專利名稱：山羊關節(jié)炎－腦炎病毒提供抗hiv－1感染的免疫保護的制作方法
本項工作部分地得到了由美國國家衛(wèi)生研究院提供的編號5-U01-HD32632基金的資助。美國政府在本發(fā)明中享有一定的權利。
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明一般涉及免疫學和醫(yī)學領域，特別是涉及提供抵抗HIV-1感染的免疫保護的方法。
背景信息獲得性免疫缺損綜合癥(艾滋病，AIDS)的影響范圍已經(jīng)達到了流行病水平，尤其是在非洲、亞洲和加勒比地區(qū)的第三世界國家。盡管上億的經(jīng)費用于尋找治療此疾病的藥物的研究上，但是在確定藥物以用于延遲疾病進程的方面僅僅取得了很有限的進展。
AIDS的致病原因是人免疫缺損病毒(HIV-1)。HIV-1感染免疫系統(tǒng)的特定的一種細胞類型，T細胞。通過進入T細胞，HIV-1基因組DNA整合到T細胞的基因組中，在那里T細胞的基因組指導病毒的蛋白合成。然后新的HIV-1病毒的拷貝從被感染的T細胞中釋放出來，并進一步感染其他的T細胞。最終，被感染的T細胞死亡而受HIV-1感染的個體的免疫系統(tǒng)衰竭，不能防御隨后的感染。其結果，艾滋病患者常典型地死于在健康個體上通常并不會發(fā)生的，至多也就是導致輕微疾病的感染。
起初，對艾滋病的治療僅局限于因免疫應答衰竭引起的感染的治療。后來，如AZT和ddI作為核苷類似物的藥物被確認能夠干擾HIV-1 DNA的復制。最近，一類稱作蛋白酶抑制劑的藥物據(jù)報道能夠更有效地抑制HIV-1的復制。人們期望蛋白酶抑制劑結合核苷類似物能夠進一步延長艾滋病患者的生命，甚至能夠治愈艾滋病。
雖然施用上述方法中的藥物提供了殺死HIV-1感染個體中的病毒的方法，但這些藥物只能在一個人已經(jīng)受到感染后使用；它們對免疫系統(tǒng)沒有任何的增強作用。顯然，更優(yōu)選的抑制AIDS傳染病方法應當是在第一地點防治HIV-1的感染。疫苗能夠刺激人抗免疫接種藥劑的免疫應答，疫苗也是防止HIV-1感染的合乎邏輯的選擇。例如，疫苗已經(jīng)用于防止或降低許多病毒疾病的嚴重性，包括小兒麻痹癥、麻疹、天花和流行性感冒。此外，疫苗可以在已經(jīng)受感染的個體上刺激免疫系統(tǒng)。
已有許多的方法用于開發(fā)能夠增強人對艾滋病病毒感染抗性的疫苗。然而，雖然設計了各種類型的HIV-1疫苗，并且進行了臨床試驗檢測，但是每種疫苗多有嚴格的局限。例如，由部分HIV-1蛋白組成的亞單位疫苗，只能提供短暫的或低效的保護。疫苗開發(fā)的障礙之一是HIV-1繁殖時的快速突變。結果，對一種HIV-1蛋白或HIV-1病毒株而刺激起的免疫應答，對病毒另一種的變體卻無效。甚至，HIV-1表面的一部分所產(chǎn)生的抗體，雖可能是疫苗中最有效的部分，實際上卻能刺激HIV-1的感染。
減毒疫苗，由活的繁殖缺陷的病毒組成，也曾被建議過。但是對給人尤其是給別的健康人注射這種HIV-1病毒存在是否合法性的問題。因此，需要一種疫苗，它能夠提供對HIV-1廣泛的免疫應答，但并不伴隨有使用HIV-1作為免疫試劑而涉及的危險和限制。本發(fā)明正能夠滿足這種需要，并能夠提供其他的優(yōu)越性。
山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)是一種逆轉錄病毒，和能夠導致人AIDS的人免疫缺損病毒(HIV-1)密切相關。已知CAEV感染山羊，導致一系列病理情況，包括關節(jié)炎和腦炎。CAEV感染發(fā)生在全世界范圍內，可導致山羊飼養(yǎng)業(yè)的嚴重損失。
在世界的許多地方消費山羊奶，尤其是在欠發(fā)達國家，山羊奶是一種重要的營養(yǎng)來源。然而在這些國家里，山羊奶在人們消費前很少加熱殺菌。并且，由于能夠在健康食品市場中買到，在美國的生山羊奶消費量在上升。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)已認為CAEV類的病毒結構可感染人(HIV-1-CAEV)，尤其是那些職業(yè)接觸山羊或消費生山羊奶的人。雖然還沒有確定CAEV是否可導致人的病理反應，但是CAEV與HIV-1的密切關系提示，最好將CAEV對人的感染事件減到最小。
雖然制乳業(yè)努力防止CAEV在山羊中的傳播，但迄今無法知道人是否被人適應性的結構感染。因此，一種可應用于人的診斷方法是必要的。這種診斷受CAEV感染的人的方法應能夠鑒定CAEV感染的血制品。尤其重要的是要有一種方法，檢測CAEV在血制品中的感染，因為與CAEV感染相關的腦炎能在幼兒在進行受感染血液輸血時發(fā)生。不幸的是沒有方便的方法可以鑒定CAEV對人的感染。因此，需要一種簡單便宜的方法，能夠診斷CAEV感染的情況。本發(fā)明正能夠滿足這種需要，并能夠提供其他的優(yōu)越性。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供一種含有山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)免疫原，優(yōu)選地為人CAEV，和制藥上可接受的載體的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以用于，例如，刺激抗CAEV的免疫應答或在人體中刺激抗人免疫缺損病毒-1(HIV-1)交叉保護免疫應答，以及用于對人，或對其他非山羊哺乳動物抗CAEV感染的免疫接種。
本發(fā)明還提供一種方法，通過對個體施用CAEV免疫原而在該個體中刺激抗CAEV或HIV-1的免疫應答。此方法可以用于，例如，增強未接觸HIV-1或CAEV的個體對HIV-1感染的抗性或CAEV感染的抗性，或分別相應地減輕受HIV-1感染個體中HIV-1導致的病理反應的嚴重程度或CAEV感染個體中CAEV所導致的病理反應的嚴重程度。另外，本發(fā)明還提供了一種通過將淋巴細胞與CAEV免疫原接觸而體外刺激免疫應答的方法。
本發(fā)明還提供了一種對一懷疑受CAEV感染的樣本診斷其受山羊關節(jié)炎-腦炎病毒感染的方法。例如，本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，其中CAEV gp135結合于一固體支持物，并且在其中將CAEV gp135與例如來自一懷疑受CAEV感染個體的血漿樣品接觸，通過檢測結合CAEV gp135的血漿中的抗體作為對該個體感染CAEV的診斷。其他方法還包括基于PCR的試驗。本發(fā)明還提供了進行例如基于ELISA或核酸的診斷操作的試劑盒。
附圖的簡要描述

圖1表示將CAEV gag序列與其他慢病毒屬的gag序列相比較的系統(tǒng)進化樹分析。PCR和RT-PCR，以及PCR產(chǎn)物的克隆和測序按實施例1D.所述操作。各種分析的序列，以及它們的入藏號，如實施例1D.所述。所有的CAEV相關序列在圖1中用一方框所框。所有其他的序列，除了JSR，即Jaagsiekte綿羊逆轉錄病毒，均為慢病毒屬，在圖1中設作為祖先序列。通過PAUP3.1.1節(jié)儉算法分析173個對比的gag位點，其中圖1中的157個和圖2中的65個有變化。使用了序列輸入的隨機性和MULPARS兩個操作選項。圖1中列出的反向計算的節(jié)儉性，如實施例1D.中所述，得出的分支長度不是和單個核苷酸變化相對應的，而是提供相關的上層分支序列的高層相關距離。一個最為節(jié)儉的系統(tǒng)樹在圖1中表示，其分支次序通過“相鄰-接合分析”(neighbor-joining)和“bootstrapping”，以及利用pol基因片段的系統(tǒng)樹分析中得到進一步支持。
圖2表示將CAEV gag序列與實施例1D.中所述的其他序列一一相比較而作的系統(tǒng)進化樹分析。普通的節(jié)儉性如圖2所示(這些序列都是密切相關的)，而相應的分支長度以最小的核苷酸變化為單位給出。Maedi-visna序列設為祖先序列。圖2中得到兩個節(jié)儉性相同的系統(tǒng)樹，它們沒有本質的不同。
圖3對PCR擴增的Hmc4衍生的人-CAEV gag克隆與實施例2所述的感染山羊的CAEV的相應區(qū)域作了比較。所分析的克隆為Hmc4基因組克隆g-30,g-39,g-40,g-46和g-50；Hmc4血漿克隆p-254和p-256；來自感染實驗i-238和i-239的克隆?！癷”克隆衍生自感染的培養(yǎng)物的細胞質。“p”克隆衍生自感染個體的血漿。
圖4對PCR擴增的Hmc4-衍生的人-CAEV pol克隆的核苷酸序列與實施例2所述的兩個感染山羊的CAEV的相應區(qū)域作了比較。
圖5表示了對來自山羊的CAEV病毒株CAEV-CO與gWa19(即，CAEV-79-63)和來自人的h-CAEV病毒株Hmc1與Hmc4的直接序列比較。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了一種含有山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)免疫原，優(yōu)選地為人適應株的CAEV，和制藥上可接受的載體的疫苗。如本文所公開的，本發(fā)明的疫苗可以用于在人體中刺激抗HIV-1的免疫保護應答。此外，本發(fā)明的疫苗可用于對人，或對其他非山羊哺乳動物抗CAEV感染的免疫接種。
本文中所使用的“CAEV免疫原”是指一個CAEV病毒顆粒，它可以是活的，減毒的或已滅活的CAEV，或者是一個CAEV病毒顆粒的免疫原性部分，即它可以是CAEV病毒顆粒的一部分，或是一個例如象gp135包膜糖蛋白的肽片段(見表1；env)這樣的CAEV蛋白的肽片段。CAEV免疫原的特征是它在體內或在體外可以刺激免疫應答。特別的是，一個CAEV免疫原當它對人施用時可以刺激抗CAEV的免疫應答并可以刺激抗HIV-1交叉反應的免疫應答。通過CAEV感染所產(chǎn)生的抗HIV-1的交叉反應的免疫應答可使人聯(lián)想到通過牛痘感染而產(chǎn)生的抗天花的交叉反應免疫應答。表1
-env，pol和gag分別表示CAEV的包膜，多聚酶和核衣殼核心蛋白編碼區(qū)。各個序列前面的數(shù)字表示各個肽所示的第一個氨基酸在相應的各個CAEV蛋白的氨基酸的位置。
存在于U1核糖核蛋白復合物中的一個70K的蛋白的肽片段，與存在于HIV-1中的一個氨基酸序列同源，它可以作為一個代用免疫原，能刺激與HIV-1交叉反應的免疫應答(Douvas and Takehlana,AIDS Res.Hum.Retrovir.10:253-262(1994)，在此引入作參考)如本文所公開的，CAEV蛋白的許多肽片段與70K和HIV-1序列相同源，因此可用作CAEV免疫原來在一個體中刺激與HIV-1交叉反應的免疫應答。
與70K和HIV-1中存在的氨基酸序列相同源的CAEV肽片段的實例在表1中有提供。本文中涉及的具有HIV-1(HIV-1→CAEV)相應結構特征的其他舉例性CAEV肽片段，包括例如220-FAILKC→200-FAILKC(樞紐區(qū))；99-DMVEQM→415DMVEHM(α螺旋1)；129-LKCTDL→203-LKCTKW(保守轉角)；300-NNNTRT→480-NNNTIT(保守轉角)等。其他可用于CAEV免疫原的這種CAEV肽，可以通過查找CAEV DNA或氨基酸序列來確定與70K和HIV-1的免疫學同源序列具同源性的CAEV肽而確定(見Douvas和Takehana，同上，1994)。進一步，本文在此還公開了用于確定與70K和HIV-1肽同源的CAEV肽作為CAEV免疫原的方法，包括ELISA或western印跡或病毒中和試驗(實施例1)，或者其他本領域所知道的方法(例如可見Harlow和Lane，抗體實驗手冊(Cold Spring Harbor Labortor Press 1998)，在此引入本文作參考)。
本文所使用的術語“疫苗”是指一種含有免疫原的組合物，當其對一個體通常是非山羊的哺乳動物如人施用時，可在個體中刺激免疫應答。尤其是，本發(fā)明的疫苗含有CAEV免疫原，能施用于例如人，刺激與抗HIV-1交叉反應的抗CAEV的免疫應答。因此，CAEV免疫原可用于刺激抗HIV-1免疫應答的代用免疫原。一個優(yōu)選的疫苗是減毒的人CAEV，如圖3和圖4中所示的那些。
雖然本文中可考慮使用任何一種CAEV感染藥劑，但在本文尤為優(yōu)選使用的是新的CAEV人適應型病毒株，在此記為“人-CAEV”，如實施例2中所述從病人Hmc1和Hmc4獲得的人病毒株，其部分基因組序列如圖3和圖4中所示。我們發(fā)現(xiàn)人-CAEV區(qū)別于可感染山羊的CAEV。例如，在相應于由SEQ ID Nos:16和17所述引物擴增的173個核苷酸片段的基因組區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)人-CAEV病毒的該特定區(qū)域至少有兩個突變是人源特定的。這些突變是在173 gag區(qū)域擴增產(chǎn)物上對應于56位的鳥嘌呤和77位的胞嘧啶。
因此，本發(fā)明的另一個實施方案是，提供了新分離的人-CAEV。本發(fā)明的人-CAEV可以通過如實施例2中所述的方法或利用其他本領域所知道的方法分離。
應理解的是本發(fā)明的疫苗可以給予一個未感染HIV-1的個體，這樣該疫苗刺激免疫應答以保護個體在以后接觸HIV-1時不受感染，或者給予一個已感染HIV-1的個體，這樣刺激免疫應答抵抗HIV-1的免疫病理反應(例如可見，Cease and Berzofsky,Ann.Rev.Immunol.12:923-989(1994))。因此，本發(fā)明的疫苗可用于增強個體對HIV-1感染的抗性或者對感染HIV-1的個體減輕HIV-1造成的病理反應的嚴重程度。
在本發(fā)明公開之前，尚不知道CAEV能夠感染人。如本文所公開的，人的CAEV感染是普遍的，尤其是在普遍消費生山羊奶的人群中和那些接觸山羊的人群中(見實施例1C.)。雖然還不能確定CAEV感染是否象在山羊中那樣導致人的關節(jié)炎和腦炎的病理反應，但如果CAEV誘導的病理反應存在，那么對那些涉及山羊產(chǎn)業(yè)的人員進行免疫接種以抗CAEV感染是很重要的。本發(fā)明的疫苗可用于此目的。此外，本文所公開的ELISA診斷試驗可以用于確定CAEV的感染個體，并可特別用于例如掃描血液制品以確定CAEV感染的血液，因而能夠防止CAEV感染通過施用被CAEV污染的血液進行傳播。
因為現(xiàn)已確定CAEV可感染人，所以可見類似地CAEV也能感染其他“非山羊”哺乳動物，包括例如人之外的靈長類(如，猴等)，牛，馬，綿羊，狗，貓或其他動物。因此，本發(fā)明的ELISA也可用于對任何這些非山羊哺乳動物的CAEV感染的診斷。進而，如果確定了CAEV感染其他動物，本發(fā)明的疫苗也可以用于防止或限制CAEV在這些非山羊動物中的傳播。
如本文所公開的，人與CAEV的接觸也可刺激與HIV-1交叉反應的對CAEV的免疫應答(實施例1E.)。CAEV是逆轉錄病毒，慢病毒亞型，與人免疫缺損病毒-1(HIV-1)相關。CAEV感染山羊并導致被感染動物的關節(jié)炎和免疫系統(tǒng)的異常(例如可見，Banks等，Arthrit.Rheum.30:1046-1053(1987):Carwford等，Science 207:997-999(1980))。
Visna maedi病毒(VMV)是另一種慢病毒，與CAEV和HIV-1密切相關，并能夠導致綿羊象CAEV對山羊一樣的疾病。因此，在此可以考慮將VMV或VMV的免疫原性片段作為CAEV免疫原的替代物或，如果需要的話，與CAEV免疫原結合用于本發(fā)明疫苗。含有VMV免疫原的疫苗可用于刺激人抗HIV-1交叉反應的免疫應答。
CAEV導致山羊的持續(xù)感染并涉及有三種癥狀，包括關節(jié)炎--有20-30％的被感染動物發(fā)生；腦白質炎--在幼小動物中發(fā)生；偶發(fā)性神經(jīng)疾病--在成年動物中發(fā)生。CAEV感染在全世界范圍內被發(fā)現(xiàn)，1980年被確定為山羊關節(jié)炎和腦炎的致病原因。1985年和1986年描述了CAEV與HIV-1(那時稱作HTLV-Ⅲ)核苷酸和氨基酸序列的關系。CAEV與HIV-1在系統(tǒng)進化上是密切相關的并具有高度的同源性，包括例如，在它們的RNA依賴性DNA多聚酶(pol)之間和HIV-1的gpl20/41與CAEV的gp135/38之間(例如可見Gonda等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83:40007-4111(1986)；Gonda等，Retroviridae3:83-109(1994)；Garry等，Retroviridae 4:491-603(1995)；各文獻在此引入作參考)。
CAEV在山羊中通過被感染的奶，特另是初乳傳染，且感染通過庫集初乳喂養(yǎng)幼羊的農(nóng)業(yè)習慣而傳播。CAEV在單細胞/巨噬細胞譜系和成纖維細胞系中繁殖，但不感染T細胞。表達CAEV的巨噬細胞分布于被感染山羊的關節(jié)滑液、肺、中央神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴結、脾、胃腸道和乳腺中。
在本發(fā)明公開之前，不知道CAEV可感染人。然而，通過ELISA進行血清轉化現(xiàn)象的檢測和用人血樣品所作的western印跡分析(實施例1C.)，以及通過多聚酶鏈反應(PCR)分析來自MCTD病人的基因組DNA檢測到相應于CAEV的gag和pol基因的前病毒DNA，提供了明顯證據(jù)表明CAEV可感染人。病毒DNA序列摻入到宿主細胞DNA中是被包括CAEV和HIV-1在內的慢病毒感染的明確標志。
基于本文所公開的結果，CAEV可能感染半數(shù)的墨西哥和中美洲人群，尤其那些消費生山羊奶(這在當?shù)睾芷毡?的人群或那些接觸山羊的人群(見實施例1C.)。雖然沒有證據(jù)表明CAEV可導致人的病理狀態(tài)，但是，確定CAEV在人群中的感染范圍仍然很重要，這可以確定是否存在，例如，某種未知病理反應與CAEV感染間的病原學關系。本發(fā)明在此提供的ELISA試驗可用于常規(guī)掃描人的CAEV感染，并且也便于掃描其他非山羊哺乳動物以確定CAEV感染的存在。
對三組不同地理區(qū)域山羊的以及受CAEV感染的人的基因組DNA的進行了PCR分析(實施例1D.)。人的和山羊的基因組PCR分析確定出至少兩個可能的CAEV病毒株，它們不同于參照CAEV病毒株的DNA序列(所參照的CAEV DNA序列可從GenBank獲得，登記號M33677，引入本文作參考)。值得注意的是，來自三組CAEV感染的山羊中的兩組以及幾個感染人的CAEV所產(chǎn)生的免疫應答對HIV-1有交叉反應，這表明這些病毒株中的任何一個都可用作本發(fā)明疫苗的免疫原的來源。
CAEV感染的山羊用作人風濕性關節(jié)炎的動物模型，風濕性關節(jié)炎是關節(jié)炎/自身免疫失調、系統(tǒng)風濕癥失調家族中最常見和最流行的癥候。系統(tǒng)風濕癥失調在女性中的普遍性是男性中的三倍。
混合結締組織病(MCTD)是另一種系統(tǒng)風濕失調。MCTD的特征是抗U1 snRNP剪切復合物的自身抗體。MCTD被認為是一種重疊綜合癥，它包含了在其他三種系統(tǒng)風濕失調--紅斑狼瘡(SLE)、硬皮癥和多肌炎中共有的臨床上和血清學的特征。MCTD的臨床特征包括關節(jié)炎、淋巴結病、脈管炎、肌炎、Sjogren綜合癥(唾液和淚腺的淋巴滲透)和免疫調節(jié)異常。
MCTD個體中的臨床特征的表現(xiàn)也發(fā)生在HIV-1感染的個體中。但在HIV-1感染患者中這些臨床表現(xiàn)更為嚴重且更難于治療。例如，MCTD個體的Sjogren綜合癥的特征是局部的淋巴滲透，然而發(fā)生在相應的HIV-1相關的綜合癥中，則是擴散的腺體滲透，即彌散型淋巴細胞增多綜合癥。
嚴重的壞死性脈管炎伴隨著神經(jīng)病、與藥物治療無關的發(fā)炎性多肌癥以及其他形式的與風濕病相關的脈管和神經(jīng)肌肉疾病也發(fā)生在HIV-1感染的個體上。在MCTD、SLE和HIV-1感染中會發(fā)生壞死性淋巴結疾病，可導致大規(guī)模的淋巴結結構被破壞。兩種典型的風濕病，牛皮癬性關節(jié)炎和Reiter綜合癥，是HIV-1感染的早期表現(xiàn)，并且當與HIV-1感染有關時更難進行化學療法的治療。
HIV-1感染和系統(tǒng)風濕病如MCTD的臨床相似性提示，HIV-1可能是風濕病理的一個極端或是在系統(tǒng)發(fā)生上相關的，而較為臨床良性的慢病毒是風濕病的一個發(fā)病因素。血清學上，MCTD的特征是存在抗RNP(核糖核蛋白)的抗體，該抗體對在核RNA剪切時位于內含子5’-端的U1 snRNP顆粒特異?？筊NP抗體也存在于一些SLE和硬皮癥患者中。U1 snRNP顆粒由一個U1 RNA核心和一簇RNA結合蛋白包括70K、A和C蛋白組成?？筊NP抗體通過結合U1 snRNP抑制RNA的剪切。
雖然體液的抗RNP自身抗體應答是MCTD的癥候，但，例如70K蛋白，同時含有T細胞和B細胞表位，并且體液和細胞的自身免疫表現(xiàn)是相互關聯(lián)的。對70K表位應答的T細胞克隆已經(jīng)得到分離，且包括具有細胞毒T淋巴細胞活性的CD8+T細胞和具有輔助T細胞活性的CD4+T細胞。70KT細胞的一些表位與HIV-1的T細胞表位具有同源性(見Souvas和Takehana，同上，1994)。如本文所公開的，CAEV蛋白，包括CAEV gp135，也含有與70K和HIV-1T細胞表位同源的表位(見表1，同上)。因此，含有這樣的表位的一個CAEV免疫原可以誘導廣泛的抗HIV-1的交叉反應免疫應答。
考慮到HIV-1感染與MCTD的臨床相似性以及MCTD患者中與其他健康個體中CAEV感染的鑒定，確定感染CAEV的個體是否發(fā)生了與HIV-1交叉反應的免疫應答是很重要的。從CAEV感染的個體所獲得的血液中對HIV-1蛋白gp120的免疫水平通過ELISA和western印跡分析(見實施例1E.)進行測定。除了揭示了CAEV感染和對HIV-1的免疫應答的發(fā)生之間的關系，我們對CAEV感染和MCTD之間的關系也進行了調查。因為一些來自墨西哥和中美洲的MCTD患者帶有與HIV-1 gp120反應的抗體并能體外抑制HIV-1感染，所以仍需確定未患MCTD的CAEV感染者是否也產(chǎn)生了對HIV-1的免疫。
如本文所公開的，人的CAEV感染，不論是患MCTD或是健康的，刺激了對HIV-1 gp 120或p24病毒抗原交叉反應的體液免疫應答(見實施例1E.)。明顯地，通過使用臨床認可的試驗確定沒有一個被檢測的人受HIV-1感染。此結果表明帶CAEV免疫原的個體的免疫可以產(chǎn)生對HIV-1的交叉反應免疫，因而在未受感染的個體中增強了對HIV-1感染的抗性或在HIV-1感染的個體中減輕了HIV-1導致的病理反應的程度。進而，CAEV感染患者的系統(tǒng)風濕病如MCTD繼而增強了對HIV-1交叉反應的水平。因此CAEV免疫原的施用，優(yōu)選地結合一個與MCTD相關的自身抗體，如70K免疫原，它能夠產(chǎn)生對HIV-1交叉反應的免疫應答(Douvas和Takehana，同上，1994)，可以更為有效地刺激人體中對HIV-1交叉反應的免疫應答。
一個CAEV免疫原可以自己產(chǎn)生免疫原性或者附著于一個載體分子如小牛血清白蛋白或惰性載體，如此的CAEV免疫原-載體復合物可刺激免疫應答(見例如，Harlow和Lane，同上，1988)。例如，當一個疫苗含有完整的CAEV病毒時，病毒具有免疫原性并可刺激接種個體的免疫應答。CAEV可方便地從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCCVR-905)。
本發(fā)明的疫苗也可以含有CAEV蛋白的一個肽片段如gp135(見表1，同上)。表1中列舉的或者本發(fā)明所用的每種肽本身可能不具有免疫原性，但是眾所周知，這種半抗原可以附著在一個載體分子上，從而呈現(xiàn)出免疫原性(例如見，Harlow和Lane，同上，1988)?？稍隗w內或體外刺激免疫應答。例如，包括T細胞和B細胞的免疫細胞可從個體中取得后置于組織培養(yǎng)基中。然后使細胞接觸CAEV免疫原，它可以刺激這些免疫細胞并誘導T輔助細胞和細胞毒T細胞的免疫應答。
本發(fā)明的疫苗除CAEV免疫原外，還含有制藥學上可接受的載體，所述載體是為本領域所熟知的，包括水溶液如生理緩沖鹽水或其他溶劑或介質如乙二醇、甘油、油脂如橄欖油或可注射的有機酯。如愿意，本發(fā)明的疫苗可含有作為佐劑的制藥學上可接受的載體。佐劑如明礬或弗氏完全或非完全佐劑，或者其他適當?shù)淖魟┦潜绢I域所熟知的，并可以商業(yè)購得的(Ribi Immunochem Research,Inc.:Hamilton MT)。添加佐劑通常能降低刺激免疫應答所需的CAEV免疫原的用量。
制藥學上可接受的載體還可以含有生理學可接受的化合物，其作用能夠，例如，穩(wěn)定CAEV免疫原或增強它的吸收。生理學可接受化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖；抗氧化物，如維生素C或谷胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白，或者其他穩(wěn)定劑或賦型劑。本領域中的熟練技術人員會根據(jù)例如該疫苗的施用常規(guī)和CAEV免疫原特定的物理化學性質，選擇這些制藥學上可接受的載體，包括生理學可接受的化合物。刺激免疫應答的疫苗施用的各種途徑為本領域所熟知，它們包括，例如，靜脈的、真皮的或皮下注射，口服和經(jīng)皮膚給藥。
如果需要，本發(fā)明的疫苗也可以含有一個70K免疫原，或者其肽片段，它能夠作為代用免疫原刺激對HIV-1交叉反應的免疫應答(Douvas和Takehana，同上，1994)。疫苗中添加70K免疫原是有益的，因為它是一個自身免疫蛋白，代表富集了能夠刺激早期的共享克隆的序列，這些克隆是抗70K的潛在的T細胞和B細胞，能夠迅速被激活以與HIV-1反應或可以產(chǎn)生交叉反應的抗gp120/41抗體從而中和HIV-1。添加70K免疫原的益處還在于它可以產(chǎn)生帶有gp120/41的共享克隆的共同擴增或協(xié)同擴增。此外，可以篩選不含有刺激抗體的氨基酸序列的70K免疫原性片段(Douvas和Takehana，同上，1994)，這些刺激的抗體能夠調節(jié)與HIV-1感染有關的毒性作用的。
CAEV免疫原可以通過許多方法產(chǎn)生，例如，通過重組DNA的方法或通過化學合成的方法。例如，如果需要一個CAEV蛋白或其肽片段，可以通過將適當?shù)腃AEV編碼序列克隆到一個桿狀病毒載體上，在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_該蛋白或肽，再分離出，從而獲得該蛋白或肽片段。CAEV的核酸序列可從GenBank獲得，編號M33677(也可見，Saltarelli等，Virology 179:347-364(1990)；Knowles等，J.Virol.65:5744-5750(1991)，各文獻在此引入作參考)。此外，也可設計在哺乳動物細胞中產(chǎn)生重組蛋白，這樣可繼續(xù)所需的翻譯后修飾。適當?shù)谋磉_載體和宿主細胞為本領域所熟知并可商業(yè)購得，熟練的技術人員將根據(jù)特定的需要知道選擇適當?shù)妮d體/宿主細胞系統(tǒng)。
當所選擇的CAEV免疫原是一個肽免疫原時，例如，表1中所列舉的CAEV免疫原，該肽可以通過所熟知的化學合成方法合成，方法包括，例如，自動固相方法。CAEV的化學合成可能是特別需要的，因為該方法可以將氨基酸類似物引入肽中。例如，可設計合成一個含有一個或多個D型氨基酸替代相應的天然存在的L型氨基酸的CAEV免疫原。D型氨基酸的使用可提供所需的CAEV免疫原特性，包括例如，增加肽的穩(wěn)定性從而可特別用于制備不依賴冷凍設備的或在世界不常使用冷凍設備的地區(qū)應用的疫苗。此外如果希望，可以合成一個含有額外的半胱氨酸殘基的CAEV多肽，這樣利于在適當?shù)难趸瘲l件下肽與基質或載體分子如匙孔嘁血藍蛋白的特異附著。
本發(fā)明還提供了一種方法，通過對接受者施用治療有效量的CAEV免疫原，從而刺激個體抗CAEV的免疫應答，或刺激與抗HIV-1交叉反應的免疫應答。如果希望，VMV或VMV的一個免疫原性片段可以用來替代CAEV免疫原。此外，有益的是對一個體可施用70K免疫原，既可結合使用CAEV或VMV免疫原也可作單獨處理。
雖然在此所述的是對一個個體施用CAEV免疫原或者對一個個體作免疫接種，但是我們知道可以在體內或來自體內刺激抗HIV-1的免疫應答。所有這些方法均包括在本發(fā)明之中。例如，當待治療的個體患有AIDS時，可設計來自體內刺激抗HIV-1的免疫應答。在這種情況下，從個體中取出淋巴細胞并在培養(yǎng)中免疫。同時，可擴增淋巴細胞數(shù)量。經(jīng)刺激的擴充的免疫細胞再輸入進個體，從而對該個體提供治療效果。進一步，即使本發(fā)明的方法如來自體內免疫和再輸入方法不能治愈，這種治療也可起減輕作用，從而延長AIDS患者的生命。
如本文所公開的，以CAEV免疫原對個體的免疫可刺激與抗HIV-1交叉反應的免疫應答。利用CAEV免疫原的抗HIV-1免疫接種，既可單獨也可結合70K免疫原進行，具有顯著的優(yōu)點，例如，與應用滅活的或減毒的HIV-1結構或HIV-1蛋白抗體作為疫苗相比，CAEV據(jù)知不是人的致病原，它也不感染T細胞。此外，CAEV感染，尤其是MCTD患者中，提供了對HIV-1廣泛的基于免疫原性的抗性，包括抗各種HIV-1病毒株的B細胞應答和T細胞應答。例如，在實施例1中公開的研究中所檢測的拉丁美洲人群內，大于60％的個體感染有CAEV(實施例1D.)。此外，22％的CAEV感染的MCTD患者表現(xiàn)出對HIV-1交叉反應(實施例1E.)。CAEV免疫原免疫接種的對照方法，單獨或結合70K免疫原，可增強個體建立對HIV-1交叉反應免疫性的幾率(實施例2)。
為了刺激抗HIV-1的免疫應答，對個體施用治療有效量的CAEV免疫原。如本文所使用的，“治療有效量”是指刺激免疫應答所需的免疫原量。免疫原如CAEV免疫原的用量提供出的有效量是變化的，它取決于，例如，是在體內還是來自體內刺激免疫應答；是首次使用還是加強施用；是否結合免疫原的施用而使用佐劑；以及當體內施用時的途徑。通常，CAEV免疫原的有效量約為50μg至50mg，優(yōu)選地為500μg至5mg。例如當施用CAEV病毒時，顆粒狀CAEV免疫原的有效量可為100μg至2mg，而當施用可溶性CAEV免疫原時，有效量可約為1mg至5mg。確定免疫原的有效量的方法是常規(guī)的且為本領域所熟知(見實施例2；也可見，Powell和Newman,Vaccine Design:The subunitand adjuvant approach(Plenum Publ.Corp.；1994)，在此引入作參考)。
對個體免疫接種以刺激免疫應答的方法是熟知的(Harlow和Lane,同上，1988)。例如，免疫原可以皮內、肌內注射或靜脈內施用。此外，更有益處的施用是進行一次或多次加強免疫接種，這種加強接種的時間可通過，例如利用本文所公開的方法測量抗HIV-1的抗體在被接種者血清中的量來實驗確定。
本發(fā)明的方法可用于增強以前未接觸HIV-1的個體對HIV-1感染的抗性。類似地，本發(fā)明的方法可用于增強以前未接觸CAEV的人或其他易感的非山羊哺乳動物對CAEV感染的抗性。如本文所使用的，“增強抗性”在用于對HIV-1或CAEV感染的抗性時，是指因抗病毒免疫應答的刺激，繼而產(chǎn)生記憶免疫細胞，這些細胞迅速地動員抵抗和隔絕后來的病毒感染，從而使得被病毒感染的可能性降低。在CAEV的情況下，抗性的增強是由于用CAEV或VMV免疫原接種，而在HIV-1的情況下，抗性的增強是由于接種刺激對HIV-1交叉反應的免疫應答的CAEV或VMV免疫原。
此外，本發(fā)明的方法可用于已感染病毒并由于感染導致病理反應的個體，包括人或非山羊哺乳動物。尤其是，對HIV-1感染的人施用CAEV免疫原以刺激個體中與HIV-1交叉反應的免疫應答，從而可用于降低HIV-1的免疫病理反應。特別地，這種在HIV-1感染個體中的應答的刺激可以防止HIV-1感染在該個體中的進一步擴散，從而降低該個體的T細胞消耗。HIV-1感染個體觀測到的許多病理反應是由于免疫系統(tǒng)的消耗引起的，所以免疫系統(tǒng)消耗降低的處理能夠提供有益治療效果。
基于本文所公開的研究，大量的，特別是墨西哥和中美洲的人群，可能感染CAEV。因此，重要的是要有一種簡單便宜的試驗以診斷CAEV感染的個體。
故，本發(fā)明進而提供了一種方法，可對懷疑受CAEV感染的非山羊哺乳動物，優(yōu)選地是人，進行CAEV感染的診斷。舉例性的診斷CAEV感染方法包括ELISA試驗、PCR擴增試驗、核酸探針試驗和其他等。
在一個實施方案中，例如，本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，可用于診斷懷疑具有CAEV感染個體中的CAEV感染，通過從該個體身上獲得如血液樣品，將樣品與一個CAEV抗原接觸，并檢測樣品中抗CAEV抗體與該CAEV抗原的結合，這種結合的檢出即是CAEV感染的診斷。因此，本發(fā)明進行診斷試驗的方法和試劑為在此公開的或為本領域所熟知的(例如見，Litt,U.S.專利4,092,408,1978年5月30日授權，在此引入作參考)。
本發(fā)明所列舉的ELISA方法(實施例1C.)，其中的CAEV gp135用作CAEV抗原。但是，本發(fā)明的方法所用的CAEV抗原可選自基本上任何抗原性的CAEV片段或者可以是整個CAEV病毒顆粒。為了便于描述本發(fā)明的方法，“CAEV抗原”意為上面所述的“CAEV免疫原”的同義詞。
競爭性ELISA可特別用于對從一個體獲得的樣品進行CAEV感染的診斷。競爭性ELISA的操作類似于標準ELISA，除了在反應中加入了一個或多個單克隆抗體與樣品中的抗CAEV抗體競爭，每個單克隆抗體特異于一個CAEV表位，如那些表1所示的CAEV免疫原確定的表位。使用競爭性ELISA可以提高檢測樣品中抗CAEV抗體存在的靈敏度。競爭性ELISA的操作方法如Buechler等的閾值配體受體試驗(U.S.專利5.089,391,1992年2月18日授權，在此引入作參考)為本領域所熟知。
對特定的CAEV表位特異的單克隆抗體的制備可利用熟知的方法(見，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。例如，可用CAEV免疫原(見，例如，表1)免疫小鼠，然后從具有高滴度的針對特定CAEV免疫原的抗體的小鼠上獲取脾臟細胞。確定具有合適的特異性的和親和性的抗CAEV免疫原抗體的方法，可按照本發(fā)明所公開的或其他本領域所熟知的方法進行，包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射性免疫試驗和沉淀試驗(見實施例1；也可見，Harlow和Lane，同上，1988，第14章)。小鼠的脾臟細胞與適當?shù)墓撬枇黾毎等鏢P/02或P3x653.Ag8骨髓瘤細胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤細胞?？寺〉碾s交瘤細胞系可利用標記的CAEV免疫原掃描，以確定分泌特異于CAEV免疫原的單克隆抗體的克隆。將表達具有所需特異性和親和性的抗體的雜交瘤分離出來，作為在競爭性ELISA中使用的單克隆抗體的連續(xù)來源。
作為本文所使用的“樣品”一詞，當用于本發(fā)明的診斷方法中時是指，一個組織標本或液體標本，比如血液，可以是全血、血漿或血清、或者是小便標本，可以從用于檢測CAEV感染的人或其他非山羊哺乳動物個體中獲得。獲取這種樣品，包括合適的組織樣品的方法，是本領域中所熟知的和常規(guī)的。
本發(fā)明的一個方法可以部分地根據(jù)從一個個體獲取的樣品中存在抗CAEV抗體，而診斷該個體的CAEV感染。從懷疑受CAEV感染的個體中獲取的樣品，在適當?shù)臈l件下與CAEV抗原接觸，如果樣品中存在抗體的話，該條件可使CAEV抗原與抗CAEV的抗體結合。因此，本發(fā)明的一個方法可以是在此列舉的ELISA，或者可以是放射性免疫試驗、western印跡或其他此類基于檢測特異抗原-抗體反應的試驗(見，例如，Harlow和Lane，同上，1988；也可見，Gribnau等，U.S.專利4,373,932,1983年2月15日授權，在此引入作參考)。
抗原-抗體反應如CAEV抗原與抗CAEV的抗體的反應的檢測方法為本領域所熟知的，包括例如，使用一個可檢測的標記的抗原或使用一個可檢測的標記的第二抗體，該第二抗體可與一特定類別的抗體如某種哺乳動物的IgG,IgA,IgM,IgA,IgD或IgE特異結合(見，例如，Greene和David,U.S.專利4,376,110,1983年8月授權，在此引入作參考)。例如，如果樣品是人的血清或血漿樣品，第二抗體可以是山羊抗人IgG(見實施例1C.)。這種第二抗體可以通過所熟知的方法制備或者從商業(yè)來源購得。用于標記CAEV抗原或抗體的方法為本領域所熟知的和常規(guī)的。
在舉例性的ELISA中CAEVgp135被選作抗原，因為在從一個人個體上收集的抗血清中抗gp135抗體的存在，除了表明該個體被CAEV感染，也表明該個體可能帶有與HIV-1交叉反應的抗體。實際上，被CAEV ELISA鑒別為CAEV感染的人個體中有22％也具有與HIV-1交叉反應的抗體，如由HIV-1 ELISA和Western印跡分析所確定(實施例1E.)。此外，通過CAEV ELISA確定的感染CAEV的MCTD個體中，有55％也帶有與HIV-1交叉反應的抗體。本發(fā)明的ELISA也可用于掃描人之外的非山羊哺乳動物，包括例如，其他的懷疑受CAEV感染的哺乳動物，從而確定CAEV感染的個體。
本發(fā)明的方法如ELISA在以試劑盒形式提供時顯得尤為方便。這種ELISA試劑盒，例如，可含有附著于固體支持物如塑料支持物上的CAEV抗原如gp135。例如，該試劑盒可含有一個微量滴定板如96孔板，在板上的一些或所有孔內附有一種CAEV抗原。其他可用于ELISA的固體支持物為本領域所熟知的。在ELISA中利用例如一個96孔板還有其他的優(yōu)點，通過選擇適當?shù)臋z測標記如放射性、熒光或發(fā)光標記，試驗可以自動化，從而能夠快速檢測大量的樣品，如果愿意也可包括標準或對照樣品。
試劑盒如ELISA試劑盒，如果希望還可含有一個標準試劑如預定量的抗gp135抗體。這種試劑可以提供確定在樣品中如來自個體的血液樣品或血清樣品中是否含有一定量的循環(huán)的抗CAEV抗體的手段。因而，本發(fā)明的試劑盒可含有，例如，一種適當?shù)木彌_液，它能提供適當?shù)臈l件，使得樣品中存在的抗CAEV的抗體與附著在固體支持物上的CAEV抗原結合。通過以這種試劑盒形式提供的試劑，ELISA試驗可以標準化，這樣在不同時間不同地點進行的試驗能夠相互比較?？梢?，對于一個所選的CAEV抗原，應分析一定數(shù)量的來自非感染個體(對照)的血清樣品，從而確定對該特定的CAEV抗原反應的基線水平。
本發(fā)明的方法如所列舉的CAEV ELISA可以用于檢測循環(huán)的抗CAEV抗體的存在或跟蹤免疫應答的發(fā)展。例如，個體可用本發(fā)明的疫苗免疫接種，并利用本發(fā)明的ELISA跟蹤其免疫應答的發(fā)展。這種方法可用于確定是否需要加強免疫，以及如果需要，確定加強免疫的最佳時間。此外，CAEV試驗如所列舉的ELISA可用于掃描獻血者提供的血液樣品，以鑒定和去除血庫中受CAEV污染的血液。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，還提供了基于核酸的方法，用于在非山羊哺乳動物個體中，優(yōu)選地在人中，檢測CAEV感染。一個這種方法包括在所說的個體中檢測相應于CAEV核酸的基因組或轉錄mRNA序列。
在一個實施方案中，檢測的CAEV核酸序列包括特有的CAEV人分離物(即人-CAEV)。例如，在相應于經(jīng)SEQ ID Nos:16和17所述引物擴增的173核苷酸片段的基因組區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)人-CAEV病毒的該特定區(qū)域至少有兩個突變是人源特定的。這些突變是在173gag區(qū)域擴增產(chǎn)物上對應于56位的鳥嘌呤和77位的胞嘧啶。除了上述的人源特定的突變，一旦闡述了另一個人-CAEV序列，本領域的熟練人員可容易地得到存在于人-CAEV分離物中的其他特定的核酸區(qū)域。因此，本文考慮使用這些在人-CAEV基因組中存在的大量的特定人核酸區(qū)域。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了一種診斷個體，優(yōu)選地是人的CAEV感染的方法。所說的方法包括a)將來自一個懷疑受CAEV感染的個體的核酸與引物混合，在利于形成可檢測的擴增產(chǎn)物的條件下，擴增CAEV基因組核酸片段，以及b)檢測含有CAEV基因組核酸的擴增產(chǎn)物，根據(jù)該檢測說明上述個體受到CAEV的感染。
在此PCR診斷試驗中所使用的合適的引物包括至少一對能夠擴增CAEV核酸的引物。優(yōu)選地，所選引物擴增CAEV特異的核酸，而不擴增HIV-1序列。例如包括SEQ ID Nos:16和17所述的一組嵌套PCR引物，它可擴增人-CAEV的gag基因的一個173個核苷酸區(qū)域；或者包括SEQ ID Nos:20和21所述的一組嵌套引物，它可擴增人-CAEV的pol基因的一個146個核苷酸區(qū)域。
雖然本文考慮使用的是一個單一引物對，但是在本發(fā)明的基于PCR的診斷試驗的一個特別的實施方案中，對每個分析個體可以使用擴增不同的特定核苷酸區(qū)域的多套引物(例如，引物對或嵌套引物)。由于逆轉錄表達據(jù)知有很高的突變率，所以優(yōu)選地在本發(fā)明的該診斷方法中使用多套引物，這樣可以增加感染個體的CAEV被實際檢測出來的可能性。本領域的熟練技術人員很容易確定引物對的數(shù)量，以確保至少99％的CAEV感染個體能被檢測出來。例如，本文使用1至100個或者更多個引物對。在一個實施方案中，本文使用了一組至少10至70個引物對或嵌套引物。在另一個實施方案中，使用了至少20至50個引物對。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，還提供了診斷系統(tǒng)，優(yōu)選地是試劑盒形式的，其中包括至少一個以適當材料包裝的診斷核酸。該診斷核酸優(yōu)選地來自人CAEV核酸。
本發(fā)明的診斷系統(tǒng)可用于分析CAEV感染的存在與否。一個合適的診斷系統(tǒng)包括至少一個本發(fā)明的核酸，優(yōu)選地是兩個或更多個本發(fā)明的核酸，它們作為單獨包裝的化學試劑，其量應至少足夠一次分析所需。使用包裝試劑的指導也典型地包括在其中。本領域的熟練技術人員可以很容易地將本發(fā)明的核酸探針和/或引物與適當?shù)木彌_液和溶液組合形成試劑盒，以進行本文所述本發(fā)明方法的操作。
本文所用的術語“包裝材料”是指一種或多種用于盛放該試劑盒內容物如本發(fā)明的核酸探針或引物的物理結構。該包裝材料以熟知的方法構建，優(yōu)選地應提供一個無菌無污染的環(huán)境。該包裝材料帶有一個標簽，以表示本發(fā)明的核酸可用于CAEV基因組或轉錄mRNA核酸的檢測，從而診斷CAEV感染的存在。此外，包裝材料含有說明書，以說明如何使用試劑盒中的材料檢測特定序列以及診斷CAEV感染的存在。
本文使用的這些與診斷系統(tǒng)有關的包裝材料是那些基于核酸的診斷系統(tǒng)所習慣上使用的。本文所用的“包裝”一詞是指一種固體基質或材料如玻璃、塑料、紙張、金屬箔、以及此類的能夠在一定的空間內容納本發(fā)明的分離的核酸，寡核苷酸，或引物。因此，例如，包裝可以是一個玻璃小瓶，用以容納所需的毫克級數(shù)量的核酸、寡核苷酸或引物，或者可以是一個微量滴定板孔，其中已經(jīng)附著有所需的毫克級的核酸探針。
“使用說明”通常包括描述試劑濃度或至少一個試驗方法的參數(shù)，如待混合試劑與樣品的相對用量，試劑/樣品混合物的保存時間，溫度，緩沖條件，以及此類的明確說明。
下列實施例意在對本發(fā)明舉例說明，而非限制本發(fā)明。
實施例1受CAEV感染個體中HIV-1交叉反應的鑒定本實施例描述了用于證明受CAEV感染個體產(chǎn)生與HIV-1 gp120交叉反應的免疫應答的方法。
A．人類受試者本文所公開的研究中涉及50個以上的人受試者。受試者根據(jù)它們的疾病狀況(MCTD或正常)以及它們的來源地(墨西哥/中美洲或美國)進行分類，分組如下A組MCTD-拉丁美洲出生的女性，臨床診斷患有MCTD。
B組MCTD-美國出生的黑種或白種女性，臨床診斷患有MCTD。
C組MTCD-瓜達拉加拉的女性居民，臨床診斷患有MCTD。
D組正常(非MTCD)-拉丁美洲出生的女性。
E組正常-非拉丁美洲的女性和男性，包括2個治療被感染山羊的獸醫(yī)服務機構的工人。
F組正常-距瓜達拉加拉30km的一個村子的4個女性和4個男性居民，包括一個有150只山羊牧群的擁有者和其5個家人。
G組硬皮癥患者，都帶有抗Scl-70/1型抗體。
B．血液樣品和試劑收集人和山羊(見下面的1F.部分)的血液樣品，其血清組分用于免疫學檢測。用于在ELISA和western印跡試驗中測量血清抗體的抗原包括粗CAEV，和親和純化的gp135及重組HIV-1gp120和HIV-1 p24。重組HIV-1 gp120和p24購自Intracel(Shepreth UK)。粗CAEV的制備如Klevjer Anderson等所述，(Virology110:113-119(1981)，在此引入作參考)。簡要地說，CAEV在初級胎山羊關節(jié)滑液膜(SM)細胞中培養(yǎng)，該細胞培養(yǎng)于其中補加2mM的谷氨酰胺，100mg/ml鏈霉素和100單位/ml的青霉素和10％FBS的碳酸氫鹽-HEPES緩沖液，收集CAEV感染的SM培養(yǎng)物培養(yǎng)基，600g離心澄清。
粗CAEV制品的等份液體可以凍存于-70℃。該粗CAEV制品可用于分離純化的CAEV或者用于制備純化的CAEV蛋白。純化的CAEV蛋白如純化的CAEV gp135也可以利用常規(guī)的重組DNA技術，通過將一個編碼gp135的核酸分子克隆到一個表達載體上并純化gp135而制備，如下面所述。
利用一個結合在層析基質上的抗gp135抗體從粗CAEV制品中親和純化出CAEVgp135。簡要地說，將粗CAEV制品調節(jié)成0.1％SDS溶液，以裂解CAEV病毒顆粒，然后上抗gp135抗體的親和層析柱，或將重組產(chǎn)生的gp135上此親和柱。
從CAEV感染的山羊血清中或者從來自用CAEV gp135肽片段免疫的山羊的血清中，分離抗gp135抗體。如果使用CAEV感染的山羊作為血清來源，則應使用含有高滴度抗gp135抗體的山羊作為血清來源。這種血清可以通過western印跡分析掃描來自幾個不同山羊的血清樣品而確定。通過硫酸銨沉淀，然后經(jīng)層析柱收集IgG組分，而從血清中分離抗gp135抗體。將此抗gp135抗體附著于層析基質如溴化氰激活的SepharoseTM。分離IgG抗體和將此類抗體附著于基質上的方法是本領域所熟知的和常規(guī)的(見，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。
在PBS中的粗CAEV制品和重組產(chǎn)生的gp135上樣至抗gp135抗體親和柱上，讓gp135與抗體于4℃結合過夜。結合后，柱子用PBS清洗，然后以10mM HCl,0.15M NaCl洗脫結合的gp135。gp135抗原的純度通過SDS-PAGE和銀染確定。
C．CAEV ELISA和Western印跡試驗對于ELISA試驗，粗CAEV或親和純化的gp135抗原用磷酸緩沖液(PBS)1∶20稀釋，終濃度gp135約為μg/ml，在96孔板(Corning)的每個孔內加入50μl。蓋好板在4℃孵育過夜，然后去除抗原，用901μl洗滌液(1mg BSA/ml PBS)洗滌每個孔3次，每次1分鐘。在每個孔中加入100μl的終止液(10mg BSA/ml PBS)，于室溫(RT)孵育60分鐘，然后去除終止液，每個孔用洗滌液洗滌3次，每次1分鐘。
在每個孔中加入50μl的稀釋血清樣品(1∶100于洗滌液中)，板于室溫孵育60分鐘?？盏目?對照)只含有洗滌液。孵育后，板孔作如上的洗滌，然后加入50μl第二抗體并進行如上的孵育。當分析的血清樣品是來自人的，則第二抗體是于PBS中1∶1000稀釋的結合于辣根過氧化物酶(HRP；Zymed Laboratories,Inc.；South SanFrancisco CA；cat.#62-8420)的山羊抗人IgG。當分析的血清樣品是來自山羊的，則第二抗體是于PBS中1∶3000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.；West Grove PA；cat.#30535003,lot#28671)。孵育后，每個孔用洗滌液再用PBS各洗滌2次。
在每個孔中加入75μl的顯色液(25ml的ELISA緩沖液中含有10mgO-苯二胺(Sigma)；新鮮制備的50μl 30％H2O2；ELISA緩沖液為500ml0.1M檸檬酸，500ml 0.2M Na2HPO4,pH5.0)，于室溫下黑暗處孵育10分鐘。加入25μl6N H2SO4終止顯色，然后在OD490處測定吸收值。
對于CAEV Western印跡分析，在SDS樣品緩沖液(Laemmli,Nature227:680-685(1970)，在此引入作參考)中的0.1-0.5μggp135等份樣品，通過10％的SDS-PAGE分離，然后電泳轉移至一個硝酸纖維素膜上。該膜在50ml的終止緩沖液(含1％BSA的WBS；1升WBS中含有9g NaCl,1.21g Tris堿，0.25ml NP-40,pH7.4)保溫1小時，然后用洗滌液(含0.1％BSA的WBS)洗滌3次。將該膜按凝膠上的泳道剪成條。
血清樣品以1∶100稀釋(20μl血清/2ml洗滌液；如果用血漿則40μl/2ml)，然后加入到含有醋酸纖維膜條的盤子中在室溫下?lián)u動60分鐘。孵育后，纖維膜條用洗滌液洗滌3次，再加入2ml第二抗體(如上，但用洗滌液稀釋)，室溫下孵育60分鐘。纖維膜條用洗滌液洗滌3次，加入2ml顯色液(10mg 3,3-二氨基聯(lián)苯四氯酸(Sigma ChemicalCo,；St.Louis Mo；cat.#D 5905),1ml 0.05M Tris,pH7.5,39mlWBS,80μlH2O2，應新鮮制備)。在室溫下輕微搖動，繼續(xù)孵育10分鐘，然后將膜轉至蒸餾水中終止顯色。
來自拉丁美洲出生的MCTD患者，包括那些來自LAC/USC(A組)和那些來自墨西哥的瓜達拉加拉(C組)的血清樣品中，有62％被觀測出具有對CAEV提取物和對純化的gp135的高度反應性。來自疾病對照的(G組)和來自非拉丁美洲健康個體的血清樣品，不包括那兩個獸醫(yī)的，呈弱反應性或無反應。在western印跡中與CAEV反應的人血清樣品含有的抗體與來自CAEV感染山羊的血清樣品反應的抗體針對相同的多肽。
來自正常個體的血清樣品對CAEV的反應性，與該個體具有飲用生山羊奶或接觸山羊歷史相關。最高的反應存在于那個瓜達拉加拉的山羊牧群擁有者上，和一個獸醫(yī)上，他除了治療受CAEV感染的山羊還據(jù)說經(jīng)常消費生山羊奶。另一個獸醫(yī)，也治療受CAEV感染的山羊，他也有陽性反應。
總之，39個MCTD患者中的22個和23個非MCTD個體中的11個具有CAEV感染的陽性反應，包括33個拉丁美洲MCTD患者中的20個(61％)和14個拉丁美洲非MCTD個體中的9個(64％，見表2)。這些結果表明本研究中所檢測的60％以上的拉丁美洲個體感染了CAEV。在CAEV反應個體中，來自拉丁美洲MCTD患者血清樣品的反應性要高于來自非MCTD拉丁美洲個體。
表2 MCTD患者及正常人中CAEV gp135和HIV-1 gp120反應性的關系陽性gp135 陰性gp1351．MCTD3．MCTDn=22；拉丁美洲人=20 n=17；拉丁美洲人=13總gp120(+) 12/22=55％總gp120(+) 0/17=0％拉丁美洲人gp120(+)11/20=55％拉丁美洲人gp120(+)0/13=0％2．正常人4．正常人n=11；拉丁美洲人=9 n=9；拉丁美洲人=5總gp120(+) 4/11=36％ 總gp120(+)0/9=0％拉丁美洲人gp120(+) 2/9=22％拉丁美洲人gp120(+) 0/5=0％小節(jié)1:CAEV(+)拉丁美洲人總數(shù) 29/47=62％MEC-拉丁美洲人 20/33=61％正常的拉丁美洲人9/14=64％非拉丁美洲人總數(shù)2/15=13％MCTD-非拉丁美洲人 2/6=33％正常的非拉丁美洲人 2/6=33％小節(jié)2:CAEV(+)/gp120(+)拉丁美洲人MCTD 12/22=55％拉丁美洲人正常 2/9=22％CAEV(-)/gp120(+)拉丁美洲人MCTD和正常0/20=0％非拉丁美洲人MCTD和正常 0/20=0％D．PCR分析利用從外周血單核細胞(PBMC)中分離的基因組DNA進行確定CAEVgag和pol基因的PCR分析。通過對收集自所檢測的人個體或來自WA、UC Davi和Gua山羊的全檸檬酸化血或肝素化血，進行Ficoll密度梯度離心，而獲得PBMC(見下)。
編碼gag蛋白區(qū)的CAEV特異的基因組DNA通過兩步擴增。第一步得到的擴增產(chǎn)物為CAEV的第1057至1553核苷酸。引物為5’-GCAGTTGGCATATTATGCTACTAC-3’(SEQ ID NO:14；CAEV的第1057至1080核苷酸)和5’-CTTGTTGTACTCTTTGTCCTAGTG-3’(SEQ ID NO:15；CAEV的第1530至1553核苷酸)。第二步得到的擴增產(chǎn)物在第一步擴增產(chǎn)物之內，從第1329至1501核苷酸。第二步的引物為5’-GAGCAGTAAGACATATGGCGCAC-3’(SEQ ID NO:16；第1329至1351核苷酸)和5’-TGATGCATTTGTATAAGATAGTGTTAGCTTT-3’(SEQ ID NO:17；CAEV的第1471至1501核苷酸)。
編碼CAEVpol的DNA也通過PCR檢測。其第一步擴增的引物為5’-GGATTTGAACTACACCCGCAG-3’(SEQ ID NO:18；CAEV的第2845至2865核苷酸)和5’-CCTGTTGATACTATGAACCCTAGAC-3’(SEQ ID NO:19；CAEV的第3494至3518核苷酸)。第二步的引物為5’-AAGAACCTAAGCATCCCGCAAC-3’(SEQ ID NO:20；第3223至3244核苷酸)和GTGATGTTCCCTAATTGCAATTCTAGTC-3’(SEQ ID NO:21；第3341至3368核苷酸)。
擴增操作為退火溫度52℃，延伸溫度72℃，進行38個循環(huán)。按制造商的推薦條件使用Taq多聚酶或者pfu Taq多聚酶(Promega Corp.；Madison WI)。將1μl第一步擴增的反應混合物用于第二步擴增，操作條件相同。第二步擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)洗脫適當條帶而收集。按照制造商推薦條件，擴增的DNA樣品然后克隆進一個TA3 pCRTM載體(Invitrogen；La Jolla CA)，并使用SequenaseTM2.0版的DNA測序盒(U.S.Biochemical Corp.；Cleveland OH)進行測序。將克隆的DNA序列與參照的CAEV DNA序列(GenBank編號M33677)相比較。
PCR分析揭示CAEV原病毒DNA存在于ELISA或western印跡分析確定的CAEV陽性個體的基因組中。特別是，從MCTD患者(A組)以及從CAEV感染的UC Davis山羊中擴增出了編碼CAEV gag和pol序列的DNA。與參照的CAEV gag序列的比較表明，MCTD患者中的gag序列與參照序列有8.2％的分歧，UC Davis山羊的gag序列有8.8％的分歧。此外，與參照的CAEV pol序列的比較表明，MCTD患者中的CAEVpol序列與參照序列有7.6％的分歧，UC Davis山羊的CAEV pol序列有7.6％的分歧。
存在于人基因組DNA樣品中的CAEV序列與參照山羊的CAEV序列具有較高相似程度，這給人的CAEV感染提供了確定的證據(jù)。序列間約8％的平均分歧程度表明人的CAEV感染可歸究于一個特定的、人適應的CAEV病毒株。其他的DNA測序可分析人適應的CAEV病毒株是否導致人CAEV感染。
為了獲得CAEV在人PBMC中存在的進一步直接證據(jù)，通過嵌合PCR從8個gp 135(+)個體中擴增了病毒gag和pol基因序列。通過RT-PCR從人個體樣本Hmc4的無細胞血漿中也擴增出CAEV gag。從11個gp135(-)個體的PBMC DNA中擴增CAEV gag和pol序列的結果是陰性的。所有用于CAEV gag和pol PCR的DNA樣品也進行了使用HIV-1 gag和pol引物的PCR，且除了HIV(+)對照組之外全部呈HIV-1陰性。從4個gp 135(+)山羊的PBMC DNA中也擴增出CAEV gag序列。2個CAEVgp135(+)山羊(gD1和gWA19)來自美國獸醫(yī)牧群；gT38和gT42是墨西哥gp135(+)山羊。22個人PBNC gag克隆，3個HMC4血漿gag克隆和11個山羊PBMC gag克隆進行了測序并與發(fā)表的CAEV-CO gag序列(M.Saltrarelli，等，Virology,179:347(1990))進行比較。
擴增自7個個體的8個人gag序列的系統(tǒng)進化分析如圖1所示。其還包括4個山羊gag序列。在圖1和圖2中分析的CAEV,Visna和OMVVSA gag序列的克隆和相應的GenBank查詢編號如下Hmc4-c30(U69922),-c39(U69923),-c40(U69924),-c46(U69925),-c49(U69932),-c50(U69926),-fp-c254(U69933),-fp-c256(U69934),-fp-c261(U69935)；gD1c12(U69927),-c13(U69928),-c52(U69929),-c53(U69930)；Tn8-c144(U69931),-c147(U69909),-c151(U69910),-c155(U69911)；gWa19-c74(U69918),-c75(U69919),-c77(U69920),-c80(U69921)；gT42-c84(U69916),-c90(U69917)；gT38-c93(U69915)；En1-c108(U69900),-c110(69901)；Oc1-c120(U69905),-c136(U69906),-c139(U69907)；Oc2-c167(U69908)；Umc5-c184(U69912),-c185(U69913),-c190(U69914)；Hmc1-c209(U69902),-c212(U69903),-c213(U69904)；CAEV-CO(M33677)；Visna(M18039)；OMVVSA(M31646).除了JSR是來自Jaagsiekte綿羊的逆轉錄病毒之外,圖1中所有其他序列都是慢病毒序列。此外，本文中所討論的CAEV pol克隆和相應的查詢編號如下Hmc4-c10(U69948),-c12(U69949),-c19(U69950),-c20(U69951),-c28(U69952)；gD1-c1(U69944),-c2(U69945),-c3(U69946),-c30(U69947)；gWa19-c51(U69953),-c52(U69954),-c53(U69955),-c60(U69956)；En1-c43(U69940),-c46(U69941),-c47(U69942),-c48(U69943)；Gmc15-c37(U69936),-c38(U69937),-c41(U69938),-c42(U69939).
來自人CAEV gag序列與其他慢病毒CAEV-CO gag序列間的相關距離通過反向加權節(jié)儉算法(D,M.Hillis等，Science,264:671(1994).BT.M.Korber et al.,J.Viol.,68:6730(1994))來顯示。應用PAUP3.1.1(D.L.Swofford,Illinois Natural History Survey,Urbana)進行非加權(普通)節(jié)儉算法。從開始的PAUP分析中得到12個明顯置換頻率，然后用Macclade(W.P.Maddison和D.R.Maddison,“Macclade:Analysis of phylogeny and characterevolution”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,(1992))一個反向加權圖得自于次置換頻率矩陣中，然后引入到后面的節(jié)儉算法反向中。得到的分支長度估計是反向加權置換產(chǎn)生的復合的數(shù)量。所有來自實驗個體的病毒gag序列和山羊gag序列與CAEV-CO gag相集。
使用MASE(D.v.Faulkner and J.Jurka,Trends biochem.Sci.,13:321,(1988))的SIMILARITY功能，確定了單核苷酸距離值，即Hamming距離。只有單核苷酸差異被計算，多核苷酸差異在此數(shù)據(jù)設置中沒有遇到。通過Hamming距離測定，來自CAEV-CO gag的8個gag克隆的序列差異范圍是5.3％-9.4％，相比之下，與發(fā)表的羊的maedivisna gag序列差異為23.4-28％。
為了獲得人和山羊gag序列的個體內和個體間的差異，用普通節(jié)儉算法計算了33個克隆(圖2)。如圖1，所有人序列都與CAEV-CO相集。所有22個人gag克隆與CAEV-CO的平均序列差異為8.4±1.5％。
來自3個人個體(Hmc4,Gmc15和En1)和2個山羊(gD1和gWA19)的病毒序列，用CAEV嵌合pol引物，也從PBMC DNA中擴增出來。其pol序列與發(fā)表的CAEV-CO pol序列(M.Saltarelli,et al.,Virology,179:347(1990)的差異為4.8-8.2％，與羊maedi-visna pol(P.Sonigo et al.,Cell,42:369(1985))的差異為22.6-26％。這些pol序列的節(jié)儉算法分析得到的結果與gag(圖1)的結果具有拓撲學同一性。約40％的gag和17％的pol核苷酸變化導致氨基酸改變。所有這些改變和＞80％的gag的改變是保守的(基本上是I_V,K_R和D_E)。因此gag和pol序列的計算表明本研究所測8個CAEV gp135(+)的人個體中帶有一個與CAEV密切相近的沉默的慢病毒。如實施例2所述，通過RT-PCR從個體Hmc4的無細胞血漿中擴增CAEV gag序列，獲得了該病毒體內復制的證據(jù)(圖2)。
E．HIV-1 ELISA和western印跡試驗認可的HIV-1 ELISA和western印跡診斷試劑盒購自OrganonTeknika(Cambridge UK)，試驗按照供應商推薦的方法進行。根據(jù)使用該認可的HIV-1 ELISA和western印跡試驗的臨床標準，所有的人血清樣品，除了已知的作為陽性對照的HIV-1陽性血清和抗體之外，都對HIV-1呈陰性。
ELISA和wetern印跡試驗使用重組HIV-1抗原gp120和p24，和HRP-結合的兔抗山羊和山羊抗人的第二抗體(Zymed LaboratoriesInc.)按照以前所述的方法進行(Douvas和Takehana，同上，1994；Crow等，Cell.Immunol.121:99-112(1989)，在此引入供參考)。與CAEV gp135反應的血清，也與HIV-1 gp120反應，包括與HIV-1 gp120反應的全部12個MCTD的血清(見表2，同上)。
如上述I.C.部分所述，39個MCTD患者中的22個和23個非MCTD個體中的11個，對CAEV感染呈陽性，包括33個拉丁美洲MCTD患者中的20個(61％)和14個拉丁美洲非MCTD個體中的9個(64％；表2)。HIV-1試驗的結果進而表明22個CAEV陽性拉丁美洲MCTD患者中的12個(55％)和9個陽性拉丁美洲非MCTD個體中的2個(22)也呈現(xiàn)出對HIV-1 gp120的陽性活性(見表2)。相反，沒有一個CAEV陰性的拉丁美洲MCTD或者非MCTD個體對HIV-1 gp120呈陽性。
結果表明一些健康個體CAEV感染的發(fā)生不伴隨臨床疾病的發(fā)展，包括MCTD綜合癥的發(fā)展。然而接觸CAEV導致的對CAEV的免疫應答，在部分受感染個體中也擴展到對HIV-1的免疫應答。此外，在CAEV陽性MCTD患者中，對CAEV的反應是CAEV陽性非MCTD個體的1.6倍，并且對HIV-1 gp120高度交叉反應的發(fā)生頻率更高。這些結果表明CAEV感染導致對HIV-1交叉反應，并且交叉反應免疫應答在自身免疫疾病個體中得到了增強。
F．CAEV感染的山羊研究了如下的三組山羊Ⅰ組．WA-未曾感染的山羊和實驗感染的山羊(CAEV)，飼養(yǎng)于華盛頓大學，Pullman WA.
Ⅱ組．UC Davis-天然感染的山羊，飼養(yǎng)于加州大學，Davis CA.
Ⅲ組．Gua-墨西哥Guadalajara的一個牧主擁有的20個天然感染(CAEV)的山羊，(見上F組)。
對從各個CAEV感染的和未曾感染的山羊中收集的血清樣品進行測定。Gua山羊(Ⅲ組)缺少對CAEV gp135的反應，但約50％對CAEVgp38和gag反應。此外，Gua山羊表現(xiàn)出對HIV-1 gp120和p24強烈反應，而WA山羊則不。UC Davis山羊對gp135,gp120和p24都有反應。
這些結果表明WA和Gua山羊對CAEV和對HIV-1抗原的免疫反應存在差異。這些差異可能源于不同的病毒株或者由于不同的感染途徑。例如，WA山羊是通過靜脈感染的，而UC Davis山羊是通過攝取受感染的奶而天然感染的。
G．HIV-1病毒中和試驗利用保存于生長培養(yǎng)基中的PHA激活的正常供體PBMC，以1×106個細胞/ml濃度作為用于感染的靶細胞，在48孔組織培養(yǎng)板上進行病毒中和試驗。將各種稀釋度的HIVIGTM，熱滅活(56℃,30分鐘)的MCTD血清或純化的IgG與10至50 TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量-50)的病毒一起在37℃孵育30分鐘。
MCTD血清和HIVIGTM的陰性對照相應地包括，來自未被HIV-1感染的，和不受系統(tǒng)風濕失調影響的，和IVIGTM的熱滅活血清。HIVIGTM是一種中和IgG的制品，來自HIV-1感染早期的9個血清反應陽性供體的混合血清；IVIGTM是來自正常供體的IgG，它們都從North AmericanBiologicals Inc.(Miami FL)獲得。TCID50通過常規(guī)的病毒滴度方法確定。
血清或IgG孵育之后，將以三份重復血清/IgG-病毒混合物加入到靶細胞中。37℃過夜孵育后，板在1000rpm離心5分鐘，完全更換培養(yǎng)基。該洗滌步驟重復3次以確保血清/IgG-病毒接種體的完全去除。培養(yǎng)的第4天換培養(yǎng)基，第7天收集懸浮液以定量p24核心抗原。將每個以血清/IgG處理的組織培養(yǎng)孔中的p24核心抗原的平均濃度，與特定的陰性對照相比較，從而確定抑制百分率。
平行地，準備一個對照，測定由于血清或HIVIGTM經(jīng)過清洗步驟未完全去除而導致的p24核心抗原數(shù)量上任何非特異性的降低。當將血清/IgG-病毒混合物加入靶細胞時，不與病毒進行溫育也將每種血清、IVIGTM或HIVIGTM加入到靶細胞中。這些孔平行地與實驗培養(yǎng)物進行同樣處理。培養(yǎng)7天后，每個孔的上清1∶1地與陰性對照的上清相混合，并對p24抗原濃度定量。如果測定值低于50％的陰性對照值，則被視為是由于殘留的p24抗體存在而導致p24抗原的非特異抑制。
這個實驗的結果如表3所示。表3中表明來自MCTD患者的抗RNP血清能夠中和被HIV-1病毒株MN、JR-FL、和C0的感染。表3中的1號樣品為CAEV(+)(即CAEV感染的)患者Hmc1。表3中的第6號樣品為CAEV(+)患者Hmc4。對應表3中的第4號樣品也確定為CAEV(+)。對應于第2,3,5和7號樣品的患者沒測出CAEV感染。因此，由于第1,4和6號樣品對應于來自人的抗CAEV血清，故表明人抗CAEV血清可中和HIV-1感染。
表3抗RNP血清對HIV-1病毒株的中和抗體 病毒株MN JR-FLCOa．抗-RNP中和百分率1 99 77 862 71 71 -3 52 80 -4 72 55 375 9 79 -6 28 60 317 18 - -8 0 - -9 0 - -b．HIV-1(+)Pt.M99 30 -HIVIGtm93 94 54c．正常NL-1 11 - -NL-2 8 - -NL-3 1 - -IVIGcm19 20 -
實施例2來自人個體的PCR(+)血漿對人PBMC的體外感染本實施例表明h-CAEV感染人PBMC細胞的能力。提供了獲救的CAEVgag序列的比較。
來自通過PCR測定的CAEV感染陰性(即PCR-)供體的80萬個人PBMC培養(yǎng)物，用100μl來自患者Hmc4的血漿(其是CAEV感染陽性的(PCR+))接種，總體積為1ml。4天后，抽提基因組DNA、細胞RNA和培養(yǎng)上清的RNA并經(jīng)CAEV gag引物的PCR和RT-PCR分析，對最終稀釋至1ml的100μl起始血漿也進行了測試。PCR反應的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)出在基因組DNA、RNA和培養(yǎng)上清中的CAEV gag信號，而患者Hmc4的接種血漿中CAEV的水平要低于可檢測水平。這表明CAEV可繁殖性地感染人PBMC細胞。用來自記作Hmc1的人個體的PCR(+)血漿對人PBMC進行了類似的感染，也得到了類似的結果。
從上述實驗的感染細胞培養(yǎng)物中獲救CAEV病毒。來自Hmc4實驗的獲救序列與來自同一個體的基因組DNA和血漿RNA的序列相比較。從感染的PBMC克隆的CAEV gag序列與圖3中來自患者Hmc4的濃縮血漿的序列相符合。圖3比較了來自PCR和RT-PCR的下列Hmc4相關的CAEV gag克隆Hmc4基因組克隆g-30,g-39,g-40,g-46和g-50；Hmc4血漿克隆p254和p-256；來自感染實驗的克隆i-238和i-239?！癷”克隆來自感染培養(yǎng)物的細胞質。方框表示所有的"p"和"i"克隆與來自Hcm4的基因組克隆g-30間存在集合一定的相似處，這表明在該患者存在特定活性形式的一個亞集合。
在圖3提供的數(shù)據(jù)中，很容易的顯示出感染人的CAEV亞型區(qū)別于參照的感染山羊的CAEV M33677(本文中也記作“CAEV-CO”)。例如，在對應于由SEQ ID NOs:16和17所示引物擴增出的173個核苷酸的片段的相對較小基因組區(qū)域中，發(fā)現(xiàn)人-CAEV病毒具有至少兩個突變是特定人源的。這些突變在Hmc4克隆的173gag區(qū)域的擴增產(chǎn)物上對應于第56位的鳥嘌呤和第77位的胞嘧啶。
圖4表示PCR擴增的146個核苷酸的POL基因區(qū)域序列的比較，該序列對應于山羊病毒CAEV病毒株79-63的第3223-3358核苷酸。參照的病毒株CAEV-CO來自山羊腦。腦是一個免疫豁免位點。因此，該病毒的進化不同于分離自關節(jié)炎山羊的關節(jié)液的病毒。gWa19感染了來自關節(jié)液的病毒，CAEV 79-63病毒株。人形式的進化可能更相似于CAEV-63。圖4比較了參照山羊CAEV-CO，分離自Hmc4的人-CAEV和山羊gWa19 CAEV-63病毒。圖4中感染山羊的病毒的序列與感染人的CAEV病毒的序列的不同處很明顯。因此，本文討論涉及新的能夠感染人的人-CAEV慢病毒。
圖5表示對來自山羊的CAEV病毒株CAEV-CO和gWa19(即，CAEV-79-63)和來自人的h-CAEV病毒株Hmc1和Hmc4，在圖3所示的相同的173個核苷酸區(qū)域的直接序列比較。來自人的CAEV(人-CAEV)和來自山羊的CAEV之間的差異百分比如表4所小節(jié)的。Hmc1和Hmc4為人-CAEV，而gWa19,CO和g147為山羊-CAEV。
表4差異百分比pol(173個核苷酸)最大百分率最小百分率克隆數(shù)Hmc4/gWa19 4.01.7 7/1Hmc1/gWa19 8.71.2 10/1Tn8(g147)/gWa19 1.71.7 1/1pol(146個核苷酸)Hmc4/gWa19 8.22.1 5/4gwa19/Co4.04.0 1/1(特定人gag突變包括第56和77位的核苷酸)
實施例3利用CAEV疫苗免疫接種個體本實施例描述對一個個體施用CAEV疫苗以刺激抗CAEV的免疫應答的方法。
通過接種PBMC細胞(見實施例2)或單核細胞制備人-CAEV，收集病毒細胞懸浮液，通過150000g，4℃離心沉淀CAEV病毒顆粒，從而獲得含有50％甘油作為稀釋劑的約2×108pfu/ml的無菌懸浮液(見Graham等，J.Infect.Dis.166:244-252(1992)，在此引入供參考)。活病毒受體進行真皮免疫接種，在一個皮膚位點上用無菌分叉針，接種50μlCAEV懸浮液。免疫接種也可以用滅活的或者減毒的CAEV制品或其他CAEV免疫原如CAEVgp135(見表1，同上)。在免疫點作無菌透明包扎在形成硬殼后再清除。
在施用CAEV免疫原后的第14、28和54天，抽取血樣進行評估，測定抗體滴度(體液應答)或T輔助細胞或細胞毒T細胞免疫應答(細胞應答)。用于檢測體液和細胞應答的方法如實施例1中所公開的或者如本領域所熟知的(見，例如，Egan等，J.Infect.Dis.171:1623-1627(1995)，在此提供作參考，還可見Harlow和Lane，同上，1988)。如果希望，第二次(加強)免疫可在頭次免疫后的第56天給予。另外的體液和細胞應答可在頭次免疫后的第70、90、160、180、270和355天進行評估。如果希望，第三次(加強)免疫可在頭次免疫后的第365天進行。
對于施用的CAEV免疫原是半抗原肽時，約1mg的肽與匙孔嘁血藍蛋白綴合并和佐劑一起以0.1ml的體積如上所述經(jīng)真皮施用。如上進行體液和細胞應答的評估，如果愿意，可以施用第二次或第三次免疫。
雖然本發(fā)明參考如上所述實施例進行了描述，但是應知在不離開本發(fā)明精神下可作各種修正。所以，本發(fā)明被如下的權利要求限定。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人南加利福尼亞大學(ⅱ)發(fā)明名稱山羊關節(jié)炎-腦炎病毒提供抗HIV-1感染的免疫保護(ⅲ)序列數(shù)目21(ⅳ)通信地址(A)地址Campbell & Flores LLP(B)街道4370 La Jolla Village Drive,Suite 700(C)城市San Diego(D)州California(E)國家美國(F)郵政編碼92122(ⅴ)計算機閱讀格式(A)介質類型軟盤(B)計算機類型IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatenIN Release #1.0,Version #1.25(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日1997年3月14日(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Campbell,Cathryn A.
(B)注冊號31,815(C)案號/文檔號FP-US 2495(ⅸ)電迅信息(A)電話(619)535-9001
(B)電傳(619)535-8949(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Glu Arg Lys Arg Glu Gly Phe Thr Ala Gly1 5 10(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Ser His His Gly Asn Asp Ser Arg Arg Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Ser Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ser1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Arg Lys Glu Thr Gly Thr Leu Gly Gly1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Arg Lys Lys Arg Glu Leu Ser His Lys Arg Lys Lys Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Arg Met Gln Arg Lys Glu Arg His Lys1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Val Arg Ser Ser Tyr Gly Ile Thr Ser Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Gly Arg Ile Lys Leu Gln Gly Ile Gly Gly1 5 10(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Gln Glu Ile Leu Glu Asp Trp Ile Gln Gln1 5 10(2)SEQ ID NO:10的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Lys Arg Ile Asn Asn Lys Tyr Asn Lys Asn Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11Asp Gly Leu Leu Glu Gln Glu Glu Lys Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Ser Val Phe Pro Ile Val Val Gln Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13Ala Ile Asp Ala Glu Pro Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14GCAGTTGGCA TATTATGCTA CTAC 24(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15CTTGTTGTAC TCTTTGTCCT AGTG 24(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16GAGCAGTAAG ACATATGGCG CAC23(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17TGATGVCATTT GTATAAGATA GTGTTAGCTT T31TGATGCATTT GTATAAGATA GTGTTAGCTT T(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18GGATTTGAAC TACACCCGCA G 21(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19CCTGTTGATA CTATGAACCC TAGAC 25(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20AAGAACCTAA GCATCCCGCA AC 22(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21GTGATGTTCC CTAATTGCAA TTCTAGTC28
權利要求
1．一種含有CAEV免疫原和一個藥學可接受的載體的疫苗。
2．如權利要求1所述的疫苗，其中所說的CAEV免疫原為CAEV。
3．如權利要求1所述的疫苗，其中所說的CAEV免疫原為CAEVgp135。
4．如權利要求1所述的疫苗，其中所說的CAEV免疫原為選自SEQID NOS:1至13所示的一組序列的氨基酸序列。
5．如權利要求1所述的疫苗，還含有一個70K免疫原。
6．一種在個體中刺激抗CAEV的免疫應答的方法，包括對一個個體施用治療有效量的CAEV免疫原，其中所說的治療有效量的所說CAEV免疫原刺激抗CAEV的免疫應答。
7．如權利要求6所述的方法，其中所說的個體是人并且所說的抗CAEV的免疫應答對HIV-1交叉反應。
8．一種刺激抗CAEV的免疫應答的方法，包括以治療有效量的CAEV免疫原接觸淋巴細胞，其中所說的治療有效量的所說的CAEV免疫原刺激抗CAEV的免疫應答。
9．如權利要求8所述的方法，其中所說的接觸為體外操作。
10．如權利要求8所述的方法，其中所說淋巴細胞為T細胞。
11．如權利要求8所述的方法，其中所說淋巴細胞為B細胞。
12．一種對懷疑受CAEV感染的樣品診斷CAEV感染的方法，包括下述步驟a．獲得樣品；b．將所說的樣品在合適的條件下接觸一個CAEV抗原；并且c．檢測所說樣品中存在的抗體與所說的CAEV抗原的特異結合，其中所說的特異結合的檢測是對樣品感染CAEV的診斷指征。
13．如權利要求12所述的方法，其中所說的樣品獲得自一個個體。
14．如權利要求13所述的方法，其中所說的個體為一人個體。
15．如權利要求13所述的方法，其中所說的獲得自一個個體的樣品為血清樣品。
16．如權利要求12所述的方法，其中所說的CAEV抗原結合于一個固體支持物。
17．如權利要求12所述的方法，其中所說的檢測步驟通過ELISA完成。
18．如權利要求17所述的方法，其中所說的ELISA為競爭ELISA。
19．如權利要求12所述的方法，其中所說的CAEV抗原是CAEVgp135。
20．一種用于診斷懷疑受CAEV感染的樣品的試劑盒，包括一個結合CAEV抗原的固體支持物，一個結合所說的CAEV抗原的對照抗體和一個可檢測基元。
21．一種對非山羊哺乳動物個體診斷CAEV感染的方法，所說的方法包括在所說的個體中檢測對應于CAEV核酸的基因組或轉錄mRNA的序列。
22．一種對非山羊個體診斷CAEV感染的方法，所說的方法包括a)將得自一個懷疑受CAEV感染的個體的核酸與可擴增CAEV基因組核酸片段的引物在適合形成可檢測的擴增產(chǎn)物的條件下相接觸；并b)檢測含有CAEV基因組核酸的擴增產(chǎn)物，由此所說的檢測表明所說的個體已被CAEV感染。
23．分離的人-CAEV。
24．如權利要求23所述的人-CAEV，其中所說的人-CAEV的特征在于具有感染人外周血單細胞的能力。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有山羊關節(jié)炎－腦炎病毒(CAEV)免疫原和一個藥學可接受的載體的疫苗。本發(fā)明還提供了一種通過對一個個體施用治療有效量的CAEV免疫原,從而在該個體中刺激抗免疫缺損病毒－1感染或CAEV感染的免疫應答的方法。本發(fā)明進而還提供了一種通過將淋巴細胞與治療有效量的CAEV免疫原相接觸而體外刺激免疫應答的方法。本發(fā)明也提供了診斷人的CAEV感染的方法。
文檔編號C12P21/08GK1219881SQ97193871
公開日1999年6月16日 申請日期1997年3月14日 優(yōu)先權日1996年3月15日
發(fā)明者安吉琳·多瓦斯, 格蘭·厄里斯曼 申請人:南加利福尼亞大學