糊精分子量特征在檢測淀粉液化效果上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及淀粉深加工領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于糊精分子特征評價淀粉液化效 果的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉質(zhì)原料在發(fā)酵之前需先經(jīng)α -淀粉酶水解液化，將大分子切割成短鏈，形成 糊精和少量寡糖，從而使淀粉的黏度下降，為糖化酶的作用創(chuàng)造條件。在當前普遍應(yīng)用的液 化工藝中，主要使用商品α -淀粉酶，依據(jù)制造商提供的通用化反應(yīng)條件對淀粉質(zhì)原料進 行液化。然而以上液化條件的設(shè)置，往往只考慮了酶制劑針對某種特定底物的催化效率和 穩(wěn)定性，而沒有顧及淀粉水解反應(yīng)鏈的其他步驟以及不同發(fā)酵產(chǎn)品相異的發(fā)酵過程。尤其 在我國特有的粗料發(fā)酵模式中體現(xiàn)出發(fā)酵過程不穩(wěn)定的特點，這是長期制約發(fā)酵行業(yè)提升 的關(guān)鍵技術(shù)問題。
[0003] 另一方面，黑曲霉糖化酶是一種外切型淀粉酶，它針對不同結(jié)構(gòu)的底物作用效率 不同。Jennylynd A研宄發(fā)現(xiàn)黑曲霉糖化酶作用于長鏈的活性更大。進一步地，Κ. Hiromi 研宄發(fā)現(xiàn)黑曲霉糖化酶對低聚糖的Km值隨著DP (DP < 7)的增加而降低，對麥芽糖的Km值 為0. 18~I. 4mM，而對麥芽低聚糖的Km值為0. 02~0. 14mM。
[0004] 為了提升淀粉的糖化效率，需要對液化過程實施理性控制，全面科學(xué)地表征液化 程度就顯得十分必要。當前發(fā)酵行業(yè)中普遍使用DE值（dextrose equvialent value)作 為液化評價指標。然而DE值無法真實反映糊精混合物的糖分組成和分子量分布，不足以作 為判斷液化效果的依據(jù)。傳統(tǒng)的碘試法檢測液化終點又具有精確度低和波動性大的局限。 基于全面科學(xué)表征的精細化控制液化程度是粗料發(fā)酵模式，乃至整個淀粉深加工行業(yè)亟待 解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一種糊精分子量特征在檢測淀粉 液化效果上的應(yīng)用。本發(fā)明考察糖化酶催化特性與糊精結(jié)構(gòu)的關(guān)系，能夠全面科學(xué)表征淀 粉液化程度，實現(xiàn)淀粉質(zhì)原料液化過程精細化控制；改善淀粉液化質(zhì)量，進而提高糖化效 率，提升以淀粉質(zhì)為原料的粗料發(fā)酵模式，同時有助于帶動淀粉深加工產(chǎn)業(yè)；凡提及基于糊 精分子量特征評價液化效果的方法，均適用本發(fā)明技術(shù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 糊精分子量特征在檢測淀粉液化效果上的應(yīng)用，具體步驟如下：
[0008] (1)在待測淀粉液化液中分離制備不同分子量分布的糊精組分；
[0009] (2)以步驟（1)制備的糊精組分為底物，進行糖化酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗，比較 不同分子量糊精組分的Km值，以親和力最高即Km值最小的底物分子量特征為評價指標，評 價淀粉質(zhì)原料液化效果。
[0010] 所述待測淀粉液化液通過常規(guī)方法制備。所述待測淀粉液化液的常規(guī)方法制備 為：將淀粉溶解在水中，用0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5. 8~6. 0,然后加入高溫α -淀粉酶， 其添加量為10~30U/g淀粉，得到混合液；將步驟得到的混合液置于99°C超級恒溫水浴槽 中，攪拌均勻，經(jīng)碘試合格，得到液化液，然后進行滅酶。
[0011] 所述不同分子量分布的糊精組分通過常規(guī)方法分離制備。所述不同分子量分布的 糊精組分的常規(guī)方法分離制備為：取待測淀粉液化液，加入乙醇，調(diào)節(jié)至乙醇終濃度30% (v/v)，置于4°C冰箱中靜置24h，離心，沉淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇洗滌，低溫干燥獲得組分1 ; 上清液中緩慢添加乙醇調(diào)節(jié)至乙醇終濃度為30% (v/v)，置于4°C冰箱中靜置24h，離心，沉 淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇洗滌，低溫干燥獲得組分2 ;如此重復(fù)上述操作，得到不同分子量分布 的糊精組分。
[0012] 所述碘試合格為淺棕色。
[0013] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0014] 本發(fā)明針對傳統(tǒng)液化過程DE值作為評價液化效果，DE值無法真實反映糊精混合 物的糖分組成和分子量分布，不足以作為判斷液化效果的依據(jù)，提供一種基于糊精分子特 征評價淀粉液化效果的方法。
[0015] 本發(fā)明基于淀粉液化糊精分子的組成單元相同（均為葡萄糖殘基）；其受糖化酶 催化水解的效率因分子量而異。因此，糊精的分子量可作為表征液化程度的可靠指標。為 了在糊精分子量表征下控制液化程度，從而提高糖化效率，需要以糖化酶作用于不同分子 量糊精時的動力學(xué)參數(shù)為依據(jù)。本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點有：
[0016] (1)基于黑曲霉糖化酶的催化特性與糊精結(jié)構(gòu)的關(guān)系，通過對糊精結(jié)構(gòu)的精確表 征有助于實現(xiàn)淀粉質(zhì)原料液化組分精細化控制；
[0017] (2)能夠克服傳統(tǒng)評價方法不能真實反映糊精混合物的糖分組成和分子量分布的 缺陷，能夠全面科學(xué)表征液化程度，實現(xiàn)液化過程理性控制；
[0018] (3)改善液化質(zhì)量，進而提高糖化效率，帶動以淀粉質(zhì)為原料的粗料發(fā)酵模式，同 時有助于提升淀粉深加工產(chǎn)業(yè)。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行具體描述。
[0020] 稱取40g玉米淀粉于燒杯中；加入200mL去離子水（常溫）混合均勻，用0· Imol/ L NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 8~6. 0 ;添加高溫α -淀粉酶1200U，攪拌均勻。置于99°C超級恒溫 水浴槽（配備磁力攪拌裝置）中，攪拌均勻，碘試為淺棕色合格；立即用〇· lmol/L HCI調(diào)節(jié) pH至3.0,滅酶終止反應(yīng)，平衡5min后，用0. lmol/L NaOH中和，調(diào)節(jié)pH至中性。將淀粉水 解液稀釋，配置成質(zhì)量濃度為7% (w/w)的糊精溶液。
[0021] 取糊精溶液100mL，緩慢加入乙醇，并不斷攪拌，調(diào)節(jié)至乙醇終濃度30% (v/v)，置 于4°C冰箱中靜置24h，離心（4°C，10000g，20min)，沉淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇洗滌，低溫干燥 獲得組分1 ;上清液中緩慢添加乙醇調(diào)節(jié)至乙醇終濃度為30% (v/v)，置于4°C冰箱中靜置 24h，離心（4°C，lOOOOrpm，20min)，沉淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇洗滌，低溫干燥獲得組分2 ;如此 重復(fù)上述操作，調(diào)節(jié)至乙醇終濃度為70 % (v/v)，分別獲得1~5醇沉組分，經(jīng)體積排阻色 譜測定不同組分分子量分布。
[0022] 基于體積排阻色譜法對糊精組分分析，計算糊精分子量，獲得5個糊精組分分子 量信息如下：糊精I (即組分1，下同）重均分子量為21kDa ;糊精2重均分子量為12kDa ;糊 精3重均分子量為5. 6kDa，；糊精4重均分子量為I. 9kDa ;糊精5重均分子量為I. 4kDa
[0023] 分別考察糊精組分與酶促反應(yīng)動力學(xué)特征，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出， 糖化酶對應(yīng)不同分子量糊精的Km值是不同的，即糖化酶與不同分子量糊精親和力是不同 的，Km值越低即親和力越高則液化效果越好。由此可以說明，糊精分子量特征可以用于評 價淀粉液化效果。
[0024] 表1不同分子量糊精酶促動力學(xué)參數(shù)
[0025]
【主權(quán)項】
1. 糊精分子量特征在檢測淀粉液化效果上的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下： (1) 在待測淀粉液化液中分離制備不同分子量分布的糊精組分； (2) 以步驟（1)制備的糊精組分為底物，進行糖化酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗，比較不同 分子量糊精組分的Km值，以親和力最高即Km值最小的底物分子量特征為評價指標，評價淀 粉質(zhì)原料液化效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測淀粉液化液通過常規(guī)方法制備。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述不同分子量分布的糊精組分通過常規(guī) 方法分離制備。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測淀粉液化液的常規(guī)方法制備為： 將淀粉溶解在水中，用〇. Imol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5. 8~6. 0,然后加入高溫a -淀粉酶，其添 加量為10~30U/g淀粉，得到混合液；將步驟得到的混合液置于99°C超級恒溫水浴槽中， 攪拌均勻，經(jīng)碘試合格，得到液化液，然后進行滅酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述不同分子量分布的糊精組分的常規(guī)方 法分離制備為：取待測淀粉液化液，加入乙醇，調(diào)節(jié)至乙醇終濃度30% (v/v)，置于4°C冰箱 中靜置24h，離心，沉淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇洗滌，低溫干燥獲得組分1 ;上清液中緩慢添加乙 醇調(diào)節(jié)至乙醇終濃度為30% (v/v)，置于4°C冰箱中靜置24h，離心，沉淀經(jīng)過相應(yīng)濃度乙醇 洗滌，低溫干燥獲得組分2 ;如此重復(fù)上述操作，得到不同分子量分布的糊精組分。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述碘試合格為淺棕色。
【專利摘要】糊精分子量特征在檢測淀粉液化效果上的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)在待測淀粉液化液中分離制備不同分子量分布的糊精組分；(2)以步驟(1)制備的糊精組分為底物，進行糖化酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗，比較不同分子量糊精組分的Km值，以親和力最高即Km值最小的底物分子量特征為評價指標，評價淀粉質(zhì)原料液化效果。本發(fā)明考察糖化酶催化特性與糊精結(jié)構(gòu)的關(guān)系，能夠全面科學(xué)表征淀粉液化程度，實現(xiàn)淀粉質(zhì)原料液化過程精細化控制；改善淀粉液化質(zhì)量，進而提高糖化效率，提升以淀粉質(zhì)為原料的粗料發(fā)酵模式，同時有助于帶動淀粉深加工產(chǎn)業(yè)；凡提及基于糊精分子量特征評價液化效果的方法，均適用本發(fā)明技術(shù)。
【IPC分類】C12Q1-40
【公開號】CN104862375
【申請?zhí)枴緾N201510324346
【發(fā)明人】石貴陽, 王寶石, 李由然, 胡志杰, 蔣小東, 孫福新, 張 杰, 張梁, 丁重陽, 李贏, 顧正華
【申請人】江南大學(xué), 江蘇國信協(xié)聯(lián)能源有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月12日