專利名稱：發(fā)酵生產l－賴氨酸的方法
本申請是申請?zhí)枮?2101496.1、申請日為1992年3月9日、發(fā)明名稱為“在微生物通氣培養(yǎng)過程中控制碳源濃度的方法和裝置”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法。由于L-賴氨酸在飼料谷物中供應不足，所以L-賴氨酸是作為肉雞飼料或豬飼料添加劑使用的一種重要氨基酸。
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法。前人描述過的一些方法包括，用分批法或連續(xù)法培養(yǎng)能夠產生L-賴氨酸的微生物，在培養(yǎng)基中積累L-賴氨酸，并收集L-賴氨酸產物。
在分批處理的情況下，將含有碳源和氮源的液體培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中進行分批培養(yǎng)。另一種方法是，進行培養(yǎng)物加料時連續(xù)地或間歇地加入只含有碳源的培養(yǎng)基。
在連續(xù)處理的情況下，進行培養(yǎng)時把培養(yǎng)基連續(xù)供入發(fā)酵罐中，并連續(xù)放出相同體積的培養(yǎng)液，以使細胞數量或產物濃度等保持恒定。
在用常規(guī)分批法進行L-賴氨酸發(fā)酵時，培養(yǎng)液中產物的積累量或收率雖然高，但卻難以達到高生產率。另一方面，采用常規(guī)連續(xù)法時，生產率雖然高，但卻難以達到高產物積累量或高收率。為了適應L-賴氨酸需求的增長并以較低廉的成本生產L-賴氨酸，必然提高L-賴氨酸發(fā)酵的生產率，改善產物積累濃度和收率。
因此，需要提供一種用能夠解決先有技術技術難題的發(fā)酵法來生產L-賴氨酸的方法。本發(fā)明提供了一種以高生產率、高產物積累濃度和高收率生產L-賴氨酸的新發(fā)酵方法，從而把常規(guī)分批處理和連續(xù)處理的優(yōu)點結合起來。
本發(fā)明的一個目的是提供一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的改進方法。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法，該方法包括在液體培養(yǎng)基中接種一種能夠產生L-賴氨酸的微生物；培養(yǎng)該微生物，并在該微生物的對數生長期之后，加入另一批同時含有碳源和具有生長促進作用的養(yǎng)分的培養(yǎng)基，以維持培養(yǎng)基內的碳源濃度不超過5克/升；收集培養(yǎng)基內產生并積累的L-賴氨酸。
從以下的發(fā)明詳述部分中可明顯看出本發(fā)明的各種其他目的和優(yōu)點。
本發(fā)明涉及用L-賴氨酸生產菌發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法。本發(fā)明所提供的L-賴氨酸生產方法結合了常規(guī)連續(xù)發(fā)酵法和常規(guī)分批發(fā)酵法的優(yōu)點，即生產率高、產物積累濃度高、L-賴氨酸收率高。申請人發(fā)現，L-賴氨酸生產方法的上述改進可以用以下方法來實現在液體培養(yǎng)基中接種能夠產生L-賴氨酸的微生物；培養(yǎng)該微生物，并在該微生物的對數生長期后加入同時含有碳源和具有生長促進作用的養(yǎng)分的流加培養(yǎng)基，以保持培養(yǎng)液中的碳源濃度不超過5克/升；收集培養(yǎng)液中產生和積累的L-賴氨酸。
因此，本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法，該方法包括在液體培養(yǎng)基中接種能夠產生L-賴氨酸的微生物；培養(yǎng)該微生物，并在該微生物的對數生長期之后，加入同時含有碳源和具有生長促進作用的養(yǎng)分的流加培養(yǎng)基，同時保持培養(yǎng)液中的碳源濃度不超過5克/升；收集培養(yǎng)液中產生并積累的L-賴氨酸。
在本發(fā)明的方法中，對本發(fā)明中能夠產生賴氨酸的微生物沒有特殊限制，只要求該微生物能夠產生L-賴氨酸。這類微生物的例子包括屬于短桿菌屬(Brevibacterium)或棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物，這些微生物具有使其具有L-賴氨酸生產能力的必要性質(高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸抗性、α-氯己內酰胺抗性等)。更具體地說，這些微生物的例子包括乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)CCTCC M90006、M90007；黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 21475；嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)CCTCC M90008、M90009。
對液體培養(yǎng)基也沒有特殊限制，但可以使用習知的完全液體培養(yǎng)基，其中含有有機和無機養(yǎng)分源，例如碳源、氮源和其他微量養(yǎng)分。
作為本發(fā)明料液中所用的碳源，可以使用常用作發(fā)酵原料(碳源)的任何糖類、有機酸類、醇類和其他物質，只要求上述賴氨酸生產菌可吸收這些碳源。
具有生長促進作用的養(yǎng)分是指能促進L-賴氨酸生產菌生長的氨基酸、維生素及含有這些成分的天然物質。具體的例子包括大豆蛋白水解產物、醇母提取物和玉米漿等。
正如本領域所已知的，流加培養(yǎng)中的流加培養(yǎng)基一般只含有碳源，而連續(xù)法中的液體培養(yǎng)基則是完全的。在本發(fā)明方法中，流加培養(yǎng)基既含有碳源也含有具有生長促進作用的養(yǎng)分。使用這種流加培養(yǎng)基是本發(fā)明方法的特征之一。
在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基的加入是在微生物完成對數生長過程中或對數生長完成后進行。應避免在對數生長完成前加料，因為這樣會使細菌的初始生長受到抑制。
對于在對數生長完成過程中或對數生長完成后加入培養(yǎng)基來說，加料過程既可連續(xù)進行也可間歇進行。另外，如果預計發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的體積將超過該發(fā)酵罐容許加入的體積，則預先從發(fā)酵罐中放出一部分培養(yǎng)液，或者在體積達到容許體積時放出一部分培養(yǎng)液從而使加料過程可以繼續(xù)進行。
所以，對培養(yǎng)基的加入來說重要的就是，加入培養(yǎng)基時應使培養(yǎng)液中碳源的濃度始終保持不超過5克/升。這也是本發(fā)明的特征之一。為使碳源濃度保持這一恒定值，可以不時從培養(yǎng)液中取樣直接分析碳源濃度。另外，也可測定pH或溶解氧濃度，由pH或溶解氧濃度的變化監(jiān)測碳源的不足，就可以控制培養(yǎng)基的加入。除非碳源濃度恒定保持在5克/升或更低，否則細菌的生長或生成L-賴氨酸的速度就要下降，這種情況與本發(fā)明的目的不相吻合。
本發(fā)明的特征如上所述，其他條件如發(fā)酵條件則沒有特殊限制。例如，根據本發(fā)明發(fā)酵生產L-賴氨酸的溫度，可以是所用的賴氨酸生產菌能夠生長的任何溫度，一般在25-45℃的范圍，優(yōu)選30-40℃。發(fā)酵過程所規(guī)定的pH一般在5.8-8.5的范圍，優(yōu)選6.5-7.5。對于pH的調節(jié)來說，可以采用無機或有機的酸性或堿性物質，以及脲、碳酸鈣或氨氣等。
作為本發(fā)明所使用的發(fā)酵罐，只要是氨基酸發(fā)酵常用的發(fā)酵罐，可以采取任何形狀。例如，可以采用裝有渦輪式葉輪的完全混合罐或空氣帶升式發(fā)酵罐。
培養(yǎng)過程完成后，可以用常規(guī)方法從發(fā)酵液中收集L-賴氨酸，例如用離子交換樹脂法、結晶法和其他方法，或用這些方法的組合。
給出下列實施例是為了進一步說明本發(fā)明，但不應認為是限制性的。
實施例實施例1在三個體積各為500亳升的搖瓶中，分別裝入20毫升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化銨、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于115℃加熱滅菌10分鐘后，從肉湯斜面上取一白金環(huán)已預先培養(yǎng)48小時的乳酸發(fā)酵短桿菌FERM BP2294(CCTCC M90006)，接種在上述培養(yǎng)基上，然后于31.5℃下搖瓶培養(yǎng)24小時。上述步驟用于種子培養(yǎng)。
在三個體積為1升的小型發(fā)酵罐中，每罐中分別裝入300毫升培養(yǎng)基(pH7.0)，該培養(yǎng)基中含有80克/升糖蜜(以糖含量計)、50克/升硫酸銨、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于120℃下加熱滅菌15分鐘。冷卻至31.5℃后，在各發(fā)酵罐中加入上述進行過搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基，加入量為每個發(fā)酵罐15毫升。在下列條件下進行培養(yǎng)溫度為31.5℃；空氣流速為0.5vvm；攪拌轉速為700轉/分。
在三個發(fā)酵罐其中之一，在培養(yǎng)基中的糖用盡時停止培養(yǎng)(常規(guī)分批培養(yǎng))，用酸性銅茚三酮比色法定量測定培養(yǎng)基中積累的L-賴氨酸的濃度。在另兩個發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)基中的糖濃度變?yōu)?克/升或更低時開始加入流加培養(yǎng)基。在其中一個發(fā)酵罐中，流加培養(yǎng)基只含有葡萄糖(40克/升)(常規(guī)流加培養(yǎng))；在本發(fā)明的發(fā)酵罐中，流加培養(yǎng)基含有葡萄糖(40克/升)、大豆蛋白水解產物(100毫克/升，以含氮量計)、鹽酸硫胺素(0.1毫克/升)和生物素(0.3毫克/升)。在這些發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)的同時，控制流加培養(yǎng)基加料速度以使培養(yǎng)液中的糖濃度保持在5克/升或更低。在每個培養(yǎng)物中加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時完成培養(yǎng)。定量測定培養(yǎng)液中積累的L-賴氨酸的濃度。
這三個發(fā)酵罐中的培養(yǎng)結果示于表1。
表1發(fā)酵方法 L-賴氨酸生產率 L-賴氨酸收率(克/升·小時) (％)分批培養(yǎng)(先有技術)1.926流加培養(yǎng)(先有技術)2.127本發(fā)明2.630從表1可見，L-賴氨酸的生產率和收率都很好。
實施例2在二個體積各為500毫升的搖瓶中，分別裝入20毫升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化銨、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2OO、8毫克/升MnSO4·4H2O、100毫克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于115℃加熱滅菌10分鐘后，從肉湯斜面上取一白金環(huán)已預先培養(yǎng)48小時的乳酸發(fā)酵短桿菌FERM BP2297(CCTCC M90007)，接種在上述培養(yǎng)基上，然后于31.5℃下搖瓶培養(yǎng)24小時。上述步驟用于種子培養(yǎng)。
在二個體積為1升的小型發(fā)酵罐中，每罐中分別裝入300毫升培養(yǎng)基(pH 7.0)，該培養(yǎng)基中含有80克/升糖蜜(以糖含量計)、50克/升硫酸銨、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于120℃下加熱滅菌15分鐘。冷卻至31.5℃后，在各發(fā)酵罐中加入上述進行過搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基，加入量為每個發(fā)酵罐15毫升。在下列條件下進行培養(yǎng)溫度為31.5℃；空氣流速為0.5vvm，攪拌轉速為700轉/分。
在培養(yǎng)液中的糖濃度變?yōu)?克/升或更低時開始加入流加培養(yǎng)基。該流加培養(yǎng)基中含有葡萄糖(40克/升)、大豆蛋白水解產物(100毫克/升，以含氮量計)、鹽酸硫胺素(0.1毫克/升)和生物素(0.3毫克/升)。在其中一個發(fā)酵罐中，在連續(xù)培養(yǎng)的同時控制流加培養(yǎng)基的加料速度，以使培養(yǎng)液中的糖濃度恒定保持在5克/升或更低(本發(fā)明)。在另一個發(fā)酵罐中，連續(xù)培養(yǎng)時的加料速度要使糖濃度處在5-15克/升的范圍內(對照)。在每個培養(yǎng)物中加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時完成培養(yǎng)。定量測定培養(yǎng)液中積累的L-賴氨酸的濃度。
這二個發(fā)酵罐中的培養(yǎng)結果示于表2。
表2糖濃度的控制(克/升)L-賴氨酸生產率L-賴氨酸收率(克/升·小時) (％)低于5(本發(fā)明)3.5415-15(對照) 2.938
實施例3在三個體積各為500毫升的搖瓶中，分別裝入20毫升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化銨、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于115℃加熱滅菌10分鐘后，從肉湯斜面上取一白金環(huán)已預選培養(yǎng)48小時的嗜乙酰-乙酸棒桿菌FERM BP2295(CCTCC M90008)，接種在上述培養(yǎng)基上，然后于31.5℃下搖瓶培養(yǎng)24小時。上述步驟用于種子培養(yǎng)。
在三個體積為1升的小型發(fā)酵罐中，每罐中分別裝入300毫升培養(yǎng)基(pH 7.0)，該培養(yǎng)基中含有80克/升糖蜜(以糖含量計)、50克/升硫酸銨、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于120℃下加熱滅菌15分鐘。冷卻至31.5℃后，在各發(fā)酵罐中加入上述進行過搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)，加入量為每個發(fā)酵罐15毫升。在下列條件下進行培養(yǎng)溫度為31.5℃；空氣流速為0.5vvm，攪拌轉速為700轉/分。
在培養(yǎng)液中的糖濃度變?yōu)?克/升或更低時，開始加入流加培養(yǎng)基。本發(fā)明的流加培養(yǎng)基含有葡萄糖(40克/升)、大豆蛋白水解產物(100毫克/升，以含氮量計)、鹽酸硫胺素(0.1毫克/升)和生物素(0.3毫克/升)。在進行培養(yǎng)的同時控制流加培養(yǎng)基的加料速度，以使培養(yǎng)基中的糖濃度恒定保持在5克/升或更低。在培養(yǎng)物中加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時從發(fā)酵罐中放出100毫升培養(yǎng)基。
在繼續(xù)進行培養(yǎng)的同時進一步加入流加培養(yǎng)基。在這種情況下仍然規(guī)定培養(yǎng)基中的糖濃度，使其保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時停止培養(yǎng)。把發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基和前面放出的培養(yǎng)基合并，定量測定其中積累的L-賴氨酸的濃度。
結果表明，賴氨酸的生產率為2.9克/升·小時，賴氨酸的收率為28％。
實施例4在二個體積各為500毫升的搖瓶中，分別裝入20毫升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有30克/升葡萄糖、10克/升氯化銨、3克/升脲、1克/升KH2PO4、100毫克/升MgSO4·7H2O、10毫克/升FeSO4·7H2O、8毫克/升MnSO4·4H2O、1克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于115℃下加熱滅菌10分鐘后，從肉湯斜面上取一白金環(huán)已預先培養(yǎng)48小時的嗜乙酰乙酸棒桿菌FERM BP2296(CCTCC M90009)，接種在上述培養(yǎng)基上，然后于31.5℃下搖瓶培養(yǎng)24小時。上述步驟用于種子培養(yǎng)。
在二個體積為1升的小型發(fā)酵罐中，每罐中分別裝入300毫升培養(yǎng)基(pH 7.0)，該培養(yǎng)基中含有80克/升糖蜜(以糖含量計)、50克/升硫酸銨、1克/升KH2PO4、1克/升MgSO4·7H2O、100毫克/升(以含氮量計)大豆蛋白酸解產物、0.1毫克/升鹽酸硫胺素、0.3毫克/升生物素。將該培養(yǎng)基于120℃下加熱滅菌15分鐘。冷卻至31.5℃后，在各發(fā)酵罐中加入上述進行過搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基，加入量為每個發(fā)酵罐15毫升。在下列條件下進行培養(yǎng)溫度為31.5℃；空氣流速為0.5vvm，攪拌轉速為700轉/分。
在其中一個發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)液中的糖濃度變?yōu)?克/升或更低時，開始加入流加培養(yǎng)基。該流加培養(yǎng)基含有葡萄糖(40克/升)、大豆蛋白水解產物(100毫克/升，以含氮量計)、鹽酸硫胺素(0.1毫克/升)、生物素(0.3毫克/升)(本發(fā)明)。在繼續(xù)進行培養(yǎng)的同時控制流加培養(yǎng)基的加料速度，以使培養(yǎng)液中的糖濃度恒定保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時從發(fā)酵罐中放出100毫升培養(yǎng)液。
在繼續(xù)進行培養(yǎng)的同時進一步加入流加培養(yǎng)基。在這種情況下仍然規(guī)定培養(yǎng)基中的糖濃度，使其保持在5克/升或更低。加入100毫升流加培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)液中的糖用盡時停止培養(yǎng)。把發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液和前面放出的培養(yǎng)液合并，定量測定其中積累的L-賴氨酸的濃度。
結果表明，賴氨酸的生產率為3.6克/升·小時，賴氨酸的收率為38％。
另一個發(fā)酵罐在培養(yǎng)開始25小時后開始加入供連續(xù)培養(yǎng)用的流加培養(yǎng)基。作為流加培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基是將初始培養(yǎng)基稀釋4倍而得到的。以每小時0.05的稀釋倍數通入約1升流加培養(yǎng)基以進行連續(xù)培養(yǎng)。達到恒態(tài)后，定量測定培養(yǎng)基中L-賴氨酸的濃度。
結果表明，賴氨酸的生產率為3.4克/升·小時，賴氨酸的收率為28％。
如實施例1-4所表明的，本發(fā)明能夠以常規(guī)連續(xù)法的高生產率發(fā)酵生產L-賴氨酸，同時保持了常規(guī)分批法發(fā)酵所達到的高產物積累濃度和高收率。因此，利用本發(fā)明可以使工業(yè)化生產L-賴氨酸的生產率大大改善，而成本降低。
以上提到的所有出版物均在此列為參考。
以上為清楚和便于理解起見而略為詳細地描述了本發(fā)明，但本領域專業(yè)人員通過閱讀本公開會認識到，可以對其形式和細節(jié)做出各種改變而不偏離本發(fā)明的實質范圍。
權利要求
1.一種發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法，該方法包括如下步驟(i)在液體培養(yǎng)基中接種一種能夠產生L-賴氨酸的微生物；(ii)培養(yǎng)所述微生物，并在所述微生物的對數生長期之后，加入另一批同時含有碳源和具有生長促進作用的養(yǎng)分的培養(yǎng)基，其中所述碳源在培養(yǎng)基內的濃度保持不超過5克/升；(iii)收集培養(yǎng)基中產生并積累的L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產L－賴氨酸的方法,該方法具有優(yōu)于先有技術方法的優(yōu)點,即,生產率得到改進、產物積累濃度較高、L－賴氨酸收率提高。
文檔編號C12P13/00GK1183474SQ97112748
公開日1998年6月3日 申請日期1997年6月10日 優(yōu)先權日1991年3月12日
發(fā)明者中村尚志, 仲山達哉, 小山洋介, 島崎敬士, 三輪治文, 鶴田稔, 田村光司, 戶坂修 申請人:味之素株式會社