專利名稱：克服生物素同效維生素中dapa氨基轉(zhuǎn)移酶的瓶頸環(huán)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及生物素同效維生素的生物合成領(lǐng)域。
盡管闡明了生物素合成中的一些步驟和組分(Ohshiro等人，Biosci.Biotech.Biochem,58:1738-1741,1994；Ifuku等人，歐洲生物化學(xué)雜志，224:173-178,1994；Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Birch等人，生物化學(xué)雜志，270:19158-19165,1995；Sanyal等人，生物化學(xué)，33:3625-3631,1995)，但已在生物化學(xué)和分子生物學(xué)水平上研究了大腸桿菌(E.Coli)和球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)的生物素生物合成(DeMoll,1996,F.C.Neidhardt等人(編輯)，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細(xì)胞和分子生物學(xué)，第2版，第1卷，pp.704-709,ASM出版社，華盛頓；Perkins等人，A.L.Sonenshein等人(編輯)，枯草桿菌(Bacillus subtilis)和其它革蘭氏陽性細(xì)菌生物化學(xué)，生理學(xué)和分子遺傳學(xué)，pp.319-334，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓；Eisenberg,1987,F.Neidhardt等人(編輯)，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，p544-550，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓；Cronan，細(xì)胞，58:427-429,1989,Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，45:1983-1989,1981；Gloeckler等人，基因，87:63-70,1990)。已從上述兩種細(xì)菌類型中分離和鑒定了涉及庚二酰-CoA轉(zhuǎn)化為生物素的幾種酶(Ploux等人，生物化學(xué)雜志，283:327-321,1992；Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，45:1983-1989,1981；Eisenberg，文獻(xiàn)同上，Huang等人，生物化學(xué)，34:10985-10995,1995)。KAPA合成酶是bioF的產(chǎn)物，該酶催化庚二酰-CoA和丙氨酸轉(zhuǎn)化為8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)。DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶是bioA的產(chǎn)物，該酶將供體的氨基轉(zhuǎn)移給KAPA以產(chǎn)生7,8-二氨基壬酸(DAPA)。脫硫生物素合成酶(bioD)催化脲基環(huán)的閉合以產(chǎn)生脫硫生物素(DTB)，最終，bioB的產(chǎn)物生物素合成酶與大量其它成分一起作用使脫硫生物素轉(zhuǎn)化為生物素，所述其它成分包括黃素氧還蛋白(Birch等人，文獻(xiàn)同上；Ifuku等人，文獻(xiàn)同上)，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Ohshiro等人，文獻(xiàn)同上；Sanyal等人，文獻(xiàn)同上；Birch等人，文獻(xiàn)同上)，F(xiàn)errodoxin NADP+還原酶(Birch等人，文獻(xiàn)同上；Sanyal等人，Arch.Biochem.Biophys,326:48-56,1996)，可能還包括半胱氨酸(Florentin等人，C.R.Acad.Sci，巴黎，317:485-488,1994；Birch等人，文獻(xiàn)同上；Sanyal等人，文獻(xiàn)同上)?；衔颣APA,DAPA,DTB和生物素統(tǒng)一地或單獨(dú)地被稱為同效維生素或生物素同效維生素。
在大腸桿菌中，編碼這些酶的基因位于兩個趨異轉(zhuǎn)錄的操縱子上，這兩個操縱子由一個與BirA阻遏物相互作用的操縱基因控制(Cronan，細(xì)胞，58:427-429,1989)。在球形芽孢桿菌中，所述基因位于兩個獨(dú)立的操縱子上(Gloeckler等人，文獻(xiàn)同上)。此途徑中那些涉及庚二酰-CoA合成的較早的步驟未被很好地理解(Ifuku等人，歐洲生物化學(xué)雜志，224:173-178,1994；Sanyal等人，美國化學(xué)學(xué)會雜志，116:2637-2638,1994)。球形芽孢桿菌含有一種酶，即庚二酰-coA合成酶(bioW)，它可以將庚二酸轉(zhuǎn)化為庚二酰-CoA(Gloeckler等人，基因，87:63-70,1990；Ploux等人，生物化學(xué)雜志，287:685-690,1992)。大腸桿菌缺乏這種酶，因此在生物素合成中不能將庚二酸用作中間體(Gloeckler等人，文獻(xiàn)同上；Ifuku等人，歐洲生物化學(xué)雜志，224:173-178,1994；Sanyal等人，美國化學(xué)學(xué)會雜志，116:2637-2638,1994)。大腸桿菌含有兩個基因，它們是位于bio操縱子上的bioC和與其它bio基因不相關(guān)的bioH，這兩個基因似乎都涉及生物素的生物合成中一直導(dǎo)致庚二酰-CoA生成的較早的步驟，但它們確切的作用仍是未知的(Eisenberg，文獻(xiàn)同上；Lemoine等人，分子微生物學(xué)，19:645-647,1996)。
枯草芽孢桿菌含有大腸桿菌和球形芽孢桿菌的bioA,bioB,bioD和bioF基因的同系物，這四個基因與球形芽孢桿菌的bioW基因的同系物一起以bioWAFDB的次序位于單個操縱子上，其后緊接著兩個另外的基因，即bioI和orf2(Bower等人，細(xì)菌學(xué)雜志，178:4122-4130,1996)。一般情況下，bioI和orf2與其它已知的生物素生物合成基因不相似。bioI基因編碼與細(xì)胞色素P450相類似的蛋白質(zhì)，并能與大腸桿菌bioC或bioH中的突變互補(bǔ)(Bower等人，文獻(xiàn)同上)。bioI中的突變導(dǎo)致枯草芽孢桿菌在缺乏生物素時生長較差，bioI突變體營養(yǎng)作用徐緩的表型可通過庚二酸來克服，這暗示著bioI的產(chǎn)物在庚二酸合成之前的步驟中起作用(Bower等人，文獻(xiàn)同上)。
位于枯草芽孢桿菌bio操縱子之前的是推定的生長(vegetative)啟動子序列，緊接該操縱子下游含有與球形芽孢桿菌bio調(diào)節(jié)區(qū)域同源之區(qū)域的二重對稱區(qū)域(Bower等人，文獻(xiàn)同上)。對bioW-lacZ翻譯的融合蛋白的分析表明生物素操縱子的表達(dá)由生物素和枯草芽孢桿菌的birA基因調(diào)控。通過用歐洲專利申請公開(EP)635572中所述的組成型啟動子取代啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域可以改造生物素合成去調(diào)控的菌株，通過整合和擴(kuò)增枯草芽孢桿菌染色體中的去調(diào)控基因可進(jìn)一步地改善生物素和生物素同效維生素的生產(chǎn)，EP635572中所述的BI282菌株是這種菌株的例子。
我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用經(jīng)改造的細(xì)胞，在補(bǔ)加庚二酸的情況下生物合成生物素時，KAPA向DAPA的轉(zhuǎn)化是重要的瓶頸環(huán)節(jié)。當(dāng)除去對生物素生物合成的其它控制時，KAPA向DAPA的轉(zhuǎn)化不能與KAPA的生產(chǎn)保持同步，從而使KAPA集結(jié)，卻不能使終產(chǎn)物相伴地增加。已發(fā)現(xiàn)瓶頸環(huán)節(jié)的重要組分是KAPA向DAPA的轉(zhuǎn)化中所用的氨基供體的有效性和一致性。一般情況下，提供足夠量的氨基供體是克服瓶頸效應(yīng)的重要策略。另外，能使用賴氨酸和相關(guān)化合物作為由KAPA生產(chǎn)DAPA的反應(yīng)中被轉(zhuǎn)移的氨基來源的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶可顯著改善下游生物素同效維生素，尤其是脫硫生物素(DTB)生物合成的產(chǎn)率?？瓷先ヌ峁┹^高水平的能被可利用的氨基轉(zhuǎn)移酶使用的氨基供體即可基本上改善上述的瓶頸環(huán)節(jié)。例如，通過或者將賴氨酸包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中，或者使賴氨酸生物合成途徑去調(diào)控以制備足夠量的可用的賴氨酸，可顯著地改善生物素同效維生素的細(xì)菌生產(chǎn)，所述細(xì)菌的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶使用賴氨酸作為氨基供體。使用枯草芽孢桿菌及其密切相關(guān)的菌株，包括以枯草芽孢桿菌為代表的芽孢桿菌種群中的成員的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶時也可使用這種策略。所述種群包括例如枯草芽孢桿菌，短小芽孢桿菌(B.pumilus)，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。枯草芽孢桿菌群的成員在遺傳和代謝上與更遠(yuǎn)相關(guān)的以球形芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)為代表的芽孢桿菌種群趨于不同(Priest，枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏細(xì)菌，文獻(xiàn)同上，p3-16，引為本文作為參考；Stackbrant等人，微生物遺傳學(xué)雜志，133:2523-2529,1987)。
因此，本發(fā)明的一個方面一般地涉及通過在加富賴氨酸，賴氨酸前體或類似物的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)菌以生物合成(如酶解或使用經(jīng)改造的細(xì)胞發(fā)酵)生物素同效維生素的方法，所述細(xì)菌中含有利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶，然后從環(huán)境中收獲所需的生物素同效維生素?？梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)臏y定法評價指定的氨基轉(zhuǎn)移酶所使用的氨基供體的能力，所述測定法包括但不限于基于Eisenberg和Stoner(1971，見下文)所述的生物測定法，其中使用大腸桿菌的DAPA敏感菌株測定DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。典型地，如EP635572中所述，有關(guān)一個或多個生物素合成途徑步驟，細(xì)菌也可以去調(diào)控。通過細(xì)胞的野生型基因材料，通過被導(dǎo)入細(xì)胞的外源核酸，或者通過這兩者的作用，可產(chǎn)生DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。
本文所用的“利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶”指的是利用賴氨酸或能轉(zhuǎn)化成賴氨酸的化合物或能取代賴氨酸以作為氨基供體的化合物，能將8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)轉(zhuǎn)化為二氨基壬酸(DAPA)的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。
本文所用的“富含某物質(zhì)的環(huán)境”指的是細(xì)菌培養(yǎng)，其中指定分子的濃度大于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的相應(yīng)濃度，較高的濃度是生物素同效維生素不能超量產(chǎn)生時為避免細(xì)胞生長受限所必需的。
被回收和純化的生物素同效維生素產(chǎn)物可以是生物素，脫硫生物素，或二氨基壬酸(DAPA)。當(dāng)回收脫硫生物素或DAPA時，此方法可進(jìn)一步地包括將回收的脫硫生物素或DAPA轉(zhuǎn)化為生物素的步驟。
在本發(fā)明的另一方面，通過超量產(chǎn)生能將氨基供體的氨基轉(zhuǎn)移給8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶，也可改造菌株以克服KAPA至DAPA的瓶頸環(huán)節(jié)。在本發(fā)明此方面的優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過去調(diào)控生物素生物合成步驟而不是KAPA-DAPA步驟，可進(jìn)一步地改造菌株以超量產(chǎn)生生物素同效維生素。
為了進(jìn)一步地防止KAPA至DAPA瓶頸環(huán)節(jié)的發(fā)生，可依據(jù)不同的氨基供體(如賴氨酸和SAM)，進(jìn)一步地改造菌株以產(chǎn)生多樣的DAPA-氨基轉(zhuǎn)移酶?？砂聪挛脑斒龅姆椒y定并區(qū)分這些活性，簡單地說，可通過在賴氨酸，甲硫氨酸，或賴氨酸和甲硫氨酸存在的條件下所培養(yǎng)細(xì)菌之產(chǎn)物的同效維生素生物測定和生物自顯影來測定KAPA至DAPA轉(zhuǎn)化的水平。
本文所用的“利用SAM的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶”指的是利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)或能轉(zhuǎn)化成SAM的化合物或能取代SAM作為氨基供體的化合物，能將8-氨基-7-酮壬酸(KAPA)轉(zhuǎn)化為二氨基壬酸(DAPA)的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。
在其它的實(shí)施方案中，在培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸和賴氨酸，或它們的類似物。
提供富含賴氨酸之環(huán)境的一種方法是在培養(yǎng)基中加富能在DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中為KAPA提供氨基的賴氨酸或賴氨酸同系物。賴氨酸同系物包括賴氨酸，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)和能用作DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的氨基供體的其它賴氨酸同系物。提供富含賴氨酸之環(huán)境的另一種方法是通過突變或改造細(xì)菌以顯著降低對賴氨酸生產(chǎn)的野生型控制，從而在賴氨酸生產(chǎn)方面使細(xì)菌去調(diào)控。例如，使賴氨酸合成步驟去調(diào)控包括降低或除去對賴氨酸合成酶轉(zhuǎn)錄或其它表達(dá)控制的調(diào)控，或者修飾賴氨酸合成酶以降低或除去對賴氨酸生物合成的控制。去調(diào)控也包括超量產(chǎn)生作為賴氨酸合成途徑的起始物質(zhì)的化合物，和抑制賴氨酸的生物降解(氨基酸生物合成和基因調(diào)控，E.Hermann和R.Somerville(編輯)，Addison Wesley,Reading,MA 1983,pp147-172,213-244,417)。
生物素合成步驟的去調(diào)控包括降低或除去對生物素合成酶轉(zhuǎn)錄或其它表達(dá)控制的調(diào)控，或者修飾生物素合成酶以降低或除去對酶-催化的生物素合成反應(yīng)的控制。去調(diào)控也包括超量產(chǎn)生作為生物素合成途徑的起始物質(zhì)的化合物，和抑制所需生物素同效維生素的生物降解。
通過有意地和特異性地改變野生型基因組來改造細(xì)菌可產(chǎn)生所需的生物合成表型，如比相應(yīng)的野生型，即未經(jīng)改造的生物體合成更多的賴氨酸，或除去生物素生物合成途徑中的瓶頸環(huán)節(jié)。
可通過任何方法使DTB轉(zhuǎn)化為生物素，所述方法包括但不限于DTB向生物素的生化轉(zhuǎn)化，給經(jīng)改造可將DTB生物轉(zhuǎn)化為生物素的細(xì)菌補(bǔ)加DTB(Fujisawa等人，Biosci.Biotech.Biochem,57:740-744,1993)，由DTB體外合成生物素(Birch等人，生物化學(xué)雜志，270:19158-19165,1995；Fujisawa等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters,110:1-4,1993；Ifuku等人，Biosci.Biotech.Biochem,56:1780-1785,1992；Birch,WO 94/08023)或化學(xué)合成。
另外，本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)生物素同效維生素的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)含有利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，所述培養(yǎng)發(fā)生于富含賴氨酸，賴氨酸類似物，或賴氨酸前體的環(huán)境中；和(b)回收所述的生物素同效維生素。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)生物素同效維生素的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)含有利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌在賴氨酸生產(chǎn)方面被去調(diào)控；和(b)回收所述的生物素同效維生素。
另外，本發(fā)明的目的是提供上述的方法，其中細(xì)菌被改造以超量產(chǎn)生利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶，更具體地，在這種方法中，在培養(yǎng)基中外源加入賴氨酸，賴氨酸類似物，或賴氨酸前體，所述方法中生物素同效維生素是生物素，二氨基庚二酸(DAPA)或脫硫生物素，回收脫硫生物素之后，此方法進(jìn)一步地包括通過獨(dú)立的發(fā)酵，生化反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)將回收的脫硫生物素轉(zhuǎn)化為生物素，并回收生物素，所述方法中細(xì)菌對賴氨酸類似物，如(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性。
另外，本發(fā)明的目的是提供上述的方法，其中細(xì)菌在至少一個生物素合成途徑步驟以及bioA表達(dá)方面被去調(diào)控，所述方法中所述細(xì)菌被進(jìn)一步地改造以產(chǎn)生利用SAM的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶，具體地說在培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，或SAM的類似物。
最后，本發(fā)明的另一目的是提供經(jīng)改造可超量產(chǎn)生利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶和利用SAM的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌。具體地說，通過改造至少一個生物素合成步驟以及bioA表達(dá)的去調(diào)控，可進(jìn)一步地改造這種細(xì)菌的菌株以超量產(chǎn)生生物素同效維生素，本發(fā)明還提供了經(jīng)改造可超量產(chǎn)生利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，其中細(xì)菌被進(jìn)一步地改造以超量產(chǎn)生賴氨酸。
可使用下列菌株實(shí)施本發(fā)明BI90,BI96,BI603,BI641和BI642。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于1997年7月11日將這些菌株保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，它們的保藏號分別為ATCC 55999,202000,202003,202002和202001。
以下是圖和表的簡述。


圖1是顯示KAPA濃度對枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響的數(shù)據(jù)描述。
圖2是在不同濃度的KAPA存在時，枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶初速度數(shù)據(jù)的倒數(shù)圖。
圖3是如表5所述的，具有賴氨酸和甲硫氨酸，或具有或不具有賴氨酸時，不同菌株發(fā)酵肉湯生物自顯影結(jié)果的描述。
圖4是枯草芽孢桿菌生物合成賴氨酸和相關(guān)化合物之途徑的圖解。
表1是通過在反應(yīng)混合物中加入潛在的氨基供體，測出的BI611提取物的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶數(shù)據(jù)的描述。
表2是在反應(yīng)混合物中加入賴氨酸或賴氨酸相關(guān)化合物之后，BI611提取物的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶測定結(jié)果的描述。
表3是在小試規(guī)模發(fā)酵罐中，6g賴氨酸/l存在下培養(yǎng)的BI282和BI603的生物素和同效維生素生產(chǎn)的描述。
表4是在小試規(guī)模發(fā)酵罐的分批補(bǔ)料培養(yǎng)中，3g甲硫氨酸/l存在下培養(yǎng)的BI282,BI96和BI90的生物素和同效維生素生產(chǎn)的描述。
表5A-5B是在小試規(guī)模發(fā)酵罐中，在6g賴氨酸/l和3g甲硫氨酸/1存在或缺乏的條件下培養(yǎng)的BI603和BI90的生物素和同效維生素生產(chǎn)的描述。
表6是使用不同的賴氨酸補(bǔ)料制度所生產(chǎn)的生物素和同效維生素測定結(jié)果的描述。
表7列出了已知的枯草芽孢桿菌賴氨酸-去調(diào)控的突變體。
表8是在存在庚二酸的條件下培養(yǎng)的對AEC有抗性的菌株所生產(chǎn)的生物素和同效維生素測定結(jié)果的描述。
表9描述了小試發(fā)酵罐中用于生產(chǎn)生物素和同效維生素的培養(yǎng)基的組成。
表10描述了生物素和DTB的親和素-HABA置換試驗(yàn)。
以下簡述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。
在枯草芽孢桿菌補(bǔ)料庚二酸的發(fā)酵過程中發(fā)生KAPA至DAPA轉(zhuǎn)化的瓶頸環(huán)節(jié)。在下文描述的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中，DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶使用賴氨酸作為氨基供體，與之形成對照的是在球形芽孢桿菌(Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，45:1983-1989,1981)，谷氨酸棒桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)，鼠傷寒沙門氏菌，產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)，玫瑰色芽孢桿菌(Bacillus roseus)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)，和劃界八疊球菌(Sarcina marginata)(Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，39:175-181,1975)，大腸桿菌(Eisenberg等人，細(xì)菌學(xué)雜志，108:1135-1140,1971)，和S.marcescens中，DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶使用S-腺苷甲硫氨酸這種化合物作為氨基供體。
在大腸桿菌和球形芽孢桿菌中，KAPA至DAPA的轉(zhuǎn)化由DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶催化，該酶是bioA基因的產(chǎn)物，它利用SAM和KAPA作為底物(Eisenberg等人，細(xì)菌學(xué)雜志，108:1135-1140,1971；Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，45:1983-1989,1981；Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043,1975；Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4029-4036)。假定該反應(yīng)與枯草芽孢桿菌中的類似，因?yàn)榭莶菅挎邨U菌氨基轉(zhuǎn)移酶與大腸桿菌氨基轉(zhuǎn)移酶33％同源，并可以與大腸桿菌的bioA突變體互補(bǔ)。然而，枯草芽孢桿菌酶的體外測定使我們驚奇地發(fā)現(xiàn)賴氨酸是枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的氨基供體。另外，在枯草芽孢桿菌生物素生產(chǎn)菌株，如BI282的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入賴氨酸(2-10g/l)可降低所產(chǎn)生的KAPA的量，并導(dǎo)致顯著量的脫硫生物素(DTB)的積累。然后可使用多種發(fā)酵或化學(xué)方法將DTB轉(zhuǎn)化為生物素。
SAM不是枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶有效的氨基供體，這一觀察提供了克服上述瓶頸環(huán)節(jié)的線索。對真正的氨基供體進(jìn)行研究，試驗(yàn)了26個不同的氨基酸和相關(guān)化合物之后，只發(fā)現(xiàn)賴氨酸可顯著刺激枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶在體外將KAPA轉(zhuǎn)化為DAPA。在隨后的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)D-和L-賴氨酸，和賴氨酸類似物，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)可被枯草芽孢桿菌的酶用作氨基供體。因此，這些化合物中的任何一個，或它們的任何組合都可用于本發(fā)明。盡管存在其它已知的利用賴氨酸為氨基供體的氨基轉(zhuǎn)移酶(Tobin等人，1991，細(xì)菌學(xué)雜志，173:6223-6229；Coque等人，1991，細(xì)菌學(xué)雜志，173:6258-6264；Soda等人，1968，生物化學(xué)，7:4102-4109；Soda和Misono,1968，生物化學(xué)，7:4110-4119；Schmidt等人，1988,FEMSMicrobiol.Lett.,49:203；Lowe和Rowe,1986,Mol.Biochem.Parasitol,21:65)，但沒有其它已知的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶利用賴氨酸。大腸桿菌和球形芽孢桿菌的BioA酶都利用SAM(Eisenberg等人，細(xì)菌學(xué)雜志，108:1135-1140,1971；Izumi等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，45:1983-1989,1981；Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043,1975；Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4029-4036)。
對枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的鑒定表明賴氨酸的Km高，該值受KAPA底物抑制。我們得出結(jié)論KAPA至DAPA的瓶頸環(huán)節(jié)是由不充足的賴氨酸，或KAPA/賴氨酸的不適當(dāng)?shù)谋嚷室鸬模诎l(fā)酵培養(yǎng)基中加入賴氨酸可克服這一瓶頸環(huán)節(jié)。
當(dāng)添加了賴氨酸(6g/l)，以及庚二酸(1g/l)進(jìn)行發(fā)酵時，經(jīng)改造的枯草芽孢桿菌菌株BI282(bio∷[P15bio]7-8)的DTB生產(chǎn)顯示出顯著的增長(＞10倍)。在這些發(fā)酵條件下，BI282產(chǎn)生了約300-700mg/l的DTB。根據(jù)精確的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件，幾乎所有的KAPA都能被轉(zhuǎn)化為DTB。另外，在6g/l賴氨酸，3g/l甲硫氨酸(因?yàn)榇竽c桿菌的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶利用SAM，而甲硫氨酸是SAM的前體)，和1g/l庚二酸存在的條件下，發(fā)酵菌株BI90可導(dǎo)致KAPA至DTB＞90％的轉(zhuǎn)化和高水平的DTB生產(chǎn)，600-900mg/l，菌株BI90是BI282的衍生物，它含有單拷貝的盒，其中的大腸桿菌bioA基因由枯草芽孢桿菌的veg啟動子起始轉(zhuǎn)錄，并從合成的枯草芽孢桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)處翻譯(PvegbioAec盒)。使用生物自顯影進(jìn)一步地證實(shí)可測量的KAPA的缺乏。這些數(shù)據(jù)表明在添加庚二酸的發(fā)酵中，KAPA的積累至少部分地是由氨基供體的不充足的胞內(nèi)水平所引起的。增加培養(yǎng)基中賴氨酸的濃度可克服KAPA至DAPA的瓶頸環(huán)節(jié)，并可導(dǎo)致DTB生產(chǎn)的顯著改善。
可在BI282中引入使賴氨酸生物合成途徑去調(diào)控的突變(見圖4)。生物素生產(chǎn)菌株的兩個賴氨酸類似物(AEC)抗性突變體的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明在未添加賴氨酸的條件下，DTB的滴度有所改善。然而，在這些突變體菌株中，賴氨酸仍是限制的。如果希望消除賴氨酸補(bǔ)料，則需要引入另外的突變以進(jìn)一步地使賴氨酸的生物合成去調(diào)控。這種突變包括那些導(dǎo)致1)天冬氨酸激酶Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ中的任何一種或全部的去調(diào)控表達(dá)，2)對天冬氨酸激酶Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ的反饋抗性，3)二氨基庚二酸脫羧酶的去調(diào)控表達(dá)，4)對二氨基庚二酸脫羧酶的反饋抗性，或5)上述的任何聯(lián)合的突變(枯草桿菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌(1993),A.Sowenstein J.Hoch,R.Losick(編輯)，pp.237-267，美國微生物學(xué)學(xué)會，華盛頓)。
實(shí)施例實(shí)施例1DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的酶測定DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的測定如Eisenberg和Stoner在1971年的描述(細(xì)菌學(xué)雜志，108:1135-1140)。在此試驗(yàn)中，在輔因子吡哆醛5’-磷酸和細(xì)胞提取物的存在下，將底物KAPA與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)一起保溫。測量利用大腸桿菌bioA菌株的平板生物試驗(yàn)中產(chǎn)生的DAPA的量。由于被檢測的很多菌株的提取物中含有顯著量的生物素和脫硫生物素可補(bǔ)料給生物測定中所用的大腸桿菌指示菌株，因此在試驗(yàn)混合物中加入鏈霉親和素(8mg/ml)。通過將用作底物的KAPA制品穿過親和素-瓊脂糖柱，從中除去痕量生物素和脫硫生物素的污染。在生物測定中使用大腸桿菌bioA109菌株(MEC1)測量DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。相對任何其它的bioA突變體而言，由Eisenberg發(fā)展起來的用于此試驗(yàn)的大腸桿菌bioA菌株被多次報道對DAPA更敏感。Eisenberg的DAPA-敏感菌株得自耶魯大學(xué)大腸桿菌基因庫中心(Genetic Stock Center)。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶不能利用SAM作為氨基供體測定經(jīng)改造可超量表達(dá)枯草芽孢桿菌BioA蛋白的枯草芽孢桿菌菌株BI282的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的活性BI282含有如EP635572所述的在bio基因座處擴(kuò)增的P15bio盒。缺失了bio操縱子的枯草芽孢桿菌菌株BI9(Dbio∷neo)被用作陰性對照。將已知濃度的DAPA溶液點(diǎn)在生物測定板上以使每次測定時產(chǎn)生的DAPA的量能被估計。在BI282提取物中發(fā)現(xiàn)了可測的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性，但在BI9提取物中未發(fā)現(xiàn)上述活性。
在至少60分鐘內(nèi)，酶反應(yīng)與時間大致呈線性關(guān)系。使用薄層層析顯示出反應(yīng)產(chǎn)物為DAPA。盡管在10％ DMSO存在下冷凍提取物似乎能使酶穩(wěn)定化，但通過將提取物煮沸，或冷凍和解凍可破壞酶活性。活性取決于KAPA的存在，但令人驚奇的是活性不取決于SAM的存在。然而，從缺乏原有的bioA基因但含有得自大腸桿菌或S.marcescens之bioA基因的枯草芽孢桿菌菌株測定的提取物具有DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性，該活性取決于外源SAM的存在。我們得出結(jié)論枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶利用的氨基供體與大腸桿菌或S.marcescens之酶所利用的有所不同。在所使用的試驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的比活比大腸桿菌或S.marcescens之酶的要低100倍。這種低比活可能是提取物中有限濃度的氨基供體引起的。實(shí)施例3鑒定作為枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶氨基供體的賴氨酸為了測定通過在反應(yīng)混合物中加入其它氨基供體是否能刺激枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的活性，在體外篩選了多種氨基供體刺激酶活性的能力。透析由枯草芽孢桿菌菌株BI611(Dbio∷cat,bpr∷[P26bioA]4-6)制備的無細(xì)胞提取物以除去任何內(nèi)源性水平的氨基供體，并在各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和幾種其它的胺化合物存在的條件下檢測此提取物，菌株BI611缺失了bio操縱子，但含有多拷貝(4-6)的枯草芽孢桿菌bioA基因，該基因由噬菌體SP01-26啟動子起始轉(zhuǎn)錄，盒整合于bpr基因座。在26個被檢測的化合物中，只有L-賴氨酸鹽酸鹽(＞98％純)能刺激DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的活性(表1)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，檢測了多種賴氨酸衍生物和類似物的刺激活性(表2)。更純的L-賴氨酸制品(＞99％純)刺激活性的能力支持這樣一個結(jié)論，即L-賴氨酸是酶真正的氨基供體，而反對真正的氨基供賴氨酸制品中的污染物這一結(jié)論。L-賴氨酸的類似物，即(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)刺激活性的能力進(jìn)一步地支持這樣一個結(jié)論，即L-賴氨酸是枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶真正的氨基供體。除了g碳已被硫原子取代外，(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸的結(jié)構(gòu)與L-賴氨酸相同。
賴氨酸作為枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶氨基供體的用途區(qū)分了使用SAM作為氨基供體的其它細(xì)菌(大腸桿菌，S.marcescens和球形芽孢桿菌)的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)研究使用制備自BI611(Dbio∷cat,bpr∷[P26bioA]4-6)的無細(xì)胞的粗提取物研究枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)特性。由KAPA和賴氨酸生產(chǎn)DAPA顯示出與時間大致呈線性。在20分鐘內(nèi)，約10-40％的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。在標(biāo)準(zhǔn)的20分鐘反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的DAPA的總量顯示出與反應(yīng)混合物中所加入的蛋白質(zhì)的量直接成比例。經(jīng)測定，氨基交換反應(yīng)最適的pH為8.6。當(dāng)賴氨酸的濃度在飽和水平上(19mM)維持恒定時，KAPA濃度(＜20mM)和比活之間表現(xiàn)出線性關(guān)系(圖1)。當(dāng)KAPA濃度為20mM-80mM時，酶活性保持穩(wěn)定，當(dāng)KAPA濃度約為80mM時，觀察到活性抑制。Eisenberg和Stoner也已闡明對大腸桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的KAPA底物抑制(1971，細(xì)菌學(xué)雜志，108:1135-1140)。約20mM水平的KAPA會抑制大腸桿菌酶。當(dāng)KAPA濃度保持恒定時，枯草芽孢桿菌bioA酶活性和賴氨酸濃度(0-20mM)之間呈現(xiàn)出大致的線性關(guān)系。對于濃度為20-40mM的賴氨酸而言，酶變得飽和。
KAPA對枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的底物抑制提供了雙置換或乒乓反應(yīng)機(jī)制的證據(jù)，在大腸桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶中已闡明了該機(jī)制(Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043,1975)。圖2所示的實(shí)驗(yàn)提供了支持此結(jié)論的另外的證據(jù)。在4個不同的固定的賴氨酸濃度下，KAPA的濃度是不同的，收集初速度的數(shù)據(jù)，并以雙倒數(shù)形式作圖。在顯示乒乓型反應(yīng)機(jī)制的低KAPA濃度區(qū)域，線大致平行(Stoner等人，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043)。
對于枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)，測定出賴氨酸和KAPA的表觀Km值范圍分別為2-25mM和1-5mM。以前，Eisenberg和Stoner估計對于大腸桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶而言，KAPA的Km值為1.2mM(1975，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043)。由于KAPA是底物抑制劑，在較低的賴氨酸濃度下，它可能與賴氨酸競爭同活性位點(diǎn)的結(jié)合，因此難以準(zhǔn)確地測量賴氨酸的Km值。然而，經(jīng)Stoner和Eisenberg測定，對于枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶而言，賴氨酸的表觀Km值(2-25mM)比對于純化的大腸桿菌酶而言的SAM的Km值(0.2mM)顯著較高(1975，生物化學(xué)雜志，250:4037-4043)。實(shí)施例5具有增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，或S.marcescens的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性的菌株的發(fā)酵為了檢測對于適當(dāng)?shù)陌被w而言，經(jīng)改造的生物素生產(chǎn)菌株的發(fā)酵是否受到限制，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，其中在含有適當(dāng)bioA盒之菌株的發(fā)酵過程中補(bǔ)加賴氨酸，甲硫氨酸(SAM的前體)或賴氨酸+甲硫氨酸，通過同效維生素生物測定法和生物自顯影測量KAPA至DAPA的轉(zhuǎn)化水平。
在計算機(jī)控制的14升Chemap發(fā)酵罐中進(jìn)行所有的發(fā)酵，所述發(fā)酵使用溶解氧控制，限制葡萄糖的補(bǔ)料分批發(fā)酵策略。使用表9所示的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，按指示在發(fā)酵罐中分批補(bǔ)加庚二酸，賴氨酸和甲硫氨酸。使用HABA-親和素置換試驗(yàn)測定搖瓶和發(fā)酵樣品中脫硫生物素和生物素的總量。將此化學(xué)測定法與測定生物素水平的生物測定法(如EP635572所述，和Tanaka等人，微生物學(xué)方法雜志，6:237-247,1987)聯(lián)合以另外測定脫硫生物素的生產(chǎn)。
HABA-親和素置換試驗(yàn)基于兩個事實(shí)1)相對HABA在溶液中游離時而言，HABA與親和素結(jié)合時在500nm下有更強(qiáng)的吸收，和2)DTB或生物素會等量地將HABA從親和素上置換下來。表10中給出了此試驗(yàn)的描述，在2-14mg/l脫硫生物素(DTB)的范圍內(nèi)，HABA試驗(yàn)是線性的。
總的同效維生素被測定為發(fā)酵樣品中DTB等價物，所述樣品在高壓滅菌之前已被酸化以防止KAPA分解。按EP635572所述測定總的同效維生素。實(shí)施例6具有增強(qiáng)的枯草芽胞桿菌bioA活性之菌株的補(bǔ)加賴氨酸的發(fā)酵通過使用超量表達(dá)枯草芽胞桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的菌株BI282和BI603來研究補(bǔ)加賴氨酸對KAPA轉(zhuǎn)化為DAPA的影響。BI282超量表達(dá)多拷貝盒(P15bio)上的所有生物素生物合成基因，所述盒整合于bio基因座上。BI603是BI282的衍生物，它含有整合于bpr基因座上的多拷貝的額外的bioA盒(P26bioA)，可進(jìn)一步地增加DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的水平。表3(上部)表示在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中，添加了1g/l庚二酸和6g/l賴氨酸培養(yǎng)的BI603和BI282的光密度，生物素和同效維生素生產(chǎn)。在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中，添加了賴氨酸培養(yǎng)的BI603和BI282所生產(chǎn)的總的同效維生素分別約為1300mg/l和1000mg/l。3組發(fā)酵的生物素生產(chǎn)水平差不多(20-22mg/l)。與以前不加賴氨酸的發(fā)酵相比，賴氨酸分批發(fā)酵中的HABA同效維生素(生物素+DTB)水平要高很多。典型地，BI282和BI603產(chǎn)生了20-40mg/l的HABA同效維生素。加入賴氨酸將BI603生產(chǎn)的HABA同效維生素增加到570mg/l，將BI282生產(chǎn)的HABA同效維生素增加到330mg/l。根據(jù)生物素的滴度，由補(bǔ)加賴氨酸生產(chǎn)的大多數(shù)HABA同效維生素似乎是脫硫生物素的形式。由于生物素由脫硫生物素形成，HABA滴度代表細(xì)胞中脫硫生物素的總生產(chǎn)水平(為了簡單起見，從此脫硫生物素的生產(chǎn)和HABA同效維生素的滴度可互換使用)。BI603的30小時發(fā)酵樣品的生物自顯影證實(shí)了脫硫生物素的積累，并顯示出DAPA沒有大量地積累(大約10mg/l)。實(shí)施例7具有增強(qiáng)的大腸桿菌或S.marcescens的BioA活性之菌株的補(bǔ)加甲硫氨酸的發(fā)酵通過發(fā)酵分別表達(dá)大腸桿菌或S.marcescens ATCC 31809 DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的菌株BI90和BI96，研究補(bǔ)加甲硫氨酸(SAM的前體)對KAPA轉(zhuǎn)化為DAPA的影響。BI90(bio∷[P15bio]7-8sacB∷[PvegbioAec]1)和BI96(bio∷[P15bio]7-8sacB∷[PvegbioAsm]1)是BI282的衍生物，它們分別含有整合于sacB基因座的單拷貝的大腸桿菌PvegbioAec或S.marcescens PvegbioAsm盒。在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中，添加了1g/l庚二酸和3g/l甲硫氨酸；在這些發(fā)酵中不加入外源的賴氨酸以僅觀察對革蘭氏陰性細(xì)菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶將KAPA轉(zhuǎn)化為DAPA的影響。BI282用作陰性對照，它不含經(jīng)改造的革蘭氏陰性細(xì)菌的bioA基因，在與上相同的條件下培養(yǎng)BI282。如表4所示，BI90,BI96和BI282總的同效維生素生產(chǎn)類似。生物素的生產(chǎn)比平常稍低(5-10mg/l)。與對照BI282的發(fā)酵相比，BI90和BI96補(bǔ)加甲硫氨酸的發(fā)酵中的HABA同效維生素(生物素+DTB)水平較高。表達(dá)S.marcescens ATCC 31809 PvegbioAsm盒的BI96比BI282多生產(chǎn)3-4倍的HABA同效維生素。表達(dá)大腸桿菌PvegbioAec盒的BI90產(chǎn)生的HABA同效維生素水平高出5-6倍。與上述的表達(dá)經(jīng)改造的枯草芽胞桿菌bioA基因之菌株的補(bǔ)加賴氨酸的發(fā)酵相同，大多數(shù)HABA同效維生素是脫硫生物素。在具有增強(qiáng)的大腸桿菌或S.marcescens DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性之菌株的發(fā)酵中補(bǔ)加甲硫氨酸，即可通過增加細(xì)胞中SAM的水平來減少KAPA至DAPA的障礙。另外，在這些菌株中，由經(jīng)改造的P15bio操縱子合成的枯草芽胞桿菌BioA酶在某種程度上受不充足的賴氨酸限制，當(dāng)在BI90或BI96的發(fā)酵中補(bǔ)加賴氨酸+甲硫氨酸時，KAPA至DAPA的轉(zhuǎn)化可以增加。實(shí)施例8具有增強(qiáng)的枯草芽胞桿菌和大腸桿菌BioA活性之菌株的補(bǔ)加賴氨酸和甲硫氨酸的發(fā)酵通過在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中，添加1g/l庚二酸，6g/l賴氨酸和3g/l甲硫氨酸，研究賴氨酸和甲硫氨酸(SAM的前體)的聯(lián)合對表達(dá)大腸桿菌和枯草芽胞桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的菌株BI90的發(fā)酵中KAPA轉(zhuǎn)化為DAPA的影響。作為對照，在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中加或不加6g/l賴氨酸培養(yǎng)BI603。如表5A所示，不加賴氨酸的BI603產(chǎn)生了很少的HABA同效維生素(30mg/l)，其中約10mg/l是脫硫生物素。然而，加入賴氨酸后BI603中產(chǎn)生的脫硫生物素增加了10倍以上(510mg/l)。另外，加入賴氨酸+甲硫氨酸的BI90發(fā)酵比僅加入賴氨酸的BI603發(fā)酵所產(chǎn)生的脫硫生物素幾乎高2倍(930mg/l)。加入賴氨酸+甲硫氨酸+1g/l庚二酸的BI90發(fā)酵中產(chǎn)生的脫硫生物素范圍約為600-900mg/l，但在所有的情況下，大多數(shù)的KAPA都轉(zhuǎn)化為DTB。
通過使用E.coli_bioH作為指示菌的生物自顯影分析30小時的發(fā)酵樣品，證實(shí)了這些菌株中保留的KAPA水平(圖3和表5B)。在使用E.coliMEC1指示菌的獨(dú)立的生物自顯影中，對于補(bǔ)加了賴氨酸和甲硫氨酸的BI90而言，DAPA未被大量地測出(15mg/l)，對于補(bǔ)加了賴氨酸的BI603而言，測出的DAPA為40mg/l(表6，底部)；這與上述的補(bǔ)加了賴氨酸的BI603發(fā)酵一致(表3，底部)。實(shí)施例9在Amberex基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的具有增強(qiáng)的枯草芽孢桿菌DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶活性之菌株的補(bǔ)加賴氨酸的發(fā)酵我們檢查了補(bǔ)加不同量的賴氨酸對BI282的生物素，DTB(HABA同效維生素)和同效維生素生產(chǎn)的影響，BI282在由Amberex代替VY的發(fā)酵培養(yǎng)基(表6)中培養(yǎng)。在這些發(fā)酵條件下，在分批和補(bǔ)料發(fā)酵中加入7.5g/l賴氨酸足以使KAPA約100％地轉(zhuǎn)化為DTB。似乎并不需要在補(bǔ)料發(fā)酵中加入更高水平的賴氨酸(24.8g/l)。BI282添加了賴氨酸和庚二酸的發(fā)酵比不添加賴氨酸的發(fā)酵所產(chǎn)生的DTB約多10倍(660-780mg/l)。不添加賴氨酸的發(fā)酵比具有高10倍水平之DTB的發(fā)酵(4-5mg/l生物素)所產(chǎn)生的生物素多2-3倍(12mg/l)。實(shí)施例10超量產(chǎn)生賴氨酸的BI282衍生物的構(gòu)建我們也嘗試通過另一種方法，即促進(jìn)內(nèi)部賴氨酸生物合成的能力來增加細(xì)胞的賴氨酸庫存。已開發(fā)了短桿菌和棒狀桿菌菌株以生產(chǎn)約80g/l的賴氨酸，因此應(yīng)該可以改造枯草芽孢桿菌以超量產(chǎn)生賴氨酸至刺激DTB合成所必需的程度。可采用兩個基本的方法，1)收集賴氨酸生物合成去調(diào)控的已知突變體，并將相關(guān)的突變轉(zhuǎn)移至生物素生產(chǎn)菌株中，和2)通過在生物素生產(chǎn)菌株背景中直接選擇賴氨酸類似物抗性菌株來分離賴氨酸生產(chǎn)去調(diào)控的突變體。實(shí)施例11枯草芽孢桿菌已知的賴氨酸去調(diào)控突變體枯草芽孢桿菌從天冬氨酸至賴氨酸的生物合成途徑列于圖4。兩個被調(diào)控的步驟是天冬氨酸激酶催化的第一個步驟，和由二氨基庚二酸(DAP)脫羧酶催化的最后一個步驟，此最后的步驟是單獨(dú)指定用于賴氨酸的第一個步驟。這兩個步驟在基因表達(dá)水平上受反饋抑制的調(diào)控。表7中給出了被調(diào)控的酶的概要。
導(dǎo)致賴氨酸合成去調(diào)控的4種類型的突變是已知的，1)DAP抗性的天冬氨酸激酶Ⅰ,2)組成型的天冬氨酸激酶Ⅱ,3)賴氨酸抗性的DAP脫羧酶，和4)與任何已知的賴氨酸基因無聯(lián)系的不確定的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)抗性突變。這些已知的突變概述于表7。最后的3個都具有AEC抗性表型，因此通過轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化，或中板集合可將這3種中的每種突變轉(zhuǎn)移到生物素生產(chǎn)菌株中。實(shí)施例12在生物素生產(chǎn)菌株背景中直接分離超量產(chǎn)生賴氨酸的菌株通過選擇賴氨酸類似物抗性從4種典型的賴氨酸去調(diào)控突變體中分離出3種。在沒有添加物，添加蘇氨酸，或添加DAP+蘇氨酸的極限培養(yǎng)基中檢測枯草芽孢桿菌菌株P(guān)Y79(Youngman等人，質(zhì)粒，12:1-9,1984),BI282和BI603對4種賴氨酸類似物的敏感性。添加物的目的是集中選擇lysC基因，該基因編碼對賴氨酸敏感的天冬氨酸激酶Ⅱ。在任何條件下都抑制生長的唯一的類似物是AEC，所有3個菌株的行為類似；在所有3種培養(yǎng)基中都對AEC敏感。
從PY79,BI282和BI603中分離AEC抗性的自發(fā)突變體。這些菌株中的突變最可能是lysC組成型突變，因?yàn)楦鶕?jù)文獻(xiàn)記載，大多數(shù)AEC抗性突變體都是種類型。在極限培養(yǎng)基中檢測得自每個母菌株的11個突變體的賴氨酸分泌情況。所用測定法是使用枯草芽孢桿菌lA615(trpC2 lys∷Tn917)作為指示菌株的生物測定法。經(jīng)測定母菌株中沒有一個分泌出可測濃度的賴氨酸(2mg/l)。然而，11個PY79突變體中有10個分泌出20-70mg/l的賴氨酸，1個BI282突變體分泌出30mg/l賴氨酸，1個BI603突變體分泌出26mg/l賴氨酸。然后在未補(bǔ)加賴氨酸的發(fā)酵罐中檢測被稱為BI641和BI642的BI282和BI603突變體的生物素生產(chǎn)情況，并與補(bǔ)加了賴氨酸的BI282的相應(yīng)生產(chǎn)情況比較。如表5,6和8所示，在缺乏賴氨酸時，BI641和BI642與它們各自的母菌株相比，生產(chǎn)出較高水平的DTB，但不如補(bǔ)加了6g/l賴氨酸時生產(chǎn)的DTB多。通過導(dǎo)入如上所述的第二個賴氨酸去調(diào)控突變可進(jìn)一步地使賴氨酸的生物合成去調(diào)控。表1
表2
表3賴氨酸(6g/l)發(fā)酵#/ 分批 補(bǔ)料 時間 OD600總同效維生素 生物素 HABA 同效維生素經(jīng)計算的DTB菌株(小時) (mg/l) (mg/l) (mg/l)(mg/l)BI60/BI603+-24150740 16330 314BI60/BI603+-30160950 22400 378BI61/BI603++241401100 14420 406BI61/BI603++301601290 20570 550BI62/BI282++241321100 10220 210BI62/BI282++301401000 22330 308同效維生素的降解賴氨酸(6g/l)發(fā)酵#/ 分批 補(bǔ)料 時間 KAPA DAPA* DTB 生物素 總量菌株 (小時)(mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)BI61/BI603++ 3071010550 201290a由使用大腸桿菌MEC1指示菌的酸性高壓滅菌樣品的生物自顯影估計出的值。表4發(fā)酵#/時間 OD600總同效維 生物素 HABA同效維生 經(jīng)計算的DTB菌株 (小時) 生素 (mg/l) 素(mg/l) (mg/l)(mg/l)BI63/BI9024150760 8 126 118BI63/BI9030160720 9 145 136BI64/BI9624170830 9 8475BI64/BI9630160850 10 8878BI65/BI282 24140610 5 1712BI65/BI282 30150590 6 2519表5A分批和補(bǔ)料發(fā)酵#/ Lys Met 時間OD600總同效維 生物素 HABA同效維 經(jīng)計算的菌株 (6g/l)(3g/l)(小時) 生素 (mg/l) 生素(mg/l) DTB(mg/l)(mg/l)BI66/BI603 - -24 150 800 20 3010BI66/BI603 - -30 155 600 21 309BI67/BI603 + -24 143 800 6 460 454BI67/BI603 + -30 166 870 5 510 506BI68/BI90 + +24 128 800 5 890 885BI68/BI90 + +30 165 1000 5 930 925表5B同效維生素的降解<
>a通過從總的同效維生素中減去DAPA,DTB和生物素滴度計算出的值。b由使用大腸桿菌△bioH指示菌的酸性高壓滅菌樣品的生物自顯影估計出的值。c由使用大腸桿菌MEC1指示菌的酸性高壓滅菌樣品的生物自顯影估計出的值。表6<
>*分批培養(yǎng)基(Amberex)和補(bǔ)料培養(yǎng)基都含有1g/l庚二酸和指定量的賴氨酸。表7
表8
表9濃度培養(yǎng)基成分 分批補(bǔ)料葡萄糖 15.0g/l 750g/lVeal肉浸汁 25.0g/l酵母提取物 5.0g/l谷氨酸鈉5.0g/lKH2PO47.5g/l 13.7g/lMgCl2.6H2O1.0g/l 1.5g/l(NH4)2SO42.0g/lMAZU DF-37C 2.5g/lCaCl2.2H2O1.0g/lCuSO4.5H2O0.4g/l 4.0mg/lZnSO4.7H2O0.5mg/l 5.0mg/lMnSO4.H2O25.0mg/l35.0mg/lCoCl2.6H2O1.0mg/l 10.0mg/l鉬酸鈉.2H2O0.2mg/l 2.0mg/lFeSO4.7H2O50.0mg/l100.0mg/l檸檬酸鈉.2H2O 50.0mg/l100.0mg/l表10試劑和溶液緩沖液0.1M NaPO4,pH7.0。
親和素得自Sigma(Cat#A-9275)，以5mg/ml溶于緩沖液中。
HABA得自Aldrich(Cat#14,803-2)，以0.375M溶于水+1當(dāng)量NaOH中。制備混合物20份樣品 50份樣品親和素1ml 2.5mlHABA 0.08ml 0.2ml緩沖液 38.9ml 97.3ml試驗(yàn)Zero分光光度計；在一次性的5ml小池中加入2ml緩沖液；記錄OD500。為了讀數(shù)樣品將一次性的5ml小池置于分光光度計中。
加入2ml混合物；攪拌；記錄OD500。
加入0.1ml體積的樣品；攪拌；記錄OD500。標(biāo)準(zhǔn)使用0.1ml 2mg/ml-14mg/ml的DTB作為樣品。
使用0.1ml緩沖液作為“0”點(diǎn)。計算計算ΔOD500減去ΔOD500。
對標(biāo)準(zhǔn)作圖并使用曲線測定樣品中的HABA同效維生素。注意1．有用的范圍是2-14mg/l的生物素+脫硫生物素。
2．在小池中加入混合物，讀出OD500，然后不必將小池從分光光度計中取出即加入樣品和混合物。
3．當(dāng)使用體積恒定的一套樣品和標(biāo)準(zhǔn)時可得到最佳結(jié)果，使用緩沖液將所有樣品調(diào)節(jié)成相同體積。
權(quán)利要求
1．生產(chǎn)生物素同效維生素的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)含有利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，所述培養(yǎng)發(fā)生于富含賴氨酸，賴氨酸類似物，或賴氨酸前體的環(huán)境中；和(b)回收所述的生物素同效維生素。
2．生產(chǎn)生物素同效維生素的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)含有利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌在賴氨酸生產(chǎn)方面被去調(diào)控；和(b)回收所述的生物素同效維生素。
3．權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)菌經(jīng)改造可超量產(chǎn)生利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。
4．權(quán)利要求1-3中任一個的方法，其中賴氨酸，賴氨酸類似物，或賴氨酸前體被外源加入培養(yǎng)基中。
5．權(quán)利要求1-3中任一個的方法，其中生物素同效維生素是生物素，二氨基庚二酸(DAPA)或脫硫生物素，更具體地說，回收脫硫生物素之后，此方法進(jìn)一步地包括通過獨(dú)立的發(fā)酵，生化反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)將回收的脫硫生物素轉(zhuǎn)化為生物素，并回收生物素。
6．權(quán)利要求1,2,3或4的方法，其中細(xì)菌對賴氨酸類似物，如(S)-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)具有抗性。
7．權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)菌在至少一個生物素合成途徑步驟以及bioA表達(dá)方面被去調(diào)控。
8．權(quán)利要求1-6中任一個的方法，其中所述細(xì)菌被進(jìn)一步地改造以產(chǎn)生利用SAM的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶。
9．權(quán)利要求8的方法，其中在培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，或SAM的類似物。
10．經(jīng)改造可超量產(chǎn)生利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶和利用SAM的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，具體地說，其中通過改造至少一個生物素合成步驟以及bioA表達(dá)的去調(diào)控，可進(jìn)一步地改造菌株以超量產(chǎn)生生物素同效維生素。
11．經(jīng)改造可超量產(chǎn)生利用賴氨酸的DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌，其中細(xì)菌被進(jìn)一步地改造以超量產(chǎn)生賴氨酸。
12．通過權(quán)利要求1-9中任一個方法制備的生物素同效維生素。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用產(chǎn)生利用賴氨酸之DAPA氨基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌增加生物素和生物素前體脫硫生物素生產(chǎn)的方法,所述方法包括使用或在賴氨酸存在時培養(yǎng),或其賴氨酸生物合成去調(diào)控的細(xì)菌。
文檔編號C12P17/18GK1210149SQ98103370
公開日1999年3月10日 申請日期1998年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月14日
發(fā)明者J·B·珀金斯, J·G·珀奧, S·W·范阿斯德爾, R·R·約庫姆 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司