專利名稱：生產(chǎn)脂抑制素和四氫脂抑制素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)脂抑制素(lipstatin)的方法，該方法包括a)在基本上不含脂肪和油，但含有適當(dāng)碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽的水性培養(yǎng)基中，并在有氧條件下培養(yǎng)能夠產(chǎn)生脂抑制素的放線菌目所屬的微生物，直至起始生長(zhǎng)階段基本完成并有大量細(xì)胞產(chǎn)生，b)向液體培養(yǎng)基中加入亞油酸，選擇性地加入辛酸(其中部分或全部的亞油酸和/或部分或全部辛酸可以由相應(yīng)的酯類和/或鹽類所替代)，以及N-甲?；?L-亮氨酸，或優(yōu)選L-亮氨酸，已被抗氧化劑穩(wěn)定的亞油酸或其酯或其鹽。
脂抑制素其發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程、從液體培養(yǎng)基中分離脂抑制素的方法，以及將它還原為四氫脂抑制素(tetrahydrolipstatin)(THL，orlistat，一種抗多脂劑an anti-obesity agent)的方法都在美國(guó)專利4,598,089中有所描述。
在美國(guó)專利第4,598,089號(hào)中所描述的產(chǎn)生脂抑制素的微生物是毒三素鏈霉菌(streptomyces toxytricini Preobrazhenskaya & Sveshnikova)(見Bergey的細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，第八版，第811頁(yè))。1983年6月14日，毒三素鏈霉菌被保藏在伊利諾宜州，Peoria市的農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心，保藏號(hào)NRRL 15443。本發(fā)明的方法可用該毒三素鏈霉菌或其衍生的其它菌株，例如篩選出的高產(chǎn)突變菌株。這種方法也可用放線菌目中的鏈霉菌科或放線菌目中其它科的產(chǎn)生脂抑制素的菌類來(lái)進(jìn)行。
當(dāng)應(yīng)用美國(guó)專利4598,089中所描述的發(fā)酵方法時(shí)，在發(fā)酵的液體培養(yǎng)基中含有每升幾微克的很少量的脂抑制素，很難用現(xiàn)有經(jīng)濟(jì)的和技術(shù)的方法將其分離出來(lái)。
本發(fā)明提供了一種改進(jìn)了的發(fā)酵生產(chǎn)脂抑制素的方法，即應(yīng)用上述分批補(bǔ)料培養(yǎng)的方法，使該發(fā)酵液具具有更高的濃度。在該方法的第一步a)中，產(chǎn)生脂抑制素的微生物細(xì)胞生長(zhǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。在該方法的第二步b)中，向該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些成份，這些成份可直接作為生化反應(yīng)前體參與生化反應(yīng)，或者經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的生物化學(xué)轉(zhuǎn)變后，再作為反應(yīng)前體參與生物合成過(guò)程。這種系統(tǒng)就可以通過(guò)該微生物以更高的濃度合成所需產(chǎn)物-脂抑制素。
脂抑制素的生物合成過(guò)程受一系列的基本機(jī)制的控制，如氮的抑制作用。添加各種隨手可得的氮源到培養(yǎng)基中，特別是各種氨基酸和它們的衍生物，包括L-亮氨酸或N-甲?；?L-亮氨酸，能有效地抑制脂抑制素的合成。本發(fā)明中只是在生物合成的各種酶被形成后，才開始加入這類氨基酸，因而不再抑制脂抑制素的生成。除此之外，L-亮氨酸或N-甲?；?L-亮氨酸的加入方法使得氮在該培養(yǎng)液中保持較低濃度。
通常，能合成脂抑制素的放線菌生長(zhǎng)于某種適合的水質(zhì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含一種或多種碳源，如淀粉，淀粉水解物和糖，例如葡萄糖和/或蔗糖，甘油，磷脂類，也含一種或多種氮源，如大豆粉，棉籽粉，玉米粉或玉米漿和干酵母。碳源和氮源的含量要足以使微生物獲得充分生長(zhǎng)，一般為每升培養(yǎng)基中含5至50克的碳源和氮源。在這種培養(yǎng)基中還可加其它大、小分子物質(zhì)。這些物質(zhì)能以復(fù)合介質(zhì)的形式或以無(wú)機(jī)鹽加入培養(yǎng)基。
這種水質(zhì)培養(yǎng)基幾乎不含脂肪和油類，而且每升培養(yǎng)基中含有少于10克的三甘油酯。通常在加入亞油酸和/或辛酸，或它們的酯或鹽類到培養(yǎng)液中時(shí)，加入的速率要能使它們?cè)谂囵B(yǎng)基中為游離的，同時(shí)，不要它們?cè)谂囵B(yǎng)基中累積。一般速率為每升每小時(shí)10至1000毫克，最好是100至300毫克/升/小時(shí)。加入亞油酸和辛酸，或它們的鹽和酯到培養(yǎng)基中時(shí)，要使其濃度低于1000毫克/升培養(yǎng)基，優(yōu)選其濃度低于300毫克/升，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候停止加料，以使在脂抑制素被分離之前，該培養(yǎng)基中幾乎沒(méi)有脂肪酸和/或它的酯或鹽類。通常，對(duì)于每1份辛酸，所要加入的亞油酸按1∶10重量比被加到培養(yǎng)基中，優(yōu)選比例為1.5∶3。通常，N-甲?；?L-亮氨酸，或優(yōu)選的L-亮氨酸加到培養(yǎng)基中的速率是1至100毫克/升/小時(shí)，優(yōu)選為5-50毫克/升/小時(shí)，以使其濃度保持在25毫摩爾以下。
可以替代一部分(或全部)亞油酸或它與辛酸混合物的鹽類和酯類有堿類，或堿土金屬鹽，例如鈉，鉀，鈣或鎂鹽；以及低級(jí)烷基酯，例如甲基酯類，或甘油酯。
為了避免亞油酸[或它的酯類或鹽類]氧化，需混合加入一種抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯，生育酚，卵磷脂，或它們的混合物，或一種基團(tuán)捕集劑，比如BHA(叔丁基-4-羥基-茴香醚，或BHT(2，6-二叔丁基對(duì)甲酚)。
本發(fā)明還涉及到四氫脂抑制素的生產(chǎn)方法，該方法包括a)在幾乎無(wú)脂肪和油類，但含有適當(dāng)?shù)奶荚春偷匆约盁o(wú)機(jī)鹽類的水質(zhì)培養(yǎng)基中，在有氧條件下培養(yǎng)放線菌目中的一種產(chǎn)生脂抑制素的微生物，直至這種微生物的起始生長(zhǎng)階段基本完成，有大量的細(xì)胞團(tuán)生成，b)在培養(yǎng)基中加入亞油酸，優(yōu)選與辛酸混加(其中部分的或全部的亞油酸，和部分的或全部的辛酸可以由相應(yīng)的酯類或鹽類替代)，以及N-甲酰基-L-亮氨酸，優(yōu)選L-亮氨酸，所述的亞油酸或它的酯或鹽類已被氧化劑所穩(wěn)定。
c)從該培養(yǎng)液中分離脂抑制素，并還原脂抑制素為四氫脂抑制素。
從這種發(fā)酵培養(yǎng)液中分離脂抑制素，可以應(yīng)用本技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的分離方法。例如，可采用下述的方法在發(fā)酵過(guò)程完成后，離心發(fā)酵液，得到的細(xì)胞沉淀物用一種低級(jí)鏈烷醇，如甲醇或乙醇處理，并用同樣的溶劑提取?？捎靡贿m合的有機(jī)溶劑提取離心后的物質(zhì)例如，二氯甲烷或乙酸乙酯。從上述的提取過(guò)程所得到的物質(zhì)中含有所需的脂抑制素，并且可用色譜方法濃縮和純化，方法如美國(guó)專利4,598,089中所述。
根據(jù)已知的方法，如美國(guó)專利4,598,089中所描述，在某種適合的催化劑存在下，可以使脂抑制素還原為四氫脂抑制素?？墒褂玫拇呋瘎┑睦佑锈Z/碳，氧化鉑，鈀和同類物。適用的溶劑有，例如低級(jí)醇類，如甲醇和乙醇。該還原反應(yīng)最好在低氫氣壓力下和室溫條件下進(jìn)行。
實(shí)施例1a)制備種子培養(yǎng)物，其含有10克去脂肪豆粉，10克丙三醇，5克干酵母粉并加水到1升。用28％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0，滅菌消毒后其pH值為6.8。將100毫升的這種培養(yǎng)基放入500毫升的錐形瓶中，用棉花塞蓋好后滅菌消毒。之后用接種環(huán)將一接種環(huán)毒三素鏈霉菌(streptomyces toxytricini)，菌株NRRL 15443的孢子接種到培養(yǎng)基中，然后放在27℃的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
b)將100毫升上述種子培養(yǎng)物接種到一個(gè)14升的發(fā)酵容器內(nèi)，其中裝有8升發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基每升含有32克去脂肪大豆粉，20克丙三醇，14克卵磷脂，和0.25毫升作為去泡沫劑的聚丙二醇，用28％的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.4。該培養(yǎng)基每升含有少于5克的三甘油酯。
c)在發(fā)酵培養(yǎng)47小時(shí)之后開始添加脂肪酸亞油酸和辛酸，再加入0.2％(w/w)重量比的抗氧化劑(RONOXANA)以穩(wěn)定亞油酸，該抗氧化劑由70％重量的卵磷脂，25％重量的棕櫚酸抗壞血酸酯和5％重量的生育酚組成。加入這些脂肪酸的速率為每小時(shí)每升加入136到190毫克，且對(duì)加入的速率進(jìn)行調(diào)節(jié)，使亞油酸和辛酸的濃度在每升70毫克以下。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中共加入108克亞油酸和54克辛酸。以每小時(shí)每升14.4毫克的速率加入L-亮氨酸，所加的L-亮氨酸為每升80克的水溶液，用28％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到11。共加入10.2克L-亮氨酸。
將上述接種過(guò)的并已添加過(guò)上述脂肪酸和L-亮氨酸的種子培養(yǎng)物在有氧且攪抖下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，以每分鐘4升的氣體流量通氣，使培養(yǎng)過(guò)程在有氧條件下進(jìn)行。自動(dòng)化加入硫酸或氫氧化鈉溶液，使pH保持在6.1至7.3范圍內(nèi)。通過(guò)控制攪拌器的攪拌速度，使培養(yǎng)基中溶解的氧濃度不低于飽和氧濃度的10％。在收獲脂抑制素時(shí)，培養(yǎng)物中幾乎沒(méi)有亞油酸和辛酸，在經(jīng)過(guò)138小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)之后，脂抑制素在培養(yǎng)基中的滴定度是每升150毫克。
實(shí)施例2用與上述實(shí)施例1a中相同的種子培養(yǎng)物接種一個(gè)14升的發(fā)酵器，發(fā)酵培養(yǎng)基如美國(guó)專利4,598,089所描述，即實(shí)施例1中的發(fā)酵培養(yǎng)基N7。該培養(yǎng)基每8升體積中，含80克土豆淀粉，40克葡萄糖，80克核糖，40克丙三醇，16克蛋白胨，160克大豆粉，16克硫酸銨。加入一種如實(shí)施例1b中的泡沫抑制劑(每升培養(yǎng)液加入0.25毫升聚丙二醇)。滅菌消毒之前，用28％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.0。在有氧條件下攪拌培養(yǎng)，攪拌速度為每分鐘400轉(zhuǎn)，氣體流量為每分鐘4升氣體。
培養(yǎng)結(jié)束，在該種培養(yǎng)基中，脂抑制素的濃度少于每升10毫克。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)脂抑制素的方法，該方法包括a)在基本上不含脂肪和油，但含有適當(dāng)碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽的水質(zhì)培養(yǎng)基中，在有氧條件下培養(yǎng)能夠產(chǎn)生脂抑制素的放線菌目所屬的微生物，直至起始生長(zhǎng)階段基本完成，并有大量細(xì)胞產(chǎn)生，b)向液體培養(yǎng)基中加入亞油酸，可選擇性地加入辛酸(其中部分或全部的亞油酸和/或部分或全部辛酸可以由相應(yīng)的酯類和/或鹽類所替代)，以及N-甲?；?L-亮氨酸，或優(yōu)選L-亮氨酸，所述的亞油酸或其酯或其鹽已經(jīng)被抗氧化劑穩(wěn)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中放線菌目的微生物是鏈球菌科，水質(zhì)培養(yǎng)基基本不含脂肪和油類，每升培養(yǎng)基中含少于10克的三甘油酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中亞油酸或它與辛酸的混合物質(zhì)，和/或它們的鹽類或酯類被添加時(shí)的速率使其在液體培養(yǎng)基中為游離狀態(tài)，但又不累積在培養(yǎng)基中，為每小時(shí)每升培養(yǎng)液10到1000毫克，優(yōu)選為每小時(shí)每升培養(yǎng)液100到300毫克。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中亞油酸和辛酸，和/或它們的鹽和酯的加入要使其在培養(yǎng)液中的濃度保持在每升1000毫克以下，優(yōu)選在每升300毫克以下，并在適當(dāng)時(shí)停止此加入，使在分離脂抑制素之前，液體培養(yǎng)基中基本不含所述的脂肪酸和/或其酯或其鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中加到培養(yǎng)液中的亞油酸對(duì)每一份辛酸的比率為1比10份，最好為1.5比3份。
6.根據(jù)權(quán)利要求3，4或5的方法，其中N-甲?；?L-亮氨酸，或優(yōu)選的L-亮氨酸被加入到培養(yǎng)液中的速率為每小時(shí)每升培養(yǎng)基1到100毫克，優(yōu)選為5到50毫克，使其濃度保持在25毫摩爾以下。
7.一種生產(chǎn)四氫脂抑制素的方法，該方法包括a)用一種幾乎無(wú)脂肪和油類但含有適當(dāng)?shù)奶荚春偷匆约盁o(wú)機(jī)鹽類的水質(zhì)培養(yǎng)基，在有氧條件下培養(yǎng)放線菌目的一種產(chǎn)生脂抑制素的微生物，直至這種微生物的起始生長(zhǎng)階段基本完成，并有大量的細(xì)胞形成，b)在培養(yǎng)基中加入亞油酸，選擇性地混合加入辛酸(部分的或全部的亞油酸，和部分的或全部的辛酸可以由相應(yīng)的酯類或鹽類替代)，以及N-甲?；?L-亮氨酸，優(yōu)選L-亮氨酸，所述的亞油酸或其酯或其鹽類已被抗氧化劑穩(wěn)定。c)從培養(yǎng)液中分離脂抑制素，并且將其還原為四氫脂抑制素。
全文摘要
一種發(fā)酵生產(chǎn)脂抑制素的方法,該方法包括∶a)在基本上不含脂肪和油,但含有適當(dāng)碳源和氮源及無(wú)機(jī)鹽的水質(zhì)培養(yǎng)基中,在有氧條件下培養(yǎng)能夠產(chǎn)生脂抑制素的放線菌目所屬的微生物,直至起始生長(zhǎng)階段基本完成,并有大量細(xì)胞產(chǎn)生,b)在液體培養(yǎng)基中加入亞油酸,可選擇性地混合加入辛酸(其中部分或全部的亞油酸和/或部分或全部辛酸可以由相應(yīng)的酯類和/或鹽類所替代),以及N－甲酰基－L－亮氨酸,或優(yōu)選L－亮氨酸,所述的亞油酸或其酯或其鹽已經(jīng)被抗氧化劑穩(wěn)定。脂抑制素可以從培養(yǎng)液中分離得到,并可將脂抑制素還原為四氫脂抑制素。
文檔編號(hào)C12P21/04GK1170761SQ9710973
公開日1998年1月21日 申請(qǐng)日期1997年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月26日
發(fā)明者A·巴切爾, P·斯拖爾, W·威伯爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司