專利名稱：新型肌醇六磷酸酶及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對肌醇六磷酸具有低米氏常數(shù)(這里縮寫為Km)的廉價(jià)肌醇六磷酸酶，該酶降解飼料中所含的阻礙營養(yǎng)因子肌醇六磷酸，從而提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)還使由所說降解釋放出來的磷酸得到有效利用。
背景技術(shù)：
磷是所有有機(jī)體的基本元素。磷包含在飼養(yǎng)家養(yǎng)動物的植物來源的飼料中，并且50至70％的磷以肌醇六磷酸的形式存在。植物種子中所含的大量肌醇六磷酸是磷酸酯的一種主要貯存物質(zhì)。但是，肌醇六磷酸在單胃動物如豬、雞等的消化器官中沒有被消化和吸收而被排泄了，因此，雖然它是磷酸酯的一種主要貯存物質(zhì)，但它一點(diǎn)也沒被利用。因此，為了促進(jìn)其生長，人們在單胃動物的飼料中加入無機(jī)磷酸鹽，但是，在飼料中加入磷酸鹽導(dǎo)致了糞便中磷含量的增加。近年來，由于家養(yǎng)動物的產(chǎn)量不斷增加，家養(yǎng)動物的糞便也增加了，從而在全世界引起環(huán)境問題。具體來說，糞便中所含的磷是湖泊和沼澤中富營養(yǎng)現(xiàn)象的一個(gè)原因，排泄磷的數(shù)量達(dá)到要控制的地步，因而必須處理這個(gè)問題。
而且，肌醇六磷酸與作為重要的營養(yǎng)來源的二價(jià)金屬如鎂、鈣、鋅、鐵等螯合，使它們難以被動物吸收，從而導(dǎo)致飼料營養(yǎng)價(jià)值的降低，因此，肌醇六磷酸被認(rèn)為是一種阻礙營養(yǎng)因子。
由前所述，使用將肌醇六磷酸水解為肌醇和無機(jī)磷酸鹽的酶處理飼料，從而使肌醇六磷酸釋放磷酸鹽來代替?zhèn)鹘y(tǒng)上添加的磷酸鹽，同時(shí)降低糞便中的含磷量，并將作為阻礙營養(yǎng)因子的肌醇六磷酸降解，這種努力能提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值(美國專利No.3,297,548(1967)《營養(yǎng)雜志》101卷，1289-1294(1971))。已知能產(chǎn)生肌醇六磷酸酶(降解肌醇六磷酸的酶)的微生物包括細(xì)菌如枯草芽孢桿菌和假單胞菌、酵母如釀酒酵母、絲狀真菌如土曲霉、無花果曲霉和泡盛曲霉，關(guān)于來自無花果曲霉的肌醇六磷酸酶，其純化和生物特征在《制備生物化學(xué)》18卷，443-458(1988)中介紹，其基因和氨基酸序列描述于《基因》127卷，87-94(1993)。來自泡盛曲霉的肌醇六磷酸酶的核苷酸序列和氨基酸序列描述于《基因》133卷，55-62(1992)。
為證明該酶具有的能力，需要使其底物濃度高于米氏常數(shù)(Km)，在具有相同最大反應(yīng)速率(Vmax)的酶的情況下，具有較低Km值的酶，與具有較高Km值的酶相比較，即使在較低底物濃度時(shí)也不降低反應(yīng)速率。也就是說，具有較低Km值的酶即使在較低底物濃度時(shí)也能維持足夠的降解速率，而且與具有較高Km值的酶相比未降解底物的量也能減少。
來自絲狀真菌的已知肌醇六磷酸酶的米氏常數(shù)對無花果曲霉(WO91/05053)來說為250uM，對米曲霉來說為330uM(《生物科學(xué)、生物技術(shù)和生物化學(xué)》57卷，1364-1365(1993)。
在一個(gè)方面，酸性磷酸酶純化自不同的微生物，它們的特性已有報(bào)道，例如，來自無花果曲霉的酸性磷酸酶已被純化，它們的特性已被檢測(《制備生物化學(xué)》18卷，37-65(1988)。但是，酸性磷酸酶不能將肌醇六磷酸用作底物。因此，將它們按前述用來提高飼料中的營養(yǎng)價(jià)值是不可行的。
就前述而言，我們需要一種肌醇六磷酸酶，它能降解飼料中所含的、作為阻礙營養(yǎng)因子的肌醇六磷酸，從而提高飼料中的營養(yǎng)價(jià)值，并同時(shí)使所說降解釋放的磷酸鹽得到有效利用。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的是提供對肌醇六磷酸具有較低Km值的肌醇六磷酸酶以及制造該肌醇六磷酸酶的方法。
作為上述對解決這種難題所做的廣泛研究的結(jié)果，從屬于紅曲霉屬的微生物中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了當(dāng)以肌醇六磷酸為底物時(shí)Km值為10至110uM的新型肌醇六磷酸酶，揭示了它們的特性，并建立了制造所說肌醇六磷酸酶的方法，至此本發(fā)明完成。
即，本發(fā)明涉及具有Km值為10至110uM的新型肌醇六磷酸酶以及制造所說肌醇六磷酸酶的方法。
本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶的具體實(shí)例包括具有如下理化特性的3種肌醇六磷酸酶。
1．肌醇六磷酸酶Ⅰ
1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為27uM；2)最適pH:pH5.5；3)pH穩(wěn)定性在pH5.5至6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至35℃穩(wěn)定6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約80至100KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI5.7(層析聚焦法)。
2．肌醇六磷酸酶Ⅱ1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為20uM；2)最適pH:pH6.0；3)pH穩(wěn)定性在pH6.0至7.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至50℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約120KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI4.8(層析聚焦法)。
3．肌醇六磷酸酶Ⅲ1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為107uM；2)最適pH:pH2.5；3)pH穩(wěn)定性在pH2.0至8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度45℃；5)溫度穩(wěn)定性至60℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以對硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約140KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI5.2(層析聚焦法)；
9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
用于本發(fā)明的微生物可以是任何能產(chǎn)生在肌醇六磷酸用作底物時(shí)Km值為10-110uM的新型肌醇六磷酸酶。其例子為屬于紅曲霉屬的微生物，特別提到的是亞克紅曲霉IFO3087。并且，能夠制造在以肌醇六磷酸為底物時(shí)Km值為10至110uM的新型肌醇六磷酸酶的動物細(xì)胞也可用于本發(fā)明。
能夠制造新型肌醇六磷酸酶的微生物用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)到肌醇六磷酸酶形成并積累。由培養(yǎng)物中回收肌醇六磷酸酶，從而制得新型肌醇六磷酸酶。以下，用于制造新型肌醇六磷酸酶的微生物稱為新型肌醇六磷酸酶制備有機(jī)體。
如果新型肌醇六磷酸酶制備微生物是一種原核生物如大腸桿菌或真核生物如絲狀真菌、酵母等，用來培養(yǎng)所說微生物的培養(yǎng)基可以是一種天然或合成培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基含有能被微生物同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽等，在培養(yǎng)基中微生物能有效生長。
碳源可以是任何能被微生物同化的碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖漿、碳水化合物如淀粉、淀粉水解物等、有機(jī)酸如乙酸、丙酸等、以及醇類如乙醇、丙醇等。
氮源包括氨、各種無機(jī)酸和有機(jī)酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等、和其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉抽提物、酵母抽提物、玉米漿、酪素水解物、豆餅、豆餅水解物、以及由發(fā)酵而來的多種微生物及其降解物。
無機(jī)物質(zhì)包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鈣等。
而且，含有小麥麩皮、大米麩皮等作為碳源、氮源和無機(jī)鹽來源并補(bǔ)加合適鹽的培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)絲狀真菌中用作培養(yǎng)基。
培養(yǎng)可在有氧環(huán)境下振蕩培養(yǎng)中進(jìn)行，或在通氣條件下深層培養(yǎng)來進(jìn)行。培養(yǎng)溫度優(yōu)選是15至40℃，培養(yǎng)期通常為16至96小時(shí)。在培養(yǎng)中，pH維持在3.0至9.0的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié)用無機(jī)或有機(jī)的酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣或氨來進(jìn)行。
在培養(yǎng)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。
如果絲狀真菌在含有固體物質(zhì)如小麥麩皮等的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，絲狀真菌的接種方法為，將其與固體成分有效混合，在小室中的多個(gè)鋁質(zhì)或不銹鋼培養(yǎng)架上鋪成薄薄一層，然后在控制溫度、濕度和通氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。具體來說，真菌在100％濕度、25℃至35℃下在培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)3至10天。
如果新型肌醇六磷酸酶制備有機(jī)體是動物細(xì)胞，培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基包括通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基、Eagle’s MEM培養(yǎng)基、以及在上述培養(yǎng)基中含有胎牛血清的培養(yǎng)基等。
培養(yǎng)在存在5％CO2等的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為35至37℃，培養(yǎng)期通常為3至7天。
在培養(yǎng)中，可在培養(yǎng)基中加入抗生素如卡那霉素、氨芐青霉素等。
為從新型肌醇六磷酸酶制備有機(jī)體的培養(yǎng)物中分離和純化新型肌醇六磷酸酶，可以采用傳統(tǒng)的酶分離和純化技術(shù)。
例如，如果新型肌醇六磷酸酶在新型肌醇六磷酸酶制備有機(jī)體的細(xì)胞中積累，通過離心從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，然后洗滌并用超聲儀、弗氏壓碎器、Manton-Gaulin勻漿器、dynomill等破碎，從而得到無細(xì)胞抽提物。由無細(xì)胞抽提物離心得來的上清用諸如硫酸銨鹽析、去鹽、用一種有機(jī)溶劑沉淀、在諸如二乙基氨基乙基(DEAE)-Sepharose和DIAIONHPA-75(Mitsubishi Chemical Industries Ltd)樹脂上進(jìn)行陰離子交換層析、在諸如S-Sepharose FF(Pharmacia)樹脂上進(jìn)行陽離子交換層析、在諸如丁基-Sepharose和苯基-Sepharose上進(jìn)行疏水層析、在分子篩上凝膠過濾、層析聚焦和電泳如等電聚焦。如此能夠獲得純化的酶制備物。
對純化酶制備物的結(jié)構(gòu)分析可用常用于蛋白化學(xué)的技術(shù)來完成，例如“基因克隆中所用的蛋白結(jié)構(gòu)分析”，作者為Hisashi Hirano,TokyoKagaku Dojin(1993)出版。
如果新型肌醇六磷酸酶是細(xì)胞外分泌的，將培養(yǎng)物通過諸如離心得到可溶性級份，如果培養(yǎng)基成分中存在固體組分如小麥麩皮等，就用熱水等抽提新型肌醇六磷酸酶，然后用諸如離心等技術(shù)獲得可溶性級份。由此可溶性級份，用上面介紹的從無細(xì)胞抽提物上清中分離和純化的技術(shù)就能獲得新型肌醇六磷酸酶的純化酶制備物。
在本發(fā)明中，新型肌醇六磷酸酶的活性可按標(biāo)準(zhǔn)的活性測量方法確定(參見下面的參考實(shí)施例)。
而且，新型肌醇六磷酸酶的Km值可用Lineweaver-Burk作圖來確定，其中，用標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法確定的新型肌醇六磷酸酶的活性對不同的底物濃度作圖。
本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶可用于所需的將一種肌醇六磷酸鹽轉(zhuǎn)化為肌醇和無機(jī)磷酸的不同步驟中，例如生產(chǎn)動物飼料、大豆加工、豬和家禽的液體飼料、以及由肌醇六磷酸鹽生產(chǎn)肌醇和肌醇單磷酸。
含有本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶的動物飼料可按如下方法生產(chǎn)，將所說的酶與載體如小麥麩皮混合，在一個(gè)噴灑柱或流動床中干燥，然后在干燥物中加入滲透壓穩(wěn)定劑如山梨糖醇和防腐劑如苯甲酸。動物飼料中新型肌醇六磷酸酶的量為每公斤動物飼料中10至5000U，優(yōu)選100至1000U。
附圖簡述

圖1顯示肌醇六磷酸酶Ⅰ的最適pH。
圖2顯示肌醇六磷酸酶Ⅱ的最適pH。
圖3顯示肌醇六磷酸酶Ⅲ的最適pH。
圖4顯示肌醇六磷酸酶Ⅰ的pH穩(wěn)定性。
圖5顯示肌醇六磷酸酶Ⅱ的pH穩(wěn)定性。
圖6顯示肌醇六磷酸酶Ⅲ的pH穩(wěn)定性。
圖7顯示肌醇六磷酸酶Ⅰ的最適溫度。
圖8顯示肌醇六磷酸酶Ⅱ的最適溫度。
圖9顯示肌醇六磷酸酶Ⅲ的最適溫度。
圖10顯示肌醇六磷酸酶Ⅰ的溫度穩(wěn)定性。
圖11顯示肌醇六磷酸酶Ⅱ的溫度穩(wěn)定性。
圖12顯示肌醇六磷酸酶Ⅲ的溫度穩(wěn)定性。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在下文中，通過參考實(shí)施例來詳細(xì)介紹本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不限于實(shí)施例。
參考實(shí)施例(測量肌醇六磷酸酶活性的方法)
在本發(fā)明中，肌醇六磷酸酶的標(biāo)準(zhǔn)活性測量按下面方式進(jìn)行。
0.5ml含有2.5mM肌醇六磷酸鈉(Sigma)的0.2M乙酸緩沖液pH5.5(或者在檢測降解肌醇六磷酸的酸性磷酸酶活性時(shí)為甘氨酸-HCl緩沖液pH2.5)在37℃保溫5分鐘，加入0.5ml的酶溶液使反應(yīng)開始(終濃度為1.25mM肌醇六磷酸鈉、0.1M乙酸鈉pH5.5或0.1M甘氨酸-HCl緩沖液pH2.5)。在37℃保溫20分鐘后，加入2ml的酶反應(yīng)終止緩沖液(即含有10mM鉬酸銨、5N硫酸和丙酮的1∶1∶2混合物)，加入0.1ml的1M檸檬酸，并與反應(yīng)溶液混合。用分光光度計(jì)(Hitachi U-2000)測量380nm處溶液的吸收值。1個(gè)單位的肌醇六磷酸酶活性定義為每分鐘釋放1umol無機(jī)磷酸的酶量。
實(shí)施例1(肌醇六磷酸酶的制備)在一個(gè)2000ml三角瓶中加入200ml肌醇六磷酸酶生產(chǎn)培養(yǎng)基(1％蔗糖、0.2％NaNO3、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.01％FeSO4·7H2O、0.1％玉米漿(C.S.L)pH5.5)，蓋上硅化的海綿塞，在120℃滅菌20分鐘。在其中接種亞克紅曲霉IFO30873的菌絲，并靜止培養(yǎng)10天以產(chǎn)生肌醇六磷酸酶。作為粗制的肌醇六磷酸酶溶液，使用980ml所獲得的培養(yǎng)物，并由此獲得約6單位的肌醇六磷酸酶。
實(shí)施例2(肌醇六磷酸酶的純化)將粗制肌醇六磷酸酶溶液通過超濾(排阻分子量為10,000,Advantec)去鹽。所獲得的酶溶液上預(yù)先用20 mM MES緩沖液(pH6.0)(Katayama Kagaku)平衡的DEAE-Sepharose F.F.(Pharmacia)柱。用20mM MES緩沖液(pH6.0)洗滌后，肌醇六磷酸酶Ⅰ和酶Ⅲ用含有0.05MNaCl的20mM MES緩沖液(pH6.0)洗脫。然后肌醇六磷酸酶Ⅱ用含有0.1M NaCl的20mM MES緩沖液(pH6.0)洗脫。將如此分離的每種酶脫鹽，并用超濾(排阻分子量為10,000,Advantec)分別濃縮約20倍，然后將每種酶上預(yù)先用20mM MES緩沖液(pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose F.F.(Pharmacia)柱，在用20 mM MES緩沖液(pH6.0)洗滌后，蛋白用0-0.3M線性梯度的NaCl洗脫，從而獲得肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的級份。每種由此獲得的酶溶液用超濾(排阻分子量為10,000,Advantec)分別濃縮約20倍，并上預(yù)先用含有0.05M KCl的20mM MES緩沖液(pH6.0)平衡的TOYO-pearl HW-55F(Tosoh公司)柱。肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別用含有0.05M KCl的20mM MES緩沖液(pH6.0)洗脫。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別按前述步驟純化。
實(shí)施例3(肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的Km值測量)純化后的肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ按照標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法進(jìn)行測量，其中以不同濃度的肌醇六磷酸作為底物，范圍為0.00625至0.8mM。將結(jié)果的Lineweaver-Burk倒數(shù)作圖以確定Km。肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對肌醇六磷酸的Km值為27,20和107uM。
實(shí)施例4(肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的理化特性)①最適pH標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法中的緩沖液被下列0.2M緩沖液取代，每一pH的活性按標(biāo)準(zhǔn)的活性測量方法測量。
甘氨酸-HCl緩沖液 pH2.0-3.5乙酸-乙酸鈉緩沖液 pH3.5-5.5MES-緩沖液(優(yōu)選緩沖液)pH5.5-7.0Tris-HCl緩沖液pH7.0-9.0結(jié)果示于圖1、2和3。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別在pH5.5、6.0和2.5顯示最大活性。
②pH穩(wěn)定性當(dāng)酶溶液在50mM的下列緩沖液中在30℃保溫60分鐘后，活性按標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法測量。
甘氨酸-HCl緩沖液 pH2.0-4.0乙酸-乙酸鈉緩沖液 pH4.0-5.5MES-緩沖液(優(yōu)選緩沖液)pH5.5-7.0Tris-HCl緩沖液pH7.0-9.0結(jié)果示于圖4、5和6。
肌醇六磷酸酶Ⅰ在pH5.5至6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定，肌醇六磷酸酶Ⅱ在pH6.0至7.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，肌醇六磷酸酶Ⅲ在pH2.0至8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
③最適溫度當(dāng)用于測量酶活性的溫度在30至70℃范圍內(nèi)改變時(shí)，每一溫度的活性按標(biāo)準(zhǔn)的活性測量方法測量。
結(jié)果示于圖7、8和9。
肌醇六磷酸酶Ⅰ和Ⅱ都在50℃顯示最大活性，肌醇六磷酸酶Ⅲ在45℃顯示最大活性。
④溫度穩(wěn)定性當(dāng)酶溶液在4-70℃、在20mM MES緩沖液(pH6.0)中保溫10分鐘后，活性按標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法測量。
結(jié)果示于圖10、11和12。
肌醇六磷酸酶Ⅰ在高至35℃時(shí)穩(wěn)定，肌醇六磷酸酶Ⅱ在高至50℃時(shí)穩(wěn)定，肌醇六磷酸酶Ⅲ在高至60℃時(shí)穩(wěn)定。
⑤底物特異性活性按標(biāo)準(zhǔn)活性測量方法測量，使用均制備為2.5mM的底物，結(jié)果示于表Ⅰ。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均具有低底物特異性。
表1肌醇六磷酸酶的底物特異性

⑥分子量分子量用在TOYO-pearl HW-55 F(柱大小為1.0×119cm,93.4ml)柱上凝膠過濾進(jìn)行測量。標(biāo)準(zhǔn)用RNA酶A(M.W.15500)、卵清蛋白(M.W.42700)、白蛋白(M.W.63300)及醛縮酶(M.W.163000)作為標(biāo)準(zhǔn)制備。
肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的分子量分別為80-100、120和140KDa。
⑦等電點(diǎn)將肌醇六磷酸酶上預(yù)先用20mM MES(pH6.0)平衡的Polybufferexchanger PBE 94柱(Pharmacia)，然后用10％Polybuffer 74-HCl(pH4.0)洗脫，肌醇六磷酸酶的等電點(diǎn)通過用pH計(jì)測量洗脫級份的pH值來確定。
結(jié)果顯示，肌醇六磷酸酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的等電點(diǎn)分別為pI5.7、4.8和5.2。
實(shí)施例5(肌醇六磷酸酶Ⅲ的N-末端氨基酸序列分析)為用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定肌醇六磷酸酶的分子量，將該酶高度純化，在12.5％multi-gel(Daiichi Kagaka K.K)中，將按照實(shí)施例2中純化的50ul酶按B.J.Davis的方法(《Ann.N.Y.Acad.Sci》121卷，404-427(1964))進(jìn)行非變性PAGE。電泳后，將凝膠切成5mm寬的膠條，并浸入1ml、20mM的MES(pH6.0)緩沖液中，并在4℃保存12小時(shí)，使酶浸出。將浸出物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮15至20倍后，用參考實(shí)施例中介紹的標(biāo)準(zhǔn)測量方法鑒定肌醇六磷酸酶級份。用巰基乙醇還原后，將10uL活性級份進(jìn)行SDS-PAGE來獲得高純度的肌醇六磷酸酶Ⅲ。由此結(jié)果，用SDS-PAGE得到的肌醇六磷酸酶Ⅲ的分子量測定為約65KDa。
肌醇六磷酸酶Ⅲ的N末端氨基酸序列分析按下面方法進(jìn)行。即，將實(shí)施例2中純化的肌醇六磷酸酶Ⅲ在用2-巰基乙醇還原下進(jìn)行SDS-PAGE，然后按照P.Matsudaira《J.B.C.》262卷，10035-10038(1987))電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(ProBlott,Perkin Elmer)，轉(zhuǎn)移了該酶的膜用考馬斯亮藍(lán)染色，將其上分子量約為65KDa的帶切下，在氣相蛋白測序儀(PDSQ-10,Shimadzu公司)上按廠家指示推薦的方法分析其N-末端氨基酸序列，由此獲得的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:1。將這里介紹的氨基酸序列通過使用蛋白數(shù)據(jù)庫檢測同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)新序列。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供對肌醇六磷酸有低Km值的肌醇六磷酸酶和通過使用具有生產(chǎn)和積累肌醇六磷酸酶能力的微生物來生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法。
肌醇六磷酸酶可加入到飼料中來降解飼料中含有的作為阻礙營養(yǎng)因子的肌醇六磷酸，從而提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)使由所說的降解釋放的磷酸得到充分利用。
序列表SEQ ID NO:1長度17類型氨基酸鏈型單鏈拓?fù)錁?gòu)型線型分子類型肽序列描述Phe Gln Ser Val Ile Ser Glu Lys Gln Phe Ser Gln Glu Phe Leu Asp Asn1 5 10 1權(quán)利要求
1．當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)，具有10至100uM米氏常數(shù)(以下Km)的肌醇六磷酸酶。
2．權(quán)利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅰ具有以下理化特性1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為27uM；2)最適pH:pH5.5；3)pH穩(wěn)定性在pH5.5至6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至35℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約80至100KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI5.7(層析聚焦法)。
3．權(quán)利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅱ具有以下理化特性1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為20uM；2)最適pH:pH6.0；3)pH穩(wěn)定性在pH6.0至7.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至50℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約120KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI4.8(層析聚焦法)。
4．權(quán)利要求1的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶Ⅲ具有以下理化特性1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為107uM；2)最適DH:pH2.5；3)pH穩(wěn)定性在pH2.0至8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度45℃；5)溫度穩(wěn)定性至60℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以對硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約140KDa(凝膠過濾法)；8)等電點(diǎn)pI5.2(層析聚焦法)；9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
5．權(quán)利要求1、2、3或4的肌醇六磷酸酶，其中肌醇六磷酸酶是來自屬于紅曲霉屬的微生物的肌醇六磷酸酶。
6．權(quán)利要求5的肌醇六磷酸酶，其中屬于紅曲霉屬的微生物是亞克紅曲霉IFO30873。
7．生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法，該方法包括培養(yǎng)能夠形成和積累肌醇六磷酸酶的微生物直至肌醇六磷酸酶酶形成和積累，其中所說的肌醇六磷酸酶在以肌醇六磷酸為底物時(shí)，其米氏常數(shù)為10至100uM，然后從培養(yǎng)物中回收肌醇六磷酸酶。
8．權(quán)利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅰ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為27uM；2)最適pH:pH5.5；3)pH穩(wěn)定性在pH5.5至6.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至35℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約80至100KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI5.7(層析聚焦法)。
9．權(quán)利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅱ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為20uM；2)最適pH:pH6.0；3)pH穩(wěn)定性在pH6.0至7.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度50℃；5)溫度穩(wěn)定性至50℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以肌醇六磷酸、對硝基苯磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約120KDa(凝膠過濾法)；及8)等電點(diǎn)pI4.8(層析聚焦法)。
10．權(quán)利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶Ⅲ是具有以下理化特性的肌醇六磷酸酶1)Km當(dāng)肌醇六磷酸用作底物時(shí)為107uM；2)最適pH:pH2.5；3)pH穩(wěn)定性在pH2.0至8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；4)最適溫度45℃；5)溫度穩(wěn)定性至60℃穩(wěn)定；6)底物特異性在以對硝基苯磷酸、肌醇六磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、D-肌醇-2-磷酸、D-肌醇-1-磷酸、D-肌醇-1、4-二磷酸和三磷酸腺苷為底物時(shí)有活性；7)分子量約140KDa(凝膠過濾法)；8)等電點(diǎn)pI5.2(層析聚焦法)；9)N末端氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。
11．權(quán)利要求7、8、9或10的方法，其中肌醇六磷酸酶來自屬于紅曲霉屬的微生物。
12．權(quán)利要求11的方法，其中屬于紅曲霉屬的微生物是亞克紅曲霉IFO30873。
13．含有當(dāng)肌醇六磷酸作為底物時(shí)米氏常數(shù)為10至110uM的肌醇六磷酸酶的動物飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對肌醇六磷酸具有低Km值的肌醇六磷酸酶,使用能夠產(chǎn)生和積累該肌醇六磷酸酶的微生物制備肌醇六磷酸酶的方法,以及含有肌醇六磷酸酶的飼料。該新型肌醇六磷酸酶能水解飼料中所含的肌醇六磷酸(作為阻礙營養(yǎng)因子),從而能增加飼料的營養(yǎng)價(jià)值,并使水解產(chǎn)生的磷酸得到有效利用。
文檔編號C12N9/16GK1231692SQ97198221
公開日1999年10月13日 申請日期1997年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月25日
發(fā)明者長島直, 畔柳聰, 山村直紀(jì), 穴澤秀治, 加藤容子, 杉本整治, 矢野敬一 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社, 新日本化學(xué)工業(yè)株式會社 被以下專利引用 (2),