對淀粉溶液的水解。對從糊化的淀粉顆粒中提取的、在低pH值下抑制α-淀粉酶的組分進行的化學(xué)分析顯示，EIC含有某種形式的肌醇六磷酸酯。含有酶抑制組分的肌醇六磷酸酯的形式被認為是肌醇六磷酸的鎂、鐵、鉀、錳、鋅和/或鈣鹽。
“處理”被定義為表示對顆粒狀淀粉或淀粉溶液的處理，其目的是在低pH值，例如pH值低于5.7時，減弱或消除在酶促水解淀粉過程中由酶抑制組分引起的影響。舉例來說，處理包括向顆粒狀淀粉或淀粉溶液中加入一種或一組化合物，其作用是防止酶抑制組分使α-淀粉酶的淀粉水解活性失穩(wěn)、失活，或換句話說使活性減?。蛔岊w粒狀淀粉或淀粉溶液經(jīng)受某些條件或分離技術(shù)，以在低pH值液化前除去或明顯地減弱酶抑制組分的抑制特性；或者加入一種或一組化合物，它通過將EIC化學(xué)修飾為非EIC化合物而將酶抑制組分從溶液中除去。
“α-淀粉酶”表示一種酶活力，它切開或水解諸如淀粉、支鏈淀粉或直鏈淀粉聚合物中的α(1-4)糖苷鍵。合適的α-淀粉酶既包括自然產(chǎn)生的α-淀粉酶，也包括重組或變異的淀粉酶，它們都被用于淀粉液化。在本發(fā)明中優(yōu)選的淀粉酶是從芽孢桿菌屬中，尤其是從地衣型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)中提取的α-淀粉酶。
與本領(lǐng)域以前的液化方法相比，本發(fā)明對淀粉的處理使得液化反應(yīng)，即淀粉、支鏈淀粉或直鍵淀粉的酶促水解，能夠有效地在低于6.0，甚至低于5.0的pH值下進行。液化反應(yīng)優(yōu)選在大約4.5至大約5.7的pH值下進行，更優(yōu)選是在大約4.5至大約5.5之間，最優(yōu)選是在大約4.5至大約5.2之間。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在加入α-淀粉酶之前，通過熱處理對顆粒狀淀粉或淀粉溶液進行處理以使存在于其中的酶抑制組分失活。在該實施方案中，α-淀粉酶優(yōu)選是在加熱后加入顆粒狀淀粉或淀粉溶液中，以確保酶抑制組分失活，從而不在一開始就影響α-淀粉酶。然而，在處理步驟的同時加入α-淀粉酶也被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。然后按照本領(lǐng)域所熟知的方法將稀漿在合適的時間內(nèi)以及在合適的pH值和合適的溫度下保溫以使淀粉液化。根據(jù)本發(fā)明，在液化前，即加入α-淀粉酶前，通過加熱淀粉溶液能夠明顯地減弱酶抑制組分抑制α-淀粉酶活力的能力。
另一方面，在液化完成之前，首先將含有淀粉酶的淀粉溶液在低溫下，例如60℃至90℃下保溫以便從淀粉或糊化的淀粉中將酶抑制組分釋放，上述步驟也被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。隨后，通過將溫度升高到合適的度數(shù)并維持足以使其基本液化的時間來液化淀粉。優(yōu)選地，將溫度升高到大約80℃至大約115℃之間。酶失活組分的失活可能發(fā)生在低溫保溫時，或發(fā)生在液化過程中升高和保持溫度時。在該實施方案中，在對α-淀粉酶進行低溫保溫過程中或在隨后進行的液化過程中或之后，可以另外加入α-淀粉酶。象本發(fā)明的其它實施方案一樣，該實施方案能夠在pH值低于5.7時進行有效的液化。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，將顆粒狀淀粉或淀粉溶液用一種組分處理，該組分對酶抑制組分進行化學(xué)修飾或降解從而消除它的酶抑制特性，由此將酶抑制組分從淀粉中除去。優(yōu)選地，在進行液化之前，將肌醇六磷酸酯降解酶加入淀粉顆?；虻矸廴芤褐?。優(yōu)選的肌醇六磷酸酯降解酶包括肌醇六磷酸酶或酸性磷酸酶。產(chǎn)生自微生物、將肌醇六磷酸酯催化轉(zhuǎn)化為肌醇和無機磷酸的許多酶中，已知其中大部分是肌醇六磷酸酶。產(chǎn)肌醇六磷酸酶的微生物包括細菌和絲狀真菌和酵母，其中包括枯草桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉的變種泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、無花果曲霉(Aspergillusficuum)。肌醇六磷酸酶優(yōu)選是從無花果曲霉中提取。從微生物來源中對這種肌醇六磷酸酶進行提純由本領(lǐng)域的已知技術(shù)完成。例如，在Ullah，et al.，Preparative Biochemistry，18(4)，pp.443-458(1988)中，描述了從無花果曲霉中提純肌醇六磷酸酶，其描述被并入本文作參考。
加入顆粒狀淀粉或淀粉溶液中的肌醇六磷酸酯降解酶的濃度應(yīng)該足以使溶液中的酶抑制組分明顯地降解。當(dāng)然，對合適的肌醇六磷酸酯降解酶的濃度的確定取決于pH、溫度、反應(yīng)時間、酶的比活力，另外還取決于所得到的顆粒狀淀粉或淀粉溶液來源于何種谷物。然而，肌醇六磷酸酯降解酶活力的最適條件對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是很容易確定的。肌醇六磷酸酯降解酶濃度優(yōu)選為每克淀粉大約0.1至大約100單位肌醇六磷酸(肌醇六磷酸單位)。更優(yōu)選地，肌醇六磷酸酯降解酶的濃度為每克淀粉從大約1至大約25肌醇六磷酶單位。一個肌醇六磷酸酶單位(肌醇六磷酸酯降解活力)被定義為在37℃下，每分鐘從0.042M的Mg-K肌醇六磷酸酯中釋放1μmol無機磷酸(P)所需的酶量(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)?？紤]了將肌醇六磷酸酯降解酶或加入到顆粒狀淀粉中或加入到淀粉溶液中。不管淀粉是處于顆粒狀態(tài)還是溶解于溶液中，肌醇六磷酸酯降解酶都被確信對于本發(fā)明的目的是有效的。實際上，申請人發(fā)現(xiàn)，向顆粒狀淀粉中加入肌醇六磷酸酯降解酶，即在糊化之前加入，對于本發(fā)明中對溶液的處理是有效的。另一種選擇是肌醇六磷酸酶可在糊化過程中或過程后加入淀粉溶液中。
根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，在液化前使酶抑制組分失活和/或?qū)⑵鋸念w粒狀淀粉或淀粉溶液中除去。可以使用本領(lǐng)域已知的任何化學(xué)或機械分離方法將酶抑制組分除去，只要該法對于將包括肌醇六磷酸或肌醇六磷酸鹽的化合物從溶液中分離是有效的。合適的分離方法包括色譜、離子交換、微濾和離心。一個特別優(yōu)選的方法包括用與pH值有關(guān)的肌醇六磷酸沉淀法除去酶抑制組分，或在加熱處理后過濾，或者進行離心。通過高溫離心或高溫過濾將酶抑制組分除去也是優(yōu)選的。
在處理中，顆粒狀淀粉或溶粉溶液的pH可為任意值，只要它能夠?qū)⒚敢种平M分除去或使其失活。盡管處理步驟可在任何pH水平下操作，pH值在大約4至大約6之間處理過程則是高效的，因為不再需要對來自濕磨過程的顆粒狀淀粉物流的pH水平進行不希望有的調(diào)整。優(yōu)選地，pH值在大約4.5至大約5.7之間；更優(yōu)選地，pH值在大約4.5至大約5.5之間；最優(yōu)選的pH值在大約4.5至大約5.2之間。應(yīng)該指出的是，通過將處理步驟的pH值維持在上述范圍內(nèi)，處理步驟的pH將與濕磨后谷物淀粉處理物流的pH很好地相關(guān)，從而避免了因調(diào)節(jié)濕磨后玉米的pH值而需要的額外花費。
處理步驟的溫度對于將酶抑制組分除去或使其失活是一個合適的溫度，它取決于所選擇的特定的處理方式。當(dāng)處理步驟中包括加入肌醇六磷酸酶時，就應(yīng)該選擇一個適用于特定酶的水解活力的溫度。對于微生物肌醇六磷酸酶來說，合適的溫度通常在大約20℃至大約60℃之間，優(yōu)選是在大約30℃至大約40℃之間。然而，開發(fā)能夠在例如100-110℃的溫度下水解肌醇六磷酸酯的耐高溫的肌醇六磷酸酶被特別地加以考慮，它被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)并且是優(yōu)選的。如果處理步驟包括熱處理，其選擇性地隨后進行過濾或離心，處理溫度應(yīng)高于淀粉的糊化溫度；優(yōu)選是在大約80℃至大約150℃，更優(yōu)選是在大約90℃至大約110℃之間，最優(yōu)選是在大約95℃至大約110℃之間。
處理步驟的時間也可以隨所選擇的特定的處理方式而變化。如果處理步驟包括加入肌醇六磷酸酶，處理時間將取決于所加入的肌醇六磷酸酶的比活力以及保溫的溫度。如果使用微生物肌醇六磷酸酶，處理時間優(yōu)選是從大約1小時至大約24小時，更優(yōu)選是從大約3小時至大約6小時，這隨條件而定。如果處理步驟包括通過熱處理將酶抑制組分從顆粒狀淀粉或淀粉溶液中除去，其選擇性地隨后進行過濾或離心，處理時間優(yōu)選是從大約10秒鐘至大約60分鐘，更優(yōu)選是從大約3分鐘至大約10分鐘。在合適的條件下，例如合適的加熱條件下，來自顆粒狀淀粉的肌醇六磷酸酯的失活被認為幾乎是在瞬間完成的，因而處理時間只受技術(shù)條件的限制。
在熱處理后，可以用本領(lǐng)域已知的手段使用離心或過濾方法將失活的肌醇六磷酸酯從溶液中分離出來。如果在處理中使用離心方法將肌醇六磷酸酯從淀粉中分離，離心應(yīng)該在至少2000×g的g力下進行，優(yōu)選是在大約5000×g至大約10,000×g的g力下進行。
處理條件也會受所使用的谷物或研磨類型的影響。例如，含有相對較高酶抑制組分濃度的谷物比酶抑制組分濃度較低的谷物需要更長的處理時間。在不同的植物物質(zhì)中不同的肌醇六磷酸含量公開于Lehrfield，J.Agric.Food Chem.，Vol.42，pp.2726-2731(1994)中，將它并入本文作參考。當(dāng)用干磨法處理谷物以用于液化時，似乎存在比濕磨法多得多的肌醇六磷酸酯，原因是纖維和蛋白質(zhì)組分的存在。所以對于干磨的淀粉的處理需要使用比濕磨淀粉更為苛刻的條件。
在對顆粒狀淀粉或淀粉溶液進行處理以使酶抑制組分失活和/或?qū)⑵涑サ耐瑫r或之后，將α-淀粉酶加入淀粉中以將淀粉液化為分子量更低的糊精。因此，在使用α-淀粉酶液化的同時或之前無論對顆粒狀淀粉還是淀粉溶液進行處理都被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？梢愿鶕?jù)任何眾所周知的使用α-淀粉酶的液化技術(shù)進行液化。根據(jù)本發(fā)明，在液化步驟中的pH優(yōu)選是低于大約5.7，更優(yōu)選是低于5.3，最優(yōu)選是在大約4.5至大約5之間。
下述實施例反映了采用本發(fā)明而具有的優(yōu)點，而不是限制性的。然而，根據(jù)上述公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠變換條件、谷物、溫度、酶等等。
實施例1α-淀粉酶活力的測定
α-淀粉酶活力是通過一種檢測方法測定的，該法的依據(jù)是淀粉能與碘形成一種藍色的絡(luò)合物，而當(dāng)?shù)矸鬯鉃楦痰暮肿訒r這種顏色會消失。對α-淀粉酶活力的定義以產(chǎn)生顏色變化所需的消化時間為單位，該顏色變化代表淀粉糊精化的一種確定的狀態(tài)。
所使用的試劑如下磷酸緩沖液-將磷酸二氫鉀(340g)和氫氧化鈉(25.3g)溶于水中并稀釋至～2升。將緩沖液冷卻至室溫并將pH調(diào)節(jié)至6.2±0.1。該緩沖液在一個容量瓶中被稀釋至2升。淀粉底物-將10克(干物質(zhì))可溶性林特納淀粉懸浮于50ml水中并將其沖入～300ml的沸水中。再次使該懸浮物沸騰并在不斷的攪拌下使其沸騰5分鐘。使該淀粉溶液在不斷的攪拌下冷卻至室溫，然后加入125ml的磷酸緩沖溶液。將該溶液用水稀釋至500ml。每天都要制備新鮮的淀粉底物。備用碘溶液-將碘結(jié)晶(5.5g)和碘化鉀(11.0g)溶于水中并稀釋定容至250ml。將該溶液避光保存。稀釋的碘溶液-將碘化鉀(20g)和2ml備用碘溶液溶解于水中并稀釋定容至500ml。該溶液每天都要制備新鮮的。酶稀釋溶液-將氯化鈣(11.1g)溶于4升水中。用于所有試劑的水都是蒸餾水或去離子水。
將待測的α-淀粉酶樣品用酶稀釋溶液稀釋至10-15LU/ml之間(參見下面的定義)。對于許多商品α-淀粉酶試劑來說，發(fā)現(xiàn)合適的稀釋倍數(shù)為2000倍。將稀釋碘溶液的5ml等分試樣送入13×100mm的試管中，將10ml的淀粉底物置于一個23×200mm的試管中。將所有試管都置于30℃的水浴中。使用一臺裝備有特殊的α-淀粉酶色板的Hellige比色計(產(chǎn)品編號620-s5)進行讀數(shù)。將五毫升被稀釋的酶(也是30℃)與淀粉底物混合并開始計時。在合適的時間間隔內(nèi)，例如在反應(yīng)的早期間隔為1分鐘，在反應(yīng)的后期間隔為15秒，將酶-底物混合物的1ml等分試樣移入裝有保溫的稀釋碘溶液的試管中。將淀粉碘溶液混合并移入一個精確的13mm方形試管中，將其顏色在Hellige比色計中與標(biāo)準(zhǔn)α-淀粉酶色板進行比較。當(dāng)時間接近終點時，取樣品的時間間隔為0.25分鐘。
使樣品的顏色與色板的顏色一致所需的時間被記錄下來，根據(jù)下面的公式計算活力(每克或每毫升的淀粉酶活性單位)LU/ml或LU/g=570V×t×D]]>其中LU＝淀粉酶活性單位V＝酶的容積(5ml)t＝糊化時間(分鐘)D＝稀釋系數(shù)稀釋容積÷所稀釋的酶的毫升數(shù)或克數(shù)實施例2淀粉液化條件-液化后的淀粉的DE(葡萄糖值)的測定淀粉液化在一個反應(yīng)器中進行，其結(jié)構(gòu)如下將50英尺長、直徑為0.24英寸(內(nèi)徑為0.21英寸)的不銹鋼管彎成直徑大約為10英寸、高為～5.5英寸的盤管。該盤管裝備有一個11.5英寸的作業(yè)線內(nèi)靜態(tài)混合器(Cole-Parmer#G-04669-60)，它安裝在距前端～4英尺處。盤管的末端裝備有一個Swagelok作業(yè)線內(nèi)可調(diào)減壓閥(#SS 4CA-3)，其開閥壓力設(shè)定為大約20psi。用一臺活塞計量泵以～70ml/分鐘的流率將淀粉稀漿送入盤管中。對盤管的加熱是通過將其浸入加熱到105.5℃的甘油-水浴中完成的。使用循環(huán)加熱器/溫度控制器(Fisher Scientific model 7305)維持該浴的溫度。
顆粒狀淀粉得自玉米濕磨機并在兩天之內(nèi)使用。作為另一種淀粉來源，LO-DEXTM10(一種可溶于水的經(jīng)過提純的糊精，由對玉米淀粉的有限的水解制得)購自American Maize-Products Company，Hammond，Indiana。此處所使用的LO-DEXTM10的初始DE為～9.5。
用無離子水將淀粉或麥芽糖糊精稀釋至大約30-35％干固體這一理想的固體含量，根據(jù)需要用2.5％的NaOH或6％的HCl調(diào)節(jié)pH。鈣被以CaCl2·2H2O的形式加入。典型的液化條件為淀粉或LO-DEXTM10 30％-35％的固體鈣 40-60ppm(加入的為30ppm)pH 5.0-6.0α-淀粉酶12-14 LU/g碳水化合物(干基)將含有酶和CaCl2·2H2O形式的鈣的淀粉或LO-DEXTM10以大約70ml/min的流率加入到反應(yīng)器中。通過將反應(yīng)器浸沒在甘油-水浴中將其溫度維持在105.5℃。將淀粉樣品從反應(yīng)器中轉(zhuǎn)移到一個95℃的第二階段液化浴中并維持90分鐘。在第二階段的液化之后，根據(jù)Standard AnalyticalMethods of the Member Companies of the Corn Refiners Association，Inc.，sixth ed.，Analytical Procedure Committee(1980)中描述的方法，通過測定樣品的葡萄糖值(DE)馬上測定淀粉液化的程度。
實施例3肌醇六磷酸酯的HPLC分析如下所述，對肌醇六磷酸酯的分析是通過HPLC(高效液相色譜)完成的。使用一個HPLC系統(tǒng)，它包括一個Millipore/Waters，model 510Waters Automated Gradient Controller、用Poros 20 PI/M樹脂(PerSeptive Biosystems)填充的長為250mm、內(nèi)徑為4.6mm的柱子、裝備有一個Dionex陰離子抑制器和一個Diohex SRS控制器Dionex的電導(dǎo)檢測器。將商品肌醇六磷酸酯的樣品、從玉米谷蛋白物流中、粉碎的整個玉米、浸泡液、粉碎的全麥面粉、粉碎的大米提取的EIC以及來自顆粒狀淀粉的EIC用無離子水稀釋至肌醇六磷酸酯的濃度為10-200mg/L，同時過濾以除去任何不溶的物質(zhì)。將20至500ml的樣品(取決于肌醇六磷酸酯的濃度)注入柱子中，然后以1.3ml/min的流率用水沖洗柱子2分鐘。2分鐘后，開始用0至40mM的NaOH進行線性梯度洗脫，以1.3ml/min的流率在下面的20分鐘中連續(xù)操作。
在～15分鐘后肌醇六磷酸酯被從柱中洗脫。用呈線性的一系列的肌醇六磷酸鈉(Sigma Chemical Company，#P8810)稀釋液來標(biāo)定電導(dǎo)檢測器的響應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)每一種來源的EIC都有與商品肌醇六磷酸酯相同的洗脫峰。
實施例4從玉米谷蛋白物流中分離EIC從一種富含蛋白質(zhì)的淀粉物流(稱作玉米谷蛋白物流)中分離出一種能使α-淀粉酶失活或受到抑制的組分，所述物流是在玉米濕磨廠進行玉米胚乳分級時產(chǎn)生的，如下所述。通過離心(～6000×g，操作15分鐘)將不可溶的蛋白質(zhì)和淀粉顆粒從玉米谷蛋白級分(～18.6％的固體)中除去。通過Whatman#3濾紙進行真空過濾以使上層清液進一步澄清。使用一個截流分子量為5,000的聚礬中空纖維濾芯(A/G Technology Corp.，modelUFP-5-D-4)進行超濾以使過濾液分級。通過加入1N的NaOH將來自超濾步驟的大約1200ml的濾液調(diào)節(jié)至pH為9。通過離心(～6000×g，操作10分鐘)將形成的沉淀回收并懸浮在水中加以清洗。
通過離心(～6000×g，操作10分鐘)將沉淀從清洗的水中回收后，將沉淀再次懸浮于～500ml的水中，通過逐滴加入3M的HCl將pH慢慢地調(diào)至5從而使沉淀溶解。通過Whatman#3濾紙將溶液過濾以除去任何不溶物，然后將濾液冷卻至～4℃。將兩倍體積的酒精(4℃)加入到濾液中，通過一個多孔玻璃過濾器的過濾將所得到的沉淀回收。將沉淀用冷酒精清洗，回收后置于真空中在室溫下干燥。
1200ml的超濾液產(chǎn)生3.04g的EIC。
實施例5低pH的液化過程中EIC對α-淀粉酶的抑制按照實施例4中的方法分離的EIC(從0至200mg/升)被加入到含有50ppm鈣的35％的LO-DEXTM10(pH5.2)中。將α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational，Inc.，South San Francisco，CA)以12LU/g碳水化合物的比率加入并按照需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將溶液的pH值調(diào)節(jié)并維持在pH5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)使溶液水解。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。
表1顯示EIC濃度的升高降低了液化的LO-DEXTM10(初始DE為9.5)的最終DE，這表明對α-淀粉酶抑制的增加。
表1在pH5.2下EIC對α-淀粉酶催化水解LO-DEXTM10的影響EIC(mg/升)DE0 18.75017.5100 15.8150 13.9200 12.9從該實施例中可以看出，EIC的存在明顯地降低了α-淀粉酶在pH5.2下的效用。
實施例6EIC抑制α-淀粉酶與pH值的關(guān)系按照實施例4中的方法分離的EIC(200mg/升)被加入到含有50ppm鈣的35％的LO-DEXTM10中，其pH被調(diào)節(jié)為大約6.0或5.2。將α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational，Inc.，)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)并維持在pH5.2或6.0。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟使溶液水解。在.pH5.2和6.0下，將除了不含EIC外其它均相同的對照組與測試樣品同時進行測試。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。
結(jié)果被列于表2中?？梢钥闯?，在LO-DEXTM10的水解中EIC對α-淀粉酶的抑制是與pH有關(guān)的。在pH6.0時，200mg/L EIC的加入僅導(dǎo)致DE下降了～6％。在pH5.2時，DE下降了～65％。
表2在LO-DEXTM10的水解中pH對EIC抑制α-淀粉酶的影響pH EIC(mg/L) DE6.0 0 19.26.020018.65.2 0 18.75.220012.9實施例7EIC的元素分析使用原子吸收光譜(Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN)對按照實施例4從玉米谷蛋白級分中分離出的EIC進行元素分析。結(jié)果列于表3中。
表3EIC的元素分析碳 7.41％鎂10.32氫 2.48 錳 0.07氮＜0.05 鋅 0.05磷 22.38 鐵 0.04鈣 0.78灰分 69.50這一分析與對肌醇六磷酸的鎂、錳、鋅或鐵鹽的混合物的分析相一致。接著，按照實施例3中的描述用HPLC分析測定EIC中的肌醇六磷酸酯含量。分析顯示EIC中的陰離子組分基本上由肌醇六磷酸酯組成。
實施例8從粉碎的全玉米中分離EIC將250g粉碎的全玉米懸浮于500g的無離子水中，用6％的HCl將所得到的稀漿的pH調(diào)節(jié)至4。將該稀漿攪拌～8小時，然后靜置～10小時。通過在Whatman#3濾紙上的過濾將稀漿分離，用1M的NaOH把過濾液(～310g)的pH調(diào)節(jié)至9。通過在一個0.45m膜過濾器中的過濾將所產(chǎn)生的沉淀回收并用水沖洗。沉淀被懸浮于水中以形成一種溶液，通過緩慢加入6％的HCl將pH調(diào)節(jié)至5。將該溶液過濾以除去任何不溶物并冷卻至～4℃。加入兩倍體積的冷酒精，所形成的沉淀用離心方法回收。將沉淀用冷酒精洗滌一次，然后在室溫下在真空中干燥過夜。
從250g粉碎的全玉米中回收了0.772g的EIC。如實施例3中所示，由于其中特征性肌醇六磷酸酯的存在，可用HPLC分析確認EIC。對EIC的確認是在pH5.2下向LO-DEXTM10的液化混合物中加入所分離的EIC，然后測定α-淀粉酶是否受到了抑制。將來自粉碎的全玉米中的EIC(200mg/升)加入含有以CaCl2·2H2O形式存在的50ppm的鈣離子的35％LO-DEXTM10中，pH被調(diào)至大約5.2。將α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通過加入2.5的NaOH或6％的HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟使溶液水解。將除了不含EIC外其它均相同的對照組與測試樣品同時進行測試。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。
試驗的結(jié)果示于下面的表4中，它們與上面顯示的使用從玉米谷蛋白物流中分離的EIC時所產(chǎn)生的結(jié)果相同。
表4pH5.2下在LO-DEXTM10的水解中，從粉碎的全玉米中分離的EIC對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響樣品DE200mg/L EIC 9.5對照 16.3按照描述于實施例3中的方法對從粉碎的全玉米中分離的EIC進行HPLC分析。將一百微升的15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在材料中只發(fā)現(xiàn)了一個陰離子峰，通過洗脫時間被證實為肌醇六磷酸酯。該HPLC的峰形與從玉米谷蛋白級分中分離的EIC的峰形基本相同。
實施例9從玉米浸泡液中分離EIC將來自玉米濕磨廠的比重為～19Be的重玉米浸泡液，即經(jīng)過提濃的浸泡水濃縮液用離心方法澄清。通過加入5M的NaOH將一升澄清液的pH從4.2調(diào)節(jié)為8.1。所得到的沉淀用離心方法收集，將沉淀懸浮于水中進行清洗后再次用離心方法收集。將該沉淀懸浮于～400ml的水中，通過緩慢地加入6％的HCl將漿液的pH調(diào)節(jié)至～4。沉淀溶解后，通過Whatman#3濾紙對溶液過濾以除去任何不溶物，濾液被冷卻至～4℃。通過加入2倍體積的用冰冷卻的酒精使EIC從溶液中沉淀出來，用離心方法收集。用冷酒精洗滌沉淀一次，用離心方法收集后在室溫下真空干燥。
從1升重玉米浸泡液中回收了23.3g的EIC。對EIC的識別是在pH5.2下水解LO-DEXTM10時通過測定α-淀粉酶的失活以及對肌醇六磷酸酯的HPLC分析確定的。
為了確定來自玉米浸泡液的EIC對使用α-淀粉酶的液化的影響，將200mg/升的EIC加入到含有以CaCl2·2H2O形式存在的50ppm鈣離子的35％的LO-DEXTM10中，將pH調(diào)節(jié)至大約5.2。將α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟使溶液水解。將除了不含EIC外其它均相同的對照組在pH5.2下測定以進行比較。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。將除了未加EIC外其它均相同的對照組在pH5.2下測定。
結(jié)果顯示于表5中。這些結(jié)果與上面顯示的使用從玉米谷蛋白物流中分離的EIC時所產(chǎn)生的結(jié)果相同。
表5pH5.2下在LO-DEXTM10的水解中從玉米浸泡液中分離的EIC對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響樣品DE200mg/L EIC 10.9對照組 l4.9按照描述于實施例3中的方法對從玉米浸泡液中分離的EIC進行HPLC分析。將一百微升的200mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在材料中只發(fā)現(xiàn)了一個陰離子峰，通過洗脫時間被證實為肌醇六磷酸酯。該HPLC的峰形與從玉米谷蛋白級分中分離的EIC的峰形基本相同。
實施例10顆粒狀玉米淀粉中EIC的鑒定將來自玉米濕磨機的顆粒狀玉米淀粉的稀漿在Whatman#3濾紙上過濾以將水與淀粉顆粒分離。將顆粒狀淀粉再次懸浮于去離子水中并再次過濾以便從不可溶淀粉中除去任何可溶于水的組分。然后將顆粒狀淀粉再次懸浮于水中并稀釋至固含量為35％。加入來自地衣型芽孢桿菌的α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物)(SPEZYMEAA20，購自GenencorInternational Inc.)和鈣(50ppm)，按照實施例2中的描述在pH5.2下使顆粒狀淀粉稀漿液化。
從對玉米淀粉稀漿進行的第一次過濾中回收的水被用于溶解LO-DEXTM10以產(chǎn)生固含量為35％的溶液。加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物)和以CaCl2·2H2O的形式加入的鈣離子(50ppm)，按照實施例2中的描述在pH5.2下使溶液液化。對照組中含有LO-DEXTM10，它溶解于去離子水中，而不是溶解于來自玉米淀粉稀漿的過濾水中，同時使其液化。
用HPLC對特征性的肌醇六磷酸酯是否存在進行分析時，在來自顆粒狀淀粉稀漿的過濾液中沒有檢測到EIC。然而，對pH6下液化的顆粒狀玉米淀粉的HPLC分析檢測到了一個洗脫峰，該峰顯示存在一種與實施例4中從玉米谷蛋白中分離的EIC相同的物質(zhì)。HPLC分析表明，30wt％固形物的每升液化顆粒狀淀粉中存在30～40mg肌醇六磷酸酯。將麥芽糖糊精中的α-淀粉酶與顆粒狀淀粉過濾液混合后的液化結(jié)果與LO-DEXTM10中的α-淀粉酶與去離水水混合后的液化結(jié)果進行比較，證實了存在于顆粒狀淀粉中的EIC并沒有通過清洗被除去。由此，列于下面表6中的這些實驗結(jié)果顯示，在淀粉液化中導(dǎo)致α-淀粉酶失活的EIC與淀粉顆粒相結(jié)合，在溶液中不是游離的。
表6使用來自清洗后的玉米淀粉顆粒的過濾液所進行的液化樣品 90分鐘DE清洗后的淀粉顆粒 ～0去離子水中的LO-DEXTM1017.9來自淀粉稀漿的過濾液中的LO-DEXTM1018.1實施例11EIC的肌醇六磷酸酶失活將參照實施例4分離的20ml EIC用500單位的肌醇六磷酸酶(來自無花果曲霉，Sigma Chemical Company，P9792)在pH2.5、37℃下處理30分鐘。將10ml處理后的EIC加入LO-DEXTM10中以產(chǎn)生1升35％的LO-DEXTM10溶液，其中含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm的鈣離子和200mg/L的EIC。將提取自地衣型芽孢桿菌的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，購自Genencor International Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，使用描述于上述實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟在pH5.2下使溶液液化。將含有未添加EIC的LO-DEXTM10的對照組與含有200mg/ml的未處理的EIC的LO-DEXTM10同時液化。如表7中所示，肌醇六磷酸酶處理使EIC失活，由此阻止了它對α-淀粉酶的抑制能力。
表7肌醇六磷酸酶處理對α-淀粉酶的EIC失活的影響樣品 90分鐘DE不含EIC的對照組 15.4200mg/L的EIC 9.5用200mg/L肌醇六磷酸酶處理的EIC14.4實施例12對顆粒狀玉米淀粉的肌醇六磷酸酶處理將肌醇六磷酸酶(來自無花果曲霉，5ml，250單位/ml，購自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO.，產(chǎn)品編號P9792)加入到1升34％的顆粒狀玉米淀粉中，后者含有以CaCl2·2H2O形式加入的～50ppm的鈣離子，將它們在37℃、pH4.0下保溫5個小時。保溫后將顆粒狀淀粉稀漿的pH調(diào)節(jié)至pH5.2，將提取自地衣型芽孢桿菌的12LU/g碳水化合物的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，購自Genencor International Inc.)加入到顆粒狀淀粉稀漿中。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)將混合物液化。同時進行pH5.2下的對照液化試驗，它使用沒有經(jīng)過肌醇六磷酸酶處理的34％的顆粒狀玉米淀粉稀漿。
在第二個試驗中，將肌醇六磷酸酶(來自小麥，Sigma ChemicalCompany P1259，160單位)在1升35％的顆粒狀玉米淀粉稀漿中在55℃、pH5.15下保溫6小時，稀漿中含有以CaCl2·2H2O形式加入的～50ppm的鈣離子。保溫后，將顆粒狀淀粉稀漿的pH值調(diào)節(jié)至5.5，將提取自地衣型芽孢桿菌的12LU/g碳水化合物的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，購自Genencor International Inc.)加入到稀漿中。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟將混合物液化。同時進行pH5.5下的對照液化試驗，它使用沒有經(jīng)過肌醇六磷酸酶處理的35％的顆粒狀玉米淀粉的稀漿。
如表8中所示，在液化前對顆粒狀玉米淀粉的肌醇六磷酸酶處理提高了α-淀粉酶在低pH值下水解淀粉的能力。
表8在低pH值液化中肌醇六磷酸酶對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響液化pH值 90分鐘DE對照 肌醇六磷酸酶處理的淀粉5.2 ～01.45.5 6.48.6實施例13對含有EIC的麥芽糖糊精的熱過濾將按照實施例4的方法分離的EIC(200mg/升)加入35％w/w的含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm鈣的LO-DEXTM10中并將pH調(diào)節(jié)至大約為5.2。將該溶液分成兩部分。將一部分加熱至～100℃，然后乘熱立即通過Whatman#3濾紙進行真空過濾。將第二部分在室溫下(例如20-25℃)通過Whatman#3濾紙進行真空過濾。將α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入到每一部分溶液中，按照需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將每部分溶液的pH值都調(diào)節(jié)至5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟將每部分溶液都水解。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。按照描述于實施例3中的方法，在進行水解前在每一部分溶液中取樣用于肌醇六磷酸酯分析。
如表9中所示，在～100℃下對含有EIC的LO-DEXTM10的過濾從溶液中除去了大約75％的EIC。結(jié)果是在pH5.2下的液化中使較少的α-淀粉酶失活，而且使所得到的水解液的DE顯著增高。
表9在低pH值液化中熱過濾對α-淀粉酶EIC失活的影響樣品 EIC濃度DE冷過濾的麥芽糖糊精 184mg/L11.5熱過濾的麥芽糖糊精 45mg/L 14.5“沒有水解的”麥芽糖糊精 9.5實施例14從糙米中分離EIC使用一臺小型咖啡磨將Basmati糙米(購自Lundburg Mills)研磨成粉狀。將二百克磨碎的大米加入到500ml去離子水中，用6％的HCl將pH值調(diào)節(jié)至～3。將該漿液靜置30小時并不時攪拌，然后用Whatman#3濾紙進行真空過濾以將其分離。
通過加入1M的NaOH將濾液的pH值調(diào)節(jié)至9，所形成的沉淀用離心方法回收。用水將沉淀洗滌一次，離心收集后再次懸浮于水中。通過逐滴加入6％的HCl將懸浮液的pH緩慢地調(diào)節(jié)至～5，攪拌該懸浮液以使沉淀溶解。通過一個5m的膜過濾器的過濾將不溶物除去，濾液被冷卻至～4℃。將兩倍體積的冷酒精加入濾液中，用離心方法回收所形成的沉淀。將沉淀用冷酒精洗滌一次，然后在室溫下真空干燥。
由二百克粉碎的大米得到了0.3571g的EIC。對EIC的鑒定是在pH5.2下水解LO-DEXTM10時通過測定α-淀粉酶的失活以及對肌醇六磷酸酯的HPLC分析確定的。
將來自磨碎的大米的EIC(200mg/升)加入35％的含有以CaCl2·2H2O形式加入的50ppm的鈣離子的LO-DEXTM10中并將pH調(diào)至大約5.2。將提取自地衣型芽孢桿菌的α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，購自Genencor International，Inc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，按照需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟將溶液水解。在pH5.2下將除了不含EIC外其它均相同的對照組與測試樣品同時進行測試。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。試驗的結(jié)果列于表10中。
表10在pH5.2下水解LO-DEXTM10時從磨碎的大米中分離的EIC對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響樣品 DE對照 16.3200mg/L EIC 11.7按照描述于實施例3中的方法對從磨碎的大米中分離的EIC進行HPLC分析。將一百微升15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在樣品中只發(fā)現(xiàn)了一個陰離子峰，通過洗脫時間被證實為肌醇六磷酸酯。該HPLC的峰形與從玉米谷蛋白級分中分離的EIC的峰形基本相同。
實施例15從全麥面粉中分離EIC將二百克的商品全麥面粉(購自Arrowhead Mills)加入含有12mM的D，L-二硫蘇糖醇(Sigma Chemical Co.)的去離子水中。用6％的HCl將漿液的pH調(diào)節(jié)至～3，在不時攪拌的情況下將該漿液在室溫下靜置～30小時。離心法分離漿液。
通過加入1M的NaOH把濾液pH調(diào)至9，離心法回收產(chǎn)生的沉淀。水洗沉淀物一次，離心法再次收集，再懸浮于水中。通過逐滴加入6％的HCl將懸浮液的pH緩緩地調(diào)節(jié)至～5，攪拌懸浮液以使沉淀溶解。通過一個5m的膜過濾器的過濾將不溶物除去并將濾液冷卻至～4℃。將兩倍體積的冷酒精加入濾液中，通過離心方法將所形成的沉淀除去。用冷酒精將沉淀洗滌一次，然后在室溫下進行真空干燥。
由兩百克的全麥面粉得到了0.385g EIC。對EIC的鑒別是在pH5.2下水解LO-DEXTM10時通過測定α-淀粉酶的失活以及對肌醇六磷酸酯的HPLC分析確定的。
將來自全麥面粉的EIC(150mg/升)加入含有50ppm鈣離子的35％的LO-DEXTM10中并將pH值調(diào)節(jié)至大約5.2。將提取自地衣型芽孢桿菌的α-淀粉酶(SPEZMEAA20，購自Genencor InternationalInc.)以12LU/g碳水化合物的比率加入，根據(jù)需要通過加入2.5％的NaOH或6％的HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)至5.2。使用描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)和步驟將溶液水解。
將不含EIC的對照組在相同條件下進行測試以用于比較。在第二階段的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。試驗的結(jié)果列于表11中。
表11在pH5.2下水解LO-DEXTM10對從全麥面粉中分離的EIC對α-淀粉酶穩(wěn)定性的影響樣品 DE對照 16.3150mg/L EIC 14.2按照描述于實施例3中的方法對從全麥面粉中分離的EIC進行HPLC分析。將一百微升15mg/L的EIC溶液注入HPLC柱中，在樣品中只發(fā)現(xiàn)了一個陰離子峰，通過洗脫時間被證實為肌醇六磷酸酯。該HPLC的峰形與從玉米谷蛋白級分中分離的EIC的峰形基本相同。
實施例16通過加熱到95℃使EIC沉淀將按照實施例4中的方法分離的EIC(200mg/L)加入到含有50ppm鈣離子(以CaCl2·2H2O形式加入)的35％w/w的LO-DEXTM10中，用2.5％的NaOH將pH值調(diào)節(jié)至5.2。將LO-DEXTM10溶液分成兩份。將其中的一份通過描述于實施例2中的反應(yīng)器加熱到95℃并維持～6分鐘。該溶液通過反應(yīng)器后，以12LU/g碳水化合物的比率向其中加入α淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational Inc.)。然后將該溶液在95℃下保溫90分鐘。在90分鐘的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。
向第二部分含有EIC的麥芽糖糊精溶液中加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物，SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自Genencor International Inc.)并使其通過描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)，所不同的是，溫度為95℃。然后將該溶液在95℃下保溫90分鐘。在90分鐘的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。在pH5.2下將除了不含EIC外其它均相同的對照組同時進行測試以用于比較。
試驗結(jié)果列于表12中，它顯示通過加熱可以在液化過程中降低EIC對α-淀粉酶的失活作用。
表12加熱對α-淀粉酶的EIC失活的影響樣品 DE對照 17.6EIC+α-淀粉酶 14.0EIC+加熱后加入的α-淀粉酶 17.5實施例17通過加熱到105.5℃使EIC從麥芽糖糊精中沉淀將按照實施例4中的方法分離的EIC(200mg/L)加入到含有50ppm鈣離子(以CaCl2·2H2O形式加入)的35％w/w的LO-DEXTM10中，用2.5％的NaOH將pH調(diào)節(jié)至5.2。將LO-DEXTM10溶液分成兩份。將其中的一份通過描述于實施例2中的反應(yīng)器加熱到105.5℃并維持～6分鐘。該溶液通過反應(yīng)器后，以12LU/g碳水化合物的比率向其中加入α-淀粉酶(SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational，Inc.)。然后將該溶液在95℃下保溫90分鐘。在90分鐘的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。
向第二部分含有EIC的麥芽糖糊精溶液中加入α-淀粉酶(12LU/g碳水化合物，SPEZYMEAA20，由地衣型芽孢桿菌生產(chǎn)，購自GenencorInternational Inc.)并使其通過描述于實施例2中的反應(yīng)器系統(tǒng)，溫度是105.5℃。然后將該溶液在95℃下保溫90分鐘。在90分鐘的保溫后馬上用葡萄糖值(DE)對LO-DEXTM10的水解程度進行計量。在pH5.2下將除了不含EIC外其它均相同的對照組同時進行測試以用于比較。
試驗結(jié)果列于表13中，它顯示在加入α-淀粉酶之前通過加熱可以在液化過程中降低EIC對α-淀粉酶的失活作用。
表13在低pH值液化時加熱對α-淀粉酶的EIC失活的影響樣品 DE無EIC的對照組 15.0EIC+α-淀粉酶 10.2加熱后的EIC+α-淀粉酶 17.5與不加入任何EIC以及不進行熱處理的對照組相比，我們觀察到加入EIC和進行熱處理后DE升高了，LO-DEXTM10中EIC的存在被認為是導(dǎo)致DE升高的原因。
當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)了解的是可以對上述的優(yōu)選實施方案在很寬的范圍內(nèi)進行改變和修正。因而上述詳細的描述是為了促進對本發(fā)明的了解；而下面的權(quán)利要求，包括所有的等同內(nèi)容，其目的是為了定義本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種液化淀粉的方法，它包括如下步驟(a)在液化淀粉之前或在液化淀粉的同時處理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制組分失活和/或?qū)⑵涑?，從而得到處理后的淀粉?b)向處理后的淀粉中加入α-淀粉酶；(c)使處理后的淀粉在一定的溫度下反應(yīng)一段時間，該溫度對處理后的淀粉的液化有利。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(a)包括向所述淀粉中加入一種含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶與α-淀粉酶同時加入。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中加入的含有肌醇六磷酸酯降解活力的酶的濃度為大約0.1至大約100肌醇六磷酸酶單位/克淀粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括在加入α-淀粉酶之前將所述淀粉加熱到大約80℃至150℃之間的溫度以使所述酶抑制組分失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，進一步包括用離心方法將酶抑制組分除去。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中在將淀粉溫度升高之后或同時進行離心。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(b)與步驟(a)同時進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(b)在步驟(a)之后進行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(c)在低于6.0的pH下進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(c)在大約4.5至大約5.7的pH下進行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的步驟(c)在大約4.5至大約5.2的pH下進行。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(a)之前，在大約60℃至大約90℃之間的溫度下將α-淀粉酶加入淀粉中，從而將酶抑制組分從淀粉中除去。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中步驟(a)包括加入α-淀粉酶后的熱處理，其目的是通過在一定時間內(nèi)以及在足以使酶抑制組分失活的溫度下加熱淀粉而使酶抑制組分從淀粉中除去。
15.一種使水解酶失活的方法，它包括向含有所述水解酶的液體混合物中加入酶抑制組分。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述水解酶包括α-淀粉酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述酶抑制組分包括肌醇六磷酸酯及其鹽類。
18.一種組合物，它包括在pH低于5.0下α-淀粉酶和淀粉水溶液的混合物，該組合物基本上不含酶抑制組分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種液化淀粉的方法,包括如下步驟:在液化淀粉之前或液化淀粉的同時處理淀粉以使存在于淀粉中的酶抑制組分失活和/或?qū)⑵涑?從而得到處理后的淀粉;向處理后的淀粉中加入α－淀粉酶;使處理后的淀粉在一定的溫度下反應(yīng)一段時間,該溫度對處理后的淀粉的液化有利。處理淀粉的有效方法包括加入肌醇六磷酸酯降解酶和熱處理,隨后可選擇性地對顆粒狀淀粉或淀粉溶液進行過濾或離心。
文檔編號C12P19/14GK1177983SQ96192439
公開日1998年4月1日 申請日期1996年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月9日
發(fā)明者R·L·安特里姆, C·密奇恩森, L·P·索爾海姆 申請人:金克克國際有限公司