專利名稱：制備生物反應(yīng)器的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備生物反應(yīng)器的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用表面活性劑純化酶的方法和用蛋白酶再生固定化酶載體的方法。
背景領(lǐng)域生物反應(yīng)器為在人工容器中復(fù)制生化反應(yīng)的系統(tǒng)技術(shù)，并且由該術(shù)語(yǔ)所指的內(nèi)涵已逐漸擴(kuò)展。然而，正如這里所使用的，生物反應(yīng)器意為其中的酶本身用作催化劑的反應(yīng)器。為了這個(gè)目的，該酶為了作為催化劑的經(jīng)濟(jì)使用應(yīng)該以某種方式加以固定。因此，固定化酶在生物反應(yīng)器中起主導(dǎo)作用。決定固定化酶優(yōu)越性的一個(gè)重要因素是所用酶的純度。
根據(jù)目的酶和雜質(zhì)蛋白的特性，通過(guò)適當(dāng)結(jié)合通常已知的各種蛋白分離技術(shù)從生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化酶蛋白。目前，主導(dǎo)的分離技術(shù)包括，例如，利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉淀法等；利用分量差異的方法如透析、超濾、凝膠過(guò)濾、聚丙烯酰胺電泳等；利用電荷的方法，如離子交換層析等；利用親和特異性的方法如親和層析等；利用疏水性差異的方法如反相高效液相色譜等；和利用等電點(diǎn)差異的方法如等電點(diǎn)電泳等。
然而，在實(shí)踐中沒(méi)有幾種情況可從目的酶中完全去除雜質(zhì)蛋白。這可能歸結(jié)于目的酶與雜質(zhì)蛋白在常規(guī)蛋白分離方法所用的各種理化特性中缺乏明顯的差異。例如，通過(guò)如透析、硫酸銨分級(jí)分離、陰離子交換層析等(未審查的日本專利公開(kāi)號(hào)5-84078)步驟反復(fù)分離作為起始原料的粗細(xì)胞提取液可將源自假單胞桿菌屬的頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶〔將頭孢菌素C和戊二?；?-氨基頭孢菌酸(GL7-ACA)轉(zhuǎn)化成7-氨基頭孢菌酸(7-ACA)的酶；之后簡(jiǎn)稱為CC酰基轉(zhuǎn)移酶〕純化至約95％的純度。然而，通過(guò)常規(guī)的方法不能夠去除污染物脫乙?；敢?yàn)槠湓陉庪x子交換樹(shù)脂柱中幾乎顯示出與CC?；D(zhuǎn)移酶相同的行為。脫乙?；甘?-ACA脫乙?；鶑亩a(chǎn)生脫乙酰基7-ACA，導(dǎo)致7-ACA較低的產(chǎn)量。因此，存在一種能夠分離和去除該無(wú)需蛋白的新的酶純化方法的強(qiáng)烈需求。
決定固定化酶優(yōu)越性的另一因素為固定化酶載體的壽命。一般來(lái)說(shuō)，酶對(duì)加熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等趨于不穩(wěn)定，并且甚至在適于酶反應(yīng)的條件下容易喪失活性。固定化酶隨著其反復(fù)使用顯示出逐漸降低的酶活性，因而降低目的物質(zhì)的生產(chǎn)效率。降解的固定化酶一般被丟棄，但當(dāng)離子交換樹(shù)脂用作載體時(shí)，從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)上考慮，此載體的循環(huán)使用是必要的。
用于再生固定化酶載體的常規(guī)方法包括使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿從而從載體中釋放和去除酶，然而，通過(guò)此方法不可能將酶從載體中完全去除，從而導(dǎo)致當(dāng)反復(fù)再生載體和固定化酶時(shí)此固定化酶活性的劇烈下降。特別是當(dāng)載體具有細(xì)小孔時(shí)，該酶凝集于細(xì)小孔中，由于再生和再固定而導(dǎo)致適當(dāng)?shù)慕到狻?br>
發(fā)明內(nèi)容
因此，提供用于選擇性分離和去除對(duì)目的酶不必要并且不能通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)去除的雜質(zhì)酶的方法從而使高純度目的酶的制備成為可能是本發(fā)明的一個(gè)目的。本發(fā)明的另一目的是提供能夠有效從載體去除酶再生固定化酶載體的方法。
本發(fā)明者進(jìn)行了深入的研究試圖達(dá)到上述目的并且具有利用由表面活性劑所致蛋白選擇性聚集和沉淀的觀念。因此，他們用由脫乙?；肝廴镜腃C酰基轉(zhuǎn)移酶溶液系統(tǒng)從各方面加以研究。結(jié)果顯示添加表面活性劑，特別是陽(yáng)離子表面活性劑導(dǎo)致脫乙酰基酶的選擇性聚集和沉淀，并且用該作用，本發(fā)明者成功制備出具有高純度和高7-ACA制備效率的標(biāo)準(zhǔn)CC?；D(zhuǎn)移酶產(chǎn)物。
通過(guò)使蛋白酶作用于由吸附CC酰基轉(zhuǎn)移酶至離子交換樹(shù)脂載體并以戊二醛交聯(lián)CC?；D(zhuǎn)移酶而獲得的固定化酶，本發(fā)明者也成功有效地去除CC?；D(zhuǎn)移酶。此外，他們發(fā)現(xiàn)，在用上述酶和交聯(lián)劑的固定化酶情形中，酸性蛋白酶的使用對(duì)去除酶特別有效，這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
因此，本發(fā)明提供了純化酶的方法，包括用表面活性劑導(dǎo)致雜質(zhì)酶選擇性聚集和沉淀。本發(fā)明也提供上述用于純化酶，特別是?；D(zhuǎn)移酶的方法，其中的表面活性劑為陽(yáng)離子表面活性劑。本發(fā)明也提供用于純化上述?；D(zhuǎn)移酶的方法，其中的?；D(zhuǎn)移酶為頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶并且雜質(zhì)酶為脫乙酰基酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于純化上述酶的方法，其中的表面活性劑為甲基型或芐基型陽(yáng)離子表面活性劑，特別是氯化烷基(棕櫚基)二甲芐基銨，此外，本發(fā)明提供用于純化上述?；D(zhuǎn)移酶的方法，其中的陽(yáng)離子表面活性劑以0.1-0.6％的濃度使用。
此外，本發(fā)明還提供了用于再生固定化酶載體的方法，包括將蛋白酶對(duì)固定化酶作用從而從該載體中去除酶，所述的固定化酶通過(guò)將此酶與載體，如合成的吸附劑和離子交換樹(shù)脂結(jié)合，并且在結(jié)合后用交聯(lián)劑任選地交聯(lián)酶而制備。特別地，本發(fā)明提供了用于再生上述載體的方法，其中所述的載體具有細(xì)小的孔。此外，本發(fā)明提供了用于再生上述載體的方法，其中的酶為CC?；D(zhuǎn)移酶。此外，本發(fā)明提供了用于再生上述載體的方法，其中所述的蛋白酶為酸性蛋白酶。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了再生和重新固定后再生條件對(duì)固定化CC酰基轉(zhuǎn)移酶活性的影響。
發(fā)明詳述只要其較其它雜質(zhì)酶對(duì)至少一種表面活性劑顯示出更低的聚集和較少的沉淀，適用于本發(fā)明純化方法的酶沒(méi)有任何特別的限制。優(yōu)選地，在其中不到95％雜質(zhì)酶聚集和沉淀的條件下不到70％的酶保持于溶液中。優(yōu)選酶的實(shí)例包括?；D(zhuǎn)移酶，特別是CC?；D(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明純化方法待去除的雜質(zhì)酶應(yīng)該具有較目的酶對(duì)至少一種表面活性劑更易聚集和沉淀的特性。例如，當(dāng)目的酶為?；D(zhuǎn)移酶時(shí)，雜質(zhì)酶的實(shí)例有脫乙酰基酶等。可以含有多種雜質(zhì)酶。當(dāng)每種雜質(zhì)酶通過(guò)不同種表面活性劑聚集和沉淀時(shí)，首先加入一種表面活性劑以導(dǎo)致第一種雜質(zhì)酶聚集和沉淀，接著通過(guò)離心或過(guò)濾去除沉淀物，并且然后，加入不同的表面活性劑以導(dǎo)致另一種雜質(zhì)酶的聚集和沉淀。
本發(fā)明中待用的表面活性劑沒(méi)有特別的限制并且可根據(jù)目的酶和雜質(zhì)酶的特性選自陽(yáng)離子、陰離子和非離子型表面活性劑。例如，當(dāng)去除污染?；D(zhuǎn)移酶溶液的脫乙酰基酶時(shí)，優(yōu)選使用陽(yáng)離子表面活性劑，更優(yōu)選使用甲基型或芐基型陽(yáng)離子表面活性劑，特別是甲基和芐基型陽(yáng)離子表面活性劑〔如，氯化烷基(棕櫚)二甲芐基銨等〕。
表面活性劑可以隨表面活性劑的種類以及目的酶和雜質(zhì)酶的組合而變化的濃度使用。所需的濃度為使95％或更多雜質(zhì)酶聚集和沉淀并且使70％或更多目的酶保留于溶液中的濃度，例如，當(dāng)目的酶為酰基轉(zhuǎn)移酶并且雜質(zhì)酶為脫乙?；笗r(shí)，此表面活性劑加入至0.1-0.6％的濃度。
只要其可用于通過(guò)典型載體結(jié)合方法對(duì)酶固定化，可應(yīng)用于本發(fā)明載體再生方法中的載體沒(méi)有特別的限制。其實(shí)例包括天然吸附劑如活性炭、酸性粘土、高嶺石、硅藻土、氧化鋁、皂土、硅膠、氧化鈦、殼多糖、鞣質(zhì)等；合成的吸附劑如其中導(dǎo)入有疏水殘基(如，丙基、丁基、己基、苯基等)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺凝膠等；具有離子交換基的多糖凝膠；離子交換樹(shù)脂等。合成吸附劑和離子交換樹(shù)脂是優(yōu)選的。載體的種類可根據(jù)待固定的酶特性等而改變。
當(dāng)載體具有細(xì)小孔(本發(fā)明的細(xì)小孔意指具有100nm或更小直徑的孔)時(shí)本發(fā)明的載體再生方法特別有效。例如，當(dāng)酶通過(guò)載體結(jié)合方法和交聯(lián)方法的組合而固定于載體上時(shí)，用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的常規(guī)方法未能溶解由形成交聯(lián)而固定的酶。然后此酶凝集于細(xì)小的孔中以導(dǎo)致載體的顯著降解。相反，本發(fā)明用蛋白酶的降解方法提供從載體中有效去除固定酶，因?yàn)樵摴潭赣捎诘鞍酌傅淖饔枚到?，?dǎo)致該酶的重新溶解。
只要其可通過(guò)物理吸附、離子鍵合等與載體結(jié)合而不喪失其活性，待固定于載體上的酶沒(méi)有特別的限制，并且可以使用源自微生物、植物和動(dòng)物的多種酶。工業(yè)化酶包括?；D(zhuǎn)移酶、酰化氨基酸水解酶、轉(zhuǎn)化酶、腈水合酶、糖異構(gòu)酶等。
酶可通過(guò)常規(guī)的載體結(jié)合方法(其中的酶與不溶于水載體結(jié)合的固定方法，包括本發(fā)明中通過(guò)物理吸附的結(jié)合方法)固定至載體上。特別地，根據(jù)需要，通過(guò)離子親鍵、疏水親鍵或物理吸附將酶與載體結(jié)合。例如，當(dāng)離子交換樹(shù)脂用作載體時(shí)，將平衡的樹(shù)脂包裝于柱中并將含有酶的適當(dāng)緩沖液流經(jīng)柱(400-100單位/mL柱)，因而使該酶與樹(shù)脂結(jié)合。
當(dāng)僅僅載體結(jié)合不足以阻止酶泄漏時(shí)，將與該載體結(jié)合后的酶以交聯(lián)劑交聯(lián)并且固定。交聯(lián)劑的實(shí)例包括戊二醛、1,6-己二異氰酸酯等。通過(guò)洗上述方法獲得的固定化酶并且將溶解于適當(dāng)緩沖液中的交聯(lián)劑經(jīng)柱循環(huán)大約0.5-2小時(shí)而進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)劑中未反應(yīng)的官能團(tuán)需要以失活劑如甘油經(jīng)該柱循環(huán)約0.5-1小時(shí)而加以失活。
固定化酶載體可按如下再生。將通過(guò)上述固定方法制備的固定化酶反復(fù)用于已知的酶反應(yīng)直至其喪失一半的酶活性，并且將含有3-50單位/mL酸性蛋白酶(或堿性蛋白酶)的溶液(pH 3-5或pH 9-11)以大約5-15倍的柱床體積并以5-20柱床/小時(shí)的流速(之后表示為SV5-20)流經(jīng)含有所述固定化酶的柱床約1到5小時(shí)。再生反應(yīng)溫度為20-60℃，優(yōu)選30-50℃。
酶可以與第一次固定相同的方式重新固定至再生的固定載體上。
實(shí)施例通過(guò)僅用于例舉的實(shí)例本發(fā)明詳細(xì)解釋如下并且并不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1 通過(guò)不同的表面活性劑脫乙?；笍腃C?；D(zhuǎn)移酶溶液中的分離和去除(1)CC?；D(zhuǎn)移酶制備菌的培養(yǎng)和粗提取液的純化將突變的CC酰基轉(zhuǎn)移酶N-176制備菌大腸桿菌JM 109(PCCN176-2)FERM BP-3047根據(jù)實(shí)施例3中公開(kāi)的未審查的日本專利公開(kāi)No.5-84078的方法培養(yǎng)并通過(guò)離心收獲細(xì)胞，以勻漿器破碎獲得的細(xì)胞沉淀并用水提取可溶的蛋白組分，接著離心去除廢物，繼而獲得粗提取液。(2)通過(guò)表面活性劑對(duì)污染脫乙?；傅娜コ龑⒕垡蚁﹣啺芳尤氲缴鲜?1)中獲得的粗提取液中以使核酸沉淀，接著離心以回收上清液。將此上清液應(yīng)用至以磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的DEAE柱，以水洗并用0.2M-NaCl洗脫(通過(guò)此步驟，選擇性回收另一種雜質(zhì)酶，β-內(nèi)酰胺酶并將其從非吸附餾份中去除)。向此獲得的洗脫液中加入陽(yáng)離子表面活性劑氯化烷基(棕櫚)二甲芐基銨〔商品名Cation F2-50；由NOF公司生產(chǎn)(以下同)〕，氯化烷基〔棕櫚〕三甲基銨(商品名Cation FB)或氯化十二烷基三甲基銨〔商品名Cation BB〕，陰離子表面活性劑烷基甘氨酸〔商品名Nissan Anon LG〕或非離子型表面活性劑聚氧化乙烯辛基苯醚(商品名Nonion HS-210)或聚氧化乙烯山梨聚糖油酸單酯(商品名Nonion OT-221)至0.1、0.3和0.5％的終濃度，并將混合物于室溫靜置16小時(shí)。測(cè)定添加該表面活性劑前后每種樣品中CC?；D(zhuǎn)移酶和脫乙酰基酶的活性并且測(cè)定其變化。通過(guò)定量測(cè)定以GL7-ACA為底物而產(chǎn)生的7-ACA和去乙酰7-ACA而計(jì)算酶的活性。結(jié)果顯示于表1中。Cation F2-50在0.1-0.3％濃度時(shí)顯示出90％或更多的CC酰基轉(zhuǎn)移酶殘余活性并且污染的脫乙?；富钚越抵敛怀^(guò)5％。在0.5％的濃度時(shí)，脫乙酰基酶幾乎被完全去除。其它2種陽(yáng)離子表面活性劑在0.5％的濃度時(shí)也顯示出選擇性去除脫乙?；?。當(dāng)使用陰離子或非離子型表面活性劑時(shí)，在此測(cè)定濃度范圍中不能夠完全去除脫乙?；?，但脫乙?；傅幕钚越抵烈话牖蚋俣鴰缀鯖](méi)有降低CC?；D(zhuǎn)移酶的活性。
表1通過(guò)添加不同的表面活性劑對(duì)去除污染的脫乙?；傅挠绊?

1)殘余活性以基于添加表面活性劑之前(添加濃度0％)的酶活性為100的相對(duì)活性表示的。實(shí)施例2 通過(guò)蛋白酶對(duì)交聯(lián)的CC酰基轉(zhuǎn)移酶沉淀物的溶解向10mM含有67單位/mL CC?；D(zhuǎn)移酶N176的Tris HCl緩沖液(pH8.0,5mL)(如何獲得該酶公開(kāi)于未審查的日本專利公開(kāi)No.5-84078)中加入含有2％戊二醛的1 50mM Tris HCl緩沖液(pH8.7,5mL)中并將混合物攪拌1小時(shí)以造成反應(yīng)，繼而交聯(lián)產(chǎn)物得以沉淀。通過(guò)離心去除上清液并且回收沉淀物。向此沉淀物中加入3mL 2N-NaOH、0.1N-NaOH、0.1N-NaOH+堿性蛋白酶〔Bioprase AL-15(30單位)；Nagase生化有限公司生產(chǎn)〕，2N-HCl、0.1N-HCl或0.1N-HCl+酸性蛋白酶〔Denapsin(30單位)；由Nagase生化有限公司生產(chǎn)〕并將沉淀物于40℃浸入其中2小時(shí)。結(jié)果，單獨(dú)加入NaOH或HCl沒(méi)有導(dǎo)致沉淀物的改變，但加入HCl+酸性蛋白酶導(dǎo)致沉淀物的完全溶解并獲得了清亮的溶液。雖然添加NaOH+堿性蛋白酶也導(dǎo)致該沉淀物幾乎完全的溶解，但溶液渾濁并且沒(méi)有獲得完全的溶解。從上面的結(jié)果，顯示通過(guò)交聯(lián)處理而固定的CC?；D(zhuǎn)移酶通過(guò)使用蛋白酶，特別是酸性蛋白酶而有效地再溶解。實(shí)施例3 通過(guò)蛋白酶對(duì)固定的CC酰基轉(zhuǎn)移酶載體的再生(1)固定化載體的制備將一種新的苯乙烯-二乙烯苯高度多孔的強(qiáng)堿離子交換樹(shù)脂〔80mL,HPA 25(具有直徑10-100nm的細(xì)小孔)；由三菱化學(xué)公司生產(chǎn)〕浸入1N-NaOH∶甲醇=1∶1中一天并且包裝于柱(350mm×15cm)中。然后，以SV3將3-倍體積的2N-HCl流經(jīng)該柱并且以5-倍體積的水(SV3)洗柱，之后以SV3將5-倍體積的0.1N-HCl流經(jīng)此柱并且以水以SV3洗柱直至該柱的流出液pH變?yōu)?或更高。(2)CC酰基轉(zhuǎn)移酶的固定將上述(1)中制備的HPA 25(80mL)包裝于柱中并且用10mM含有CC?；D(zhuǎn)移酶N176(67單位/mL)的Tris HCl緩沖液(pH8.0,240mL)以SV3流經(jīng)此柱。以240mL水(SV3)洗柱后，將60mM含有2％戊二醛的磷酸緩沖液(pH8.0,300mL)以SV20循環(huán)1小時(shí)同時(shí)調(diào)整pH至7.5。交聯(lián)后，以400mL水(SV3)洗柱。然后，將60mM含有0.2M甘氨酸的磷酸緩沖液(pH8.0,300mL)以SV10循環(huán)1小時(shí)以失活未反應(yīng)的醛基。用水(400mL或更多)以SV5洗柱以得到82mL固定于HPA25上的?；D(zhuǎn)移酶。(3)通過(guò)固定的CC酰基轉(zhuǎn)移酶制備7-ACA將固定于HPA25(20mL)且在上述(2)中制備的CC?；D(zhuǎn)移酶裝于具有夾套(jacket)的柱中，并且以大約70mL/分鐘的循環(huán)流速于20℃將6.0mg/mL戊二?；?-氨基頭孢菌酸(GL7-ACA)溶液(100mL)循環(huán)1小時(shí)同時(shí)以NaOH調(diào)pH至7.75，繼而獲得7-ACA。反應(yīng)后，用水沖出柱中的反應(yīng)混合物并回收7-ACA。將上述反應(yīng)重復(fù)100次(連續(xù)分批反應(yīng))作為一個(gè)循環(huán)。(4)固定化載體的再生用2N-NaOH、0.1N-NaOH+Bioprase(3000ppm,10單位/mL)或0.1N-HCl+Denapsin(3000ppm,10單位/mL)作為再生劑，每個(gè)循環(huán)再生HPA25。將再生劑(載體體積的10-倍)于40℃ SV約20循環(huán)5小時(shí)。
再生反應(yīng)后，重復(fù)上述步驟(1)-(4)2到4次，并且測(cè)定再固定(2)后CC?；D(zhuǎn)移酶的活性。比較其活性的改變。
結(jié)果顯示于圖1中。當(dāng)2N-NaOH用作再生劑時(shí)，固定化CC酰基轉(zhuǎn)移酶的活性每輪循環(huán)幾乎降低一半，而用0.1N-HCl和Denapsin(酸性蛋白酶)甚至在3輪循環(huán)后仍沒(méi)有導(dǎo)致酶活性的下降。當(dāng)使用0.1N-NaOH和Bioprase(堿性蛋白酶)時(shí)，與單獨(dú)使用NaOH相比，每輪循環(huán)后CC?；D(zhuǎn)移酶的活性下降較小的幅度，并且甚至經(jīng)4輪循環(huán)后仍表現(xiàn)出不到原初活性的50％。
本發(fā)明的酶純化方法特征在于通過(guò)表面活性劑利用蛋白的選擇性聚集和沉淀分離和去除不能夠用常規(guī)純化方法去除且對(duì)目的酶是不必要的雜質(zhì)酶。因此，根據(jù)本發(fā)明，可制備較常規(guī)產(chǎn)物具有更高純度的標(biāo)準(zhǔn)酶產(chǎn)物。此外，基于蛋白酶對(duì)酶的作用而用于再生本發(fā)明固定化酶載體的方法可極其有效地從載體去除酶，從而長(zhǎng)期連續(xù)的循環(huán)使用此載體得以實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明大大地有利于生物反應(yīng)器生產(chǎn)成本的降低并防止與載體廢物處理有關(guān)的環(huán)境破壞。
本申請(qǐng)是基于在日本提交的申請(qǐng)Nos.212383/1996和212387/1996，在此摻入其內(nèi)容僅供參考。在此摻入的所有公開(kāi)參考與其中具體描述的每個(gè)單個(gè)公開(kāi)相同的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1．純化酶的方法，其特征在于用表面活性劑選擇性地聚集和沉淀雜質(zhì)酶。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的表面活性劑為陽(yáng)離子性的。
3．純化?；D(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于用陽(yáng)離子表面活性劑選擇性聚集和沉淀雜質(zhì)酶。
4．權(quán)利要求3的?；D(zhuǎn)移酶純化方法，其中的?；D(zhuǎn)移酶為頭孢菌素C酰基轉(zhuǎn)移酶，并且雜質(zhì)酶為脫乙?；浮?br> 5．權(quán)利要求3或4的?；D(zhuǎn)移酶純化方法，其中的陽(yáng)離子表面活性劑為甲基型或芐基型。
6．權(quán)利要求3的?；D(zhuǎn)移酶純化方法，其中的陽(yáng)離子表面活性劑為氯化烷基(棕櫚)二甲基芐基銨。
7．權(quán)利要求3到6任一權(quán)利要求的?；D(zhuǎn)移酶純化方法，其中的陽(yáng)離子型表面活性劑以0.1-0.6％的濃度使用。
8．用于再生固定化酶載體的方法，包括使蛋白酶作用于固定化的酶從而從該載體上去除酶，所述的固定化酶通過(guò)將該酶與載體結(jié)合并且任選在結(jié)合后使用交聯(lián)劑交聯(lián)該酶而制備。
9．權(quán)利要求8的方法，其中的載體為合成的吸附劑或離子交換樹(shù)脂。
10．權(quán)利要求8或9的方法，其中的載體具有細(xì)小的孔。
11．權(quán)利要求8到10中任一權(quán)利要求的方法，其中的酶為頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶。
12．權(quán)利要求8到11中任一權(quán)利要求的方法，其中的蛋白酶為酸性蛋白酶。
全文摘要
用于純化酶,特別是?；D(zhuǎn)移酶的方法,其特征在于用表面活性劑,特別是陽(yáng)離子表面活性劑選擇性聚集和沉淀雜質(zhì)酶,特別是脫乙酰基酶;用于通過(guò)處理由結(jié)合酶至載體且任選再加上以交聯(lián)劑交聯(lián)而制備的固定化酶再生固定化酶載體,特別是那些由合成吸附劑或離子交換樹(shù)脂所制成載體的方法;用于再生上述為多孔載體的方法;和用于再生其中的酶為頭孢菌素(?；D(zhuǎn)移酶的上述載體的方法。通過(guò)上面純化酶的方法,可選擇性地去除對(duì)靶酶是不必要的但又通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)不能去除的雜質(zhì)酶。因此,這些酶對(duì)于制備高度純酶樣本是有用的。與常規(guī)方法相比,用于再生固定化酶載體的上述方法使很有效地從此載體特別是多孔的載體中經(jīng)蛋白酶消化而去除該酶成為可能。因此,這些載體可反復(fù)使用,這使這些方法無(wú)論對(duì)環(huán)境還是對(duì)費(fèi)用角度均是有用的。
文檔編號(hào)C12N11/02GK1232496SQ97198500
公開(kāi)日1999年10月20日 申請(qǐng)日期1997年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月12日
發(fā)明者淺井克史 申請(qǐng)人:藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社 被以下專利引用 (1),