專利名稱：除垢劑酶活性的噬菌體顯示的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適合于除垢劑中使用的酶的鑒定方法，尤其是在通過(guò)隨機(jī)誘變創(chuàng)造的大量變體中間選擇特異性的酶變體。
本發(fā)明還涉及用于所說(shuō)方法的特異性材料、通過(guò)使用所說(shuō)的方法選擇的酶以及含有輔助酶的除垢劑組合物。
背景技術(shù)：
為了應(yīng)用于各種工業(yè)、家庭、食品/飼料、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，工業(yè)上不斷地生產(chǎn)大量的多肽，包括酶和非酶蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的主要來(lái)源是已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的微生物。然而，因?yàn)榭茖W(xué)已經(jīng)發(fā)明許多通過(guò)蛋白質(zhì)工程產(chǎn)生多肽變體的新技術(shù)，能夠產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)變體以篩選和選擇新特性就變得越來(lái)越重要。
發(fā)現(xiàn)具有新的和特殊屬性的多肽的經(jīng)典方法一直用于篩選存在于自然界的野生型有機(jī)體。這曾是一種十分成功的產(chǎn)生將用于如以上提及的工業(yè)等不同領(lǐng)域中的多肽的方法。而且有可能通過(guò)對(duì)微生物的經(jīng)典突變產(chǎn)生蛋白質(zhì)的新變體。然而，因?yàn)檫@種方法是十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，在最近二十年，研究人員使用更特異和更快速的技術(shù)(如蛋白質(zhì)和基因工程)通過(guò)創(chuàng)造人工多樣性，在現(xiàn)有的多肽基礎(chǔ)上產(chǎn)生了改進(jìn)方法。
通過(guò)使用重組DNA技術(shù)(定點(diǎn)或隨機(jī)誘變)可以產(chǎn)生人工多樣性。這種方法產(chǎn)生了大量的多肽變體，這種多肽變體可以按照實(shí)驗(yàn)中給定有機(jī)體的新近獲得的表型進(jìn)行選擇。按照能夠篩選的突變體的數(shù)量，這樣的表型的篩選有它的局限性。首先，人們得建立一種篩選分析方法，這種方法能夠檢測(cè)多肽的新特性，并能分離出突變體。然后分離和鑒定出編碼該多肽的DNA。
已經(jīng)成功地應(yīng)用這些技術(shù)創(chuàng)造出新的重要的顯示出改進(jìn)特性(如更高的特異活性、在高或低pH值下更高的穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性等)的多肽。
然而，盡管這種方法是成功的，但是其在多肽的數(shù)量方面仍具有局限性。通過(guò)使用這些技術(shù)可能進(jìn)行篩選和檢測(cè)。因此創(chuàng)造新的體系是有益的，其能夠把篩選和選擇組合在一種方法之中。
此外，這樣的方法在所給出的條件下應(yīng)該僅能選出那些具有最好特性的變體，這些變體應(yīng)該從由超過(guò)108個(gè)成員組成的群體中選出。
用以制造這樣的人工多樣性和選擇新的或改進(jìn)特異性的多肽特性的一種有前途的方法就是公知的″噬菌體顯示″技術(shù)。這種技術(shù)把遺傳型與表型相結(jié)合，使一起選擇這兩種性狀成為可能。因此排除了在上述所提到的方法中的兩個(gè)步驟。
噬菌體顯示是一種相當(dāng)新的技術(shù)，George P.Smith在1988年(第一次嘗試是在1985年)第一次使用和描述了這種技術(shù)。最早的專利授予了R.C.Ladner(美國(guó)專利5,096,815和5,223,409)，這兩個(gè)專利分別描述的是“新DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和多肽的產(chǎn)生和選擇”和“新的結(jié)合蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化”。這兩個(gè)專利含有給出該技術(shù)背景的大量參考文獻(xiàn)。
已經(jīng)研究出來(lái)的噬菌體顯示系統(tǒng)把興趣多肽或肽與編碼它的DNA聯(lián)系到一起。這種噬菌體顯示系統(tǒng)曾用于選擇用來(lái)結(jié)合到所選擇的靶分子的肽文庫(kù)和用來(lái)顯示具有篩選這些蛋白質(zhì)所需特性的潛力的功能蛋白(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)12至15)。
最近，顯示方法的改進(jìn)使得能夠在噬菌體表面表達(dá)酶和抗體片段，因此能夠通過(guò)選擇特異性的配位體來(lái)選擇特異性的特征(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)2-6和16-18)。
有許多參考文獻(xiàn)描述了用于顯示抗體的這種成功的方法。而對(duì)于顯示酶的描述則較少，然而卻有一些這種方法的例子(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1、8和10)。
尤其是酶噬菌體的選擇原理正在評(píng)價(jià)和研究中。已經(jīng)證明給定酶的酶促機(jī)制可以用作經(jīng)使用自殺性抑制劑結(jié)合主體的手段(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1和9)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及到選擇適合于在除垢劑中使用的酶和酶變體的方法，其中所說(shuō)的將要選擇的酶變體在各自顯示于噬菌體微粒細(xì)胞表面上的酶變體混合物中，這種方法包括下列步驟i)在將對(duì)酶活性有負(fù)面影響或使大多數(shù)所說(shuō)的酶變體失活的條件下以液體形式將所說(shuō)的混合物引入到除垢劑組合物中；ii)使所說(shuō)的混合物與將特異性地結(jié)合到表現(xiàn)所需特性的酶變體的捕集器分子進(jìn)行反應(yīng)，以在表現(xiàn)出所需特性的酶變體的所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體和所說(shuō)的捕集器之間形成復(fù)合物；(iii)從所說(shuō)的混合物的余下部分分離所說(shuō)的復(fù)合物；(iv)解離所說(shuō)的復(fù)合物以便分離出顯示在沒(méi)有捕集器分子時(shí)所要選擇的所說(shuō)的酶變體的細(xì)胞或噬菌體；(v)把所說(shuō)的噬菌體引入到它能夠繁殖的宿主中；或者(va)在有助于其繁殖的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞；和(vi)從所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體的基因組中分離編碼所說(shuō)的酶變體的DNA分子。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通過(guò)使用上述方法選擇的酶。
本發(fā)明另外也涉及在上述方法中使用除垢劑。
本發(fā)明也涉及一些捕集器分子，例如對(duì)本發(fā)明的第一方面的方法有用的自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物。
最后，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的酶和含有這種酶的除垢劑組合物。
附圖和表的簡(jiǎn)單描述參考下面的實(shí)施例和圖將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中

圖1顯示了Savinase基因3融合的結(jié)構(gòu)、用于Savinase基因PCR的引物序列以及它們和具有下劃線的克隆位點(diǎn)的最后結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。另外，在引物上面有以小寫形式表示的由Savinase編碼的氨基酸及PCR Sav-N的有意義鏈。PCR Sav-C引物本身是從3′-5′的。
發(fā)明的詳細(xì)描述如所表明的，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及選擇適合于在除垢劑中使用的酶和酶變體的方法，其中所說(shuō)的將要選擇的酶變體在各自顯示于噬菌體微粒細(xì)胞表面上的酶變體混合物中，這種方法包括下列步驟
i)在將對(duì)酶活性有負(fù)面影響或使大多數(shù)所說(shuō)的酶變體失活的條件下以液體形式將所說(shuō)的混合物引入到除垢劑組合物中；ii)使所說(shuō)的混合物與將特異性地結(jié)合到表現(xiàn)所需特性的酶變體的捕集器分子進(jìn)行反應(yīng)，以在表現(xiàn)出所需特性的酶變體的所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體和所說(shuō)的捕集器之間形成復(fù)合物；(iii)從所說(shuō)的混合物的余下部分分離所說(shuō)的復(fù)合物；(iv)分離所說(shuō)的復(fù)合物以便分離出顯示在沒(méi)有捕集器分子時(shí)所要選擇的所說(shuō)的酶變體的細(xì)胞或噬菌體；(v)把所說(shuō)的噬菌體引入到它能夠繁殖的宿主中；或者(va)在有助于其繁殖的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞；和(vi)從所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體的基因組中分離編碼所說(shuō)的酶變體的DNA分子。
完成本發(fā)明的方法之前，必需在細(xì)胞或者噬菌體表面上表達(dá)將要研究的酶。
方便的做法是首先通過(guò)隨機(jī)誘變來(lái)誘變編碼興趣酶的DNA分子以創(chuàng)造突變的DNA分子的大群體或文庫(kù)，每一個(gè)DNA分子編碼與親本酶稍微不同的酶。由此產(chǎn)生的不同DNA分子的數(shù)量是非常大的，甚至超過(guò)109個(gè)突變體。因此，在本領(lǐng)域中這些方法是熟知的，在參考文獻(xiàn)中，Spee等(21)描述了這樣的方法。
把代表所說(shuō)的文庫(kù)的每一種DNA片段插入到細(xì)胞或者噬菌體的載體中的某一位點(diǎn)，在插入的位點(diǎn)上所說(shuō)的誘變DNA與編碼所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體的表面蛋白的DNA鄰近，并且采用的方式使得所說(shuō)的誘變DNA被表達(dá)且使相應(yīng)的酶變體在轉(zhuǎn)移到興趣細(xì)胞中時(shí)顯示在細(xì)胞或者噬菌體的表面上。這就產(chǎn)生了DNA構(gòu)建體。
這樣的表面蛋白的例子是大腸桿菌細(xì)胞表面的肽葡聚糖相關(guān)性脂蛋白、金黃色葡萄球菌的蛋白A、或者fd或者M(jìn)13絲狀噬菌體的glll蛋白。這些技術(shù)也是公知的，參考文獻(xiàn)2、3、11和22描述了這樣的方法。
然后繁殖轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞或者噬菌體的大的群體或文庫(kù)，在大的群體和文庫(kù)中每一個(gè)細(xì)胞或者噬菌體顯示一種酶變體，并且每個(gè)這種細(xì)胞或者噬菌體在它的基因組中都攜帶編碼特異性的酶變體的DNA，因此建立了細(xì)胞或者噬菌體的表型和遺傳型之間的聯(lián)系。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所表達(dá)的酶變體的數(shù)量將小于DNA突變體的數(shù)量，但是產(chǎn)生的量仍然很大。
按照本發(fā)明，在滅活大部分所說(shuō)的酶變體的條件下，尤其是在已知對(duì)親本酶的活性有害的條件下將此文庫(kù)放置在除垢劑中，和/或當(dāng)期望選擇出在檢驗(yàn)的參數(shù)方面顯示出改進(jìn)的特性的酶變體時(shí)，所說(shuō)的條件對(duì)所要檢驗(yàn)的特性具有負(fù)面影響。
對(duì)于能滅活或者對(duì)酶的特性有負(fù)面影響的條件，所說(shuō)的除垢劑可以包含氧化劑(漂白劑)、各種表面活性劑、助洗劑等，在這些條件下期望發(fā)現(xiàn)對(duì)這些試劑的影響具有更強(qiáng)抗性的酶變體，或者能夠在高溫和低溫下處理所說(shuō)的混合物，或者將其保持在一定的pH值或者離子強(qiáng)度下，這樣將會(huì)滅活親本酶或?qū)ζ滹@示出負(fù)面影響；或者如果親本酶是蛋白酶，所說(shuō)的混合物可延長(zhǎng)保留時(shí)間以便選擇出抗自體溶解的酶；或者除垢劑可以包含蛋白酶，目的是選擇出抗所說(shuō)的蛋白酶的水解活性的脂酶、纖維素酶、淀粉酶等等。
能被檢驗(yàn)的其它參數(shù)包括疏水和親水相互作用、溶劑化作用、用于底物的結(jié)合口袋、輔因子和變構(gòu)因子。所有在結(jié)構(gòu)上有微小變化的參數(shù)都可以提供變化。
在其它方面，在本發(fā)明的方法中所使用的除垢劑具有公知的組成，參照美國(guó)專利4,663,071、4,652,392、4,507,219、4,405,483、4,285,841、4,284,532、4,146,495、4,144,226、3,933,672、3,929,678、3,364,103、3,308,067、2,477,383、2,220,099、1,739,942以及德國(guó)專利申請(qǐng)DOS2,124,526，它們描述了這樣的組合物和它們的成分。
此后，把此文庫(kù)與只特異性結(jié)合到顯示的酶變體(保持了所需特性)上的捕集器分子進(jìn)行反應(yīng)，這樣的捕集器分子的例子是興趣酶活性的自殺抑制劑或者過(guò)渡態(tài)類似物。
在本文中，″自殺抑制劑″表述的意思是不可逆轉(zhuǎn)的抑制劑，其中抑制劑在溫育后共價(jià)地結(jié)合到酶上。
針對(duì)活性位點(diǎn)的不可逆轉(zhuǎn)的抑制劑和基于機(jī)制的酶抑制劑是這種抑制劑類型的具體例子。參考文獻(xiàn)1和9描述了這樣的抑制劑。
在本文中，″過(guò)渡態(tài)類似物″表述的是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在結(jié)構(gòu)上與酶促反應(yīng)的不穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)的底物部分類似。這種類型的抑制劑對(duì)酶具有非常高的親合性。參考文獻(xiàn)23和24描述了這樣的類似物。
因?yàn)楝F(xiàn)在已經(jīng)通過(guò)文庫(kù)中細(xì)胞或者噬菌體顯示的許多酶變體已經(jīng)全部或者部分地滅活，捕集器將只能和這種仍顯示所需特性的顯示酶變體進(jìn)行反應(yīng)并且形成復(fù)合物。
必須將這些復(fù)合物從余下的細(xì)胞或者噬菌體(那些不顯示所需特性，如無(wú)活性的酶變體)、除垢劑的其它成分以及與抑制劑一起加入的試劑中分離出來(lái)。
這些方法在本領(lǐng)域是公知的，如各種免疫分析方法，這些方法的參考文獻(xiàn)是參考文獻(xiàn)1和7。
完成這種分離的一種方法是使復(fù)合物結(jié)合到表面，如試管的表面、滴定板的孔或者顆粒的表面。
在一個(gè)典型的實(shí)施方案中是通過(guò)表面的吸附或者吸收進(jìn)行結(jié)合。
另一種實(shí)施方案是通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。
在這一方面，可以以各種能結(jié)合到表面的方式來(lái)改變抑制劑或者將表面激活以便結(jié)合所說(shuō)的復(fù)合物。
一種具體的方式是通過(guò)使用抗生蛋白鏈菌素處理表面和在使捕集器與文庫(kù)反應(yīng)之前將捕集器生物素化。
如果所說(shuō)的復(fù)合物已經(jīng)結(jié)合到表面上，通過(guò)使用能解離連接實(shí)體的試劑釋放所說(shuō)的噬菌體，或者如果吸附只是用來(lái)釋放復(fù)合物，那么通過(guò)消化或者解離除去捕集器。
一種方便的試劑是用于消化顯示的酶變體的特異性蛋白酶。
為了此目的而使用的試劑不能損害所說(shuō)的噬菌體，這一點(diǎn)是很重要的。
在具體的實(shí)施方案中，所說(shuō)的消化是用蛋白酶(如因子IX)來(lái)完成的。
接著顯示酶變體的噬菌體通過(guò)感染宿主來(lái)擴(kuò)增。所說(shuō)的宿主是所說(shuō)的噬菌體能夠在其中大量繁殖，進(jìn)而提供大量的用于測(cè)序的DNA的生物體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所說(shuō)的宿主是大腸桿菌的菌株DH12S。
如果酶變體已經(jīng)顯示在細(xì)胞的表面，則使細(xì)胞在有助于其增殖的條件下生長(zhǎng)。
因?yàn)槊缸凅wDNA在噬菌體或細(xì)胞基因組的位置是已知的，所以很容易分離相關(guān)的用于測(cè)序的DNA。
通過(guò)測(cè)序DNA而獲得的信息使技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出其它的DNA構(gòu)建物，這種DNA構(gòu)建物用于引入到實(shí)際生產(chǎn)所選擇的酶變體的合適宿主中，然后能用于除垢劑中。
合適的宿主通常是微生物，如細(xì)菌、酵母或者能產(chǎn)生親本酶的同一類型甚至同一菌株的真菌。這樣的宿主、把DNA引入宿主的技術(shù)、培養(yǎng)和分離酶的技術(shù)都是本領(lǐng)域公知的。
本發(fā)明的方法用于選擇在除垢劑制劑中使用的酶變體，因此這種方法經(jīng)常用于使用選自由自殺抑制劑與過(guò)渡態(tài)類似物組成的組中的捕集器的蛋白酶變體，如枯草桿菌蛋白酶，優(yōu)選的是高堿性枯草桿菌蛋白酶的選擇。
另一組興趣酶是使用選自由自殺抑制劑與過(guò)渡態(tài)類似物組成的組中的捕集器的脂酶，如真菌(如假單胞菌屬(Pseudomonas)或者木霉屬(Trichoderma)等)的脂酶，優(yōu)選的是Lipolase和其變體。
其它的興趣酶組是蛋白酶(金屬、酸性、中性或者堿性)、纖維素酶、淀粉酶、裂合酶、木聚糖酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、氧化酶、漆酶、氧化還原酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶或者過(guò)氧化物酶。材料和方法大腸桿菌菌株DH12S可從生命技術(shù)公司A/S，Roskilde(丹麥)獲得。
載體fd-tet-DOG1在參考文獻(xiàn)16中描述了這種載體的構(gòu)建。
pSX222在WO91/00345(NOVO NORDISK A/S)中描述了這種質(zhì)粒的構(gòu)建。pSX222含有編碼Savinase蛋白酶的基因。
pSX222(M222A)具有編碼氧化穩(wěn)定的變體M222A的Savinase突變基因的pSX222(在EP396 608B1中描述的)pSX581在WO96/17943(NOVO NORDISK A/S)中描述了這種質(zhì)粒的構(gòu)建。pSX581含有編碼Lipolase脂酶的基因。
pSX581(D96L)具有編碼LipolaseD96L Dobanol25-7穩(wěn)定性變體的突變基因的pSX581(在WO92/05249中描述的)限制酶如果未作具體說(shuō)明，所有的限制性酶均來(lái)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，Beverly，MA，美國(guó)。
捕集器使用了命名為″自殺-Sav-l″的自殺抑制劑。抑制劑的式子如下
也使用了另一種命名為″自殺-Lip-i″的自殺抑制劑。自殺-Sav-l抑制劑具有膦酸酯的不可逆轉(zhuǎn)抑制劑類型(Bjrkling F.等“通過(guò)膦酸酯抑制脂酶”，生物有機(jī)和藥物化學(xué)2697-705(1994))，且有如下式子
其中L是離去基團(tuán)，如鹵素(如Cl)或?qū)?硝基苯基，R是具有1至20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，如乙基或者類似二脂酰甘油酯的基團(tuán)。標(biāo)記是能用于識(shí)別/鑒別和選擇性固定化的基團(tuán)或化合物，如生物素或地谷新配基，其中的生物素是親水的，而地谷新配基是疏水的標(biāo)記。
寡核苷酸的合成所有寡核苷酸引物都是在ABI394 DNA/RNA合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，F(xiàn)oster市，CA，美國(guó))上合成的。
DNA測(cè)序所有DNA的測(cè)序都是在ABI373A型DNA序列分析儀上按照Tag DyeDeoxyTM終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒的ABI 2x Taq方案來(lái)進(jìn)行的。
fd-Sav噬菌體的鑒定ELISA使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA技術(shù)，檢測(cè)酶噬菌體的結(jié)合。
簡(jiǎn)言之，用100ml捕集器溶液(PBS中的10mg/ml的抗生蛋白鏈菌素或者在兔子中針對(duì)在Novo Nordisk A/S制備的Savinase產(chǎn)生的多克隆抗體)在4℃下涂敷微量滴定板(Maxisorp，Nunc)的孔過(guò)夜，然后在37℃用含有2％的脫脂奶粉(Difco)的PBS封閉2小時(shí)。
把直接取自于噬菌體制劑(為了用于以多克隆抗體作為捕集器的ELISA中)的噬菌體或者結(jié)合到生物素化的自殺抑制劑上并按上述方法洗滌的噬菌體(為了用于以抗生蛋白鏈菌素作為捕集器的ELISA中)的封閉溶液的系列稀釋液加入到孔中，并且在室溫下振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)。
利用含有0.05％Tween-20的PBS在不同步驟間進(jìn)行洗滌。
使用過(guò)氧化物酶綴合的兔-抗-M13多克隆抗體(Pharmacia)來(lái)測(cè)定結(jié)合，接著按照廠商的說(shuō)明使用正亞苯基二胺(DAKO)檢測(cè)。
使檢測(cè)反應(yīng)持續(xù)10-30分鐘，然后加入50ml的2M H2SO4停止反應(yīng)在微量滴定板讀數(shù)器上于OD490下讀取平板。
fd-Lip噬菌體的定性通過(guò)下面描述的ELISA分析方法表明噬菌體的脂酶活性來(lái)定性fd-Lip酶噬菌體。
ELISA微量滴定板分析原理用甘油三酯和對(duì)-硝基苯基-脂肪酸(pNP-FA)的混合物覆蓋ELISA板孔的壁。這種方法是基于pNP-FA中的酯鍵的水解導(dǎo)致對(duì)-硝基苯酚(黃色)釋放到上清液中并且在ELlSA讀數(shù)器上監(jiān)視顏色的顯現(xiàn)。
儀器UV最大動(dòng)力微板讀數(shù)器(Molecular Device)底物溶液溶解在己烷中的0.5mM油酸甘油酯(Sigma 1-7140)溶解在己烷中的0.5mM棕櫚酸對(duì)-硝基苯酯(Sigma N-2752)溶解在96％乙醇中的0.5mM橄欖油溶解在96％乙醇中的0.5mM辛酸對(duì)-硝基苯酯緩沖液0.16M Tris，pH9方法把100μl的底物混合物轉(zhuǎn)移到每一個(gè)孔中，并且使有機(jī)內(nèi)含物蒸發(fā)。把125μl的緩沖液和75μl的fd-Lip噬菌體酶(按在實(shí)施例5中描述的方法制備的)加入到孔中。把微量滴定板放置在ELISA讀數(shù)器中，記錄顏色的顯現(xiàn)。
在這種ELISA脂酶微量滴定分析中，fd-Lip和fd-Lip(D96L)酶噬菌體所顯示的脂酶活性都完全高于fd噬菌體的對(duì)照水平。這表明fd-Lip噬菌體具有脂酶活性。
實(shí)施例實(shí)施例1fd-Sav和fd-Sav M222A的構(gòu)建把Pro-Mature Savinase基因克隆到載體fd-tet-DOG1中的Apa LI和Notl位點(diǎn)。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用圖1所示的引物制備插入片段，并且其衍生于pSX222。設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用以產(chǎn)生在基因的5′末端存在ApaLI限制性位點(diǎn)和在3′末端存在Notl限制位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。寡核苷酸引物的序列是PCRSaV-N5′-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GCT GAA GAAGCA AAA GAA AAA TAT TTA ATT GGC-3′PC RSav-C5′-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTCAAT CCC ACG CGT TGC CGC TTC TGC GTT AAC-3′使用具有30個(gè)循環(huán)(由92℃1分鐘、50℃2分鐘和72℃3分鐘構(gòu)成)的Perkin Elmer Cetus DNA熱循環(huán)儀480在含有各250mM dNTP、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.01％明膠、0.25單位/ml的Taq聚合酶(Cetus/Perkin Elmer)和0.5ng/ml的pSX222模板的100ml的10mM Tris-HCL(pH8.3)中進(jìn)行PCR。這樣衍生的構(gòu)建物稱為fd-Sav。通過(guò)測(cè)序檢驗(yàn)fd-Sav中的插入片段。
在上述的PCR反應(yīng)中除了使用pSX222(M222A)作為模板外，利用和構(gòu)建fd-Sav相同的方法完成fd-Sav M222A的構(gòu)建。實(shí)施例2fd-Sav噬菌體酶的制備37℃下在含有15mg/ml四環(huán)素的2X TY中把含有fd-Sav或者fd-Sav(M222A)的大腸桿菌DH12S細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)?；旧习凑諈⒖嘉墨I(xiàn)10中所述的方法制備濃縮的噬菌體。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)離心(10,000r.p.m.，8×50ml轉(zhuǎn)頭，Sorval RC-SB離心機(jī)15-20分鐘)澄清噬菌體酶培養(yǎng)物。通過(guò)加入1/5體積的20％聚乙二醇、2.5M NaCl在4℃，沉淀出噬菌體放置1小時(shí)，并且離心(同上)。把噬菌體沉淀物在10mM Tris-HCl，pH8.0中再懸浮到原來(lái)體積的1/100，在4℃下使用微型離心機(jī)通過(guò)兩步離心(在12000r.p.m.每次5-10分鐘)除去剩余的細(xì)菌和聚集的噬菌體。實(shí)施例3fd-SavM222A噬菌體的選擇為了建立反應(yīng)條件，在1.5ml的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5)中再懸浮250ml培養(yǎng)物中的fd-Sav噬菌體的PEG沉淀物以達(dá)到每毫升大約1011TU，并且用Millex-GV(0.22mm)過(guò)濾。把溶于25ml DMSO中的0.3mg抑制劑加入到500ml的這種溶液中。在整個(gè)培養(yǎng)中通過(guò)提取樣品并且測(cè)量對(duì)下列底物Suc-ala-ala-pro-phe-pNA(SIGMA，St.Louis，Mo美國(guó))的蛋白酶活性來(lái)監(jiān)視Savinase活性的喪失。
在fd-Sav噬菌體的抑制作用的基本條件建立后，將一些上述制備的噬菌體(fd-tet-DOG1，fd-SavM222A，fd-Sav)用來(lái)制造預(yù)先確定的混合物。
在含有漂白劑的除垢劑中培養(yǎng)450ml的噬菌體混合物(1011-1012TU/ml)30分鐘(含有漂白劑的除垢劑包含氧化性的化學(xué)藥品，詳見(jiàn)EP396.608)。向噬菌體混合物中加入50ml 10％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)溶液，然后加入生物素化的自殺抑制劑至濃度為(0.5)mM。使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。通過(guò)加入200ml PEG-NaCl溶液和離心沉淀出噬菌體。把沉淀物再懸浮在500ml的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中，并再次經(jīng)PEG沉淀。重復(fù)上述過(guò)程，最后把沉淀物再懸浮在1.1ml含有2％(W/V)無(wú)脂肪的干燥奶粉(MPBS)的PBS緩沖液中。
利用免疫管(immunotubes)(Nunc 3.5ml體積)或者微量滴定孔板(Nunc140ml體積)進(jìn)行使用抗生蛋白鏈菌素作為捕集器的實(shí)際結(jié)合選擇。在選擇之前，將具有以100mg/ml的濃度存在于PBS中的抗生蛋白鏈菌素的管或孔在4℃培養(yǎng)過(guò)夜，并且用含有2％脫脂奶粉和0.05％Tween-20(Merck)的PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4x7H2O，1.4mM KH2PO4，pH7.4)封閉。
將結(jié)合的噬菌體和生物素化的抑制劑結(jié)合1-2小時(shí)，其后以10倍體積的PBS和10倍體積的含有0.05％Tween-20的PBS徹底洗滌(至少10次)。
為了洗脫，將結(jié)合的噬菌體再懸浮在1ml 50mM TrisHCl、100mM NaCl、1mMCaC12緩沖液，pH8(TNCB)中。在室溫和溫和振蕩下通過(guò)分別用免疫管和微量滴定板孔與10mg的因子X(jué)a3至18小時(shí)洗脫噬菌體。
洗脫的噬菌體用于感染大腸桿菌菌株DH12S以制備用于另一輪選擇的噬菌體(50ml指數(shù)增長(zhǎng)的噬菌體在30-37℃放置過(guò)夜以繁殖噬菌體)。
在多次選擇循環(huán)之后，獲得fd-SavM222A的噬菌體的有效選擇是可能的，與fd-Sav噬菌體相比，fd-SavM222A對(duì)氧化是穩(wěn)定的(EP396.608B1)。優(yōu)選的fdSavM222A/fd-Sav選擇比大于8；更優(yōu)選的大于10；甚至更優(yōu)選的大于20。
一般地，較多次數(shù)的選擇通常將給出較顯著的選擇結(jié)果(較高的選擇數(shù)量)。實(shí)施例4fd-Lip和fd-Lip(D96L)噬菌體的構(gòu)建除了PCR引物是PCRLip-N和PCRLip-C(參見(jiàn)以下)，并且PCR反應(yīng)是在pSX581(為構(gòu)建fd-Lip)或pSX581(D96L)(為構(gòu)建fd-Lip(D96L))上進(jìn)行之外，基本上如構(gòu)建fd-Sav的描述(實(shí)施例1)，把成熟的Lipolase基因克隆到載體fd-tet-DOG1的Apa Ll和Notl位點(diǎn)中。PCRLip-N5′-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GAG GTC TCGCAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC-3′PCRLip-C5′-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTCAAT CCC AAG ACA TGT CCC AAT TAA CCC GAA GTA CC-3′實(shí)施例5fd-Lip噬菌體酶的制備除了大腸桿菌DH12S細(xì)胞現(xiàn)在含有fd-iip或者fd-Lip(D96L)外，按照如構(gòu)建fd-Sav的描述(實(shí)施例2)制備fd-Lip噬菌體酶。實(shí)施例6fd-LipD96L噬菌體的選擇為建立反應(yīng)條件，在1.5ml的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5)中再懸浮250ml培養(yǎng)物中的fd-Sav噬菌體的PEG沉淀物以達(dá)到每毫升1011TU，并且用Millex-GV(0.22mm)過(guò)濾。把Dobanol25-7以逐漸增加的量加入到500ml的這種溶液中(Dobanol25-7是非離子表面活性劑)。在整個(gè)培養(yǎng)中通過(guò)提取樣品并且測(cè)量對(duì)C-12脂肪酸月桂酸底物的蛋白酶活性來(lái)監(jiān)視Savinase活性的喪失。
在fd-Lip噬菌體抑制劑的基本條件建立后，將一些上述制備的噬菌體(fd-tet-DOG1，fd-LipD96L，fd-Lip)用來(lái)制造預(yù)先確定的混合物。
在含有一定量(只是需要滅活fd-Lip噬菌體(參見(jiàn)以上))的Dobanol 25-7的除垢劑中培養(yǎng)450ml的噬菌體混合物(1011-1012TU/ml)30分鐘。向噬菌體混合物中加入50ml 10％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)溶液，然后加入生物素化的自殺抑制劑至濃度為(0.5)mM。使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。通過(guò)加入200mlPEG-NaCl溶液和離心沉淀出噬菌體。把沉淀物再懸浮在500ml的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.0)中，并再次經(jīng)PEG沉淀。重復(fù)上述過(guò)程，最后把沉淀物再懸浮在1.1ml含有2％(W/V)脫脂干燥奶粉(MPBS)的PBS緩沖液中。
使用免疫管(Nunc 3.5ml體積)或者微量滴定孔板(Nunc 140ml體積)進(jìn)行以抗生蛋白鏈菌素作為捕集器的實(shí)際結(jié)合選擇。在選擇之前，將具有以100mg/ml的濃度存在于PBS中的抗生蛋白鏈菌素的管或孔在4℃培養(yǎng)過(guò)夜，并且用含有2％脫脂奶粉和0.05％Tween-20(Merck)的PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4x7H2O，1.4mMKH2PO4，pH7.4)封閉。
將結(jié)合的噬菌體和生物素化的抑制劑結(jié)合1-2小時(shí)，其后以10體積的PBS和10倍體積的含有0.05％Tween-20的PBS徹底洗滌(至少10次)。
為了洗脫，結(jié)合的噬菌體再懸浮在1ml 50mM TrisHCl、100mMNaCl、1mMCaC12緩沖液，pH8(TNCB)中。在室溫和溫和振蕩下通過(guò)分別用免疫管和微量滴定板孔與10mg的因子X(jué)a3至18小時(shí)洗脫噬菌體。
洗脫的噬菌體用于感染大腸桿菌菌株DH12S以制備用于另一輪選擇的噬菌體(50ml指數(shù)增長(zhǎng)的噬菌體在30-37℃放置過(guò)夜以繁殖噬菌體)。
在多次選擇循環(huán)之后，獲得fd-LipD96L噬菌體的有效選擇是可能的，與fd-Lip相比，fd-LipD96L對(duì)Dobanol25-7是穩(wěn)定的(WO92/05249)。優(yōu)選的fd-LipD96/fd-Lip選擇比大于8；更優(yōu)選的大于10；甚至更優(yōu)選的大約20。
一般地，較多次數(shù)的選擇通常將給出較顯著的選擇結(jié)果(較高的選擇數(shù)量)。
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權(quán)利要求
1.一種選擇適合于在除垢劑中使用的酶或者酶變體的方法，其中所說(shuō)的將要選擇的酶變體在各自顯示于噬菌體微粒細(xì)胞表面上的酶變體混合物中，這種方法包括下列步驟i)在將對(duì)酶活性有負(fù)面影響或使大多數(shù)所說(shuō)的酶變體失活的條件下以液體形式將所說(shuō)的混合物引入到除垢劑組合物中；ii)使所說(shuō)的混合物與將特異性地結(jié)合到表現(xiàn)所需特性的酶變體的捕集器分子進(jìn)行反應(yīng)，以在表現(xiàn)出所需特性的酶變體的所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體和所說(shuō)的捕集器之間顯示形成復(fù)合物；(iii)從所說(shuō)的混合物的余下部分分離所說(shuō)的復(fù)合物；(iv)解離所說(shuō)的復(fù)合物以便分離出顯示在沒(méi)有捕集器分子時(shí)所要選擇的所說(shuō)的酶變體的細(xì)胞或噬菌體；(v)把所說(shuō)的噬菌體引入到它能夠繁殖的宿主中；或者(va)在有助于其繁殖的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞；和(vi)從所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體的基因組中分離編碼所說(shuō)的酶變體的DNA分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的除垢劑包含漂白系統(tǒng)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟(ii)中所說(shuō)的條件包括在高溫或低溫下處理。
4.權(quán)利要求1至3任一之方法，其中在步驟(iii)中所說(shuō)的分離是通過(guò)將所說(shuō)的復(fù)合物結(jié)合到一個(gè)表面上來(lái)完成的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的結(jié)合是吸附。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的結(jié)合是共價(jià)結(jié)合。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所說(shuō)的抑制劑被改性以能夠結(jié)合到所說(shuō)的表面上。
8.權(quán)利要求4至7的方法，其中所說(shuō)的表面被激活以便結(jié)合所說(shuō)的復(fù)合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞表面使用抗生蛋白鏈菌素處理，并且所說(shuō)的抑制劑是生物素化的。
10.權(quán)利要求1至9任一之方法，其中步驟(iv)所說(shuō)的消化是用蛋白酶如因子IX完成的。
11.權(quán)利要求1至10任一之方法，其中所說(shuō)步驟(v)的宿主是細(xì)菌，例如大腸桿菌，尤其是菌株DH12S。
12.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶，優(yōu)選的是高堿性的枯草桿菌蛋白酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
14.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是脂酶。
15.權(quán)利要求14的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
16.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是纖維素酶。
17.權(quán)利要求16的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
18.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是氧化還原酶。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
20.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是淀粉酶。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
22.權(quán)利要求1至11任一之方法，其中所說(shuō)的酶是裂合酶、木聚糖酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、氧化酶、漆酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶或者過(guò)氧化物酶。
23.權(quán)利要求22的方法，其中在步驟(ii)所說(shuō)的捕集器是選自由自殺抑制劑和過(guò)渡態(tài)類似物組成的組。
24.一種酶，這種酶是通過(guò)使用前面任一之權(quán)利要求的方法選擇的。
25.一種除垢劑組合物，這種除垢劑組合物包含按照權(quán)利要求24的酶。
全文摘要
本文涉及鑒定適合用于除垢劑中的酶的方法,尤其是在通過(guò)隨機(jī)誘變創(chuàng)造的大量變體中選擇特異性的酶變體的方法。這種方法包括將要選擇的酶變體在各自顯示于噬菌體微粒細(xì)胞表面上的酶變體混合物中;和(i)在將對(duì)酶活性有負(fù)面影響或使大多數(shù)所說(shuō)的酶變體失活的條件下把混合物引入到除垢劑組合物中;(ii)使所說(shuō)的混合物與將特異性地結(jié)合到表現(xiàn)所需特性的酶變體的捕集器分子進(jìn)行反應(yīng);(iii)從所說(shuō)的混合物的余下部分分離所說(shuō)的復(fù)合物;(iv)解離所說(shuō)的復(fù)合物以便分離出顯示所說(shuō)的酶變體(沒(méi)有捕集器分子)的細(xì)胞或噬菌體;(v)把所說(shuō)的噬菌體引入到它能夠繁殖的宿主中;或者(va)在有助于其繁殖的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞;(vi)從所說(shuō)的細(xì)胞或者噬菌體的基因組中分離編碼所說(shuō)的酶變體的DNA分子;和(vii)確定所說(shuō)的DNA分子的序列。本發(fā)明還描述了用于所說(shuō)的方法的特異性的材料、通過(guò)使用所說(shuō)的方法選擇的酶以及包含所說(shuō)的酶的除垢劑組合物。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1196094SQ9619680
公開日1998年10月14日 申請(qǐng)日期1996年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月7日
發(fā)明者P·馬克瓦德森, M·E·布約恩瓦德, F·米凱爾森, B·狄德里克森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司