專利名稱：生產(chǎn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，編碼該蛋白質(zhì)的DNA，和生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及采用遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是催化蛋白質(zhì)的肽鏈的γ-羧酰氨基基團的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的一種酶。當所述酶與蛋白質(zhì)反應(yīng)時，通過谷氨酸的脫酰氨基發(fā)生了形成ε-(γ-谷氨酸)-賴氨酸的反應(yīng)或發(fā)生了谷氨酸替代谷氨酰胺的反應(yīng)。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶被用于生產(chǎn)膠化的食物例如果凍，酸奶，奶酪，膠狀化妝品等等，也可用于改善肉類的品質(zhì)[參見用于相反目的的日本專利公開(下文中稱作為“日本特許公告公報”)No.平1-50382]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶也可用于生產(chǎn)用作具有高熱穩(wěn)定性的微膠囊的材料和用于固定化酶的載體。因此，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在工業(yè)上是非常有用的。
就轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶而言，來源于動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和來源于微生物(微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；下文中稱作為“MTG”)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶至今已是已知的。來源于動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是依賴于鈣離子的酶，該酶分布于動物的器官，皮膚和血液。例如它們是豚鼠肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(K.Ikura等人，生物化學(xué)27，2898(1988))，人表皮角蛋白細胞轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[M.A.Philips等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9333(1990)]和人血液凝固因子XIII(A.Ichinose等人，生物化學(xué)25，6900(1990))。
就來源于微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶而言，不依賴于鈣的這些酶是從鏈輪絲菌屬的微生物獲得的。例如它們是灰肉色鏈輪絲菌IFO12776，肉桂色鏈輪絲菌肉桂亞種IFO12852和Streptoverticillium(鏈輪絲菌)mobaraense IFO 13819[參見日本專利未審查公開(本申請下文中稱作為“日本特許公開公報”)No.昭和64-27471]。
根據(jù)肽繪圖和基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)由微生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的一級結(jié)構(gòu)與來源于動物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶完全不同源(歐洲專利公開No.0481504A1)。
由于來源于微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)是通過培養(yǎng)上面描述的微生物，隨后純化產(chǎn)生的，它們在供應(yīng)量，效率等等方面都存在問題。還試圖通過遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)這些酶。該技術(shù)包括通過微生物例如大腸桿菌，酵母等等的分泌表達進行的方法(日本特許公開公報平5-199883)，包括其中以大腸桿菌中的失活的融合蛋白質(zhì)包含體的形式表達MTG的方法，所述包含體溶解于蛋白質(zhì)變性劑，去除所述變性劑，然后使MTG再活化以獲得活性的MTG(日本特許公開公報平6-30771)。
但是，當以工業(yè)規(guī)模實際操作時這些方法產(chǎn)生了問題。即，當使用微生物例如大腸桿菌和酵母分泌時，生產(chǎn)的量是非常小的；和當獲得大腸桿菌中的失活的融合蛋白質(zhì)包含體的形式的MTG時，需要用于裂解的酶是昂貴的。
已知當采用遺傳工程方法分泌外源蛋白質(zhì)時，由此獲得的酶的量通常是小的。相反，還已知當外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細胞中產(chǎn)生時，在許多情況下產(chǎn)物是惰性蛋白質(zhì)包含體的形式，雖然表達量是高的。蛋白質(zhì)包含體必須是溶解于變性劑，必須去除變性劑，然后必須使MTG再活化。
已經(jīng)已知在大腸桿菌中表達時，可用甲硫氨酸氨基肽酶有效地裂解在基因轉(zhuǎn)譯后獲得的天然蛋白質(zhì)中的N-末端甲硫氨酸殘基。但是，在外源蛋白質(zhì)中不總是裂解N-末端甲硫氨酸殘基。
至今建議的用于獲得沒有N-末端甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)的方法包括化學(xué)方法，其中產(chǎn)生了在N-末端具有甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)或具有借助于甲硫氨酸殘基加到其上的肽的融合蛋白，然后在甲硫氨酸殘基的位置用溴化氰特異性地分解產(chǎn)物；酶解方法，其中在合適的肽和預(yù)期的肽之間插入一種位點特異性蛋白酶的識別序列以獲得融合肽，用該酶進行位點特異性水解。
但是，當?shù)鞍踪|(zhì)序列含有甲硫氨酸殘基，預(yù)期的蛋白質(zhì)可能在反應(yīng)過程中發(fā)生變性時，不能使用前一方法。當易于裂解的序列包含于蛋白質(zhì)序列時，后一方法不能使用，因為預(yù)期蛋白質(zhì)的產(chǎn)量被降低。另外，從考慮成本的觀點，這樣的蛋白酶的使用不適于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
用于生產(chǎn)MTG的常規(guī)的方法有許多問題例如供應(yīng)量和成本。即，由大腸桿菌，酵母等等進行分泌表達時，不利的是，表達量非常低。在大腸桿菌的融合蛋白質(zhì)的包含體中生產(chǎn)時，為了獲得成熟的MTG，在表達后，用限制性蛋白酶裂解融合部分是必要的。再者，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于MTG不依賴于鈣，活性MTG在微生物細胞中的表達是致命的，因為該酶作用于內(nèi)蛋白。
因此，對于以工業(yè)規(guī)模，由基因重組生產(chǎn)的MTG的利用，要求生產(chǎn)增加沒有融合部分的成熟MTG。本發(fā)明完成了該目的。本發(fā)明的目的之一是大規(guī)模地在微生物例如大腸桿菌中生產(chǎn)MTG。
當用本發(fā)明的重組DNA表達MTG時，在MTG的N-末端加上甲硫氨酸殘基。但是，通過將甲硫氨酸殘基加到MTG的N-末端，可能會出現(xiàn)一些問題，其中出現(xiàn)了安全性問題例如給予了MTG免疫原性。由本發(fā)明解決的另一個問題是產(chǎn)生沒有相應(yīng)于起始密碼子的甲硫氨酸殘基的MTG。
本發(fā)明的一個目的是提供了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的新的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是提供了編碼具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的新的蛋白質(zhì)的DNA。
本發(fā)明的另一個目的是提供了編碼具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的新的蛋白質(zhì)的重組DNA。
本發(fā)明的另一個目的是提供了通過由重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的另一個目的是提供了用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法。
根據(jù)下面的說明書和實施例，本發(fā)明的這些和其它目的是顯而易見的。
為了解決上述問題，本發(fā)明人通過將密碼子改變?yōu)檫m用于大腸桿菌的密碼子，或優(yōu)選的是通過利用多拷貝載體(pUC19)和強啟動子(trp啟動子)，已經(jīng)構(gòu)建了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的大規(guī)模的表達系統(tǒng)。
由于從放線菌微生物表達和分泌前原形式的MTG，MTG在N-末端沒有對應(yīng)于起始密碼子的甲硫氨酸殘基，但是由上面描述的表達方法表達的蛋白質(zhì)在N-末端有甲硫氨酸殘基。為了解決該問題，本發(fā)明人已經(jīng)對大腸桿菌的甲硫氨酸氨基肽酶的底物特異性產(chǎn)生興趣，并且通過表達沒有天冬氨酸殘基形式的蛋白質(zhì)，成功地獲得了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和在N-末端沒有甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)，其中所述天冬氨酸殘基是MTG的N-末端氨基酸。由此，完成了本發(fā)明。
就是說，本發(fā)明提供了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的序列，其中該蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸對應(yīng)于SEQ ID No.1的第二位的絲氨酸殘基。
提供了由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
提供了編碼所述蛋白質(zhì)的DNA。
提供了具有所述DNA的重組DNA，特別是表達所述DNA的重組DNA。
提供了通過用重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的重組體。
提供了用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)以及回收該蛋白質(zhì)的步驟。
考慮到甲硫氨酸氨基肽酶的底物特異性，用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和沒有起始甲硫氨酸的蛋白質(zhì)的方法不限于去除N-末端天冬氨酸。
附圖簡述附

圖1顯示了MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-01的構(gòu)建方案。
附圖2顯示了MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-02的構(gòu)建方案。
附圖3是顯示MTG被表達的SDS-聚丙烯酰胺電泳的擴展圖。
附圖4顯示MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-00的構(gòu)建方案。
附圖5顯示質(zhì)粒pUCN216D的構(gòu)建方案。
附圖6顯示MTG表達質(zhì)粒pUCTRPMTG(+)D2的構(gòu)建方案。
附圖7顯示對應(yīng)于天冬氨酸殘基的GAT被缺失。
附圖8顯示N-末端的氨基酸是絲氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)包括作為必要序列的由SEQID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的序列，但是該蛋白質(zhì)在第331位的脯氨酸殘基之后進一步具有一個氨基酸或幾個氨基酸。其中，優(yōu)選的是由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的序列組成的蛋白質(zhì)。
在這些氨基酸序列中，本發(fā)明包括其中一個氨基酸或幾個氨基酸被缺失，替代或插入的氨基酸序列，只要所述氨基酸序列具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。
本發(fā)明的DNA編碼上面提到的蛋白質(zhì)。其中，優(yōu)選的是其中編碼從N-末端氨基酸計數(shù)第四位的Arg的堿基序列是CGT或CGC，編碼從N-末端氨基酸計數(shù)第五位的Val的堿基序列是GTT或GAT的DNA。此外，優(yōu)選的是其中編碼N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之間的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的堿基序列具有下列序列的DNA。
SerTCT或TCCAspGAC或GATAspGAC或GATArgCGT或CGCValGTT或GTA在這種情況下，優(yōu)選的是其中編碼N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之間的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的堿基序列具有序列TCT-GAC-GAT-CGT-GTT的DNA。
此外，優(yōu)選的是其中編碼N-末端開始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之間的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的堿基序列具有下列序列的DNA。
ThrACT或ACCProCCA或CCGProCCA或CCGAlaGCT或GCA此外，優(yōu)選的是包括由SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基之間的序列的DNA。在這種情況下，更優(yōu)選的是由SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基之間的序列組成的DNA。
對于上面提到的DNA序列，可以缺失，替代或插入編碼一個氨基酸或幾個氨基酸的核酸，只要所述DNA編碼具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的氨基酸序列。
本發(fā)明的重組DNA具有上面提到的DNA之一。在這種情況下，優(yōu)選的是具有選自于下列組trp，tac，lac，trc，λPL和T7的啟動子的DNA。
通過用上面提到的重組DNA轉(zhuǎn)化獲得了本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。其中優(yōu)選的是通過利用多拷貝載體進行轉(zhuǎn)化，以及轉(zhuǎn)化體屬于大腸桿菌。
用于生產(chǎn)本發(fā)明的具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上面提到的轉(zhuǎn)化體之一以生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)以及回收該蛋白質(zhì)的步驟。
對本發(fā)明進一步作詳細說明。
(1)已知MTG在微生物細胞中的表達是致命的。還已知在微生物例如大腸桿菌中高效率地表達該蛋白質(zhì)時，所表達的蛋白質(zhì)傾向于是惰性不溶性的蛋白質(zhì)包含體的形式。在這樣的情況下，本發(fā)明人對在大腸桿菌中獲得高效率地表達惰性不溶性的蛋白質(zhì)包含體的形式的MTG的目的進行了研究。
用于獲得高表達的MTG的結(jié)構(gòu)基因是含有SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基之間的序列的DNA?？紤]到遺傳密碼的簡并性，在編碼N-末端部分的區(qū)域的簡并密碼子的第三個字母被轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓汆堰屎湍蜞奏さ拿艽a子，其余部分由常用于大腸桿菌的密碼子組成以便抑制mRNA的高級結(jié)構(gòu)的形成，雖然這樣的編碼具有相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA可以具有不同的堿基序列。
通常用于生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的強啟動子可用于表達MTG結(jié)構(gòu)基因，和將終止子插入到MTG結(jié)構(gòu)基因的下游。例如，啟動子是trp，tac，lac，trc，λPL和T7，和終止子是trpA，lpp和T4。
為了高效地轉(zhuǎn)譯，使SD序列的種類和數(shù)量，SD序列和起始密碼子之間區(qū)域的堿基的組成，序列和長度最佳化以表達MTG。
位于啟動子和終止子之間的區(qū)域是表達MTG必不可少的，通過已知的化學(xué)合成方法可生產(chǎn)該區(qū)域。所述堿基序列的一個例子顯示于SEQ ID No.3。對于序列號為3的氨基酸序列，起始密碼子后跟隨天冬氨酸殘基。但是，按照如下描述，優(yōu)選的是去除該天冬氨酸殘基。
本發(fā)明還提供了可用于表達MTG的重組DNA。
通過將含有上面描述的MTG的結(jié)構(gòu)基因的DNA插入到已知的表達載體中能夠生產(chǎn)重組DNA，所述載體的選擇依賴于所需的表達系統(tǒng)。本文使用的表達載體優(yōu)選的是多拷貝載體。
可用于生產(chǎn)本發(fā)明的重組DNA的已知表達載體包括pUC19和pHSG299。通過將本發(fā)明的DNA整合到pUC19獲得的本發(fā)明的重組DNA的一個例子是pUCTRPMTG-02(+)。
本發(fā)明還涉及通過導(dǎo)入重組DNA獲得的各種轉(zhuǎn)化體。
能夠形成轉(zhuǎn)化體的細胞包括大腸桿菌等等。
大腸桿菌的一個例子是菌株JM109(recA1，endA1，gyrA96，thi，hsdR17，supE44，relA1，Δ(lac-proAB)/F[traD36，proAB+，lacIq，lacZ ΔM15])。
通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體例如通過用本發(fā)明的一種載體pUCTRPMTG-02(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109獲得的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)。
用于生產(chǎn)的培養(yǎng)基的例子包括用于下面給出的實施例中的2xYT培養(yǎng)基，通常用于培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基例如LB培養(yǎng)基和M9酪氨酸培養(yǎng)基。
根據(jù)載體，啟動子，宿主等等的種類適當?shù)剡x擇培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)生產(chǎn)條件。例如，為了用trp啟動子生產(chǎn)重組產(chǎn)物，可以利用化學(xué)藥劑例如3-β-吲哚丙烯酸高效地操縱啟動子。如果必要的話，在培養(yǎng)過程中可以加入葡萄糖，酪氨酸等等。此外，還可以加入抗化學(xué)藥劑(氨芐霉素)的保持于質(zhì)粒的基因(對化學(xué)藥劑有抗性)以便選擇性地繁殖重組大腸桿菌。
按如下所述從培養(yǎng)菌株中提取具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是通過上面描述的方法生產(chǎn)的。在培養(yǎng)完成之后，收集細胞，并且懸浮于緩沖溶液中。在用溶菌酶，冷凍/溶解，超聲分裂等等處理之后，將由此獲得的破碎細胞的懸浮液離心以分離為上清液和沉淀。
具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)包含體的形式獲得并且包含于沉淀中。將該蛋白質(zhì)用變性劑等等溶解，去除變性劑，分離和純化該蛋白質(zhì)?？捎糜谌芙馊缟纤霎a(chǎn)生的蛋白質(zhì)包含體的變性劑的例子包括脲(例如8M)和鹽酸胍(例如6M)。在通過透析等等去除變性劑后，使具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)再生。用于透析的溶液是一種磷酸緩沖液，tris鹽酸緩沖液等等。不僅可通過透析，而且可通過稀釋，超濾等等去除變性劑。采用任何這些技術(shù)可預(yù)期活性的再生。
在活性再生之后，通過適當?shù)貙⒁阎姆蛛x和沉淀方法例如鹽析，透析，超濾，凝膠過濾，SDS-聚丙烯酰胺電泳，離子交換層析，親和層析，反相高效液相層析和等電點電泳結(jié)合可以分離和純化活性蛋白質(zhì)。
(2)本發(fā)明提供了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，它具有從SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的序列。
通過對用具有SEQ ID No.3表示的DNA的重組DNA轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物生產(chǎn)的MTG的N-末端進行分析，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)含有起始密碼子的(甲酰)甲硫氨酸殘基。
但是，當編碼外源蛋白的一個基因在大腸桿菌中表達時，將該基因設(shè)計為所需的蛋白質(zhì)定位于由ATG編碼的甲硫氨酸殘基之后，ATG是該基因的轉(zhuǎn)譯起始信號。已經(jīng)已知用甲硫氨酸氨基肽酶可以更有效地裂解從基因轉(zhuǎn)譯獲得的天然蛋白質(zhì)的N-末端的甲硫氨酸殘基。但是，不總是在外源蛋白質(zhì)中的N-末端的甲硫氨酸殘基被裂解。
已知甲硫氨酸氨基肽酶的底物特異性隨著定位于鄰接甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基的種類而變化。當定位于鄰接甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基是丙氨酸殘基，甘氨酸殘基，絲氨酸殘基等等時，甲硫氨酸殘基易于被裂解，當前者是天冬氨酸，天冬酰胺，賴氨酸，精氨酸，亮氨酸等等時，后者難于被裂解(自然，326,315(1987))。
MTG的N-末端的氨基酸殘基是天冬氨酸殘基。當來源于起始密碼子的甲硫氨酸殘基直接定位于天冬氨酸殘基之前時，甲硫氨酸氨基肽酶難于作用于獲得的序列，通常不是去除而是保留N-末端的甲硫氨酸殘基。但是，由于在MTG中絲氨酸殘基被安排于鄰接N-末端的天冬氨酸，可以將該序列設(shè)計為通過使天冬氨酸殘基缺失，定位于鄰接來源于起始密碼子的甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基是絲氨酸殘基(甲硫氨酸氨基肽酶易于作用的一種氨基酸殘基)。因此，可以高效地生產(chǎn)具有高轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，從該蛋白質(zhì)裂解了N-末端的甲硫氨酸殘基。
由此獲得的重組蛋白質(zhì)比天然的MTG短一個氨基酸殘基，但是該蛋白質(zhì)的功能與天然MTG相類似。即，通過缺失一個氨基酸沒有失去MTG活性。雖然，沒有從其上裂解N-末端的甲硫氨酸殘基的具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)可能獲得了新的免疫原性，但是通常會明白縮短了幾個殘基的序列不會獲得天然MTG沒有的新的免疫原性。因此，安全性沒有問題。
事實上，通過從來源于微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)缺失N-末端天冬氨酸殘基設(shè)計序列Met-Ser-Asp-Asp-Arg-……，該序列可以在大腸桿菌中產(chǎn)生。結(jié)果是，有效地去除甲硫氨酸殘基，從而獲得了具有Ser-Asp-Asp-Arg-……序列的蛋白質(zhì)。證實由此獲得的蛋白質(zhì)的比活性不同于天然的MTG。
下文將描述用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基范圍內(nèi)的序列。
就是說，以編碼具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和具有SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基范圍內(nèi)的序列蛋白質(zhì)的DNA用作為存在于適用于表達MTG的重組DNA的MTG結(jié)構(gòu)基因。具體地說，使用具有SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基范圍內(nèi)的序列的DNA。
通過普通的DNA重組技術(shù)或特異性的定位誘變技術(shù)，其中對MTG基因的整個或部分長度使用PCR的技術(shù)，或其中通過限制性酶處理用合成的DNA片段交換待改變的序列的一部分的技術(shù)，可以改變N-末端的序列。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)由此用重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，并且回收所述蛋白質(zhì)。用于制備轉(zhuǎn)化體和用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法相同于上面描述的方法。
由于由此生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有Met-Ser-.....的序列，用甲硫氨酸氨基肽酶易于從該蛋白質(zhì)上裂解甲硫氨酸殘基，因此在大腸桿菌細胞中裂解了甲硫氨酸殘基以獲得以絲氨酸殘基起始的蛋白質(zhì)。
雖然，自然界中不存在具有N-末端甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些天然MTG中，缺失了天冬氨酸殘基從而具有N-末端絲氨酸。雖然具有N-末端甲硫氨酸殘基的蛋白質(zhì)因此不同于天然MTG的序列，但是具有N-末端絲氨酸殘基的蛋白質(zhì)包含于天然的MTG的序列中，另外，具有這樣的序列的蛋白質(zhì)實際上存在于自然界。因此，可以說，這樣的MTG相等于天然的MTG。就是說，在被用作為食品的酶，例如MTG的生產(chǎn)中，其中蛋白質(zhì)的抗原性是嚴重的問題，生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和也具有相等于天然MTG的序列的蛋白質(zhì)是重要的，或換句話說，生產(chǎn)切除了N-末端的甲硫氨酸殘基的序列是重要的。
下面的實施例將進一步描述本發(fā)明，它決不限制本發(fā)明。
實施例在大腸桿菌中大量生產(chǎn)MTG(1)MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-01的構(gòu)建在考慮大腸桿菌和酵母使用的密碼子的頻率的情況下，已經(jīng)完全地合成了MTG基因(日本特許公開公報平5-199883)。但是，該基因序列對于在大腸桿菌中表達不是最佳的。就是說，所有的三十個精氨酸殘基的密碼子是AGA(最小密碼子)。在這些條件下，重新合成了MTG基因的N-末端的約200個堿基以變?yōu)樽钸m用于大腸桿菌表達的序列。
對于轉(zhuǎn)錄MTG基因的啟動子，使用能夠在缺少色氨酸的培養(yǎng)基中容易地啟動轉(zhuǎn)錄的trp啟動子。用trp啟動子獲得用于高效表達Pagrus major的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)基因的質(zhì)粒pTTG2-22(日本特許公開公報No.平6-225775)。將位于Pagrus major的TG基因的上游的序列設(shè)計為在大腸桿菌中高效地表達外源蛋白質(zhì)。
對于pTRPMTG-01的構(gòu)建，用合成DNA基因的ClaI/HpaI片段和pGEM15BTG(日本特許公開公報平6-30771)的HpaI/BamHI片段(小)替代從trp啟動子的下游的ClaI位點到Pagrus major的TG表達質(zhì)粒pTTG2-22(日本特許公開公報平6-225775)的下游的BglII位點之間的DNA片段。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段具有從pTTG2-22的trp啟動子的下游的ClaI位點到轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的序列，和來自MTG基因的N-末端的216個堿基。MTG結(jié)構(gòu)基因的堿基序列由在大腸桿菌的使用密碼子的頻率決定的，以便在大腸桿菌中進行最佳表達。但是，為了避免mRNA的高級結(jié)構(gòu)，將編碼N-末端部分的區(qū)域的簡并密碼子的第三個字母轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓汆堰屎湍蜞奏さ拿艽a子以便盡可能地避免排列為相同的堿基。
這樣設(shè)計合成DNA基因的ClaI/HpaI片段是便于其在末端具有EcoRI和HindIII位點。將所設(shè)計的基因劃分為各含有約40-50個堿基的區(qū)段，以便+鏈和-鏈互相重疊。合成對應(yīng)于各序列的12個DNA片段(SEQ ID Nos.4-15)。將合成的DNA的5’末端磷酸化。將這些序列與相配對的合成的DNA片段退火，它們互相連接。在聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，獲取預(yù)期大小的DNA片段并且整合到pUC19的EcoRI/HindIII位點。確認該序列并且將正確的一個序列命名為pUCN216。從該pUCN216，獲取ClaI/HpaI片段(小)并且用于構(gòu)建pTRPMTG-01。
(2)MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-02的構(gòu)建由于保持有pTRPMTG-01的大腸桿菌JM109沒有高效表達MTG，將除了被改變的N-末端以外的MTG基因部分(777個堿基)進行改變以適用于大腸桿菌。由于在同時合成777個堿基是困難的，因此考慮大腸桿菌中密碼子的使用頻率來決定序列，然后合成其四個大區(qū)段(B1，2，3和4)，各包括約200個堿基。這樣設(shè)計各個大區(qū)段便于在其末端具有EcoRI/HindIII位點。將所設(shè)計的基因劃分為約40-50堿基的大區(qū)段，以便+鏈和-鏈互相重疊。合成與各個大區(qū)段具有相同序列的10個DNA片段，因此總共合成40個區(qū)段(SEQID Nos.16-55)。將合成的DNA的5’末端磷酸化。將這些序列與相配對的合成的DNA片段退火，它們互相連接。在聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，獲取預(yù)期大小的DNA片段并且整合到pUC19的EcoRI/HindIII位點。確認其中各DNA的堿基序列并且將正確的序列命名為pUCB1和B2，B3和B4。如附圖2所述，B1與B2連接，B3和B4連接。通過用其替代pTRPMTG-01的相應(yīng)部分，構(gòu)建了pTRPMTG-02。存在于pTRPMTG-02上的該高效表達MTG基因的序列顯示于SEQ ID No.3。
(3)MTG表達質(zhì)粒pUCTRPMTG-02(+)，(-)的構(gòu)建由于保持有pTRPMTG-02的大腸桿菌JM109沒有高效表達MTG，該質(zhì)粒是多拷貝的。將含有pTRPMTG-02的trp啟動子的Eco0109I片段(小)變?yōu)槠烬R末端，然后整合到pUC19的HincII位點，該質(zhì)粒是多拷貝的。構(gòu)建了其中l(wèi)acZ啟動子和trp啟動子位于同方向的pUCTRPMTG-02(+)，其中兩種啟動子位于互相反方向的pUCTRPMTG-02(-)。
(4)MTG的表達通過在3毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，37℃振蕩10小時(預(yù)培養(yǎng))培養(yǎng)用pUCTRPMTG-02(+)和pUC19轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中加入0.5毫升的培養(yǎng)懸浮液，在37℃振蕩培養(yǎng)20小時。
從培養(yǎng)懸浮液收集細胞，通過超聲分裂破碎。整個組分，通過離心獲得的上清液和沉淀組分的SDS-聚丙烯酰胺電泳結(jié)果顯示于附圖3。在pUCTRPMTG-02(+)/JM109細胞的整個組分和通過離心獲得的沉淀組分中識別具有相當于MTG的分子量的蛋白質(zhì)的高效表達。通過Western印跡分析證實了蛋白質(zhì)與小鼠抗MTG的抗體的反應(yīng)。該蛋白質(zhì)的表達是500-600毫克/升。當生產(chǎn)培養(yǎng)基中沒有加入3-β吲哚丙烯酸時，獲得了足夠的，高效的表達。
再者，用抗小鼠的MTG抗體進行Western印跡分析發(fā)現(xiàn)僅在通過離心獲得的上清液組分中微量地表達了MTG，發(fā)現(xiàn)所表達的MTG實質(zhì)上都是不溶性的蛋白質(zhì)包含體形式。
(5)MTG表達質(zhì)粒pTRPMTG-00的構(gòu)建為了證明MTG基因密碼子的改變導(dǎo)致表達顯著地增加，構(gòu)建了對應(yīng)于pTRPMTG-02，但是其中MTG基因被改變?yōu)榍懊嫱暾铣傻幕蛐蛄?日本特許公開公報No.平6-30771)的pTRPMTG-00。
通過將來自于Pagrus major的TG表達質(zhì)粒pTRPMTG-02的PvuII/PstI片段(小)與pGEM15BTG的PstI/HindIII片段(小，包括PvuII位點)和PvuII/HindIII片段(小)(日本特許公開公報平6-30771)連接構(gòu)建了pTRPMTG-00。
(6)MTG表達質(zhì)粒pUCTRPMTG-00(+)，(-)的構(gòu)建pTRPMTG-00是多拷貝的。將含有pTRPMTG-00的trp啟動子和trpA終止子的Eco0109I片段(小)變?yōu)槠烬R末端，然后整合到pUC19的HincII位點，該質(zhì)粒是多拷貝的質(zhì)粒。構(gòu)建了其中l(wèi)acZ啟動子和trp啟動子位于同方向的pUCTRPMTG-00(+)，其中兩種啟動子位于互相反方向的pUCTRPMTG-00(-)。
(7)MTG表達的比較通過在3毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，37℃振蕩10小時(預(yù)培養(yǎng))培養(yǎng)用pUCTRPMTG-02(+)或(-)，pUCTRPMTG-00(+)或(-)，pTRPMTG-02，pTRPMTG-01，pTRPMTG-00或pUC19轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中加入0.5毫升的培養(yǎng)懸浮液，在37℃振蕩培養(yǎng)20小時。
從培養(yǎng)懸浮液收集細胞，和測定其表達的MTG，獲得的結(jié)果顯示于表1。發(fā)現(xiàn)新構(gòu)建的含有pTRPMTG-00，pUCTRPMTG-00(+)或(-)的大腸桿菌沒有高效表達MTG。該結(jié)果表明為了高效地表達MTG，將MTG基因的密碼子改變?yōu)榇竽c桿菌的密碼子和也改變?yōu)槎嗫截愘|(zhì)粒是必要的。
表1菌株 MTG的表達pUCTRPMTG-02(+)/JM109 +++pUCTRPMTG-02(-)/JM109 +++pUCTRPMTG-00(+)/JM109 +pUCTRPMTG-00(-)/JM109 +pTRPMTG-02/JM109 +pTRPMTG-01/JM109 +pTRPMTG-00/JM109 -pUC19/JM109 -+++至少300毫克/升+5毫克/升或更低-沒有表達(8)所表達的MTG的N-末端的氨基酸分析對所表達的MTG的蛋白質(zhì)包含體的N-末端的氨基酸殘基進行分析發(fā)現(xiàn)約60％的N-末端的序列是甲硫氨酸殘基和約40％的N-末端序列是甲酰甲硫氨酸殘基。通過下文描述的技術(shù)計劃去除對應(yīng)于起始密碼子的(甲酰)甲硫氨酸殘基。
(9)MTG的N-末端的天冬氨酸的缺失利用含有216堿基的pUCN216作為模板進行PCR缺失對應(yīng)于天冬氨酸殘基的堿基序列(MTG的N-末端)。pUCN216是通過在pUC19的EcoRI/HindIII位點克隆含有MTG的N-末端的ClaI-HpaI片段的約216堿基對獲得的質(zhì)粒。pF01(SEQ ID No.56)和pR01(SEQ ID No.57)是各含有載體中的序列的引物。pDELD(SEQ ID No.58)是通過缺失對應(yīng)于Asp殘基的堿基序列獲得的質(zhì)粒。pHd01(SEQ ID No.59)是通過用G替代C(不包括HindIII位點)獲得的質(zhì)粒。pF01和pDELD是有意義引物和pR01和pHd01是反意義引物。
對于pUCN216，結(jié)合使用pF01和pHd01，結(jié)合使用pDELD和pR01，以94℃，30秒，55℃，1分鐘和72℃，2分鐘進行PCR，共進行35個循環(huán)。用苯酚/氯仿提取各PCR產(chǎn)物，用乙醇沉淀，并且溶于100微升的水中。
各獲取1微升的PCR產(chǎn)物，將它們混合在一起。在94℃加熱10分鐘變性之后，結(jié)合使用pF01和pHd01，以94℃，30秒，55℃，1分鐘和72℃，2分鐘進行PCR，共進行35個循環(huán)。
用苯酚/氯仿提取第二次PCR產(chǎn)物，用乙醇沉淀，用HindIII和EcoRI處理。在pUC19亞克隆之后，獲得了pUCN216D(附圖5)。證實獲得的pUCN216D的序列是預(yù)期需要的。
(10)編碼缺失N-末端天冬氨酸的MTG的質(zhì)粒的構(gòu)建
將pUCN216D的Eco0109I/Hpal片段(小)與pUCB1-1的Eco0109I/Hpal片段(大)(通過在pUC19的EcoRI/HindIII位點克隆MTG基因的HpaII/BglII片段獲得的質(zhì)粒)結(jié)合獲得了pUCB1-2D。此外，將pUCNB1-2D的ClaI/BglII片段(小)與pUCTRPMTG-02(+)的ClaI/BglII片段(大)結(jié)合獲得了pUCTRPMTG(+)D2，該MTG表達質(zhì)粒缺失了N-末端天冬氨酸，pUCTRPMTG-02(+)是高效MTG表達質(zhì)粒(附圖6)。結(jié)果是，獲得了顯示于附圖7的含有缺失了對應(yīng)于天冬氨酸殘基的GAI的MTG基因的質(zhì)粒。
(11)編碼缺失N-末端天冬氨酸的MTG的質(zhì)粒的表達通過在3毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，37℃振蕩10小時(預(yù)培養(yǎng))培養(yǎng)用pUCTRPMTG(+)D2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109。向50毫升的含有150微克/毫升的氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中加入0.5毫升的培養(yǎng)懸浮液，在37℃振蕩培養(yǎng)20小時。通過超聲分裂破碎細胞。對由此獲得的上清液和沉淀用考馬斯亮藍染料染色和用小鼠的抗MTG抗體進行Western印跡分析的結(jié)果表明在通過超聲分裂破碎獲得的沉淀即在不溶性的組分中檢測到缺失了N-末端天冬氨酸殘基的MTG蛋白質(zhì)。該事實暗示缺失了N-末端天冬氨酸殘基的MTG蛋白質(zhì)以細胞中蛋白質(zhì)包含體的形式積累。
對蛋白質(zhì)包含體的N-末端氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)其中約90％是絲氨酸，如附圖8所示。
在(8)和(11)中獲得的所表達的MTG的N-末端氨基酸序列分析結(jié)果相互比較，結(jié)果如表2所示。發(fā)現(xiàn)通過從MTG缺失N-末端天冬氨酸殘基，有效地去除了加入到所表達的MTG的N-末端的起始甲硫氨酸。
表2菌株 N-末端氨基酸f-Met MetAspSerpUCTRPMTG-02(+)/JM109 40％ 60％ N.D.pUCTRPMTG(+)D2/JM109 N.D. 10％ - 90％(12)缺失了N-末端天冬氨酸殘基的MTG包含體的溶解性，復(fù)性活性和比活性的測定通過重復(fù)離心幾次部分純化缺失了天冬氨酸的MTG包含體，然后溶解于8M脲[50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)]獲得了2毫克/毫升溶液。通過離心從溶液中去除沉淀，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)將溶液稀釋到0.5M脲的濃度。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)進一步透析稀釋的溶液以去除脲。根據(jù)MonoS柱測試，當氯化鈉的濃度是在100-150mM范圍內(nèi)時洗脫具有TG活性的峰。采用異羥肟酸鹽方法測定該組分的比活性發(fā)現(xiàn)缺失天冬氨酸殘基的MTG的比活性約是30U/毫克。這相當于天然MTG的比活性。因此，顯然缺失天冬氨酸殘基對比活性沒有影響。
序列表SEQ ID NO1的資料序列特征長度331類型氨基酸幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO1Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn20 25 30Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg35 40 45Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys50 55 60Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu65 70 75 80Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn85 90 95Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu115 120 125Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser130 135 140Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala145 150 155 160Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn165 170 175Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg180 185 190Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg195 200 205Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg210 215 220Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile225 230 235 240Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr245 250 255Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp260 265 270Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met275 280 285His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp290 295 300Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro325 330SEQ ID NO2的資料序列特征長度993類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA特征特征鍵CDS定位1..993識別方法S序列描述SEQ ID NO2GAT TCT GAC GAT CGT GTT ACT CCA CCA GCT GAA CCA CTG GAT CGT ATG48Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met1 5 10 15CCA GAT CCA TAT CGT CCA TCT TAT GGT CGT GCT GAA ACT GTT GTT AAT96Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn20 25 30AAT TAT ATT CGT AAA TGG CAA CAA GTT TAT TCT CAT CGT GAT GGT CGT144Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg35 40 45AAA CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA CGT GAA TGG CTG TCT TAT GGT TGC192Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys50 55 60GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT GGT CAG TAT CCG ACT AAC CGT CTG240Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu65 70 75 80GCA TTC GCT GCC TTC GAT GAA GAT CGT TTC AAG AAC GAA CTG AAG AAC288Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn85 90 95GGT CGT CCG CGT TCT GGT GAA ACT CGT GCT GAA TTC GAA GGT CGT GTT336Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val100 105 110GCT AAG GAA TCC TTC GAT GAA GAG AAA GGC TTC CAG CGT GCT CGT GAA384Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu115 120 125GTT GCT TCT GTT ATG AAC CGT GCT CTA GAG AAC GCT CAT GAT GAA TCT432Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser130 135 140GCT TAC CTG GAT AAC CTG AAG AAG GAA CTG GCT AAC GGT AAC GAT GCT480Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala145 150 155 160CTG CGT AAC GAA GAT GCT CGT TCT CCG TTC TAC TCT GCT CTG CGT AAC528Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn165 170 175ACT CCG TCC TTC AAA GAA CGT AAC GGT GGT AAC CAT GAT CCG TCT CGT576Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190ATG AAA GCT GTT ATC TAC TCT AAA CAT TTC TGG TCT GGT CAG GAT AGA624Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg195 200 205TCT TCT TCT GCT GAT AAA CGT AAA TAC GGT GAT CCG GAT GCA TTC CGT672Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg210 215 220CCG GCT CCG GGT ACT GGT CTG GTA GAC ATG TCT CGT GAT CGT AAC ATC720Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile225 230 235 240CCG CGT TCT CCG ACT TCT CCG GGT GAA GGC TTC GTT AAC TTC GAT TAC768Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr245 250 255GGT TGG TTC GGT GCT CAG ACT GAA GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTA TGG816Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp260 265 270ACC CAT GGT AAC CAT TAC CAT GCT CCG AAC GGT TCT CTG GGT GCT ATG864Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met275 280 285CAT GTA TAC GAA TCT AAA TTC CGT AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAC912His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp290 295 300TTC GAT CGT GGT GCT TAC GTT ATC ACC TTC ATT CCG AAA TCT TGG AAC960Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn305 310 315 320ACT GCT CCG GAC AAA GTT AAA CAG GGT TGG CCG993Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro325 330SEQ ID NO3的資料序列特征長度1518類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA特征特征鍵CDS定位87..1082識別方法S序列描述SEQ ID NO3TTCCCCTGTT GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG60GGTATCGATT AGTAAGGAGG TTTAAA ATG GAT TCT GAC GAT CGT GTT ACT CCA113Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro1 5CCA GCT GAA CCA CTG GAT CGT ATG CCA GAT CCA TAT CGT CCA TCT TAT161Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr10 15 20 25GGT CGT GCT GAA ACT GTT GTT AAT AAT TAT ATT CGT AAA TGG CAA CAA209Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln30 35 40GTT TAT TCT CAT CGT GAT GGT CGT AAA CAA CAA ATG ACT GAA GAA CAA257Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln45 50 55CGT GAA TGG CTG TCT TAT GGT TGC GTT GGT GTT ACT TGG GTT AAC TCT305Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser60 65 70GGT CAG TAT CCG ACT AAC CGT CTG GCA TTC GCT TCC TTC GAT GAA GAT353Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp75 80 85CGT TTC AAG AAC GAA CTG AAG AAC GGT CGT CCG CGT TCT GGT GAA ACT401Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr90 95 100 105CGT GCT GAA TTC GAA GGT CGT GTT GCT AAG GAA TCC TTC GAT GAA GAG449Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu110 115 120AAA GGC TTC CAG CGT GCT CGT GAA GTT GCT TCT GTT ATG AAC CGT GCT497Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala125 130 135CTA GAG AAC GCT CAT GAT GAA TCT GCT TAC CTG GAT AAC CTG AAG AAG545Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys140 145 150GAA CTG GCT AAC GGT AAC GAT GCT CTG CGT AAC GAA GAT GCT CGT TCT593Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser
155 160 165CCG TTC TAC TCT GCT CTG CGT AAC ACT CCG TCC TTC AAA GAA CGT AAC641Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn170 175 180 185GGT GGT AAC CAT GAT CCG TCT CGT ATG AAA GCT GTT ATC TAC TCT AAA689Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys190 195 200CAT TTC TGG TCT GGT CAG GAT AGA TCT TCT TCT GCT GAT AAA CGT AAA737His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys205 210 215TAC GGT GAT CCG GAT GCA TTC CGT CCG GCT CCG GGT ACT GGT CTG GTA785Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val220 225 230GAC ATG TCT CGT GAT CGT AAC ATC CCG CGT TCT CCG ACT TCT CCG GGT833Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly235 240 245GAA GGC TTC GTT AAC TTC GAT TAC GGT TGG TTC GGT GCT CAG ACT GAA881Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu250 255 260 265GCT GAT GCT GAT AAG ACT GTA TGG ACC CAT GGT AAC CAT TAC CAT GCT929Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala270 275 280CCG AAC GGT TCT CTG GGT GCT ATG CAT GTA TAC GAA TCT AAA TTC CGT977Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg285 290 295AAC TGG TCT GAA GGT TAC TCT GAC TTC GAT CGT GGT GCT TAC GTT ATC1025Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile300 305 310ACC TTC ATT CCG AAA TCT TGG AAC ACT GCT CCG GAC AAA GTT AAA CAG1073Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln315 320 325GGT TGG CCG TAATGAAAGC TTGGATCTCT AATTACTGGA CTTCACACAG ACTAAAATAG1131Gly Trp Pro330ACATATCTTA TATTATGTGA TTTTGTGACA TTTCCTAGAT GTGAGGTGGA GGTGATGTAT
1191AAGGTAGATG ATGATCCTCT ACGCCGGACG CATCGTGGCC GGCATCACCG GCGCCACAGG1251TGCGGTTGCT GGCGCCTATA TCGCCGACAT CACCGATGGG GAAGATCGGG CTCGCCACTT1311CGGGCTCATG AGCGCTTGTT TCGGCGTGGG TATGGTGGCA GGCCCCGTGG CCGGGGGACT1371GTTGGGCGCC ATCTCCTTGC ATGCACCATT CCTTGCGGCG GCGGTGCTCA ACGGCCTCAA1431CCTACTACTG GGCTGCTTCC TAATGCAGGA GTCGCATAAG GGAGAGCGTC GAGAGCCCGC1491CTAATGAGCG GGCTTTTTTT TCAGCTG1518SEQ ID NO4的資料序列特征長度39類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO4AATTCATCGA TTAGTAAGGA GGTITAAAAT GGATTCTGA39SEQ ID NO5的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA
序列描述SEQ ID NO5CGATCGTCAG AATCCATTTT AAACCTCCTT ACTAATCGAT G41SEQ ID NO6的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO6CGATCGTGTT ACTCCACCAG CTGAACCACT GGATCGTATG C41SEQ ID NO7的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO7GATCTGGCAT ACGATCCAGT GGTTCAGCTG GTGGAGTAAC A41SEQ ID NO8的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA
序列描述SEQ ID NO8CAGATCCATA TCGTCCATCT TATGGTCGTG CTGAAACTGT T41SEQ ID NO9的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO9ATTAACAACA GTTTCAGCAC GACCATAAGA TGGACGATAT G41SEQ ID NO10的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO10GTTAATAATT ATATTCGTAA ATGGCAACAA GTTTATTCTC A41SEQ ID NO11的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA
序列描述SEQ ID NO11TCACGATGAG AATAAACTTG TTGCCATTTA CGAATATAAT TSEQ ID NO12的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO12TCGTGATGGT CGTAAACAAC AAATGACTGA AGAACAACGT G41SEQ ID NO13的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO13GCCATTCACG TTGTTCTTCA GTCATTTGTT GTTTACGACC A41SEQ ID NO14的資料序列特征長度42類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO14AATGGCTGTC TTATGGTTGC GTTGGTGTTA CTTGGGTTAA CA42SEQ ID NO15的資料序列特征長度40類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO15AGCTTGTTAA CCCAAGTAAC ACCAACGCAA CCATAAGACA40SEQ ID NO16的資料序列特征長度38類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO16AATTCGTTAA CTCTGGTCAG TATCCGACTA ACCGTCTG38SEQ ID NO17的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA
序列描述SEQ ID NO17CGAATGCCAG ACGGTTAGTC GGATACTGAC CAGAGTTAAC G41SEQ ID NO18的資料序列特征長度49類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO18GCATTCGCTT CCTTCGATGA AGATCGTTTC AAGAACGAAC TGAAGAACG49SEQ ID NO19的資料序列特征長度49類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO19GGACGACCGT TCTTCAGTTC GTTCTTGAAACGATCTTCAT CGAAGGAAG49SEQ ID NO20的資料序列特征長度35類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA
序列描述SEQ ID NO20GTCGTCCGCG TTCTGGTGAA ACTCGTGCTG AATTCSEQ ID NO21的資料序列特征長度35類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO21GACCTTCGAA TTCAGCACGA GTTTCACCAG AACGC35SEQ ID NO22的資料序列特征長度48類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO22GAAGGTCGTG TTGCTAAGGA ATCCTTCGAT GAAGAGAAAG GCTTCCAG48SEQ ID NO23的資料序列特征長度48類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO23GAGCACGCTG GAAGCCTTTC TCTTCATCGA AGGATTCCTT AGCAACAC48SEQ ID NO24的資料序列特征長度42類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO24CGTGCTCGTG AAGTTGCTTC TGTTATGAAC CGTGCTCTAG AA42SEQ ID NO25的資料序列特征長度39類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO25AGCTTTCTAG AGCACGGTTC ATAACAGAAG CAACTTCAC39SEQ ID NO26的資料序列特征長度45類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO26AATTCTCTAG AGAACGCTCA TGATGAATCT GCTTACCTGG ATAAC45SEQ ID NO27的資料序列特征長度50類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO27CTTCTTCAGG TTATCCAGGT AAGCAGATTC ATCATGAGCG TTCTCTAGAG50SEQ ID NO28的資料序列特征長度49類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO28CTGAAGAAGG AACTGGCTAA CGGTAACGAT GCTCTGCGTA ACGAAGATG49SEQ ID NO29的資料序列特征長度49類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO29GAGAACGAGC ATCTTCGTTA CGCAGAGCAT CGTTACCGTT AGCCAGTTCSEQ ID NO30的資料序列特征長度40類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO30CTCGTTCTCC GTTCTACTCT GCTCTGCGTA ACACTCCGTC40SEQ ID NO31的資料序列特征長度39類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO31CTTTGAAGGA CGGAGTGTTA CGCAGAGCAG AGTAGAACG39SEQ ID NO32的資料序列特征長度47類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO32CTTCAAAGAA CGTAACGGTG GTAACCATGA TCCGTCTCGT ATGAAAG47SEQ ID NO33的資料序列特征長度47類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO33GATAACAGCT TTCATACGAG ACGGATCATG GTTACCACCG TTACGTT47SEQ ID NO34的資料序列特征長度45類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO34CTGTTATCTA CTCTAAACAT TTCTGGTCTG GTCAGGATAGATCTA45SEQ ID NO35的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO35AGCTTAGATC TATCCTGACC AGACCAGAAA TGTTTAGAGT A41SEQ ID NO36的資料序列特征長度42類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO36AATTCAGATC TTCTTCTGCT GATAAACGTA AATACGGTGA TC42SEQ ID NO37的資料序列特征長度44類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO37CATCCGGATC ACCGTATTTA CGTTTATCAG CAGAAGAAGA TCTG44SEQ ID NO38的資料序列特征長度48類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO38CGGATGCATT CCGTCCGGCT CCGGGTACTG GTCTGGTAGA CATGTCTC48SEQ ID NO39的資料序列特征長度48類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO39GATCACGAGA CATGTCTACC AGACCAGTAC CCGGAGCCGG ACGGAATG48SEQ ID NO40的資料序列特征長度35類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO40GTGATCGTAA CATCCCGCGT TCTCCGACTT CTCCG35SEQ ID NO41的資料序列特征長度36類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO41CTTCACCCGG AGAAGTCGGA GAACGCGGGA TGTTAC36SEQ ID NO42的資料序列特征長度40類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO42GGTGAAGGCT TCGTTAACTT CGATTACGGT TGGTTCGGTG40SEQ ID NO43的資料序列特征長度40類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO43GTCTGAGCAC CGAACCAACC GTAATCGAAG TTAACGAAGC40SEQ ID NO44的資料序列特征長度44類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO44CTCAGACTGA AGCTGATGCT GATAAGACTG TATGGACCCA TGGA44SEQ ID NO45的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO45AGCTTCCATG GGTCCATACA GTCTTATCAG CATCAGCTTC A41SEQ ID NO46的資料序列特征長度39類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO46AATTCCCATG GTAACCATTA CCATGCTCCG AACGGTTCT39SEQ ID NO47的資料序列特征長度42類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO47CACCCAGAGA ACCGTTCGGA GCATGGTAAT GGTTACCATG GG42SEQ ID NO48的資料序列特征長度41類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO48CTGGGTGCTA TGCATGTATA CGAATCTAAA TTCCGTAACT G41SEQ ID NO49的資料序列特征長度42類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO49CTTCAGACCA GTTACGGAAT TTAGATTCGT ATACATGCAT AG42SEQ ID NO50的資料序列特征長度37類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO50GTCTGAAGGT TACTCTGACT TCGATCGTGG TGCTTAC37SEQ ID NO51的資料序列特征長度37類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO51GTGATAACGT AAGCACCACG ATCGAAGTCA GAGTAAC37SEQ ID NO52的資料序列特征長度38類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO52GTTATCACCT TCATTCCGAA ATCTTGGAAC ACTGCTCC38SEQ ID NO53的資料序列特征長度38類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO53CTTTGTCCGG AGCAGTGTTC CAAGATTTCG GAATGAAG38SEQ ID NO54的資料序列特征長度38類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO54GGACAAAGTT AAACAGGGTT GGCCGTAATG AAAGCTTA38SEQ ID NO55的資料序列特征長度34類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO55AGCTTAAGCT TTCATTACGG CCAACCCTGT TTAA34SEQ ID NO56的資料序列特征長度20類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO56TTTTCCCAGT CACGACGTTG20SEQ ID NO57的資料序列特征長度21類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO57CAGGAAACAG CTATGACCAT G21SEQ ID NO58的資料序列特征長度36類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO58TAAGGAGGTT TAAAATGTCT GACGATCGTG TTACTCSEQ ID NO59的資料序列特征長度21類型核酸鏈數(shù)單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性分子類型其它核酸合成DNA序列描述SEQ ID NO59TACGCCAAGG TTGTTAACCC A2權(quán)利要求
1.具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)，它包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基范圍內(nèi)的序列，其中蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸對應(yīng)于SEQ ID No.1的第二位的絲氨酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，它由SEQ ID No.1的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基之間的氨基酸序列組成。
3.編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的DNA。
4.編碼權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA，其中編碼從N-末端氨基酸計數(shù)第四位的Arg的堿基序列是CGT或CGC，編碼從N-末端氨基酸計數(shù)第五位的Val的堿基序列是GTT或GTA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA，其中編碼N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之間的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的堿基序列具有下列序列SerTCT或TCCAspGAC或GATAspGAC或GATArgCGT或CGCValGTT或GTA
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA，其中編碼從N-末端氨基酸到第五位的氨基酸之間的氨基酸序列，Ser-Asp-Asp-Arg-Val的堿基序列具有序列TCT-GAC-GAT-CGT-GTT。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA，其中編碼N-末端開始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之間的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的堿基序列具有下列序列ThrACT或ACCProCCA或CCGProCCA或CCGAlaGCT或GCA
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA，其中編碼N-末端開始的第六位氨基酸到第九位的氨基酸之間的氨基酸序列，Thr-Pro-Pro-Ala的堿基序列具有下列序列ThrACT或ACCProCCA或CCGProCCA或CCGAlaGCT或GCA
10.包括由SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基之間的序列的DNA。
11.由SEQ ID No.2的堿基序列中第四位的胸腺嘧啶堿基到第993位的鳥嘌呤堿基之間的序列組成的DNA。
12.具有權(quán)利要求3所述的DNA的重組DNA。
13.具有權(quán)利要求5所述的DNA的重組DNA。
14.具有權(quán)利要求6所述的DNA的重組DNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組DNA，它具有選自于下列組的啟動子trp，tac，lac，trc，λPL和T7。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組DNA，它具有選自于下列組的啟動子trp，tac，lac，trc，λPL和T7。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的重組DNA，它具有選自于下列組的啟動子trp，tac，lac，trc，λPL和T7。
18.用權(quán)利要求12所述的重組DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)化是通過使用多拷貝的載體進行的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化體，它屬于大腸桿菌。
21.通過用權(quán)利要求14所述的DNA轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)化是通過使用多拷貝的載體進行的，該轉(zhuǎn)化體屬于大腸桿菌。
22.用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)和回收該蛋白質(zhì)的步驟。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體是權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)化體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體是權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化體。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中轉(zhuǎn)化體是權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
公開了具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì),它包括由SEQ ID No.1表示的氨基酸序列的第二位的絲氨酸殘基到第331位的脯氨酸殘基范圍內(nèi)的序列,其中蛋白質(zhì)的N－末端氨基酸對應(yīng)于SEQIDNo.1的第二位的絲氨酸殘基,公開了編碼該蛋白質(zhì)的DNA,具有該DNA的轉(zhuǎn)化體,和用于生產(chǎn)具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的蛋白質(zhì)的方法,該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的步驟,利用例如大腸桿菌的宿主的轉(zhuǎn)化體能夠大量地生產(chǎn)所述的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/54GK1253177SQ9810337
公開日2000年5月17日 申請日期1998年7月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月4日
發(fā)明者橫山敬一, 中村奈已, 三輪哲也, 脊黑勝也 申請人:味之素株式會社