一種甘氨酰-l-谷氨酰胺手性異構(gòu)體的分離檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種甘氨酰-L-谷氨酰胺手性異構(gòu)體的分離檢測方法，屬分析化學(xué)領(lǐng) 域。 技術(shù)背景
[0002] 甘氨酰-L-谷氨酰胺是谷氨酰胺的重要來源，是復(fù)方氨基酸（15)雙肽（2)注射液 中二肽組成之一，克服了谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定的難題，豐富了氨基酸液的配方。其化學(xué) 名甘氨酰-L-谷氨酰胺一水合物，分子式如下：
[0004] 從分子式中可以看出其存在手性異構(gòu)體，其化學(xué)名為甘氨酰-D-谷氨酰胺，現(xiàn)有 的技術(shù)及文獻當(dāng)中無甘氨酰-L-谷氨酰胺異構(gòu)體測定的相關(guān)報道。
[0005] 甘氨酰-L-谷氨酰胺的手性異構(gòu)體為其雜質(zhì)，是甘氨酰-L-谷氨酰胺的重要控制 指標，是藥品生產(chǎn)及藥品申報重點關(guān)注項目。但甘氨酰-L-谷氨酰胺為末端吸收，紫外吸收 不強，采用手性色譜柱進行分離測定甘氨酰-L-谷氨酰胺的異構(gòu)體不但成品高，而且分離 難度大?，F(xiàn)有技術(shù)中已有其它紫外吸收較弱的產(chǎn)品采用衍生化試劑衍生化后通過普通色譜 柱進行分離的報道，較為典型的報道包含中國專利200510057381. 8 ( -種普瑞巴林手性異 構(gòu)體的分離測定方法）和中國專利2001010297844. 9 ( -種分離測定乙酰半胱氨酸手性異 構(gòu)體的方法）。
[0006] 本發(fā)明提供的一種柱前衍生化方法與使用普通色譜柱即可實現(xiàn)甘氨酰-L-谷氨 酰胺與其手性異構(gòu)體分離的測定方法。填補了此項空白，可對甘氨酰-L-谷氨酰胺中的甘 氨酰-D-谷氨酰胺進行有效控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種甘氨酰谷氨酰手性異構(gòu)體的檢測方法，該方法采用衍 生化試劑N a - (5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-氨基酸類化合物與甘氨酰-L-谷氨酰胺及其手 性異構(gòu)體同時進行衍生化反應(yīng)，再經(jīng)普通色譜柱進行分離測定。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0009] 甘氨酰-L-谷氨酰胺在進柱前用衍生化試劑進行衍生化，其衍生試劑為 Na - (5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-氨基酸類化合物，所述的衍生化試劑選自Na - (5-氟-2， 二硝基苯基）-L-丙氨酰胺、Na - (5-氣-2,4-二硝基苯基）-L-苯丙胺酰胺、Na - (5-氣-2， 4-二硝基苯基）-L-脯氨酰胺或Na - (5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-纈氨酰胺中的一種，其 分離測定過程包括：
[0010] ①取甘氨酰-L-谷氨酰胺，用水溶解并稀釋制成每1ml中約含20mg~40mg的溶 液；
[0011] ②取Na - (5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-氨基酸類化合物試劑適量，精密稱定，加有 機溶劑溶解并稀釋制成l〇mg/ml的溶液，搖勻，置于冰箱冷藏（2°C~8°C )保存；
[0012] ③取甘氨酰-L-谷氨酰胺溶液、衍生化試液和碳酸鹽溶液，混勻；
[0013] ④于20~60°C反應(yīng)2~7小時，反應(yīng)完畢加入鹽酸溶液；
[0014] ⑤反應(yīng)物在預(yù)置五氧化二磷與氫氧化鉀的干燥系統(tǒng)中干燥至溶劑充分揮盡后，加 二甲基亞砜或N，N-二甲基甲酰胺使殘留物溶解，濾過，濾液作為供試品溶液；
[0015] ⑥用高效液相色譜法分離測定上一步的供試品溶液。
[0016] 其中甘氨酰-L-谷氨酰胺與衍生化試劑的摩爾比為I : 1~1 : 250。
[0017] 其中步驟⑥所說的高效液相色譜法使用的色譜柱可以是十八烷基鍵合硅膠或是 以辛基硅烷建合硅膠為填料的色譜柱，優(yōu)選堿基鈍化后的十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜 柱，檢測波長為200~380nm，優(yōu)選340±5nm，流速為1. 5~2. 5ml/min，優(yōu)選I. 8ml/min，洗 脫程序為梯度洗脫程序，優(yōu)選但不限于如下程序：
[0020] 流動相A是三氟乙酸水溶液-乙腈體系或三乙胺水溶液-乙腈體系，比例為 95 : 5~85 : 15,優(yōu)選92 : 8,流動相B是乙腈。
[0021] 綜上，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0022] 1、本發(fā)明采用Na - (5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-氨基酸類化合物與甘氨酰-L-谷 氨酰胺進行柱前衍生，不但使衍生后的產(chǎn)物具有較強的紫外吸收，而且可方便快捷的測定 甘氨酰-L-谷氨酰胺中的手性異構(gòu)體甘氨酰-D-谷氨酰胺；
[0023] 2、本發(fā)明具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、過量衍生化試劑不干擾測定等優(yōu)點；
[0024] 3、本發(fā)明衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，分析靈敏度高，甘氨酰-L-谷氨酰胺手性異構(gòu)體的定 量限為 0.02 % (0.067 μ g/ml))。
[0025] 4、本發(fā)明可采用普通色譜柱（堿基鈍化的十八烷基鍵合硅膠為填料）分離測定甘 氨酰-L-谷氨酰胺手性異構(gòu)體，而不需花費昂貴和不耐用的專用手性色譜柱。
[0026] 附圖：
[0027] 圖1實施例1甘氨酰-L-谷氨酰胺及其異構(gòu)體高效液相色譜圖
[0028] (三氟乙酸水溶液pH為2. 3,比例94 : 6,柱溫25°C，流速I. 6ml/min，檢測波長 340nm，衍生試劑量為200 μ 1，35 °C衍生6h)
[0029] 圖2實施例2甘氨酰-L-谷氨酰胺及其異構(gòu)體高效液相色譜圖
[0030] (三氟乙酸水溶液pH為2. 7,比例86 : 14,柱溫35°C，流速2. Oml/min，檢測波長 340nm，衍生試劑量為250 μ 1，45 °C衍生5h)
[0031] 圖3實施例3甘氨酰-L-谷氨酰胺及其異構(gòu)體高效液相色譜圖
[0032] (三氟乙酸水溶液pH為2. 5,比例88 : 12,柱溫30°C，流速I. 8ml/min，檢測波長 335nm，衍生試劑量為300 μ 1，40°C衍生5h)
[0033] 圖4實施例4甘氨酰-L-谷氨酰胺及其異構(gòu)體高效液相色譜圖
[0034] (三乙胺水溶液？!1為2.5，比例88:12，柱溫30°(：，流速1.81111/1^11，檢測波長 345nm，衍生試劑量為400 μ 1，60 °C衍生3h)
【具體實施方式】
[0035] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0036] 實施例1
[0037] (1)儀器與條件
[0038] 色譜條件：
[0039] 色譜柱：堿基鈍化的十八烷基鍵合硅膠色譜柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)
[0040] 流動相4相：0.09%三氟乙酸（用恥0!1調(diào)？!12.3)-乙腈（94:6)
[0041] B相：乙腈
[0042] 檢測波長：340nm ;柱溫：25°C ;流速：1. 6ml/min ;稀釋液：水
[0043] 梯度洗脫程序：
[0045] (2)實驗步驟
[0046] 衍生化試液：取Merfey ' s [Na-(5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-丙胺酰胺]試劑適 量，精密稱定，加丙酮溶解并稀釋制成l〇mg/ml的溶液，搖勻，置于冰箱冷藏（2°C~8°C )保 存。
[0047] 樣品溶液：取甘氨酰-L-谷氨酰胺及其異構(gòu)體各適量，用水溶解并稀釋制成每1ml 約含甘氨酰-L-谷氨酰胺30mg、異構(gòu)體30 μ g的混合溶液，取樣進行衍生化處理。
[0048] 衍生化處理：精密量取樣品溶液50 μ 1、衍生化試液200 μ 1、lmol/L碳酸氫鈉溶 液20 μ 1，置同一樣品瓶中，密閉，在35°C加熱反應(yīng)6h，反應(yīng)完畢后加入2mol/L鹽酸溶液 10 μ 1，在預(yù)置五氧化二磷與氫氧化鈉的減壓干燥系統(tǒng)中干燥至溶劑充分揮盡，再加二甲基 亞砜4ml分次溶解殘渣，并定量轉(zhuǎn)移至量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。
[0049] 取供試品溶液在上述條件下進行分析。結(jié)果見圖1，其中保留時間為26. 851為甘 氨酰-D-谷氨酰胺，其中保留時間為28. 783為甘氨酰-L-谷氨酰胺，其余峰為未反應(yīng)完的 衍生試劑的峰，分離度為2. 20。
[0050] 實施例2
[0051] (1)儀器與條件
[0052] 色譜條件：
[0053] 色譜柱：堿基鈍化的十八烷基鍵合硅膠色譜柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)
[0054] 流動相：A相：0· 11 %三氟乙酸（用NaOH調(diào)ρΗ2· 7)-乙腈（86 : 14)
[0055] B相：乙腈
[0056] 檢測波長：340nm ;柱溫：35°C ;流速：2. Oml/min ;稀釋液：水
[0057] 梯度洗脫程序：
[0059] (2)實驗步驟
[0060] 衍生化試液：取Merfey ' s [Na-(5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-丙胺酰胺]試劑適 量，精密稱定，加丙酮溶解并稀釋制成l〇mg/ml的溶液，搖勻，置于冰箱冷藏（2°C~8°C )保 存。
[0061] 樣品溶