專利名稱：在酵母細胞中表達n-末端延伸蛋白質(zhì)的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在真核細胞(優(yōu)選的是酵母細胞)中表達和加工的多肽，含有編碼這種多肽之DNA序列的構(gòu)建體、攜帶所說的DNA片段的載體、用這種載體轉(zhuǎn)化的細胞(包括酵母細胞)、在酵母中產(chǎn)生異源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
酵母有機體能夠產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)合成，但在細胞外發(fā)生作用。這種胞外蛋白質(zhì)被稱作為分泌蛋白質(zhì)。這些分泌蛋白質(zhì)最初是在細胞內(nèi)部以含有前序列的前體或者前體形式(pre-form)表達，所說的前序列可以確保表達的產(chǎn)物通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜有效的分泌。這種通常稱為信號肽的前序列一般在轉(zhuǎn)移期間從所需要的產(chǎn)物中切割下來。進入分泌途徑后，所說的蛋白質(zhì)被運輸?shù)礁郀柣w中。從高爾基體中這種蛋白質(zhì)可以通過不同的途徑進入細胞的一定區(qū)室(如液泡或者細胞膜)，或者將這種蛋白質(zhì)分泌到細胞外的基質(zhì)中(Pfeffer，S.R.and Rothman，J.E.生物化學年度終述56(1987)，829-852。
一些研究報告已經(jīng)表明，異源蛋白質(zhì)可以在酵母中表達和分泌。歐洲出版物0088632A中描述了一種可以在酵母中表達、加工和分泌異源蛋白質(zhì)的方法，這是通過用含有編碼所需要的蛋白質(zhì)和信號肽之DNA的表達載體轉(zhuǎn)化酵母有機體、制備轉(zhuǎn)化的有機體培養(yǎng)物、培養(yǎng)所說的培養(yǎng)物并從培養(yǎng)基中回收所說的蛋白質(zhì)來完成的。所說的信號肽可以是所需要的蛋白質(zhì)本身的信號肽、異源信號肽或者天然和異源信號肽的雜交體。
在酵母中使用異源信號肽的問題是所說的異源信號肽不能確保信號肽后邊的前體多肽的有效轉(zhuǎn)移和/或切割。
以165個氨基酸的前原體形式合成釀酒酵母MFα1(α-因子)，其包含19個氨基酸長的信號或前肽，之后是64個氨基酸長的“前導”或原肽(其包含3個與N連接的糖基化位點，之后是(LysArg(Asp/Glu，Ala)2-3α-因子)4(Kurjan，J.和Herskowitz，I.細胞30(1982)，933-943))。已經(jīng)廣泛地使用了前原MFα1的信號-前導部分以便使異源蛋白質(zhì)在釀酒酵母中合成并分泌。
有關(guān)異源信號/前導肽在酵母中的使用可以在沒有提到的(i.a.)美國專利4,546,082、歐洲出版物0116201A、0123294A、0123544A、0163529A、0123289A和歐洲專利0100561B中獲得。
在EP0123289A中描述了釀酒酵母α-因子前體的使用，而EP100561中描述了釀酒酵母PH05信號的使用，PCT公開WO95/02059描述了YAP3信號肽用于外源蛋白分泌的情況。
美國專利4,546,082和歐洲出版物0016201A、0123294A、0123544A和0163529A描述了在酵母中表達的異源蛋白質(zhì)的分泌過程中使用釀酒酵母α-因子信號-前導肽(MFαl或者MFα2)的方法。通過將編碼釀酒酵母MFαl/前導序列的DNA序列融合到所需要蛋白質(zhì)之基因的5’末端，來顯示所需要蛋白質(zhì)的分泌和加工。
EP206783描述了釀酒酵母多肽的分泌的系統(tǒng)，因此將α-因子前導序列截短以便除去四個存在于天然前導序列中的α-因子肽，這樣就可以使得所說的前導肽本身通過α-因子加工位點Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala融合到異源多肽中。已表明這一構(gòu)建可以導致有效的加工以便產(chǎn)生更小的肽(少于50個氨基酸)。為了分泌和加工更大的多肽，已經(jīng)將天然的α-因子前導序列截短，在前導肽和多肽之間留下一個或兩個α-因子肽。
將大量的分泌蛋白質(zhì)運輸?shù)娇梢员┞对诘鞍姿饧庸は到y(tǒng)的地方，所說的系統(tǒng)可以切割羧基末端兩個連續(xù)堿性氨基酸之間的肽鍵。在釀酒酵母中這種酶促活性是由KEX2基因編碼的(Julius，D.A.et al.，Cell37(1984b)，1075)。KEX2蛋白酶加工所說的產(chǎn)物需要活性釀酒酵母匹配因子α1(MFαl或者α-因子)的分泌，但與活性釀酒酵母匹配因子α的分泌無關(guān)。
在有些情況下，當培養(yǎng)用如上文參考文獻所述的方法構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化的酵母有機體時，可以使將要分泌的多肽分泌并正確地加工。然而，在很多情況下分泌水平很低或者沒有分泌，或者蛋白水解加工不正確或不完全。如PCT公開WO90/10075所述，這在一定程度上是因為位于前導肽C-末端和所說的異源蛋白質(zhì)N-末端之間的加工位點不能充分暴露，結(jié)果是蛋白的水解切割無法進行，或者至少是進行得不充分。
WO90/10075描述了異源多肽加工已經(jīng)改進的酵母表達系統(tǒng)，這是通過在前導肽C-末端和/或融合到所說的前導肽的異源多肽的N-末端的加工位點附近進行某些修飾來完成的。這樣，與未修飾的前導肽-異源多肽構(gòu)建相比，可能獲得高產(chǎn)量的正確加工的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是提供一種新型的融合到所說的前導肽上的異源多肽的N末端修飾，所說的前導肽能夠確保異源多肽N末端延伸序列進行更有效的表達和/或加工以及改進其在體外的除去。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了所說的異源多肽的N-末端修飾，這種多肽被設(shè)計成含有延伸序列，所說的延伸序列可以在從培養(yǎng)基中純化此產(chǎn)物的過程中或之后通過體外蛋白水解而切割掉。
本發(fā)明涉及編碼多肽的DNA構(gòu)建體，所說的多肽具有下列結(jié)構(gòu)信號肽-前導肽-EEAEPK-異源蛋白質(zhì)。
在整個說明書和權(quán)利要求中，使用按照生化命名IUPAC-IUB委員會批準的規(guī)則(1974)的常規(guī)的氨基酸一個字母代碼。
在本文中，術(shù)語＂信號肽＂應該理解成為是指以N-末端序列存在于在酵母中表達的細胞外蛋白質(zhì)前體形式上的前序列。所說的信號肽的功能是使將要分泌的異源蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。通常在這一過程中切除此信號肽。所說的信號肽對產(chǎn)生此蛋白的酵母有機體來說可以是異源的也可以是同源的。在本發(fā)明中優(yōu)選的信號肽是酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽或者它的任何功能類似物。Egel-Mitani M.等(酵母6p.127-137，1990)已經(jīng)克隆了YAP3并確定了其性質(zhì)。
術(shù)語＂前導肽＂應該理解為前肽序列形式的肽，它的功能是使將要分泌的異源蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接進入高爾基體中并進入到分泌泡以便分泌到培養(yǎng)基中(即表達的蛋白質(zhì)或多肽通過細胞膜和細胞壁(如果存在)或至少通過細胞膜進入具有細胞壁的細胞的周質(zhì)空間)。優(yōu)選的前導肽是如本文SEQ IDNo.5所公開的LA19前導肽。
術(shù)語＂異源蛋白質(zhì)＂是指不是由宿主有機體天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者多肽，優(yōu)選的為不是由酵母天然產(chǎn)生的多肽。然而，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在哺乳動物細胞中產(chǎn)生異源多肽(如胰高血糖素)是顯而易見的，并且所說的多肽也包括在“異源蛋白質(zhì)”中。
序列EEAEPK在所說的異源多肽的N-末端形成突出端。此突出端不僅增加了發(fā)酵產(chǎn)量，而且也保護其免受二肽基氨肽酶(DPAP A)加工，結(jié)果產(chǎn)生此多肽的同質(zhì)的N-末端。以這樣的方式構(gòu)建此突出端，可以使其在發(fā)酵過程中抵抗蛋白水解切割作用，結(jié)果，例如可以通過胰蛋白酶或者水解無色桿菌蛋白酶I從用于接下來體外成熟的培養(yǎng)基中純化N-末端延伸的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物。大概是由于所說的N-末端延伸肽的靈活性，可以很容易地通過胰蛋白酶或者水解無色桿菌蛋白酶I來體外除去N-末端突出端EEAEPK，結(jié)果提高了成熟的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
本發(fā)明還涉及能夠在真核細胞(優(yōu)選的是酵母細胞)中復制的重組表達載體，此載體還攜帶了本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選地，所說的DNA構(gòu)建體包含合成的前導肽，優(yōu)選的是LA19前導肽。此外，本發(fā)明涉及本文圖2描述的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明也涉及能夠表達異源蛋白質(zhì)并可以用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的真核細胞，優(yōu)選的是酵母細胞。
此外，本發(fā)明涉及在酵母中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的酵母菌株，以便使所說的異源蛋白質(zhì)表達并分泌，之后從培養(yǎng)基和/或細胞中分離所說的蛋白質(zhì)。
附圖的簡要描述參照附圖進一步說明本發(fā)明，其中

圖1顯示出包含表達本發(fā)明的N-末端延伸多肽的基因的表達質(zhì)粒pAK729，并使用了下列符號TPI-PROMOTER是指釀酒酵母的TPI基因啟動子序列。
2指編碼信號/前導肽的區(qū)域(如來源于與EEAEPK N-末端延伸MI3胰島素前體結(jié)合的YAP3信號肽和LA19前導肽)。
TPI-TERMINATOR指釀酒酵母TPI基因終止子序列。
TPI-POMBE指粟酒裂殖酵母-1的TPI基因。
起點指釀酒酵母2μ質(zhì)粒的序列，包括它在釀酒酵母中的DNA復制起點。
AMP-RpBR322/pUC13的序列，包括氨芐青霉素抗性基因和大腸桿菌的DNA復制起點。
SEQ ID NO1是pAK729中編碼YAP3信號肽(氨基酸1-21)、LA19前導肽(氨基酸22-64)、N-末端突出端EEAEPK(氨基酸65-70)、MI3胰島素前體B鏈(1-29)-Ala-Ala-Lys-A鏈(氨基酸1-21)(氨基酸71-123)的DNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO2是pAK733的編碼實施例2的YAP3信號肽-LA19前導肽EEAEPK-MI1胰島素前體復合物的DNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO3是pAK749的編碼實施例3的YAP3信號肽-LA19前導肽EEAEPK-MI5胰島素前體復合物的DNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO4是pAK866的編碼實施例4的YAP3信號肽-LA19前導肽EEAEPK-X14胰島素前體復合物的DNA和氨基酸序列。
SEQ ID NO4是LA19前導肽DNA序列。
本發(fā)明的詳細描述通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的N-末端延伸異源蛋白質(zhì)可以是任何便于在真核細胞(優(yōu)選的是酵母細胞)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的例子是抑蛋白酶肽、組織因子途徑抑制劑或者其它的蛋白酶抑制劑、胰島素或者胰島素前體、胰島素類似物、類胰島素生長因子I或II、人或牛生長激素、白介素、組織纖溶酶原激活物、轉(zhuǎn)化生長因子a或者b、胰高血糖素、類胰高血糖素肽1(GLP-1)、類胰高血糖素肽2(GLP-2)、GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板衍生生長因子、酶(如脂酶)或者這些蛋白任何一種的功能類似物。在本文中，術(shù)語＂功能類似物＂是指與所說的天然蛋白質(zhì)具有類似的功能的多肽(這里應理解為是指天然蛋白質(zhì)的本質(zhì)，而不是指其生物活性水平)。所說的多肽可以在結(jié)構(gòu)上與天然蛋白質(zhì)相似，可以由天然蛋白質(zhì)通過將一個或多個氨基酸加入到此天然蛋白質(zhì)C-和N-末端或者只加入到一端、在天然氨基酸序列的一個或多個不同位點上取代一個或多個氨基酸、在此天然蛋白質(zhì)的一端或兩端或者在此氨基酸序列的一個或幾個位點上缺失一個或多個氨基酸、或者在此天然氨基酸序列的一個或多個位點上插入一個或多個氨基酸而產(chǎn)生。這樣的修飾對于幾種上述蛋白質(zhì)是熟知的。
＂胰島素前體＂或者“胰島素類似物前體”應該理解成為單鏈多肽(包括胰島素原)，這種多肽通過后面的一個或多個化學和/或酶促加工可以轉(zhuǎn)化成為具有正確的如在天然人類胰島素中發(fā)現(xiàn)的3個二硫橋結(jié)構(gòu)的雙鏈胰島素或者胰島素類似物分子?？梢砸源朔绞疆a(chǎn)生的胰島素或者胰島素類似物的例子是人類胰島素(優(yōu)選的是des(B30)人胰島素、豬胰島素、至少含有一個Lys或者Arg的胰島素類似物，優(yōu)選的是PheB1已經(jīng)缺失的胰島素類似物、A-鏈和/或B鏈具有N-末端突出端的胰島素類似物、A-鏈和/或B鏈具有C-末端突出端的胰島素類似物。其它優(yōu)選的胰島素類似物是其中的一個或多個氨基酸殘基(優(yōu)選的是它們中的一個、兩個或三個)已經(jīng)由另一個密碼氨基酸殘基取代的胰島素類似物。這樣在A21位置上親本胰島素可以由選自下組的氨基酸殘基取代AsnAla、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特別是選自下組的氨基酸殘基Gly、Ala、Ser、和Thr。也可以通過將上述變化組合在一起來修飾胰島素類似物。同樣地，在位置B28上可以取代親本胰島素Pro的氨基酸殘基可以是選自下組的氨基酸殘基Asp、Lys等等；在位置B29上可以取代親本胰島素Lys的氨基酸殘基可以是Pro。本文所用的“密碼氨基酸殘基”是指可以由遺傳密碼(即核苷酸的三聯(lián)密碼(“密碼子”))編碼的氨基酸殘基。
最優(yōu)選的胰島素前體是MI1、B(1-29)-A(1-21)；MI3、B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(如在EP163 529中所述)；X14、B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(如在PCT公開95/00550中所述)；B(1-27-Asp-Lys)-A(1-21)；B(1-27-Asp-Lys)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21)；B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)(如在PCT公開95/07931中所述)；MI5、B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21)；和B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)。
可以通過標準的合成方法制備編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，所說的方法如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在“四面體通訊”22，1981，pp.1859-1869中描述的phosphoamidite方法，或者由Matthes等，EMBO雜志3，1984，pp.801-805描述的方法。按照phosphoamidite方法，例如可以在自動DNA合成儀上合成寡核苷酸，并將寡核苷酸純化、變成雙鏈并連接成合成的DNA構(gòu)建體。目前制備這種DNA構(gòu)建體優(yōu)選的方法是通過聚合酶鏈反應(PCR)，如Sambrook等在“分子克隆”，實驗室手冊，冷泉港，NY，1989中描述的。
本發(fā)明DNA構(gòu)建體也可以是基因組或者cDNA起源，例如通過制備基因組或cDNA文庫、使用合成寡核苷酸探針按照標準方法(參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗室手冊，冷泉港，1989)經(jīng)雜交篩選編碼本發(fā)明多肽全部或部分的DNA序列來獲得。在這種情況下，可以將編碼信號和前導肽的基因組或cDNA序列與編碼異源蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列連接起來，之后在相應于所說多肽的氨基酸序列EEAEPK的位點上按照公知的方法通過插入編碼同源重組所需的氨基酸序列的合成寡核苷酸來修飾所說的DNA序列，優(yōu)選的是使用合適的寡核苷酸通過PCR產(chǎn)生所需的序列。
最后，所說的DNA構(gòu)建體可以是通過將合成的、基因組或的cDNA起源(合適的)的片段、相當于全部DNA構(gòu)建體各部分的片段按照標準的技術(shù)退火而制備而成的混合型合成和基因組、混合型合成和cDNA、或者混合型基因組和cDNA起源的。這樣，可以理解編碼所說的異源蛋白質(zhì)的DNA序列可以是基因組或cDNA起源的，而編碼所說的信號及前導肽的序列以及編碼N-末端突出端EEAEPK的序列可以是通過合成的方法制備的。
在一個方面，本發(fā)明涉及能夠在酵母中復制并且攜帶編碼上文限定的多肽的DNA構(gòu)建體的重組表達載體。所說的重組表達載體可以是在酵母有機體中能夠復制的任何載體。在此載體中，所說的編碼本發(fā)明多肽的DNA序列可以可操作性地與合適的啟動子序列連接。所說的啟動子可以是任何在酵母中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可來源于編碼酵母同源或異源蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選的是啟動子來源于編碼酵母同源蛋白質(zhì)的基因。合適的啟動子的例子是釀酒酵母Mα1、TPI，ADH或者PGK啟動子。
編碼本發(fā)明多肽的DNA序列也可以可操作性地與合適的終止子連接，如TPI終止子(參見T.Alber和G.Kawa-saki，分子應用遺傳學，1，1982，pp.419-434)。
本發(fā)明的重組表達載體包含能夠使載體在酵母中復制的DNA序列。這種序列的例子是酵母質(zhì)粒2μ復制基因REP1-3和復制起點。此載體也可以包含選擇標記，如P.R.Russell在“基因40”(1985，pp.125-130)中描述的粟酒裂殖酵母-1TPI基因。
用于將編碼本發(fā)明多肽的DNA序列、啟動子和終止子分別連接的方法以及將它們插入到含有酵母復制所需信息的合適的酵母載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(例如參見Sambrook等op.cit.)。應該理解，可以通過首先制備含有編碼本發(fā)明多肽的全部DNA序列的DNA構(gòu)建體，然后將此片段插入到合適的表達載體中來構(gòu)建所說的載體，或者通過將含有各個元件(如信號肽、前導肽或者異源蛋白質(zhì))之遺傳信息的DNA片段依次插入，然后進行連接來構(gòu)建所說的載體。
用于本發(fā)明方法中的酵母有機體或者真核宿主細胞可以是任何在培養(yǎng)中產(chǎn)生大量所說的異源蛋白質(zhì)或多肽的合適的酵母有機體。合適的酵母有機體的例子可以是下列酵母類的菌株釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母-1、葡萄汁酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、克魯弗畢赤酵、Yarrowia lipolytica、念珠菌屬未知種、產(chǎn)朊假絲酵母、可可假絲酵母、地絲菌屬未知種、Geotrichumfermentans，優(yōu)選的是釀酒酵母。選擇任何其它的真核細胞(如曲霉屬、鏈霉菌屬的細胞、昆蟲細胞或者哺乳動物的細胞)作為宿主有機體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
例如可以通過制備原生質(zhì)體之后以本領(lǐng)域公知的方式轉(zhuǎn)化來完成這些酵母細胞的轉(zhuǎn)化。用于培養(yǎng)這些細胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于酵母有機體生長的常規(guī)培養(yǎng)基。其主要部分以正確加工的形式存在于培養(yǎng)基中的分泌的異源蛋白質(zhì)，可以通過常規(guī)的方法從培養(yǎng)基中回收，所說的常規(guī)方法包括從培養(yǎng)基中通過離心或過濾分離所說的酵母細胞、通過鹽(如硫酸銨)法沉淀上清液或濾液中的蛋白組分、之后通過各種層析方法(如離子交換層析、親和層析等等)純化。當所說的蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)空間時，可以通過酶促或機械方法打碎細胞。
在所說的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基或周質(zhì)空間后，可以通過各種方法除去序列EEAEPK。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所說的突出端在發(fā)酵過程中與這種異源蛋白質(zhì)穩(wěn)定地結(jié)合，保護異源蛋白質(zhì)的N-末端免受酵母蛋白酶(如DPAP)的水解。N-末端突出端存在于異源蛋白質(zhì)中的作用也是在此蛋白的化學加工過程中保護異源蛋白質(zhì)的N-末端氨基基團，即它的作用是取代BOC或者類似的保護基團。在這種情況下，可以通過蛋白水解酶(這種蛋白酶對堿性氨基酸(即K(Lys))具有特異性)從回收的異源蛋白質(zhì)中除去氨基酸序列EEAEPK，以便在K位置上切除末端突出端。這些蛋白酶的例子是胰蛋白酶或者水解無色桿菌蛋白酶I。
通過下列實施例更詳細地描述本發(fā)明，這些實施例無意于以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求所要求的范圍。實施例1.表達EEAEPK-MI3胰島素前體的酵母菌株yAK729的構(gòu)建使用聚合酶鏈反應(PCR)構(gòu)建編碼N-末端延伸的胰島素前體EEAEPK-MI3的N-末端突出端的合成基因。
合成下列2個寡核苷酸#672 5’-TCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAACCAAAGTTCGTT-3’#2785 5’-AATTTATTTTACATAACACTAG-3’使用phosphoamidite化學和市售的試劑通過自動DNA合成儀(應用生物系統(tǒng)模型380A)合成寡核苷酸(Beaucage，S.L.和Caruthers，M.H.，四面體通訊22(1981)1859-1869)。
使用Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim GmbH，SandhoefterStrasse 116，Mannheim，德國)按照廠商的說明完成下列PCR，并使用100μl礦物油(Sigma化學公司，St.Louis MO，美國)覆蓋所說的PCR混合物。
PCR5μl寡核苷酸#672(50 pmol)5μl寡核苷酸#2785(50 pmol)10μl 10X PCR緩沖液8μl dNTP混合物0.5μl Pwo酶以0.5μl pAK680質(zhì)粒作為模板(0.2μg DNA)71μl蒸餾水總共完成12個循環(huán)，一個循環(huán)為94℃，45秒；40℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘。然后將所得的PCR混合物加入到2.5％瓊脂糖凝膠上，使用標準技術(shù)(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)完成電泳。從此瓊脂糖凝膠中切除所得的DNA片段，并按照廠商的說明由基因純化試劑盒(Bio 101公司，PO BOX 2284，LaJolla，CA 92038，美國)分離所得的DNA片段。
將純化的PCR DNA片段溶解在14μl的水和限制性核酸內(nèi)切酶緩沖液中，并用限制性核酸內(nèi)切酶Ncol與Xbal按照標準技術(shù)切割(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)。將209個核苷酸堿基對上的Ncol-Xbal DNA片段進行瓊脂糖電泳，并使用如上所述的基因純化試劑盒純化。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和Xbal切割質(zhì)粒pAK721(參見圖1)，使用如上所述的基因純化試劑盒分離10849個核苷酸堿基對的載體片段。使用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和Ncol切割質(zhì)粒pAK721，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離160個核苷酸堿基對的DNA片段。使用T4 DNA連接酶和標準條件(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)將這3個DNA片段連接在一起。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株(R-，M+)中，之后通過氨芐青霉素抗性進行選擇。
使用標準技術(shù)(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)分離所得的大腸桿菌中的質(zhì)粒，并使用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶(即Ncol和Xbal)檢測插入物。通過DNA序列分析(測序酶，美國生化公司，美國)確認選擇的質(zhì)?？删幋aEEAEPK-MI3胰島素前體的正確DNA序列，并插入到編碼合成LA19前導鏈DNA的后面。此質(zhì)粒命名為pAK729。
編碼YAP3信號肽-IA19前導肽EEAEPK-MI3胰島素前體復合物的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
將質(zhì)粒pAK721轉(zhuǎn)化到如PCT/DK95/00250所述的釀酒酵母菌株MT663中，所得的菌株命名為yAK721。
所說的酵母表達質(zhì)粒pAK729為C-POT型(參見圖1)，并且此質(zhì)粒與WO EP171 142中描述的質(zhì)粒相似，后者含有用于質(zhì)粒選擇并在釀酒酵母中穩(wěn)定的粟酒裂殖酵母-1丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)。pAK729也含有釀酒酵母的丙糖磷酸異構(gòu)酶的啟動子和終止子。所說的啟動子和終止子與質(zhì)粒pKFN1003(WO90/100075中描述的)中描述的啟動子及終止子相似，除了編碼YAP3信號肽-LA19前導肽-EEAEPK-MI3胰島素前體的EcoRI-Xbal片段間的序列之外，所有的序列都在此質(zhì)粒中。
實施例2.表達EEAEPK-MI1胰島素前體的酵母菌株yAK733的構(gòu)建通過將編碼前導肽、突出端和胰島素前體的各種DNA片段組合在一起來構(gòu)建編碼N-末端延伸胰島素前體EEAEPK-MI1的N-末端突出端的合成基因。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和Xbal切割質(zhì)粒pAK721(參見圖1)，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離10849個核苷酸堿基對的載體片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和Xbal切割質(zhì)粒pAK729，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離131個核苷酸堿基對的DNA片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和HindIII切割質(zhì)粒pAK729，并如上所述分離229個核苷酸堿基對的DNA片段。
使用T4 DNA連接酶和標準條件(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和ManiatisT，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)將這3個DNA片段連接在一起。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株(R-，M+)中，之后通過氨芐青霉素抗性進行選擇。使用標準技術(shù)(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)分離所得的大腸桿菌中的質(zhì)粒，并使用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶檢測插入物。通過DNA序列分析(測序酶，美國生化公司，美國)確認選擇的質(zhì)?？删幋aEEAEPK-MI1胰島素前體的正確DNA序列，并插入到編碼合成的LA19前導鏈及突出端DNA的后面。此質(zhì)粒命名為pAK733。
編碼YAP3信號肽-IA19前導肽EEAEPK-MI1胰島素前體復合物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
將質(zhì)粒pAK733轉(zhuǎn)化到如PCT/DK95/00250所述的釀酒酵母菌株MT663中，所得的菌株命名為yAK733。所說的酵母表達質(zhì)粒pAK733為C-POT型(參見圖1)，并且此質(zhì)粒與WO EP 171 142中描述的質(zhì)粒相似，后者含有用于質(zhì)粒選擇并在釀酒酵母中穩(wěn)定的粟酒裂殖酵母-1丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)。pAK733也含有釀酒酵母的丙糖磷酸異構(gòu)酶的啟動子和終止子。所說的啟動子和終止子與質(zhì)粒pKFN1003(WO 90/100075中描述的)中描述的啟動子及終止子相似，除了編碼YAP3信號肽-LA19前導肽-EEAEPK-MI1胰島素前體的EcoRI-Xbal片段間的序列之外，所有的序列都在此質(zhì)粒中。
實施例3.表達EEAEPK-MI5胰島素前體的酵母菌株yAK749的構(gòu)建通過將編碼前導肽、突出端和胰島素前體的各種DNA片段組合在一起來構(gòu)建編碼N-末端延伸胰島素前體EEAEPK-MI5的N-末端突出端的合成基因。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和NheI切割質(zhì)粒pAK743，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離10757個核苷酸堿基對的載體片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和NheI切割質(zhì)粒pAK405，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離238個核苷酸堿基對的DNA片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和HindIII切割質(zhì)粒pAK729，并如上所述分離229個核苷酸堿基對的DNA片段。
使用T4DNA連接酶和標準條件(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和ManiatisT，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)將這3個DNA片段連接在一起。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株(R-，M+)中，之后通過氨芐青霉素抗性進行選擇。使用標準技術(shù)(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)分離所得的大腸桿菌中的質(zhì)粒，并使用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶檢測插入物。通過DNA序列分析(測序酶，美國生化公司，美國)確認選擇的質(zhì)粒可編碼EEAEPK-MI5胰島素前體的正確DNA序列，并插入到編碼合成的LA19前導鏈及突出端DNA的后面。此質(zhì)粒命名為pAK749。
編碼YAP3信號肽-IA19前導肽EEAEPK-MI5胰島素前體復合物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
將質(zhì)粒pAK749轉(zhuǎn)化到如PCT/DK95/00250所述的釀酒酵母菌株MT663中，所得的菌株命名為yAK749。所說的酵母表達質(zhì)粒pAK749為C-POT型(參見圖1)，并且此質(zhì)粒與WO EP 171 142中描述的質(zhì)粒相似，后者含有用于質(zhì)粒選擇并在釀酒酵母中穩(wěn)定的粟酒裂殖酵母-1丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)。pAK749也含有釀酒酵母的丙糖磷酸異構(gòu)酶的啟動子和終止子。所說的啟動子和終止子與質(zhì)粒pKFN1003(WO 90/100075中描述的)中描述的啟動子及終止子相似，除了編碼YAP3信號肽-LA19前導肽-EEAEPK-MI5胰島素前體的EcoRI-Xbal片段間的序列之外，所有的序列都在此質(zhì)粒中。
實施例4.表達EEAEPK-X14胰島素前體的酵母菌株yAK866的構(gòu)建通過將編碼前導肽、突出端和胰島素前體的各種DNA片段組合在一起來構(gòu)建編碼N-末端延伸胰島素前體EEAEPK-X14的N-末端突出端的合成基因。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和NheI切割質(zhì)粒pAK743，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離10757個核苷酸堿基對的載體片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和NheI切割質(zhì)粒pAK602，并使用如上所述的基因純化試劑盒分離232個核苷酸堿基對的DNA片段。
用限制性核酸內(nèi)切酶BglII和HindIII切割質(zhì)粒pAK729，并如上所述分離229個核苷酸堿基對的DNA片段。
使用T4DNA連接酶和標準條件(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和ManiatisT，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)將這3個DNA片段連接在一起。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌菌株(R-，M+)中，之后通過氨芐青霉素抗性進行選擇。使用標準技術(shù)(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch EF和Maniatis T，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，1989)分離所得的大腸桿菌中的質(zhì)粒，并使用適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶檢測插入物。通過DNA序列分析(測序酶，美國生化公司，美國)確認選擇的質(zhì)?？删幋aEEAEPK-X14胰島素前體的正確DNA序列，并插入到編碼合成的LA19前導鏈及突出端DNA的后面。此質(zhì)粒命名為pAK866。
編碼YAP3信號肽-IA19前導肽EEAEPK-X14胰島素前體復合物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
將質(zhì)粒pAK866轉(zhuǎn)化到如PCT/DK95/00250所述的釀酒酵母菌株MT663中，所得的菌株命名為yAK866。所說的酵母表達質(zhì)粒pAK866為C-POT型(參見圖1)，并且此質(zhì)粒與WO EP 171 142中描述的質(zhì)粒相似，后者含有用于質(zhì)粒選擇并在釀酒酵母中穩(wěn)定的粟酒裂殖酵母-1丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)。pAK866也含有釀酒酵母的丙糖磷酸異構(gòu)酶的啟動子和終止子。所說的啟動子和終止子與質(zhì)粒pKFN1003(WO90/100075中描述的)中描述的啟動子及終止子相似，除了編碼YAP3信號肽-LA19前導肽-EEAEPK-X14胰島素前體的EcoRI-Xbal片段間的序列之外，所有的序列都在此質(zhì)粒中。SEQ ID NO 11M K L K T V R S A V L SBglII------ATGAAA CTGAAAACTG TAAGATCTGC GGTCCTTTCGTACTTT GACTTTTGAC ATTCTAGACG CCAGGAAAGCS L F A S Q V L G Q P I D D T E STCACTCTTTG CATCTCAGGT CCTTGGCCAA CCAATTGACG ACACTGAATCAGTGAGAAAC GTAGAGTCCA GGAACCGGTT GGTTAACTGC TGTGACTTAGN T T S V N L M A D D T E S R FXbaI------TAACACTACT TCTGTCAACT TGATGGCTGA CGACACTGAA TCTAGATTCGATTGTGATGA AGACAGTTGA ACTACCGACT GCTGTGACTT AGATCTAAGCA T N T T L A L D V V N L I S M ANcoI------CTACTAACAC TACTTTGGCT TTGGATGTTG TTAACTTGAT CTCCATGGCTGATGATTGTG ATGAAACCGA AACCTACAAC AATTGAACTA GAGGTACCGAK R E E A E P K F V N Q H L C G SAAGAGAGAAG AAGCTGAACC AAAGTTCGTT AACCAACACT TGTGCGGTTCTTCTCTCTTC TTCGACTTGG TTTCAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAGH L V E A L Y L V C G E R G F FCCACTTGGTT GAAGCTTTGT ACTTGGTTTG CGGTGAAAGA GGTTTCTTCTGGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGAY T P K A A K G I V E Q C C T S IACACTCCTAA GGCTGCTAAG GGTATTGTCG AACAATGCTG TACCTCCATCTGTGAGGATT CCGACGATTC CCATAACAGC TTGTTACGAC ATGGAGGTAG123C S L Y Q L E N Y C N *TGCTCCTTGT ACCAATTGGA AAACTACTGC AACTAGACGC AGCCCGCAGGACGAGGAACA TGGTTAACCT TTTGATGACG TTGATCTGCG TCGGGCGTCCXbaI------CTCTAGAGAGATCTSEQ ID NO 2EcoRI-------901 TTCTTGCTTA AATCTATAAC TACAAAAAAC ACATACAGGA ATTCCATTCAAAGAACGAAT TTAGATATTG ATGTTTTTTG TGTATGTCCT TAAGGTAAGT951 AGAATAGTTC AAACAAGAAG ATTACAAACT ATCAATTTCA TACACAATATTCTTATCAAG TTTGTTCTTC TAATGTTTGA TAGTTAAAGT ATGTGTTATA+1 M K L K T V R S A V L SBglII------1001 AAACGATTAA AAGAATGAAA CTGAAAACTG TAAGATCTGC GGTCCTTTCGTTTGCTAATT TTCTTACTTT GACTTTTGAC ATTCTAGACG CCAGGAAAGC+1 S L F A S Q V L G Q P I D D T E SStyI------1051 TCACTCTTTG CATCTCAGGT CCTTGGCCAA CCAATTGACG ACACTGAATCAGTGAGAAAC GTAGAGTCCA GGAACCGGTT GGTTAACTGC TGTGACTTAG+1 N T T S V N L M A D D T E S R FXbaI------1101 TAACACTACT TCTGTCAACT TGATGGCTGA CGACACTGAA TCTAGATTCGATTGTGATGA AGACAGTTGA ACTACCGACT GCTGTGACTT AGATCTAAGC+1 A T N T T L A L D V V N L I S M AStyI------NcoI------1151 CTACTAACAC TACTTTGGCT TTGGATGTTG TTAACTTGAT CTCCATGGCTGATGATTGTG ATGAAACCGA AACCTACAAC AATTGAACTA GAGGTACCGA+1 K R E E A E P K F V N Q H L C G S1201 AAGAGAGAAG AAGCTGAACC AAAGTTCGTT AACCAACACT TGTGCGGTTCTTCTCTCTTC TTCGACTTGG TTTCAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG+1 H L V E A L Y L V C G E R G F FHindIII------1251 CCACTTGGTT GAAGCTTTGT ACTTGGTTTG CGGTGAAAGA GGTTTCTTCTGGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGA+1 Y T P K G I V E Q C C T S I C S LBsu36I------1301 ACACTCCTAA GGGTATTGTC GAACAATGCT GTACCTCCAT CTGCTCCTTGTGTGAGGATT CCCATAACAG CTTGTTACGA CATGGAGGTA GACGAGGAAC+1 Y Q L E N Y C N *XbaI------1351 TACCAATTGG AAAACTACTG CAACTAGACG CAGCCCGCAG GCTCTAGAAAATGGTTAACC TTTTGATGAC GTTGATCTGC GTCGGGCGTC CGAGATCTTTSEQ ID NO 3EcoRI-------901 TTCTTGCTTA AATCTATAAC TACAAAAAAC ACATACAGGA ATTCCATTCAAAGAACGAAT TTAGATATTG ATGTTTTTTG TGTATGTCCT TAAGGTAAGT951 AGAATAGTTC AAACAAGAAG ATTACAAACT ATCAATTTCA TACACAATATTCTTATCAAG TTTGTTCTTC TAATGTTTGA TAGTTAAAGT ATGTGTTATA+1 M K L K T V R S A V L SBglII------1001 AAACGATTAA AAGAATGAAA CTGAAAACTG TAAGATCTGC GGTCCTTTCGTTTGCTAATT TTCTTACTTT GACTTTTGAC ATTCTAGACG CCAGGAAAGC+1 S L F A S Q V L G Q P I D D T E SStyI------1051 TCACTCTTTG CATCTCAGGT CCTTGGCCAA CCAATTGACG ACACTGAATCAGTGAGAAAC GTAGAGTCCA GGAACCGGTT GGTTAACTGC TGTGACTTAG+1 N T T S V N L M A D D T E S R FXbaI------1101 TAACACTACT TCTGTCAACT TGATGGCTGA CGACACTGAA TCTAGATTCGATTGTGATGA AGACAGTTGA ACTACCGACT GCTGTGACTT AGATCTAAGC+1 A T N T T L A L D V V N L I S M AStyI------NcoI------1151 CTACTAACAC TACTTTGGCT TTGGATGTTG TTAACTTGAT CTCCATGGCTGATGATTGTG ATGAAACCGA AACCTACAAC AATTGAACTA GAGGTACCGA+1 K R E E A E P K F V N Q H L C G S1201 AAGAGAGAAG AAGCTGAACC AAAGTTCGTT AACCAACACT TGTGCGGTTCTTCTCTCTTC TTCGACTTGG TTTCAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG+1 H L V E A L Y L V C G E R G F FHindIII------1251 CCACTTGGTT GAAGCTTTGT ACTTGGTTTG CGGTGAAAGA GGTTTCTTCTGGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGA+1 Y T P K S D D A K G I V E Q C C T1301 ACACTCCTAA GTCTGACGAT GCTAAGGGTA TTGTCGAGCA ATGCTGTACCTGTGAGGATT CAGACTGCTA CGATTCCCAT AACAGCTCGT TACGACATGG+1 S I C S L Y Q L E N Y C N *1351 TCCATCTGCT CCTTGTACCA ATTGGAAAAC TACTGCAACT AGACGCAGCCAGGTAGACGA GGAACATGGT TAACCTTTTG ATGACGTTGA TCTGCGTCGGXbaI------1401 CGCAGGCTCT AGAAACTAAG ATTAATATAA TTATATAAAA ATATTATCTTGCGTCCGAGA TCTTTGATTC TAATTATATT AATATATTTT TATAATAGAASEQ ID NO 4EcoRI-------901 TTCTTGCTTA AATCTATAAC TACAAAAAAC ACATACAGGA ATTCCATTCAAAGAACGAAT TTAGATATTG ATGTTTTTTG TGTATGTCCT TAAGGTAAGT951 AGAATAGTTC AAACAAGAAG ATTACAAACT ATCAATTTCA TACACAATATTCTTATCAAG TTTGTTCTTC TAATGTTTGA TAGTTAAAGT ATGTGTTATA+1 M K L K T V R S A V L SBglII------1001 AAACGATTAA AAGAATGAAA CTGAAAACTG TAAGATCTGC GGTCCTTTCGTTTGCTAATT 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C N *1351 TGTTCTTTGT ACCAATTGGA AAACTACTGT AACTAGACGC AGCCCGCAGGACAAGAAACA TGGTTAACCT TTTGATGACA TTGATCTGCG TCGGGCGTCCXbaI------1401 CTCTAGACTA AGATTAATAT AATTATATAA AAATATTATC TTCTTTTCTTGAGATCTGAT TCTAATTATA TTAATATATT TTTATAATAG AAGAAAAGAA
XbaI------1401 AGGCTCTAGA AACTAAGATT AATATAATTA TATAAAAATA TTATCTTCTTTCCGAGATCT TTGATTCTAA TTATATTAAT ATATTTTTAT AATAGAAGAASEQ ID NO5，LA19前導肽SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度43個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu Met15 10 15Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu Ala Leu20 25 30Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala Lys Arg35 40
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，這種DNA構(gòu)建體編碼多肽并具有下列結(jié)構(gòu)信號肽-前導肽-EEAEPK-異源蛋白。
2.按照前面權(quán)利要求的DNA構(gòu)建體，其中所說的信號肽是酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽或者它的功能類似物。
3.按照前面的權(quán)利要求任一之DNA構(gòu)建體，其中所說的前導肽是合成前導肽，優(yōu)選的是本文SEQ ID NO5的LA19前導肽。
4.按照前面的權(quán)利要求任一之DNA構(gòu)建體，其中所說的異源蛋白質(zhì)選自由抑蛋白酶肽、組織因子途徑抑制劑或者其它蛋白酶抑制劑、胰島素或者胰島素前體、胰島素類似物、類胰島素生長因子I或者II、人或者牛生長激素、白細胞介素、組織纖溶酶原激活物、轉(zhuǎn)化生長因子a或者b、胰高血糖素、類胰高血糖素肽1(GLP-1)、類胰高血糖素肽2(GLP-2)、GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板衍生的生長因子、酶(如脂酶)、或者這些蛋白質(zhì)任何一種的功能類似物組成的組。
5.按照權(quán)利要求1、2或3任一之DNA構(gòu)建體，其中所說的異源蛋白質(zhì)選自由抑蛋白酶肽、組織因子途徑抑制劑或者其它蛋白酶抑制劑、類胰島素生長因子I或者II、人或者牛生長激素、白細胞介素、組織纖溶酶原激活物、胰高血糖素、類胰高血糖素肽1、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板衍生的生長因子、酶、胰島素或者胰島素以及這些蛋白質(zhì)任何一種的功能類似物組成的組。
6.按照權(quán)利要求4或5的DNA構(gòu)建體，其中所說的異源蛋白質(zhì)是胰島素或者胰島素前體，優(yōu)選的是選自由MI1，B(1-29)-A(1-21)；MI3，B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)；X14，B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)；B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)；MI5，B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21)；和B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)組成的組。
7.按照權(quán)利要求4或5的DNA構(gòu)建體，其中所說的異源蛋白質(zhì)是胰島素或胰島素前體，優(yōu)選的是胰島素前體MI3或者它的功能類似物。
8.本文SEQ ID NO.1、2、3或4描述的DNA構(gòu)建體。
9.一種重組表達載體，這種載體能夠在真核細胞中復制，并且攜帶按照前面權(quán)利要求任一之DNA構(gòu)建體。
10.一種重組表達載體，這種載體能夠在酵母中復制，并且攜帶按照前面權(quán)利要求1-8任一之DNA構(gòu)建體。
11.一種酵母細胞，這種酵母細胞能夠表達異源蛋白質(zhì)并且可以用按照權(quán)利要求10的載體轉(zhuǎn)化。
12.一種按照權(quán)利要求11的酵母細胞，這種酵母細胞選自下列各物種釀酒酵母、克魯弗酵母、粟酒裂殖酵母-1、葡萄汁酵母、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、Pichia methanolica、克魯弗畢赤酵母、Yarrowia lipolytica、念珠菌屬未知種、產(chǎn)朊假絲酵母、可可假絲酵母、地絲菌屬未知種和Geotrichum fermentans，優(yōu)選的是釀酒酵母。
13.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)按照權(quán)利要求11或12的酵母細胞，以便表達并分泌所說的異源蛋白質(zhì)，此后從所說的培養(yǎng)基和/或細胞中分離蛋白質(zhì)。
14.一種產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，這種方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)按照權(quán)利要求11或12的酵母細胞，以便表達并分泌所說的異源蛋白質(zhì)，此后從所說的培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)。
15.按照權(quán)利要求13或14的方法，其中所說的氨基酸序列EEAEPK通過與對堿性氨基酸是特異的蛋白水解酶處理有關(guān)的方法從所回收的異源蛋白質(zhì)中除去。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中所說的蛋白水解酶選自由胰蛋白酶和水解無色桿菌蛋白酶I組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體(這種構(gòu)建體含有編碼N－末端延伸蛋白多肽的DNA序列)、含有所說的DNA片段的載體、用此載體轉(zhuǎn)化的酵母細胞和在真核細胞(包括酵母)中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法。所說的DNA構(gòu)建體編碼下列結(jié)構(gòu):信號肽—前導肽－EEAEPK－多肽。
文檔編號C12N1/19GK1207773SQ96199732
公開日1999年2月10日 申請日期1996年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月20日
發(fā)明者T·B·科耶爾德森, P·巴爾史密德特, A·F·彼德森 申請人:諾沃挪第克公司