專利名稱：編碼植物鎂螯合酶chld亞基的dna序列及用于測(cè)定植物鎂螯合酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物鎂螯合酶(Mg-螯合酶)的CHLD亞基，編碼植物鎂螯合酶的CHLD亞基的DNA序列，制備植物鎂螯合酶的CHLD亞基的方法，測(cè)定植物鎂螯合酶活性的方法，以及用本發(fā)明的鎂螯合酶DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
作為光合系統(tǒng)的輔助因子，葉綠素扮演著將光轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能的角色，因而是植物生長(zhǎng)和生存所必需的。
鎂是在葉綠素生物合成過(guò)程中，在一種膜結(jié)合酶即由幾個(gè)亞基組成的鎂螯合酶的幫助下，摻入到卟啉中去的。
已經(jīng)公開了細(xì)菌的鎂螯合酶是由三個(gè)亞基(D，H和I)組成的，其相應(yīng)的基因序列稱為bchD、bchH和bchI(Burke等人(1993)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)175，2414-2422；Coomber等人(1990)，分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)4，977-989；Gibson等人(1995)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，1941-1844；Jensen等人(1996)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)271，16662-16667)。
表1已知的鎂螯合酶亞基的基因
關(guān)于植物鎂螯合酶，目前已有兩個(gè)亞基被描述，它們似乎相當(dāng)于細(xì)菌鎂螯合酶的bchH和bchI亞基(Koncz等人，(1990)，EMBO J.9，1337-1346；Hudson等人，(1993)，EMBO J.12，3711-3719；Eibson等人，(1996)，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)121，61-71)。目前仍然不知道其他亞基是否參與植物植鎂螯合酶的結(jié)構(gòu)。無(wú)論是單獨(dú)或與已知的細(xì)菌D型亞基(CHLD和BCHD)在一起時(shí)，都沒有觀察到兩個(gè)已知的植物亞基CHLI和CHLH的酶活性。
由于它們?cè)谌~綠素生物合成中所處的關(guān)鍵地位，植物鎂螯合酶是開發(fā)新一代高特異性活性除草化合物的基本的、新的起點(diǎn)。另外，通過(guò)影響鎂螯合酶的天然的或修飾的(例如經(jīng)遺傳工程修飾的)表達(dá)產(chǎn)物的基因表達(dá)，或通過(guò)特異性鎂螯合酶抑制物，可以將光養(yǎng)的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物，特別是細(xì)菌、藻類和植物的活力和/或生長(zhǎng)得到高水平控制。
植物鎂螯合酶的酶促活性最初是在完整的葉綠體上測(cè)定的(Castelfranco等人(1979)生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Arch.Biochem.Biophys.)192，592-598；Fuesler等人(1982)植物生理學(xué)69，421-423)。從那時(shí)起，酶促活性還在被破壞的質(zhì)體上(Walker等人(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，5789-5793)和亞質(zhì)體膜組分上(Lee，等人(1992)植物生理學(xué)99，1134-1140)進(jìn)行測(cè)定。
令人驚奇地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了編碼植物鎂螯合酶亞基的DNA。該DNA后來(lái)被命名為chlD，而氨基酸序列稱為CHLD。
而且，發(fā)現(xiàn)植物鎂螯合酶的CHLD亞基與CHLI和CHLH亞基一起令人驚奇地適合于重建功能完整的，即具有酶促活性的植物鎂螯合酶，因此本發(fā)明的植物鎂螯合酶CHLD亞基提供了測(cè)試植物鎂螯合酶活性的(體外和體內(nèi)的)新的方法。
本發(fā)明因此涉及編碼具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)的核酸分子，優(yōu)選地是如SEQ ID NO.1中所示的核酸分子、其具有生物學(xué)活性的片段、以及其互補(bǔ)序列或反義序列。
本發(fā)明涉及植物chlD序列，其優(yōu)選地來(lái)自雙子葉植物，特別優(yōu)選地來(lái)自茄科(Solanaceae)，特別是煙草(Nicotiana tabacum)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼與SEQ ID No.2一致的蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)具有植物鎂螯合酶CHLD亞基或其生物學(xué)活性片段的功能，或者它形成此核酸分子的互補(bǔ)序列或反義序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是一核酸分子，它是具有至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸，能夠與編碼具有植物鎂螯合酶CHLD亞基，優(yōu)選地SEQ IDNo.1、其片段或其互補(bǔ)序列或反義序列功能的蛋白質(zhì)的核酸分子特異地雜交。
術(shù)語(yǔ)“特異地雜交”通常理解為一單鏈核酸分子與一互補(bǔ)核酸分子形成氫鍵、堿基對(duì)、以及如果合適的話形成雙鏈的特征。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是編碼選自SEQ ID NO.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.7中的肽的核酸分子，以及其互補(bǔ)序列或反義序列。
術(shù)語(yǔ)“重組生物”理解為通過(guò)體外改變其DNA或通過(guò)DNA整合進(jìn)行改造的某一生物的細(xì)胞，例如重組酵母、細(xì)菌、藻類、昆蟲或植物細(xì)胞。
寫成小寫字母的“chl”傳統(tǒng)上用于鎂螯合酶D、I和H亞基的基因，而大寫的“CHL”指基因產(chǎn)物，即蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目的是本發(fā)明的核酸分子在擴(kuò)增、分離或鑒定編碼具有植物鎂螯合酶CHLD亞基或其生物學(xué)活性片段功能的蛋白質(zhì)的核酸分子中的應(yīng)用，特別是其它生物的chlD結(jié)構(gòu)基因或chlD mRNA，優(yōu)選地是源于植物或微生物的核酸分子。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸分子在制備針對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是非天然形成的嵌合基因，它含有一個(gè)有效地融合到本發(fā)明的DNA分子上的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是載體，優(yōu)選地是重組載體，它含有帶有嵌合基因的本發(fā)明的核酸分子，其中嵌合基因含有有效地融合到本發(fā)明DNA分子上的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是表達(dá)本發(fā)明的DNA分子的重組宿主細(xì)胞，這個(gè)宿主細(xì)胞優(yōu)選地是用根據(jù)本發(fā)明的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的，重組載體含有嵌合基因，嵌合基因上有一個(gè)有效地融合到本發(fā)明的核酸分子上的啟動(dòng)子，或者該重組宿主細(xì)胞是通過(guò)其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法轉(zhuǎn)化的，并表達(dá)本發(fā)明的DNA分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的核酸分子在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物器官、轉(zhuǎn)基因植物種子、轉(zhuǎn)基因繁殖材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物器官、轉(zhuǎn)基因植物種子、轉(zhuǎn)基因繁殖材料的方法，其中該宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化的。
本發(fā)明還涉及如本發(fā)明的植物的繁殖材料，比如果實(shí)、種子、塊莖、根狀莖、苗和插條。
本發(fā)明基因的合適的賦形劑(excipient)植物是所有的農(nóng)業(yè)上重要的單子葉植物和雙子葉植物，優(yōu)選地是玉米和其它谷類，例如小麥、黑麥、大麥、黍、燕麥、木薯和水稻，還有棉花、煙草、甜菜、馬鈴薯、油籽油菜、向日葵、大豆或果實(shí)類的和蔬菜類的品種。
為了在植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子，將核酸分子連接到保證它們?cè)谥参锛?xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件上。這些元件包括，特別是啟動(dòng)子。一般地，任何在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子都適合表達(dá)。
啟動(dòng)子的選擇是根據(jù)其表達(dá)是組成型的或者僅僅是在特定的組織中、在植物發(fā)育的特定時(shí)間點(diǎn)或在由外部因子決定的時(shí)間點(diǎn)才能發(fā)生。對(duì)植物來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子可以是同源的或是異源的。合適的啟動(dòng)子的例子有用于組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒的35S RNA啟動(dòng)子和玉米泛素啟動(dòng)子，用于sink特異表達(dá)(例如馬鈴薯塊莖、甜菜、番茄果實(shí))的patatin基因B35啟動(dòng)子(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)或是保證僅在具有光合活性的組織中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，所有的在質(zhì)體中具有組成型活性的啟動(dòng)子，例如psbA盒式表達(dá)信號(hào)序列(Staub&Maliga(1993)EMBOJ.12601-606；Zoubenko等人(1994)，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)223819-3824)和Prn啟動(dòng)子(Svab+Maliga(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90913-917)，或者在胚乳中特異表達(dá)的小麥HMG啟動(dòng)子，USP啟動(dòng)子，菜豆蛋白啟動(dòng)子，或來(lái)自玉米醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子。而且，可以存在一個(gè)終止序列，它負(fù)責(zé)正確地終止轉(zhuǎn)錄并為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加上poly-A尾巴，據(jù)說(shuō)這在穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上有作用。這些元件在文獻(xiàn)(Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)中被描述，并且通常根據(jù)需要它們可以互換。
大量的克隆載體可用于將外源基因?qū)敫叩戎参镏校⑶疫@些克隆載體含有一個(gè)大腸桿菌的復(fù)制信號(hào)和一個(gè)用于選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的標(biāo)志基因。這樣的載體的例子有pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184。目的序列可導(dǎo)入到載體上合適的限制性切點(diǎn)上。得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。將被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，然后收集并裂解。將質(zhì)?；厥?。表征所獲得的質(zhì)粒DNA的分析方法一般有限制性酶切分析、凝膠電泳和其它生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析方法。每次操作后，質(zhì)粒DNA可以被酶切，而獲得的DNA片段可以被連接到其它DNA序列上。每個(gè)質(zhì)粒DNA序列都可以在同一個(gè)質(zhì)?；蚱渌|(zhì)粒中克隆。
許多技術(shù)可用于將DNA導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞中。這些技術(shù)包括利用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑的T-DNA植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、注射技術(shù)、DNA電穿孔技術(shù)、通過(guò)biolistic方法的DNA導(dǎo)入技術(shù)等等。
當(dāng)把DNA通過(guò)注射和電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞時(shí)，所用的質(zhì)粒不必滿足任何特殊的需要。可以使用簡(jiǎn)單的質(zhì)粒，如pUC衍生質(zhì)粒。但是，如果需要從該轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生完整植株的話，則需要存在一個(gè)選擇性的標(biāo)志基因。
根據(jù)將基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法的不同，可能需要其它DNA序列。例如，如果用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，至少Ti和Ri質(zhì)粒T-DNA的右手邊界區(qū)，但通常是右手和左手邊界區(qū)，必須作為側(cè)翼序列與待導(dǎo)入的基因相連。
如果土壤桿菌被用于轉(zhuǎn)化，待導(dǎo)入的DNA必須被克隆到特定的質(zhì)粒中，即被克隆到一個(gè)中間載體中或一個(gè)雙元載體中。中間載體可以通過(guò)同源重組被整合到土壤桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒中，因?yàn)槠湫蛄信cT-DNA中的序列同源。Ti或Ri質(zhì)粒還含有轉(zhuǎn)移T-DNA所需的vir區(qū)。中間載體在土壤桿菌中不能復(fù)制。中間載體可以通過(guò)幫助質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌(接合)。雙元載體能夠在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制。它們含有選擇標(biāo)志基因和界于T-DNA左右邊界區(qū)之間的銜接物或多銜接物。它們可以被直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(Holsters等人，分子與普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)163(1978)，181-187)。作為宿主細(xì)胞的土壤桿菌應(yīng)含有一個(gè)帶有vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中所需的；可以存在額外的T-DNA。這個(gè)被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
T-DNA在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的應(yīng)用在EP 120 516；Hoekema，雙元植物載體系統(tǒng)，Offsetdrukkerij kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等人，植物科學(xué)批評(píng)綜述(Criti.Rev.Plant.Sci.)4，1-46和An等人，EMBO J.4(1985)，277-287中有詳細(xì)的描述。
為了將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，將植物的外植體與根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌共培養(yǎng)具有優(yōu)越性。完整的植株可以再生自生長(zhǎng)于合適培養(yǎng)基中的被感染的植物材料(例如葉片部分、莖部分、根，以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞)，培養(yǎng)基中含有用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素或殺蟲劑。產(chǎn)生的植株再被檢測(cè)導(dǎo)入的DNA存在與否。利用biolistic方法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源DNA的其它可能的方法也是已知的(參考，例如，Willmitzer，L.，1993轉(zhuǎn)基因植物，見生物技術(shù)，一本多卷的綜合性的論文(H.J.Rehm，G.Reed，A.Puhler，P.Stadler編著)，第2卷，627-659，VCH Weinheim)。
單子葉植物轉(zhuǎn)化的替代系統(tǒng)有通過(guò)biolistic法的轉(zhuǎn)化、電或化學(xué)誘導(dǎo)使DNA被吸收到原生質(zhì)體中、部分穿透細(xì)胞的電穿孔法、大量注射DNA到花序中、微量注射DNA到小孢子和前胚中、通過(guò)發(fā)芽的花粉吸收DNA，以及通過(guò)膨脹使DNA吸收到胚中(綜述Potrykus，生理學(xué)植物(Physiol.Plant)(1990)，269-273)。
而在根癌土壤桿菌的幫助下通過(guò)Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)的雙子葉植物的轉(zhuǎn)化已經(jīng)建立得很完善了，近來(lái)文獻(xiàn)提示甚至單子葉植物也確實(shí)可以通過(guò)以土壤桿菌為基礎(chǔ)的載體所轉(zhuǎn)化(Chan等人，植物分子生物學(xué)(Plant MolBiol.)22(1993)，491-506；Hiei等人，植物雜志(Plant J.)，6(1994)，271-282；Bytebier等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，84(1987)，5345-5349；Raineri等人，生物技術(shù)(Bio/Technology)8(1990)，33-38；Gould等人，植物生理學(xué)95(1991)，426-434；Mooney等人，植物細(xì)胞組織與器官培養(yǎng)(Plant Cell Tiss.& Org.Cult.)25(1991)，209-218；Li等人，植物生物學(xué)(Plant Boil.)20(1992)，1037-1048)。
在過(guò)去建立了三個(gè)可用于多種谷類的上述轉(zhuǎn)化系統(tǒng)組織的電穿孔、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、和通過(guò)粒子轟擊可再生組織和細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)移(Jahne等人，Euphytica85(1995)，35-44)。
小麥的轉(zhuǎn)化在各種文獻(xiàn)中都有描述(綜述Maheshwari等人植物科學(xué)批評(píng)綜述14(2)(1995)，149-178)，另參考Hess等人(植物科學(xué)72(1990)，233)，Vasil等人(生物技術(shù)10(1992)667-674)，Weeks等人(植物生理學(xué)102(1993)，1077-1084)，以及Becker等人(植物雜志5(2)(1994)，299-307)。
一旦導(dǎo)入的DNA整合到植物細(xì)胞的基因組中，通常它就是穩(wěn)定的并且保持在最初被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的后代中。正常情況下它含有一個(gè)選擇標(biāo)志，以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞對(duì)殺蟲劑如phosphinothricin或抗生素如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素或潮霉素抗性。這個(gè)標(biāo)志是被單獨(dú)選擇的，因此它應(yīng)該允許將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從缺乏所導(dǎo)入的DNA的細(xì)胞中選擇出來(lái)。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞以習(xí)慣的方式在植物內(nèi)生長(zhǎng)(還可參考McCormick等人，植物細(xì)胞報(bào)告(Plant Cell Report)5(1986)，81-84)。形成的植株可以正常生長(zhǎng)并與被相同或其它遺傳材料轉(zhuǎn)化的植株雜交。形成的雜種具有相應(yīng)的表型特征。種子可以從植物細(xì)胞中得到。
應(yīng)該種植兩代或多代以確保表型特征能夠穩(wěn)定保持并遺傳。還應(yīng)該收獲種子以確保已經(jīng)保持了相應(yīng)的表型或其它特征。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，進(jìn)一步地，產(chǎn)生本發(fā)明的核酸分子的方法，其中本發(fā)明的核酸分子是通過(guò)本質(zhì)上已知的產(chǎn)生核酸的方法產(chǎn)生的。大量不同的分離與克隆基因序列的方法可以被那些cDNA克隆領(lǐng)域的技術(shù)人員采用。
另外，本發(fā)明的序列信息還可被用于為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的許多其它的方法，例如篩選利用抗體分離基因的表達(dá)文庫(kù)，或者用于制備抗體(多克隆或單克隆)。
完整的植物chlD cDNA，優(yōu)選地是來(lái)自煙草的如在SEQ ID No.1中所示的chlD，SEQ ID No.1中的亞序列或由SEQ ID No.1衍生的寡核苷酸可被用作這些方法的探針，如果合適的話，它們可以選擇性地與來(lái)自所選生物的克隆基因片段的文庫(kù)中的其它CHLD-編碼序列雜交，例如光養(yǎng)微生物或單子葉植物或雙子葉植物。
這些技術(shù)還包括，例如，篩選克隆到合適的細(xì)胞或病毒的基因組或cDNA文庫(kù)，以及利用由SEQ ID No.1衍生的寡核苷酸引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明分離的chlD序列或亞序列可進(jìn)一步通過(guò)基因工程的標(biāo)準(zhǔn)方法加以修飾或延伸以獲得所需的特性。為了獲得在體外或體內(nèi)條件下的選擇性雜交，chlD-特異的探針基因至少具有10個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，優(yōu)選地至少17個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的雜交探針可用于，例如，從所選的生物中通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增或分析CHLD-編碼序列(即編碼CHLD的核酸分子)，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的，并且可以進(jìn)一步用于從其它生物中分離CHLD-編碼序列，或者作為檢查其它生物中CHLD編碼序列的診斷方法，或者鑒定和分離某一特定表型的經(jīng)修飾的CHLD-編碼序列，例如對(duì)除草劑的抗性、改變的葉綠素含量、改變的適合度(fitness)、改變的產(chǎn)量等等。
chlD-特異雜交探針還可用于利用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)植物基因組中自然發(fā)生的chlD基因的位置進(jìn)行作圖。這些方法包括，除了其它方法以外，DNA多態(tài)性的鑒定和利用這種多態(tài)性分析chlD基因與其它已知座位的標(biāo)志的分離(segregation)現(xiàn)象。chlD基因作圖在植物育種中具有特殊的意義。
chlD特異的雜交探針或CHLD編碼序列或亞序列還可被用于抑制植物中的chlD基因的表達(dá)(反義技術(shù))。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，還可能通過(guò)新的序列元件修飾CHLD-編碼序列或亞序列或延伸它們，并將它們導(dǎo)入植物基因組中。利用傳統(tǒng)的方法，植物轉(zhuǎn)化可以是短暫的或是穩(wěn)定的。衍生自chlD cDNA的序列向植物基因組中的整合可被用于改變植物的性狀，因此，可以在轉(zhuǎn)基因植物中形成例如具有較多或較少功能活性的鎂鰲合酶、改變了特性的鎂螯合酶的變體，或者chlD基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平減低了。例如，有功能的鎂螯合酶的數(shù)量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法得到增加，例如chlD基因單獨(dú)或與其它的鎂螯合酶亞基基因一起克隆到轉(zhuǎn)基因植物中，并處于調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。增加的CHLD的活性可被用于比如提高葉綠素含量，這可能與更高的產(chǎn)量相關(guān)，或者用于增加對(duì)抑制葉綠素生物合成的除草劑的耐受性。還比如，克隆本發(fā)明經(jīng)改變了的序列到轉(zhuǎn)基因植物中可能與對(duì)除草劑更高的耐受性有關(guān)。
然而，還可以以一種導(dǎo)致降低轉(zhuǎn)基因植物中最初的鎂螯合酶的活性的方式(例如共阻遏、chlD反義RNA的形成)，為編碼chlD序列或這些序列(分子)的片段并且被導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植物中的核酸分子提供調(diào)節(jié)元件，比如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。降低的鎂螯合酶活性可被用于產(chǎn)生患褪綠病的植物或具有褪綠病組織的植物。降低的葉綠素含量可能是所需要的，例如以后當(dāng)植物或植物器官被用于工業(yè)加工時(shí)，或者當(dāng)進(jìn)行大量的作物或裝飾植物的育種時(shí)，例如蔬菜如菊苣。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有植物鎂螯合酶CHLD亞基的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地是根據(jù)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)，或者是其有生物學(xué)活性的片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是具有植物鎂螯合酶CHLD亞基的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地是根據(jù)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)，或者是其有生物學(xué)活性的片段，在測(cè)定鎂螯合酶的活性和制備抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)的方法，其中宿主細(xì)胞是用編碼植物鎂螯合酶CHLD亞基或其活性片段的本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的，優(yōu)選地編碼具有鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段的DNA序列被插入到適于宿主細(xì)胞的表達(dá)盒中，產(chǎn)生的表達(dá)盒被以適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲竭m合于宿主細(xì)胞的載體中，合適的宿主細(xì)胞用產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化，由此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中，由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生并具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)被以適當(dāng)?shù)姆椒◤呐囵B(yǎng)基中或宿主細(xì)胞中分離出來(lái)。
而本發(fā)明的另一個(gè)目的是在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有植物鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段的方法，其中宿主細(xì)胞是用編碼植物鎂螯合酶或其活性片段的本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的，優(yōu)選地編碼具有鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)的DNA序列被插入到適于宿主細(xì)胞的表達(dá)盒中，產(chǎn)生的表達(dá)盒被以適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲竭m合于宿主細(xì)胞的載體中，合適的宿主細(xì)胞用產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化；由此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中，由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生并具有植物鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)被以適當(dāng)?shù)姆椒◤呐囵B(yǎng)基中或宿主細(xì)胞中分離出來(lái)。
在這個(gè)意義上，本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生植物鎂螯合酶CHLD亞基及植物鎂螯合酶。例如，為了在宿主生物中產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)，可以將本發(fā)明的DNA序列克隆到適于在所選擇的宿主生物中進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因異源表達(dá)的表達(dá)盒中。
適合這個(gè)目的的編碼CHLD的DNA序列的例子有植物chlDcDNA，通過(guò)習(xí)慣方法改變了序列的植物chlD cDNA分子，以及衍生自植物chlD cDNA或植物CHLD蛋白或其片段并允許表達(dá)生物學(xué)活性的鎂螯合酶CHLD的合成DNA序列。而且，可能還需要將特異的調(diào)節(jié)序列導(dǎo)入表達(dá)盒中，例如啟動(dòng)子、操作子序列、增強(qiáng)子、終止子、信號(hào)序列、5’-和3’-非翻譯序列，或編碼適當(dāng)?shù)娜诤系鞍椎男蛄?。調(diào)節(jié)序列的使用是一般習(xí)慣的技術(shù)，可以在很大范圍內(nèi)根據(jù)表達(dá)策略加以改變。形成的chlD表達(dá)盒，只要在chlD結(jié)構(gòu)基因的正確閱讀框內(nèi)帶有必需調(diào)節(jié)元件，可被插入到一個(gè)表達(dá)載體上，利用這個(gè)載體可以轉(zhuǎn)化所選擇的宿主生物。對(duì)于象大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生重組蛋白的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)策略，以及相應(yīng)的表達(dá)載體是周知的。
一般地，術(shù)語(yǔ)“載體”指本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的合適的工具，它使得單鏈或雙鏈核酸分子有目的地轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，例如轉(zhuǎn)移到DNA或RNA病毒中，病毒片段，存在或不存在調(diào)節(jié)元件的情況下適于轉(zhuǎn)移核酸到細(xì)胞中去的質(zhì)粒構(gòu)件，金屬粒子(由于它們可用于粒子槍的方法中)，但是載體還包括通過(guò)化學(xué)或物理方法可被直接導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子。
通過(guò)穩(wěn)定的或短暫的轉(zhuǎn)化例如用chlD表達(dá)盒得到的重組生物可用來(lái)獲得重組鎂螯合酶，優(yōu)選地是CHLD蛋白，或含有CHLD的細(xì)胞組分。但是，重組生物還可以直接作為一個(gè)分析測(cè)試系統(tǒng)的一個(gè)成分。
還有可能利用傳統(tǒng)的分子遺傳學(xué)方法，將chlD結(jié)構(gòu)基因與編碼兩個(gè)已知的鎂螯合酶亞基，即CHLH和CHLI的結(jié)構(gòu)基因一起導(dǎo)入宿主生物中，導(dǎo)致在這個(gè)宿主細(xì)胞中有功能的鎂螯合酶的表達(dá)。
一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是，例如，利用啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為宿主生物。采用的載體都是已知的酵母載體，它們具有合適的表達(dá)信號(hào)如啟動(dòng)子，以及合適的選擇性標(biāo)志如抗性基因或是互補(bǔ)某一營(yíng)養(yǎng)缺陷的基因。
植物鎂螯合酶的應(yīng)用基本上是根據(jù)它作為異源寡聚酶復(fù)合體的活性，而且這種活性是直接與CHLD亞基的存在相聯(lián)系的。有功能的完整的植物鎂螯合酶使得生化反應(yīng)不僅在體外(比如鎂螯合酶的無(wú)細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng))，而且在體內(nèi)也得以進(jìn)行，例如在單細(xì)胞的或多細(xì)胞的重組生物或細(xì)胞培養(yǎng)物，特別是酵母、細(xì)菌、藻類、昆蟲細(xì)胞和植物中，而且因此不限于光養(yǎng)型生物。
一方面，這些反應(yīng)可用于產(chǎn)生鎂-四吡咯，另一方面，這些生化反應(yīng)可用于在測(cè)試系統(tǒng)中確定化合物的作用，以及與鎂螯合酶的功能有關(guān)的異源物質(zhì)的混合物。
本發(fā)明因而還涉及一種測(cè)定植物鎂鰲合酶亞基之間相互作用的方法，其包括用編碼帶有CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)或其帶有生物活性的片段的DNA序列以及至少編碼另一種鎂鰲合酶亞基的DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，方法是鎂鰲合酶基因產(chǎn)物的相互作用可導(dǎo)致一種能被直接或間接地、定性或定量地測(cè)量，優(yōu)選為活化一種標(biāo)志基因。
適于尋找植物鎂鰲合酶的特異性抑制物或活化物方法允許(除了其它方式以外)帶有潛在除草劑、生長(zhǎng)抑制性或增強(qiáng)或有植物檢疫作用的物質(zhì)被鑒定。
這些(體內(nèi))細(xì)胞測(cè)試系統(tǒng)的原理是基于如下事實(shí)一種重組生物已用植物鎂鰲合酶CHLD的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化，且有功能的表達(dá)一種或多種植物鎂鰲合酶，其是以允許發(fā)現(xiàn)影響該功能的物質(zhì)的方式顯示一種或多種亞基的基本功能。
鎂鰲合酶的一項(xiàng)功能在于相互之間的相互作用。該相互作用導(dǎo)致一種酶復(fù)合物的形式，且為鎂鰲合酶酶功能的前提條件。
本發(fā)明因此涉及鎂螯合酶CHLD亞基與待檢測(cè)并將在體內(nèi)定量測(cè)定的該酶的一個(gè)或兩個(gè)其它亞基發(fā)生相互作用的測(cè)試系統(tǒng)。
例如，CHLD亞基與CHLI亞基的相互作用可以這樣測(cè)定兩個(gè)亞基都與兩個(gè)其它的多肽或蛋白質(zhì)相連，連接的方式使得亞基的相互作用直接或間接地在細(xì)胞中引起可被定性或定量檢測(cè)的反應(yīng)。
符合這個(gè)意圖的多肽有，例如，來(lái)自細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)蛋白的亞基或結(jié)構(gòu)域，其功能通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來(lái)介導(dǎo)。
DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白是合適的，在報(bào)告基因的幫助下，其中兩個(gè)或多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用可以被檢測(cè)，因此報(bào)告基因的基因產(chǎn)物僅僅在兩個(gè)或多個(gè)上述亞基相互發(fā)生作用時(shí)才形成。
為了形成這樣的測(cè)試系統(tǒng)，將待測(cè)的兩個(gè)鎂螯合酶亞基中的一個(gè)融合到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上，而另一個(gè)鎂螯合酶亞基融合到調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域上。在這里，兩個(gè)蛋白質(zhì)中的哪一個(gè)融合到兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的哪一個(gè)上都沒有關(guān)系。因此，CHLD可以連接到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上，CHLI可以結(jié)合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域上。這種連接可以通過(guò)另一個(gè)輔助因子的相互作用調(diào)節(jié)，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或蛋白質(zhì)-配體相互作用，例如抗生蛋白鏈菌素-生物素。然而，例如通過(guò)目的基因的編碼區(qū)的融合的共價(jià)連接是優(yōu)選的。
這種調(diào)節(jié)蛋白的一個(gè)例子是啤酒酵母GAL4基因的產(chǎn)物。
對(duì)于指示基因和有關(guān)的啟動(dòng)子已經(jīng)整合到基因組中的宿主生物，用上述鎂螯合酶亞基的融合基因轉(zhuǎn)化該宿主生物。這種宿主生物的優(yōu)點(diǎn)在于它表達(dá)所用轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的所有功能，除了要作為重組蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白以外。如果微生物被用作宿主生物，那么重組生物就可以根據(jù)需要，利用微生物學(xué)的習(xí)慣方法被分離出來(lái)并且加以繁殖，因而微生物在測(cè)試系統(tǒng)中的應(yīng)用是無(wú)限的。因此，優(yōu)選采用的宿主生物是可以很容易轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)的微生物，例如酵母或大腸桿菌。
而且，適合轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的啟動(dòng)子連接到編碼指示蛋白的結(jié)構(gòu)基因上。這個(gè)重組基因的優(yōu)點(diǎn)在于啟動(dòng)子的活化直接或間接引起指示蛋白的表達(dá)。這個(gè)指示蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它在重組生物中引起容易檢測(cè)的變化，例如通過(guò)催化色素的形成或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)使自身染色或熒光化，亦或是通過(guò)促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。
其中指示基因的轉(zhuǎn)錄被激活的上述系統(tǒng)的應(yīng)用對(duì)于后面所描述的生長(zhǎng)測(cè)試具有優(yōu)越性，在生長(zhǎng)測(cè)試中，突變子被鎂螯合酶亞基互補(bǔ)，前者給予與酶或酶功能的抑制劑有關(guān)的更特異的信號(hào)，而后者測(cè)試首先需要通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)排除具有除鎂螯合酶以外的作用點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。因此，本發(fā)明優(yōu)選地將指示基因系統(tǒng)用于生長(zhǎng)測(cè)試中。
將要提到的在轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白的幫助下實(shí)現(xiàn)上述相互作用的這種系統(tǒng)的一個(gè)例子特別是由Clontech，Palo Alto，California，美國(guó)公司開發(fā)的MatchmakerTM雙雜交系統(tǒng)，Catalog No.#K 1605-1，1995/96，在此將其引入作為參考。
為此，產(chǎn)生了在酵母細(xì)胞中引起CHLD、H和I表達(dá)的質(zhì)粒，CHLD、H和I與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白。為了構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，將編碼這三個(gè)鎂螯合酶亞基的DNA片段通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。
用于擴(kuò)增的模板是含有目的基因cDNA的質(zhì)粒。所用的PCR引物是合成的寡核苷酸，其特征為有義引物與目的基因的5’端同源，而反義引物與目的基因的3’端同源。還可為質(zhì)粒提供限制酶切點(diǎn)以有利于在載體質(zhì)粒中的克隆。
所采用的優(yōu)選載體是MATCHMAKERTM雙雜交系統(tǒng)(Clontech)含有編碼GAL4激活結(jié)構(gòu)域的pGBT9和pAS2。含有編碼GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的pGAD424和pACT2。pGBT9和pGAD424，以及pAS2和pACT2在每種情況下一起用在系統(tǒng)中。pGBT9和pGAD424與pAS2和pACT2是不同的，區(qū)別在于上述基因在前兩者中的表達(dá)比在后兩者中的表達(dá)更弱。
編碼鎂螯合酶的每個(gè)亞基被分別克隆到載體中。通過(guò)轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，擴(kuò)增并分離質(zhì)粒。以這種方式，進(jìn)行所有三個(gè)亞基與所有四個(gè)載體的全部12種可能的組合。重組載體命名如下載體pAS2中的CHL D基因命名為pCBS1148載體pACT2中的CHL D基因命名為pCBS1149載體pGBT9中的CHL D基因命名為pCBS1150載體pGAD424中的CHL D基因命名為pCBS1151載體pAS2中的CHL H基因命名為pCBS1152載體pACT2中的CHL H基因命名為pCBS1153載體pGBT9中的CHL H基因命名為pCBS1154載體pGAD424中的CHL H基因命名為pCBS1155載體pAS2中的CHL I基因命名為pCBS1156載體pACT2中的CHL I基因命名為pCBS1157載體pGBT9中的CHL I基因命名為pCBS1158載體pGAD424中的CHL I基因命名為pCBS1159然后，雙雜交系統(tǒng)中的一個(gè)報(bào)告酵母菌株在每種情況下用兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。優(yōu)選采用的報(bào)告酵母菌株是表達(dá)作為指示蛋白的、由GALA誘導(dǎo)的β-半乳糖苷酶的菌株，優(yōu)選地采用Clontech公司的SFY526菌株。兩個(gè)質(zhì)粒的選擇方法是根據(jù)在每種情況下，一個(gè)質(zhì)粒編碼與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的亞基，而另一個(gè)質(zhì)粒編碼與激活結(jié)構(gòu)域融合的亞基。酵母的轉(zhuǎn)化是通過(guò)如Klebe等人，1983，基因(Gene)，25，333-341的方法進(jìn)行的。為了測(cè)定指示基因的誘導(dǎo)情況，將用兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移到濾膜上后，測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性，采用的方法是Breedon和Nasmyth(Breedon，L.和Nasmyth，K.(1985)酵母HO基因的調(diào)節(jié)。Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50，643-650。
或者，將轉(zhuǎn)化的酵母培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，將細(xì)胞破壞后在酵母粗提液中測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性，采用的方法是Munder和Furst(Munder，T.和Furst，P.(1992).分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)12，2091-2099)。
為了測(cè)試物質(zhì)，首先將重組生物培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。然后將重組細(xì)胞與待測(cè)試的物質(zhì)一起溫育。溫育條件的選擇是根據(jù)在溫育時(shí)間內(nèi)不用添加待測(cè)試的物質(zhì)指示基因就發(fā)生可檢測(cè)的誘導(dǎo)。將溫育時(shí)間延長(zhǎng)超過(guò)生長(zhǎng)期會(huì)影響測(cè)試。
或者，在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的幫助下，表達(dá)在轉(zhuǎn)錄激活中起作用的蛋白質(zhì)也可能影響誘導(dǎo)。指示基因的誘導(dǎo)可利用習(xí)慣的檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。如果在測(cè)試系統(tǒng)中指示基因被激活了，基因激活的結(jié)果是，與指示基因沒有被激活相比，在宿主細(xì)胞中形成了更多的報(bào)告蛋白。測(cè)試系統(tǒng)是根據(jù)以至少兩倍的數(shù)量產(chǎn)生報(bào)告蛋白進(jìn)行優(yōu)先選擇的。報(bào)告蛋白的產(chǎn)生以至少10倍的量增加是特別優(yōu)選的。如果報(bào)告蛋白是酶，酶的活性可通過(guò)習(xí)慣的測(cè)量方法進(jìn)行測(cè)定，例如通過(guò)比色法、熒光測(cè)定法和發(fā)光法。為此，將完整的細(xì)胞或其通過(guò)不同程度純化的提取物與適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)色的酶底物一起溫育。與底物的溫育可早在溫育的前期或其后受到影響。
如果一個(gè)化合物干擾亞基之間的相互作用，例如通過(guò)結(jié)合到亞基的“界面區(qū)”，該化合物就會(huì)抑制寡聚過(guò)程。因此，該化合物能夠減少生物體中具有酶學(xué)活性的鎂螯合酶的量，并且該化合物因此還具有潛在的除草作用。所以，也可能通過(guò)本測(cè)試系統(tǒng)尋找能夠抑制活性鎂螯合酶復(fù)合體形成的除草化合物。
為了檢測(cè)某種物質(zhì)與鎂螯合酶蛋白特異的相互作用，該物質(zhì)必須符合下列條件1)與不加該物質(zhì)的細(xì)胞相比，在重組細(xì)胞中，在加入該物質(zhì)后必須顯著降低指示基因的誘導(dǎo)。
2)在一個(gè)類似的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(對(duì)照系統(tǒng))中，鎂螯合酶亞基的相互作用被替換為不同的相互作用，對(duì)指示反應(yīng)的抑制必須在加入該物質(zhì)后僅僅略微降低或者是不可測(cè)量的。任何形式的連接，例如蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵，都可以用作另一個(gè)相互作用。
如果一個(gè)物質(zhì)符合上面的條件，就可以在其它測(cè)試系統(tǒng)中檢查它的作用，例如在用鎂螯合酶的酶促測(cè)試中、在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中或是在對(duì)完整植物的除草測(cè)試中。
而且，鎂螯合酶基因可被導(dǎo)入一特定的突變體中，該突變體是這樣一種生物，它離開了目的鎂螯合酶的功能就不能生長(zhǎng)，例如一種光養(yǎng)型微生物，通過(guò)突變使它的一個(gè)或多個(gè)鎂螯合酶亞基失去了其功能。這種突變體的使用具有特殊的優(yōu)越性，即該重組生物在合適培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)可以作為鎂螯合酶作用的度量，因此可以定量地描述測(cè)試物質(zhì)對(duì)鎂螯合酶的作用。生長(zhǎng)測(cè)試的優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)對(duì)物質(zhì)特別簡(jiǎn)單的處理和迅速轉(zhuǎn)變來(lái)進(jìn)行。
為此，植物的chlD基因可以被導(dǎo)入到一種生物的突變體中，該突變體的特征在于它具有改變了的表型，或者如果沒有鎂螯合酶的功能它在特定培養(yǎng)條件下就不能生長(zhǎng)，優(yōu)選地是沒有了CHLD蛋白的功能。這種突變體可以這樣產(chǎn)生，例如首先在一種需要鎂螯合酶活性以進(jìn)行光養(yǎng)生長(zhǎng)的微生物中改變其自身的鎂螯合酶的結(jié)構(gòu)基因，使其具有鎂螯合酶功能的酶不再形成，或者形成的量不足，因而形成的生物不再能夠進(jìn)行光養(yǎng)生長(zhǎng)。而且，植物的chlI和chlH結(jié)構(gòu)基因在這個(gè)突變體中表達(dá)。通過(guò)額外表達(dá)植物的chlD結(jié)構(gòu)基因，有功能的植物鎂螯合酶能夠在遺傳工程生物中形成，并且這種植物的鎂螯合酶重新賦予該生物光養(yǎng)生長(zhǎng)的能力。那么這種重組生物的生長(zhǎng)就是植物鎂螯合酶活性的直接的度量。采用這種重組生物的生長(zhǎng)測(cè)試使得能夠確定植物鎂螯合酶是否被加入到培養(yǎng)基中的化合物所抑制。為此，將遺傳工程生物于具有或不具有待檢查的化合物的光養(yǎng)生長(zhǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待檢查化合物優(yōu)選采用的濃度在10-9M和10-3M之間，特別優(yōu)選濃度是在10-7M和10-4M之間。
為了檢測(cè)待檢查化合物對(duì)鎂螯合酶的特異抑制作用，并且排除其它引起生長(zhǎng)抑制的作用方式，該化合物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)1)遺傳工程生物在該化合物存在時(shí)的生長(zhǎng)必須比在沒有該化合物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)顯著地弱。2)該化合物必須不能顯著地降低同一生物在異養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)。
象生長(zhǎng)一樣，被適當(dāng)改變了的生物之改變的表型也可以用作植物鎂螯合酶催化活性的指示。光養(yǎng)微生物的各種色素從鎂-螯合酶、鎂-原卟啉的反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生。如上述構(gòu)建的重組微生物不含有自身的鎂螯合酶，而是含有包括重組CHLD蛋白的重組植物鎂螯合酶，它只能在當(dāng)植物鎂螯合酶具有足夠活性時(shí)才能形成其衍生自鎂-原卟啉的色素。這種重組生物的色素就是植物鎂螯合酶活性的直接量度。利用這個(gè)重組生物，對(duì)色素組成的分析使得能夠確定植物鎂螯合酶是否被加入到培養(yǎng)基中的化合物所抑制。為此，將遺傳工程生物在具有或沒有待檢查化合物的培養(yǎng)基中，在由鎂-原卟啉形成色素的條件下培養(yǎng)。待檢查化合物優(yōu)選采用的濃度在10-9M和10-3M之間，特別優(yōu)選濃度是在10-7M和10-4M之間。為了檢測(cè)待檢查化合物對(duì)鎂螯合酶的特異抑制作用，并且排除其它引起生長(zhǎng)抑制的作用方式，該化合物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)1.與在沒有該化合物的培養(yǎng)基中相比，在該化合物存在的情況下遺傳工程生物由鎂-原卟啉開始形成的色素的量顯著降低，或者色素的組成改變了。
2.在相同的培養(yǎng)條件下，該化合物必須不能顯著地改變非遺傳工程出發(fā)生物的色素形成。
如果兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都符合了，就可以假定所檢查的化合物是植物鎂螯合酶的特異抑制劑。如果僅符合標(biāo)準(zhǔn)1而不符合標(biāo)準(zhǔn)2，鎂螯合酶的酶促反應(yīng)使得能夠確定所檢查的化合物是否是植物鎂螯合酶的特異抑制劑。
如果一種物質(zhì)符合上面提到的條件，利用或不利用直接在完整的植物或合適的植物器官上作進(jìn)一步的生化檢查，可以進(jìn)一步檢查該物質(zhì)在植物中的作用。習(xí)慣的除草法和生理學(xué)方法可用于這個(gè)目的。各種用途，比如形成用于確定蛋白質(zhì)功能的生化測(cè)試系統(tǒng)的必須的前提是待檢查的蛋白質(zhì)能夠盡可能純地以有功能的狀態(tài)得到，即沒有干擾活性。所有的細(xì)胞蛋白質(zhì)都是這樣，對(duì)于植物鎂螯合酶，可以利用習(xí)慣的蛋白質(zhì)純化技術(shù)從植物組織中分離出單獨(dú)的亞基來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。本發(fā)明指出有功能的植物鎂螯合酶除了含有CHLH和CHLI亞基以外還含有CHLD亞基，它的序列是象在SEQ ID No.2中的煙草的序列那樣。雜合寡聚蛋白質(zhì)的活性也是結(jié)合到植物細(xì)胞的膜組分上，就象鎂螯合酶，它的分離通常比分離可溶的或同聚的、或單體的酶要困難得多，因?yàn)樵诩兓^(guò)程中蛋白質(zhì)會(huì)失去它的酶促活性，而且在隨后只能通過(guò)復(fù)雜的方法才能恢復(fù)。另外，葉綠素生物合成酶的形成是細(xì)胞分化類型和發(fā)育狀態(tài)的函數(shù)。而且，這些蛋白質(zhì)(鎂螯合酶也是這樣)僅僅代表了全部細(xì)胞蛋白質(zhì)的一小部分，因此當(dāng)從植物組織中分離它們時(shí)必須達(dá)到特別高的濃縮倍數(shù)。
由于所描述的困難，優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明利用編碼鎂螯合酶的核酸分子產(chǎn)生重組的植物鎂螯合酶，特別優(yōu)選是由CHLD、CHLH和CHLI蛋白組成的重組鎂螯合酶復(fù)合體。重組植物CHLD蛋白是非常特別優(yōu)選地提到的。
通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的植物鎂螯合酶，優(yōu)選地通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的CHLD蛋白，可以采用多種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。一種方法是否合適取決于在該種情況下所用的宿主生物、表達(dá)策略以及掌握重組蛋白的表達(dá)和純化技術(shù)的人員所知的其它因素。為了純化重組蛋白，還可以通過(guò)以適當(dāng)?shù)姆绞礁淖兯诒磉_(dá)盒中的基因序列將它融合到其它的肽序列上。優(yōu)選地使用的融合組分是肽或蛋白質(zhì)，它們作為C-端或N-端融合，其賦予重組鎂螯合酶亞基對(duì)特定的柱材料的親和性，或者使得表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的特定位點(diǎn)，例如通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)肽或信號(hào)肽(或者轉(zhuǎn)運(yùn)序列或信號(hào)序列)。這樣的融合必須不會(huì)影響鎂螯合酶的功能，或者必須能夠被清除掉，例如通過(guò)引入適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖形稽c(diǎn)?？赡芤岬降娜诤辖M分的例子有寡聚組氨酸尾巴、Strep-TagTM、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE)，以舉例或其片段方式給出的融合組分不限制本申請(qǐng)的范圍。要純化有活性的鎂螯合酶復(fù)合體，只要復(fù)合體中的一個(gè)亞基融合到這種肽或蛋白質(zhì)上就足夠了。而且，還有可能從通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的少量的鎂螯合酶，優(yōu)選地是CHLD蛋白中制備特異的抗體，并且在這些抗體的幫助下，能夠從重組生物或從植物中分離到鎂螯合酶或鎂螯合酶亞基。
通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的鎂螯合酶，優(yōu)選地是CHLD蛋白及其純化使得第一次能夠獲得不同純度的具有鎂螯合酶活性的植物酶，直至由CHLD、CHLH和CHLI亞基組成的純的鎂螯合酶復(fù)合體，或是純的CHLD蛋白。分離或濃縮的鎂螯合酶的可能用途有，例如，它在測(cè)定酶功能的生化測(cè)試系統(tǒng)中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及測(cè)定植物鎂螯合酶活性的方法，其中蛋白質(zhì)與CHLD的功能和編碼鎂螯合酶亞基I和H的DNA序列的基因產(chǎn)物相結(jié)合，其結(jié)合方式是鎂螯合酶基因產(chǎn)物的酶促活性引起可直接或間接地、定性或定量測(cè)量的信號(hào)。
化合物對(duì)鎂螯合酶的抑制作用可通過(guò)在該化合物存在時(shí)，該酶典型的催化活性的降低或鎂螯合酶被完全失活來(lái)測(cè)量。為此，由CHLD、CHLH和CHLI亞基組成的植物鎂螯合酶與其底物原卟啉、ATP和Mg2+一起溫育在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液中。
通過(guò)優(yōu)選的反應(yīng)條件，要提到的反應(yīng)緩沖液的pH在pH4和pH11之間，優(yōu)選地5-10，特別是6-9，反應(yīng)溫度在2-50℃，優(yōu)選地10-40℃等等。
通過(guò)簡(jiǎn)單比較在存在或不存在待測(cè)化合物時(shí)鎂螯合酶的催化活性的差別，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酶抑制的測(cè)定。
為了測(cè)定鎂螯合酶的活性可以采用各種生化測(cè)量方法，通過(guò)這些方法，可以測(cè)定鎂螯合酶催化反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物例如鎂-原卟啉、ADP或磷酸，或測(cè)定鎂螯合酶的酶底物濃度的降低，例如原卟啉、ATP或Mg2+。大量的測(cè)定鎂螯合酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法可以為那些對(duì)進(jìn)行酶測(cè)試熟練的技術(shù)人員所用。需要優(yōu)選地提到的方法是那些測(cè)量在反應(yīng)批次中原卟啉到鎂-原卟啉的轉(zhuǎn)變速率的方法，即通過(guò)測(cè)量鎂-原卟啉和原卟啉的不同熒光性質(zhì)(例如Walker等人，植物生理生化，30263-269(1992))或通過(guò)光度法分析由原卟啉到鎂-原卟啉轉(zhuǎn)變時(shí)造成的光吸收的改變(例如Gorchein，生化雜志(Biochem.J.)，299869-874(1991))或通過(guò)HPLC定量分析原卟啉或鎂-原卟啉。鎂螯合酶的ATP酶活性的測(cè)定可能是要提到的更為優(yōu)選的測(cè)量方法，因而有可能進(jìn)行檢測(cè)例如通過(guò)磷酸檢測(cè)法檢測(cè)磷酸的形成，例如通過(guò)以Fiske等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)66375-400(1925)描述的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的方法。另外，化合物對(duì)于植物鎂螯合酶的抑制類型可以通過(guò)改變底物及抑制物的濃度，利用習(xí)慣的生化方法進(jìn)行測(cè)定。
除了使用純化的鎂螯合酶，也可能使用重組表達(dá)三種鎂螯合酶亞基CHLD、CHLH和CHLI的重組生物的完整細(xì)胞，或使用該生物含蛋白質(zhì)的提取物，或使用該生物被濃縮到不同程度的含鎂螯合酶的組分。酵母細(xì)胞可能作為優(yōu)選的重組宿主生物被提到以用于這個(gè)目的?；蛘撸€可能使用從植物組織或植物細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的含有CHLD、CHLH和CHLI亞基的有功能的鎂螯合酶。
在生化或細(xì)胞生物學(xué)測(cè)試系統(tǒng)的幫助下，如果發(fā)現(xiàn)一化合物在體外抑制植物鎂螯合酶，就可以直接檢測(cè)這種化合物對(duì)植物(無(wú)論完整的植物還是植物的適當(dāng)?shù)牟糠?的作用。為此，大量習(xí)慣的除草學(xué)和生理學(xué)方法可以為那些評(píng)價(jià)活性物質(zhì)對(duì)植物的作用的技術(shù)人員所用。
而且，通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的鎂螯合酶，優(yōu)選的是具有通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生的CHLD亞基的鎂螯合酶復(fù)合體，或是游離的CHLD亞基，可被用于闡明植物酶的空間結(jié)構(gòu)。一般知道的方法如蛋白質(zhì)晶體的X-射線結(jié)構(gòu)分析或NMR光譜分析，可用于闡明空間結(jié)構(gòu)。鎂螯合酶的結(jié)構(gòu)信息，優(yōu)選地是CHLD亞基的結(jié)構(gòu)信息，可用于如推理設(shè)計(jì)新的鎂螯合酶抑制劑，以及潛在的除草劑。
本專利申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的德國(guó)專利申請(qǐng)197 17 656.9的公開，以及伴隨本申請(qǐng)的摘要，在此引入作為參考。
下面的實(shí)施例旨在更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，不應(yīng)以任何方式理解為一種限制標(biāo)準(zhǔn)方法，如DNA和RNA分離、序列分析、限制性酶切、克隆、凝膠電泳、放射性標(biāo)記、Southern和Northern雜交，是通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行的(Sambrook等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第二版。冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，美國(guó)紐約；Sanger等人，1977，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74，5463-5467)。實(shí)施例1克隆編碼鎂螯合酶CHLD亞基的煙草cDNA
為了鑒定煙草的chlD cDNA，分離出了相應(yīng)于衍生自chlD基因集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803(Jensen等人，生物化學(xué)雜志，271，16662-16667)的蛋白質(zhì)序列的肽序列VDASGS(SEQ ID No.3)、TDGRGN(SEQ ID No.4)和AKGAVM(SEQ ID No.7)，以制備下列DNA引物序列的混合物1)GA(CT)GT(ACTG)GA(GA)AA(AG)(TA)C(ACGT)GT(ACGT)2)AT(AG)TT(ACGT)CC(ACGT)CG(ACGT)CC(AG)TC(ACGT)G3)GC(ACGT)AA(AG)GG(ACGT)GC(ACGT)GT(ACGT)ATG C這些引物被用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中以從集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803中擴(kuò)增基因組DNA進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中條件為1分鐘94℃，2分鐘45℃，3分鐘72℃，然后進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中條件為30秒94℃，90秒60℃，2分鐘72℃。
PCR產(chǎn)生大約270bp的DNA片段，將它克隆到克隆載體pCRTMII(Invitrogen，San Diego)中，并分離用于通過(guò)限制性消化進(jìn)行進(jìn)一步處理。
所分離的并進(jìn)行32P[dCTP]-標(biāo)記的大約270bp長(zhǎng)的片段被用作雜交探針，根據(jù)說(shuō)明篩選煙草(Nicotiana tabacum SR1，Stratagene)λZAPIIcDNA文庫(kù)。
分離并測(cè)序經(jīng)過(guò)cDNA文庫(kù)篩選后存在于噬菌粒pBluescript SK中的DNA。所鑒定的chlD cDNA序列示于SEQ ID No.1中，其含有一個(gè)2274個(gè)核苷酸長(zhǎng)的開放閱讀框，以及5’和3’端的非翻譯區(qū)。
將煙草基因組DNA與CHLD基因的放射性標(biāo)記DNA雜交。為此，用EcoRI和HindIII將CHLD基因從噬菌粒pBluescript SK中切下。產(chǎn)生的兩個(gè)2069bp和426bp的片段用32P(dCTP)進(jìn)行放射性標(biāo)記。實(shí)施例2 chlD反義煙草植物的產(chǎn)生將根據(jù)實(shí)施例1在pBluescript SK-中得到的CHLD的煙草cDNA片段用KpnI和XbaI從載體pBluescript SK-中切下，連接到已用KpnI和XbaI切過(guò)的雙元載體BinAR(Hofgen和Willmitzer，植物科學(xué)(1990)66，22-230)上。
首先，用該構(gòu)件轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，然后轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌GV2260菌株。利用葉盤轉(zhuǎn)化法(Horsch等人，科學(xué)(Science)228，1229-1231)，將幼煙草葉盤與土壤桿菌共培養(yǎng)，CHLD反義基因被穩(wěn)定地整合到植物的基因組中。實(shí)施例3 chlD有義煙草植物的產(chǎn)生為了產(chǎn)生chlD有義煙草植物，將chlD cDNA用SmaI和XbaI從pBluescript SK-中切下并克隆到經(jīng)限制酶消化過(guò)的BinAR載體中。為了穩(wěn)定地整合到煙草的基因組中，選擇了在實(shí)施例2中描述的方法。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)基因煙草植物的分析分離到67株有義植物和56株反義植物。具有CHLD的反義或有義基因的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出逐漸不同的葉綠素缺陷。患有褪綠病的葉片表現(xiàn)出不同的類型。有均一脫色的、黃綠色的葉片，帶不同色素點(diǎn)的葉片，和圍繞葉脈及綠色脈間有白色區(qū)的葉片。隨著葉片變老，它們失去了葉綠素。葉綠素含量降低的植物還表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢(見

圖1a至1d)。
而且，通過(guò)Southern雜交分析證實(shí)了有義或反義chlD基因穩(wěn)定整合到了煙草植物的基因組中，并通過(guò)Northern雜交分析確定了chlD轉(zhuǎn)錄本的mRNA含量。在反義植物中，mRNA的含量比在野生型中的含量有所降低。與野生型相比，chlD有義植物僅僅略微提高了chlD mRNA的含量。
通過(guò)Lee等人(1992，植物生理學(xué)99，1134-1140)的方法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物的鎂螯合酶活性。有義和反義植物總是顯示出降低的酶活性。在設(shè)想能夠過(guò)量表達(dá)CHLD的轉(zhuǎn)化子中，酶活性降低的現(xiàn)象可以負(fù)顯性(negative dominance)解釋。過(guò)量供應(yīng)CHLD亞基導(dǎo)致鎂螯合酶復(fù)合體的精密調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞。
測(cè)定了在轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物中的原卟啉IX和葉綠素的含量(見表2)。必須強(qiáng)調(diào)的是，具有有義或反義CHLD mRNA的轉(zhuǎn)化子在其所檢測(cè)的幼葉中(葉片3，5和7)表現(xiàn)出的原卟啉含量高于野生型植物3-5倍，這已成為了規(guī)律。
葉綠素含量的測(cè)定證實(shí)了肉眼可見的表型。在個(gè)別植物中，葉綠素含量的降低高達(dá)25％。表2在有義和反義植物中原卟啉IX和葉綠素的相對(duì)含量植物 葉片原卟啉IX[％]葉綠素[％]SNN3100 10051007100 100AS73584 2555427157 28AS93135 505120 -7-49AS13 3160 785102 -7115 78AS18 3374 745470 -7295 80AS21 3231 955188 -798 101S1 3189 785262 -7297 80S203423 325293 -7144 25S223189 1175151 -7115 94S293298 255265 -7137 26S383257 1205127-7- 107SNN＝野生型S ＝有義AS＝反義實(shí)施例5 用于表達(dá)作為帶有GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的CHLD、H和I的質(zhì)粒的構(gòu)建為構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，編碼三個(gè)鎂螯合酶亞基的DNA利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。
為擴(kuò)增chlD基因，100ng的質(zhì)粒pNTCHLD用作模板。下面兩個(gè)寡核苷酸用作PCR引物具有SmaI切點(diǎn)的5’-TGA CCC GGG GGTAGT GGA ACC TGA AAA ACA ACC-3’為有義引物，以及具有EcoRI切點(diǎn)的5’-GGC GAA TTC TCA AGA TTC CTT TAA TGC AGA TAA-3’或是具有SalI切點(diǎn)的5’-GCG GTC GAC TCA AGA TTC CTT TAATGC AGA-3’作為反義引物。
為擴(kuò)增CHLH基因，100ng的質(zhì)粒pNTCHLH用作模板。下面兩個(gè)寡核苷酸用作PCR引物具有EcoRV切點(diǎn)的5’-GCT GAT ATC GGCTAT TGG CAA TGG TTT ATT CAC-3’為有義引物和具有SalI切點(diǎn)的5’-GCG TCG ACA TTT ATC GAT CGA TTC CCT CAA-3’為反義引物。為了擴(kuò)增chlI基因，100ng的質(zhì)粒pNTCHLI用作模板。下面兩個(gè)寡核苷酸用作PCR引物具有SmaI切點(diǎn)的5’-CAG CCC GGG GGGTCC ACT ACT AGG-3’為有義引物，以及具有SalI切點(diǎn)的5’-CAG GTCGAG GCA CAG TAC AAA GCC-3’作為反義引物。
穿梭質(zhì)粒MATCHMAKERTM雙雜交系統(tǒng)(Clontech)用作載體pGBT9和pAS2各含有一個(gè)編碼GAL4激活結(jié)構(gòu)域的基因。pGAD424和pACT2各含有一個(gè)編碼GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因。pGBT9和pGAD424，以及pAS2和pACT2在每種情況下分別被一起用于系統(tǒng)中。pGBT9和pGAD424與pAS2和pACT2的不同之處在于，上述基因在前兩者中的表達(dá)比在后兩者中的表達(dá)更弱。
為了將chlD克隆至載體pACT2，將該基因用具有SmaI切點(diǎn)的有義引物和具有EcoRI切點(diǎn)的反義引物擴(kuò)增，并且隨后連接到被SmaI-和EcoRI切過(guò)的載體上。
為了將chlD在各種情況下克隆至載體pAS2、pGBT9和pGAD424，將該基因用帶有SmaI切點(diǎn)的有義引物和帶有SalI切點(diǎn)的反義引物擴(kuò)增，并且隨后連接到在被SmaI-和SalI切過(guò)的載體上。
為了將基因chlH和I在各種情況下克隆至載體pAS2、pGBT9和pGAD424，在各種情況下通過(guò)有義和反義引物擴(kuò)增這些基因，隨后與用SmaI和SalI切過(guò)的載體連接。
為了將chlH或I在各種情況下克隆至載體pACT2，將該基因用有義引物和反義引物擴(kuò)增，并且隨后連接到被SmaI-和XhoI切過(guò)的載體上。將連接DNA通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化克隆在含有100微克氨芐青霉素/毫升的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。從重組細(xì)菌中分離出質(zhì)粒DNA并利用限制性分析檢測(cè)加以確定。
以這種方式制備了所有三個(gè)亞基與所有四個(gè)載體的全部12種可能的組合。實(shí)施例6利用雙雜交系統(tǒng)在酵母中測(cè)定鎂螯合酶亞基之間的相互作用用菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlI在酵母中進(jìn)行β-半乳糖苷酶液體分析(Munder和Furst，1992，分子細(xì)胞生物學(xué)12，2091-2099)，利用Klebe(Klebe等人，1983，基因，25，333-341)的方法制備感受態(tài)酵母細(xì)胞株SFY526(Harper等人，1993，細(xì)胞(Cell)，75，805-816)，并用實(shí)施例2中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。SFY526用所有的質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化并且用其所有可能的組合轉(zhuǎn)化，在添加氨基酸(腺嘌呤20毫克/升；L-組氨酸鹽酸20毫克/升；L-賴氨酸鹽酸30毫克/升；L-亮氨酸30毫克/升；L-色氨酸20毫克/升)的基本瓊脂板(1.5％瓊脂，10％YNB葡萄糖)上進(jìn)行篩選。
待測(cè)的酵母菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlI在添加了所需氨基酸(腺嘌呤20毫克/升；L-組氨酸鹽酸20毫克/升；L-賴氨酸鹽酸30毫克/升)的10毫升基本培養(yǎng)基中，30℃、180轉(zhuǎn)/分條件下于無(wú)菌的50毫升大口帶金屬帽的三角瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。記錄過(guò)夜培養(yǎng)物的光密度(OD600)(用Beckman DU640光度計(jì))，測(cè)得的數(shù)值在1.0和2.0之間。
取100微升該培養(yǎng)物檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活性?？偟臉悠敷w積大約1毫升100微升培養(yǎng)物700微升Z緩沖液+巰基乙醇50微升三氯甲烷50微升0.1％SDS平行檢測(cè)零值700微升Z緩沖液50微升三氯甲烷50微升0.1％SDS將樣品和平行零值各振動(dòng)混合30秒，將160微升的ONPG溶液(4毫克鄰-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷對(duì)1毫升Z緩沖液+巰基乙醇)分別加入其中。將樣品小心搖動(dòng)并在30℃水浴中保溫。1小時(shí)后，加入400微升1M Na2CO3終止反應(yīng)，并將樣品在13000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘(HeraeusBiofuge fresco，固定角轉(zhuǎn)子24)。取上清液在420nm處相對(duì)于零值進(jìn)行測(cè)定(Bechman DU640光度計(jì))，β-半乳糖苷酶的活性計(jì)算U＝1000E420(CVt)-1E420是在420nm的消光值，C是細(xì)胞懸浮液的密度(OD600)，V是所用細(xì)胞懸浮液的體積，而t是保溫時(shí)間。
在另外兩個(gè)克隆上重復(fù)測(cè)量，計(jì)算平均值。所需溶液Z緩沖液1000毫升16.1克Na2HPO4×7H2O5.5克NaH2PO4×7H2O0.75克KClMgSO4×7H2OZ緩沖液+巰基乙醇(新鮮配制)100毫升Z緩沖液+270微升巰基乙醇實(shí)施例7在酵母(Willows等人，1996，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem)235，438-443)菌株 SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlH+pSG28中重構(gòu)測(cè)試鎂螯合酶活性制備菌株SFY526+pAS2-chlD+pACT2-chlH的感受態(tài)細(xì)胞(Klebe等人，1983，基因，25，333-341)并用pSG28轉(zhuǎn)化(p423TEF+chH；p423TEFMumberg等人，1995；基因，156；119-122)。在添加了腺嘌呤(20毫克/毫升)和L-賴氨酸鹽酸(30毫克/毫升)的基本培養(yǎng)基(10％YNB葡萄糖；1.5％瓊脂)上選擇轉(zhuǎn)化子。該菌株的15毫升預(yù)培養(yǎng)物(基本培養(yǎng)基10％YNB葡萄糖+20毫克/毫升腺嘌呤+30毫克/毫升L-賴氨酸鹽酸)在30℃、180轉(zhuǎn)/分條件下，于無(wú)菌帶金屬帽的50毫升大口三角瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。150毫升主培養(yǎng)物(基本培養(yǎng)基10％YNB葡萄糖+20毫克/毫升腺嘌呤+30毫克/毫升L-賴氨酸鹽酸)用7.5毫升預(yù)培養(yǎng)物接種，并用無(wú)菌帶棉塞的500毫升三角瓶，在30℃、180轉(zhuǎn)/分條件下震蕩培養(yǎng)20小時(shí)。將細(xì)胞在5000轉(zhuǎn)/分(Sigma 4K 10)離心5分鐘沉淀并重新懸浮于1.5毫升測(cè)試緩沖液中(0.1M tricine pH 7.9，0.3M甘油，25mM MgCl2，4mMDTT)。隨后細(xì)胞懸液在冰上以低強(qiáng)度超聲破碎3×30秒。
將破碎的細(xì)胞在5000轉(zhuǎn)/分(Sigma 4K 10)離心15分鐘沉淀，上清液作進(jìn)一步處理。此酵母提取液的蛋白質(zhì)含量根據(jù)Bradford法利用BioRad蛋白質(zhì)測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定。
測(cè)試體積為1毫升。1毫升測(cè)試緩沖液含有l(wèi)毫克破碎酵母培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)提取液、4mM ATP、1.5μM原卟啉IX、50mM磷酸肌酸和10U肌酸磷酸激酶。
將混合物在30℃避光保溫1小時(shí)，然后用Perkin Elmer分光光度計(jì)LS50B測(cè)量500nm和650nm之間的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為420nm，并進(jìn)行HPLC分析。
圖1(a-d)表示轉(zhuǎn)基因的chlD有義和反義煙草植物序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Schering AgrEvo GmbH(B)街道(C)城市Frankfurt(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話069-305-82808(H)傳真069-35-7175(ii)發(fā)明名稱編碼植物鎂螯合酶CHLD亞基的DNA序列及用于測(cè)定植物鎂螯合酶活性的方法(iii)序列數(shù)目7(iv)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2495個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..39(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置40..2313(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置41..2495(xi)SEQ ID NO1的序列描述CATCTAAAAT CCTAAATCAA AAACTTCGAT GCTATAAAA ATG GGG TTT TGT TCA 54Met Gly Phe Cys Ser1 5ACT TCA ACC CTC CCA CAA ACA TCA CTA TCC AAT TCT CAA TCT TCA ACA 102Thr Ser Thr Leu Pro Gln Thr Ser Leu Ser Asn Ser Gln Ser Ser Thr10 15 20TTC TTC ACA TAC TTA AAA CCA TGC CCA ATT CTA TCC TCC ACA TAT TTA 150Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu Ser Ser Thr Tyr Leu25 30 35AGG CCG GAA CGG CTA AAA TTT CGC CTC AGA ATA AGT GCC ACT GCA ACT 198Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile Ser Ala Thr Ala Thr40 45 50ATT GAT TCA CCT AAT GGC GCT GTT GCA GTA GTG GAA CCT GAA AAA CAA 246Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val Glu Pro Glu Lys Gln55 60 65CCT GAG AAA ATT TCC TTT GGT AGA CAG TAT TTT CCT CTA GCT GCT GTT 294Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gln Tyr Phe Pro Leu Ala Ala Val70 75 80 85ATT GGA CAG GAT GCT ATT AAA ACT GCT CTT TTA CTT GGG GCC ATT GAC 342Ile Gly Gln Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ile Asp90 95 100CGT GAG ATA GGA GGA ATT GCA ATA TGT GGG AAG CGT GGA ACA GCG AAA 390Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys Arg Gly Thr Ala Lys105 110 115ACG TTA ATG GCA CGT GGA TTG CAT GCT ATT CTG CCA CCA ATT GAA GTA 438Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu Pro Pro Ile Glu Val120 125 130GTT GTT GGC TCA ATG GCA AAT GCT GAT CCG AAC TGT CCC GAT GAG TGG 486Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn Cys Pro Asp Glu Trp135 140 145GAA GAC GGG CTA GCT GAC AGA GCA GAA TAT GGG TCT GAT GGT AAT ATC 534Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly Ser Asp Gly Asn Ile150 155 160 165AAG ACC CAG ATA GTT AAA TCC CCA TTT GTT CAG ATT CCC CTT GGT GTC 582Lys Thr Gln Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gln Ile Pro Leu Gly Val170 175 180ACA GAA GAT AGA TTG ATT GGC TCT GTT GAT GTC GAG GAG TCC GTG AAA 630Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly ser Val Asp Val Glu Glu Ser Val Lys185 190 195TCT GGA ACC ACT GTC TTT CAA CCA GGC CTC CTC GCA GAA GCT CAT CGA 678Ser Gly Thr Thr Val Phe Gln Pro Gly Leu Leu Ala Glu Ala His Arg200 205 210GGA GTT CTA TAT GTT GAT GAG ATT AAT CTA TTA GAT GAA GGT ATA AGT 726Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu Asp Glu Gly Ile Ser215 220 225AAC CTA CTT CTG AAT GTA TTG GAG GGA GTC GTC AAT ATT GTA GAA AGA 774Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val Asn Ile Val Glu Arg230 235 240 245GAG GGA ATC AGC TTT CGA CAT CCA TGC AAA CCA CTA CTA ATT GCT ACC 822Glu Gly Ile Ser phe Arg His Pro Cys Lys Pro Leu Leu Ile Ala Thr250 255 260TAT AAC CCT GAA GAG GGT GCG GTT CGT GAG CAT CTG CTA GAC CGT ATT 870Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His Leu Leu Asp Arg Ile265 270 275GCG ATT AAT TTA AGT GCA GAT CTT CCA ATG AGT TTT GAC GAT CGT GTT 918Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser Phe Asp Asp Arg Val280 285 290GCA GCT GTT GAC ATA GCA ACA CGT TTT CAG GAG TGT AGC AAT GAG GTT 966Ala Ala Val AsP Ile Ala Thr Arg Phe Gln Glu Cys Ser Asn Glu Val295 300 305TTT AAA ATG GTG GAT GAA GAA ACA GAC AGT GCA AAA ACC CAG ATA ATA 1014Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala Lys Thr Gln Ile Ile310 315 320 325TTG GCA AGG GAG TAT TTA AAG GAT GTC ACA ATC AGT AGA GAT CAA CTA 1062Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile Ser Arg Asp Gln Lau330 335 340AAA TAC TTG GTC ATG GAA GCA ATT CGT GGT GGC TGC CAG GGG CAC CGA 1110Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly Cys Gln Gly His Arg345 350 355GCT GAA CTT TAT GCT GCT CGT GTA GCC AAA TGC TTA GCT GCC ATC GAT 1158Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys Leu Ala Ala Ile Asp360 365 370GGA CGT GAA AAA GTT GGT GTT GAT GAG CTG AAA AAA GCT GTA GAG CTT 1206Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys Lys Ala Val Glu Leu375 380 385GTC ATC CTC CCA CGT TCA ACT ATA GTT GAA AAC CCA CCA GAC CAG CAA 1254Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn Pro Pro Asp Gln Gln390 395 400 405AAC CAG CAG CCA CCT CCT CCC CCT CCC CCT CCC CAA AAT CAA GAT TCT 1302Asn Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Asn Gln Asp Ser410 415 420TCA GAA GAG CAG AAT GAA GAA GAA GAA AAA GAA GAA GAA GAT CAA GAG 1350Ser Glu Glu Gln Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Asp Gln Glu425 430 435GAT GAG AAA GAT AGA GAA AAT GAA CAG CAA CAG CCa CAA GTC CCT GAT 1398Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gln Gln Gln Pro Gln Val Pro Asp440 445 450GAG TTT ATT TTT GAT GCG GAA GGT GGT TTA GTG GAT GAA AAA CTT CTC 1446Glu Phe Ile phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val Asp Glu Lys Leu Leu455 460 465TTC TTT GCA CAA CAA GCA CAA AGA CGC AAA GGA AAA GCT GGA CGA GCA 1494Phe Phe Ala Gln Gln Ala Gln Arg Arg Lys Gly Lys Ala Gly Arg Ala470 475 480 485AAg AAG GTC ATC TTT TCC GAA GAT AGA GGT CGA TAT ATA AAG CCA ATG 1542Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg Tyr Ile Lys Pro Met490 495 500CTT CCA AAG GGT CCA GTG AAG AGA TTG GCA GTT GAT GCA ACT CTA AGA 1590Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val Asp Ala Thr Leu Arg505 510 515GCA GCG GCA CCA TAT CAG AAG TTA CGA AGA GCA AAG GAC ATC CAA AAA 1638Ala Ala Ala Pro Tyr Gln Lys Leu Arg Arg Ala Lys Asp Ile Gln Lys520 525 530ACT CGC AAG GTT TAT GTA GAG AAA ACT GAC ATG AGA GCC AAA AGA ATG 1686Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met Arg Ala Lys Arg Met535 540 545GCA CGC AAA GCC GGA GCT CTG GTG ATA TTC GTA GTT GAC GCT AGT GGG 1734Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val Val Asp Ala Ser Gly550 555 560 565AGT ATG GCA CTG AAT AGA ATG CAG AAT GCC AAA GGA GCA GCA CTT AAA 1782Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gln Asn Ala Lys Gly Ala Ala Leu Lys570 575 580CTA CTT GCA GAG AGT TAT ACA AGC AGA GAT CAG GTC TGT ATC ATT CCC 1830Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gln Val Cys Ile Ile Pro585 590 595TTC CGC GGA GAT GCT GCT GAA GTT TTG TTG CCA CCT TCT AGG TCA ATA 1878Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro Pro Ser Arg Ser Ile600 605 610TCG ATG GCA AGA AAT CGT CTT GAG AGA CTT CCC TGT GGA GGG GGt TCT 1926Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro Cys Gly Gly Gly Ser615 620 625CCC CTT GCT CAT GGG CTT ACG ACG GCA GTT AGA GTT GGA ATG AAT GCA 1974Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg Val Gly Met Asn Ala630 635 640 645GAA AAG AGT GGT GAT GTT GGA CGT ATC ATG ATT GTT GCA ATT ACT GAT 2022Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile Val Ala Ile Thr Asp650 655 660GGT AGA GCT AAC ATC TCT CTT AAA AGA TCC ACA GAC CCT GAA GCT GAA 2070Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr Asp Pro Glu Ala Glu665 670 675GCT TCT GAT GCA CCC AGA CCT TCT TCC CAA GAG CTG AAG GAT GAG ATT 2118Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gln Glu Leu Lys Asp Glu Ile680 685 690CTC GAG GTG GCT GGT AAA ATA TAC AAA ACA GGA ATG TCT CTC CTC GTC 2166Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly Met Ser Leu Leu Val695 700 705ATA GAT ACA GAA AAT AAG TTT GTT TCT ACT GGT TTT GCG AAA GAA ATC 2214Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser Thr Gly Phe Ala Lys Glu Ile710 715 720 725GCG AGA GTA GCT CAA GGG AAG TAC TAT TAT TTA CCA AAT GCT TCA GAT 2262Ala Arg Val Ala Gln Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu Pro Asn Ala Ser Asp730 735 740GCT GTG ATA TCT GCA GCA ACA AAG GAT GCA TTA TCT GCA TTA AAG GAA 2310Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu Ser Ala Leu Lys Glu745 750 755TCT TGACCTAAAC TCGATCGAAT TAATTGTAAA TGTTGTTTTG AGTATAGATT 2363SerATTGGGAGGA TATAAGAGCT TGCTTGATAA TTCTTATCTT TTGTTGTACT AATTGAACTT 2423ATTTCTCAAT TATGCAATCA GGGTAATGAA GATTCTTTTC ATTTCAAAAA AAAAAAAAAA 2483AAAGGAATTC GA 2495(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度758個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Gly Phe Cys Ser Thr Ser Thr Leu Pro Gln Thr Ser Leu Ser Asn1 5 10 15Ser Gln Ser Ser Thr Phe Phe Thr Tyr Leu Lys Pro Cys Pro Ile Leu20 25 30Ser Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Glu Arg Leu Lys Phe Arg Leu Arg Ile35 40 45Ser Ala Thr Ala Thr Ile Asp Ser Pro Asn Gly Ala Val Ala Val Val50 55 60Glu Pro Glu Lys Gln Pro Glu Lys Ile Ser Phe Gly Arg Gln Tyr Phe65 70 75 80Pro Leu Ala Ala Val Ile Gly Gln Asp Ala Ile Lys Thr Ala Leu Leu85 90 95Leu Gly Ala Ile Asp Arg Glu Ile Gly Gly Ile Ala Ile Cys Gly Lys100 105 110Arg Gly Thr Ala Lys Thr Leu Met Ala Arg Gly Leu His Ala Ile Leu115 120 125Pro Pro Ile Glu Val Val Val Gly Ser Met Ala Asn Ala Asp Pro Asn130 135 140Cys Pro Asp Glu Trp Glu Asp Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Tyr Gly145 150 155 160Ser Asp Gly Asn Ile Lys Thr Gln Ile Val Lys Ser Pro Phe Val Gln165 170 175Ile Pro Leu Gly Val Thr Glu Asp Arg Leu Ile Gly Ser Val Asp Val180 185 190Glu Glu Ser Val Lys Ser Gly Thr Thr Val Phe Gln Pro Gly Leu Leu195 200 205Ala Glu Ala His Arg Gly Val Leu Tyr Val Asp Glu Ile Asn Leu Leu210 215 220Asp Glu Gly Ile Ser Asn Leu Leu Leu Asn Val Leu Thr Glu Gly Val225 230 235 240Ash Ile Val Glu Arg Glu Gly Ile Ser Phe Arg His Pro Cys Lys Pro245 250 255Leu Leu Ile Ala Thr Tyr Asn Pro Glu Glu Gly Ala Val Arg Glu His260 265 270Leu Leu Asp Arg Ile Ala Ile Asn Leu Ser Ala Asp Leu Pro Met Ser275 280 285Phe Asp Asp Arg Val Ala Ala Val Asp Ile Ala Thr Arg Phe Gln Glu290 295 300Cys Ser Asn Glu Val Phe Lys Met Val Asp Glu Glu Thr Asp Ser Ala305 310 315 320Lys Thr Gln Ile Ile Leu Ala Arg Glu Tyr Leu Lys Asp Val Thr Ile325 330 335Ser Arg Asp Gln Leu Lys Tyr Leu Val Met Glu Ala Ile Arg Gly Gly340 345 350Cys Gln Gly His Arg Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Arg Val Ala Lys Cys355 360 365Leu Ala Ala Ile Asp Gly Arg Glu Lys Val Gly Val Asp Glu Leu Lys370 375 380Lys Ala Val Glu Leu Val Ile Leu Pro Arg Ser Thr Ile Val Glu Asn385 390 395 400Pro Pro Asp Gln Gln Asn Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro405 410 415Gln Asn Gln Asp Ser Ser Glu Glu Gln Asn Glu Glu Glu Glu Lys Glu420 425 430Glu Glu Asp Gln Glu Asp Glu Lys Asp Arg Glu Asn Glu Gln Gln Gln435 440 445Pro Gln Val Pro Asp Glu Phe Ile Phe Asp Ala Glu Gly Gly Leu Val450 455 460Asp Glu Lys Leu Leu Phe Phe Ala Gln Gln Ala Gln Arg Arg Lys Gly465 470 475 480Lys Ala Gly Arg Ala Lys Lys Val Ile Phe Ser Glu Asp Arg Gly Arg485 490 495Tyr Ile Lys Pro Met Leu Pro Lys Gly Pro Val Lys Arg Leu Ala Val500 505 510Asp Ala Thr Leu Arg Ala Ala Ala Pro Tyr Gln Lys Leu Arg Arg Ala515 520 525Lys Asp Ile Gln Lys Thr Arg Lys Val Tyr Val Glu Lys Thr Asp Met530 535 540Arg Ala Lys Arg Met Ala Arg Lys Ala Gly Ala Leu Val Ile Phe Val545 550 555 560Val Asp Ala Ser Gly Ser Met Ala Leu Asn Arg Met Gln Asn Ala Lys565 570 575Gly Ala Ala Leu Lys Leu Leu Ala Glu Ser Tyr Thr Ser Arg Asp Gln580 585 590Val Cys Ile Ile Pro Phe Arg Gly Asp Ala Ala Glu Val Leu Leu Pro595 600 605Pro Ser Arg Ser Ile Ser Met Ala Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Pro610 615 620Cys Gly Gly Gly Ser Pro Leu Ala His Gly Leu Thr Thr Ala Val Arg625 630 635 640Val Gly Met Asn Ala Glu Lys Ser Gly Asp Val Gly Arg Ile Met Ile645 650 655Val Ala Ile Thr Asp Gly Arg Ala Asn Ile Ser Leu Lys Arg Ser Thr660 665 670Asp Pro Glu Ala Glu Ala Ser Asp Ala Pro Arg Pro Ser Ser Gln Glu675 680 685Leu Lys Asp Glu Ile Leu Glu Val Ala Gly Lys Ile Tyr Lys Thr Gly690 695 700Met Ser Leu Leu Val Ile Asp Thr Glu Asn Lys Phe Val Ser Thr Gly705 710 715 720Phe Ala Lys Glu Ile Ala Arg Val Ala Gln Gly Lys Tyr Tyr Tyr Leu725 730 735Pro Asn Ala Ser Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Thr Lys Asp Ala Leu740 745 750Ser Ala Leu Lys Glu Ser755(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO3的序列描述Val Asp Ala Ser Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO4的序列描述Thr Asp Gly Arg Gly Asn1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1579個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..1579(xi)SEQ ID NO5的序列描述
CCCAAAATTC TTCTTCTTCT TCTTCACTGA AAAATTCTAA ACAAAATGGC TTCACTACTA 60GGAACTTCCT CTTCAGCAGC AGCTGCAATA TTAGCTTCTA CACCCTTGTC TTCTCGCTCC 120TGTAAGCCTG CCGTTTTCTC CCTCTTCCCT TCTTCAGGGC AGAGTCAAGG GAGGAAGTTT 180TATGGAGGGA TTAGAGTCCC AGTTAAGAAA GGGAGGTCCC AATTCCATGT GGCAATTTCA 240AATGTTGCGA CGGAAATCAA CCTGCTCAAG AACAGGGTCA GAAACTTGCT GGAGGAGAGC 300CAGAGACCGG TGTATCCATT TGCAGCTATA GTGGGACAAG ATGAAATGAA GTTATGTCTT 360TTGCTGAATG TAATTGATCC AAAGATTGGA GGTGTGATGA TAATGGGTGA TAGGGGAACC 420GGGAAGTCCA CCACGGTTAG ATCTTTGGTA GATTTACTTC CTGAAATCAA AGTTATTTCT 480GGTGATCCGT TCAATTCAGA TCCAGATGAC CAAGAAGTAA TGAGTGCAGA AGTCCGTGAC 540AAATTGAGGA GCGGACAGCA GCTTCCTATA TCTCGTACGA AAATCAACAT GGTTGATTTA 600CCGCTTGGTG CTACTGAGGA CAGGGTGTGT GGCACAATCG ACATTGAGAA AGCTCTTACT 660GAGGGTGTGA AGGCTTTCGA GCCTGGTCTT CTTGCTAAAG CTAACAGAGG AATACTTTAC 720GTCGATGAGG TTAATCTTTT GGACGACCAT TTAGTAGATG TTCTTTTGGA TTCTGCAGCA 780TCGGGATGGA ACACTGTTGA AAGAGAGGGG ATATCAATAT CACACCCTGC CCGGTTTATC 840CTTATTGGTT CGGGTAATCC TGAAGAAGGA GAACTTAGGC CACAACTTCT TGATCGATTT 900GGAATGCATG CCCAAGTGGG GACCGTGAGA GATGCAGAGC TGAGAGTGAA GATAGTTGAG 960GAAAGAGCTC GTTTTGATAA GAACCCCAAG GAATTCAGGG AATCATACAA GGCAGAGCAA 1020GAAAAGCTCC AGAACCAAAT CGACTCAGCT AGGAACGCTC TTTCTGCTGT TACAATCGAT 1080CATGATCTTC GAGTTAAAAT CTCTAAGGTC TGTGCAGAAC TAAACGTCGA TGGATTGAGA 1140GGTGATATAG TCACTAACAG GGCAGCAAGA GCCTTGGCTG CACTAAAAGG AAGAGATAAG 1200GTAACTCCGG AAGATATCGC CACTGTCATT CCCAACTGCT TAAGACACAG GCTGAGGAAG 1260GATCCGTTGG AATCTATTGA CTCGGGTGTA CTTGTTGTTG AGAAATTTTA TGAGGTTTTC 1320GCCTAAGCGT TTTATAGAGT GAGATACTTA TTTTTGGCTT TATTTTCCAT TCATAAATCA 1380TCTAAAGATT TGACAATTGT AACACTAGAC TTTTGCTTAA TTTTGGCTTT GTACTGTGCT 1440TAAGAAATGG GTTCAGAATT ACCTGTAGCC AGTTGTATTT GGTTATGACT GCTTTATTTC 1500TGAAATGCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1560AAAAAAAAAA AAGGAATTC 1579(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4578個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..4578(xi)SEQ ID NO6的序列描述AGCCACTACT CTCCACATAA AACTATAAAC TTAGAACATT TCACTTGAAA AAAGAGAGGA 60AAAAAGTGAA GCAGAAATCT TTTCTCAAAA CACAATCTAT AGGAAGTTAA ATTCAACTTC120CACACTTCCA AGATTCTTGT TTCAAGTTTC GTTTAGTTTT TTTTTCTTGG TTTTTTTTAT180AGTTTTCTGT ACAATTTTGT GTAGAATCAA GAAACGAAAG AGTTAAAGTT TGAAACTTTT240TTACAAGTTT GAAACAATGG CTTCTTTGGT TTCTTCACCA TTTACATTGC CAAATTCAAA300AGTAGAACAC TTGTCATCCA TTTCTCAAAA GCATTACTTT CTTCACTCAT TTCTTCCCAA360GAAAATAAAC CCCACTTACT CAAAATCACC AAAGAAATTC CAATGTAATG CTATTGGCAA420TGGTTTATTC ACTCAAACAA CTCAAGAAGT TAGGAGAATT GTGCCTGAAA ATACTCAGGG490ACTTGCTACT GTGAAAATAG TCTATGTTGT ATTGGAAGCT CAGTACCAAT CATCACTTAC540TGCTGCTGTT CAGACACTGA ACAAGAATGG TCAGTTTGCT TCTTTTGAGG TTGTGGGGTA600CTTGGTTGAG GAGCTTAGAG ATGAGAATAC TTATAAAATG TTTTGTAAAG ATCTTGAGGA660TGCAAATGTG TTTATTGGTT CATTGATTTT TGTGGAAGAA TTGGCTTTAA AGGTAAAATC720TGCAGTGGAG AAAGAAAGGG ACAGACTTGA TGCAGTTTTG GTGTTTCCAT CAATGCCTGA780GGTGATGAGG TTGAACAAGT TGGGATCTTT TAGTATGTCA CAATTGGGGC AATCAAAGAG840TCCATTTTTT GAGCTTTTCA AGAAGAAGAA ACCTTCTTCT GCAGGTTTTT CTGATCAGAT900GTTGAAGCTT GTGAGAACAT TGCCTAAGGT TTTGAAGTAT TTACCAAGTG ATAAAGCTCA960AGATGCTAGG TTGTACATAC TAAGTTTGCA GTTTTGGCTA GGAGGTTCAC CTGATAATTT 1020GGTGAATTTC TTGAAAATGA TTTCTGGTTC TTATGTTCCT GCTCTTAAAG GGATGAAAAT 1080CGACTACTCG GATCCGGTTT TGTACTTGGA TAATGGAATT TGGCACCCTT TGGCTCCTTG 1140TATGTATGAT GATGTGAAGG AGTATTTGAA TTGGTATGCA ACAAGGAGAC ATACTAATGA 1200GAAACTCAAG AGTTCAAATG CTCCTGTTGT TGGGGTGGTT TTGCAAAGGA GTCATATTGT 1260TACTTGTGAT GAGAGTCACT ATGTGGCTGT GATCATGGAA TTGGAGGCAA AGGGGGCTAA 1320AGTTATCCCA ATTTTTGCCG GTGGGCTAGA CTTTTCGAGG CCAATTGAGA GATATTTCAT 1380TGATCCTATT ACAAAGAAGC CTTTTGTGAA TTCAGTAATA TCACTTTCTG GTTTTGCACT 1440TGTTGGAGGG CCAGCAAGAC AAGACCATCC AAGGGCAATA GAGGCTTTGA TGAAACTTGA 1500TGTGCCTTAT ATTGTGGCAT TGCCTTTGGT TTTCCAAACA ACAGAGGAAT GGTTGAACAG 1560TACTTTGGGG CTGCACCCTA TTCAGGTGGC TCTACAAGTT GCTCTCCCTG AGCTGGATGG 1620AGGAATGGAG CCCATCGTAT TCGCCGGTCG CGATCCAAGA ACAGGGAAAT CACATGCTCT 1680TCACAAAAGA GTGGAGCAGC TTTGCACCAG GGCAATCAAA TGGGGAGAGT TAAACAGAAA 1740AACAAAGGCT GAGAAGAGGT TGGCAATCAC TGTCTTCAGC TTTCCTCCAG ACAAAGGCAA 1800TGTCGGAACT GCTGCATACT TGAATGTCTT TGCCTCCATA TACTCTGTTC TCAAAGATCT 1860CAAGAAAGAC GGCTACAACG TTGAGGGGCT GCCTGAGACT TCTGCACAAC TTATTGAAGA 1920AGTAATTCAC GACAAAGAAG CTCAGTTCAG CAGCCCAAAT CTTAACATAG CTTACAAGAT 1980GAATGTTAGA GAATACCAGA ACCTAACCCC CTATGCTACT GCTCTTGAAG AAAACTGGGG 2040GAAAGCACCT GGTAATTTGA ACTCTCATGG AGAAAACCTC TTGGTATATG GTAAACAGTA 2100CGGCAATGTC TTTATCGGTG TTCAGCCCAC GTTTGGATAC GAGGGTGACC CGATGAGACT 2160TCTGTTCTCC AAATCAGCTA GCCCTCACCA TGGTTTTGCT GCATACTATT CCTTTGTGGA 2220GAAAATTTTC AAAGCTGATG CAGTTCTCCA CTTTGGTACT CATGGTTCTC TTGAGTTCAT 2280GCCAGGTAAA CAGGTGGGAA TGAGCGATGC TTCTTTCCCT GATAGTCTCA TTGGAAACAT 2340TCCCAATGTC TATTACTATG CAGCAAACAA CCCATCTGAA GCAACTATTG CCAAACGAAG 2400GAGTTATGCG AATACCATTA GCTACTTGAC TCCTCCGGGT GAGAATGCTG GACTCTACAA 2460GGGACTCAAG CAGCTCAGTG AGCTCATTTC CTCATACCAA TCTCTGAAAC ACTCAGGCCG 2520TGGCCAACAG ATTGTGAACT CTATCATCAG TACAGCTAGA CAGTGTAATC TTGACAAGGA 2580TGTTGATCTT CCAGAAGAAG GGGAGGAAAT CTCGGCCAAA GAGCGTGACC TTGTGGTAGG 2640AAAAGTATAC TCTAAGATTA TGGAGATCGA GTCTCGTCTT CTTCCGTGTG GACTTCACAT2700CATTGGTGAA CCTCCAACCG CGATGGAAGC AGTTGCTACT CTTGTCAATA TTGCGACATT2760GGACCGTCCT GAAGAGGGTA TTTCTGCCCT TCCATCTATA TTGGCTGCGA CGGTTGGAAG2820AAGCATTGAG GAGATTTACA GAGGCAATGA CCAGGGCATC TTACGAGATG TGGAGCTGCT2880CCGTCAAATT ACTGAGGCAT CACGTGGAGC AATATCAGCA TTTGTTGAAC GTACGACAAA2940CAACAAGGGT CAGGTTGTGA ATGTCAATGA CAAGCTAACC TCAATCCTTG GTTTTGGTAT3000AAATGAACCA TGGATCCAGT ATTTGTCAAA CACCCAATTT TACAGAGCTG ATAGGGACAA3060GCTCAGAGTT CTATTCCAGT TCTTGGGAGA GTGTCTGAAG CTAATTGTCG CTAACAACGA3120GGTGGGAAGC TTGAAACAGG CTCTAGAAGG GAAATATGTT GAACCAGGTC CAGGAGGGGA3180TCCGATCAGA AACCCGAAAG TTTTGCCTAC TGGGAAAAAC ATCCATGCTT TGGACCCACA3240AGCTATTCCC ACAATAGCAG CAGTGCAGAG TGCCAAAATT GTTGTTGAAA GATTGTTGGA3300GAGGCAAAAG GCCGACAACG GGGGCAAGTA CCCGGAGACT GTTGCTCTGG TTCTTTGGGG3360AACAGACAAC ATCAAGACCT ATGGAGAGTC ATTGGCACAG GTTATGTGGA TGATTGGTGT3420TAGGCCAGTT ACAGACTCGT TAGGACGGGT TAACCGGGTG GAACCTGTTA GCCTTGAAGA3480GCTTGGAAGG CCTAGAGTTG ATGTTGTTGT CAACTGCTCT GGGGTGTTCA GAGATCTCTT3540CATCAATCAG ATGAATCTCC TTGACCGAGC AGTCAAGATG GTTGCAGAGC TCGACGAGCC3600AGAAGACCAA AACTACGTCA GGAAACATGC ACTAGAACAA GCAAAAACAC TCGGAGTTGA3660TGTTCGTGAA GCTGCTACAA GGATCTTCTC AAATGCTTCA GGATCTTACT CCTCCAACAT3720TAACCTTGCT GTTGAGAATT CAACATGGAA TGATGAGAAG CAACTTCAAG ACATGTACTT3780GAGCCGAAAG TCATTTGCAT TTGACTGTGA TGCCCCTGGT GTTGGCATGA CTGAGAAGAG3840GAAAGTTTTT GAGATGGCTC TTAGCACGGC TGATGCCACA TTCCAGAACC TTGACTCATC3900TGAAATTTCA TTCACAGACG TGAGTCACTA CTTCGATTCA GACCCAACCA ACCTTGTGCA3960AAACCTCAGG AAAGACGGGA AGAAGCCTAG TGCATACATT GCTGACACCA CTACTGCTAA4020TGCTCAGGTA CGTACGTTGT CTGAGACTGT GAGGCTTGAC GCAAGGACAA AGTTGTTGAA4080CCCCAAGTGG TATGAAGGCA TGCTATCCAC TGGCTACGAG GGTGTTCGTG AGATTGAGAA4140ACGATTAACT AACACAGTGG GGTGGAGTGC AACTTCAGGC CAAGTTGATA ATTGGGTGGA4200TGAAGAAGCC AACACAACCT TCATTCAAGA TCAGGACATC TTGAACAGGC TCATGAACAC4260AAATCCAAAT TCTTTCAGGA AGTTGCTTCA GACATTCTTG GAAGCCAACG GGCGTGGATA4320CTGGGAAACT TCTGCAGAGA ACATTGAGAA ACTCAAGCAA TTATACTCAG AAGTTGAAGA4380CAAGATTGAG GGAATCGATC GATAAATGTA TAGCAAAAAG AATGATCTCT GATTATTGCC4440TGTTTGTTCC TAACTGTTTC TGATGTGAAT TCCTTTGACA GTCCCCAGTG TAATTTTGTT4500CATTTTTGGG GATGTCCTAC TTCTATGAGA AAATACTGCT TCCATATATT CAAATTTGAG4560CTTGAAAAAA AAAAAAAAAA(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞蛋白質(zhì)(B)位置1..6(xi)SEQ ID NO7的序列描述Ala Lys Gly Ala Val Met1 權(quán)利要求
1.一種編碼具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)或其活性片段的核酸分子。
2.如權(quán)利要求1中所要求的核酸分子，它包括SEQ ID No.1或其活性片段。
3.如權(quán)利要求1中所要求的核酸分子，它編碼根據(jù)SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)或其活性片段。
4.一種代表至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸的核酸分子，它可與在權(quán)利要求1至3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子特異性雜交。
5.一種編碼選自SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.7中的肽的核酸分子。
6.一種代表如權(quán)利要求1至5中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子的反義或互補(bǔ)序列的核酸分子。
7.在權(quán)利要求1至6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子在擴(kuò)增、分離或鑒定編碼具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段的核酸分子中的應(yīng)用。
8.在權(quán)利要求1至6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子在制備抗體中的應(yīng)用。
9.在權(quán)利要求1至6中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.一種具有植物鎂螯合酶CHLD亞基或其活性片段功能的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地是重組蛋白質(zhì)。
11.在權(quán)利要求10中要求的蛋白質(zhì)，它包括SEQ ID No.2或其活性片段，優(yōu)選地是重組蛋白質(zhì)。
12.在權(quán)利要求10和11中的一條或兩條中所要求的蛋白質(zhì)在測(cè)定鎂螯合酶活性中的應(yīng)用。
13.在權(quán)利要求10和11中的一條或兩條中所要求的蛋白質(zhì)在制備抗體中的應(yīng)用。
14.一種在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)的方法，其中該宿主細(xì)胞用編碼植物鎂螯合酶CHLD亞基或其活性片段的本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化，優(yōu)選地在權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的DNA序列插入到適于宿主細(xì)胞的表達(dá)盒中，形成的表達(dá)盒以適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲竭m于宿主細(xì)胞的載體中，將合適的宿主細(xì)胞用形成的載體轉(zhuǎn)化，由此形成的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的培養(yǎng)基中，將由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生并具有植物鎂螯合酶CHLD亞基功能的蛋白質(zhì)以適當(dāng)?shù)姆绞綇呐囵B(yǎng)液或從宿主細(xì)胞中分離出來(lái)。
15.一種在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有植物鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)的方法，其中該宿主細(xì)胞用編碼植物鎂螯合酶或其活性片段的本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化，優(yōu)選地在權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的DNA序列插入到適于宿主細(xì)胞的表達(dá)盒中，形成的表達(dá)盒以適當(dāng)?shù)姆绞讲迦氲竭m于宿主細(xì)胞的載體中，將合適的宿主細(xì)胞用形成的載體轉(zhuǎn)化，由此形成的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，將由該宿主細(xì)胞產(chǎn)生并具有植物鎂螯合酶功能的蛋白質(zhì)以適當(dāng)?shù)姆绞綇呐囵B(yǎng)液或從宿主細(xì)胞中分離出來(lái)。
16.一種測(cè)定植物鎂螯合酶亞基相互作用的方法，包括用在權(quán)利要求1至3的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的DNA序列以及至少用編碼另一種鎂螯合酶亞基的DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其方式為鎂螯合酶基因產(chǎn)物的相互作用導(dǎo)致直接或間接、定性或定量可測(cè)的信號(hào)，優(yōu)選地是通過(guò)激活標(biāo)志基因。
17.一種測(cè)定植物鎂螯合酶活性的方法，包括將在權(quán)利要求10和11的一項(xiàng)或兩項(xiàng)中所要求的蛋白質(zhì)與編碼鎂螯合酶I和H亞基的DNA序列的基因產(chǎn)物相結(jié)合，其方式為鎂螯合酶基因產(chǎn)物的酶促活性導(dǎo)致直接或間接、定性或定量可測(cè)的信號(hào)。
18.在權(quán)利要求16和17的一項(xiàng)或兩項(xiàng)中所要求的方法在鑒定植物鎂螯合酶的效應(yīng)物中的應(yīng)用。
19.一種鎂螯合酶酶促活性的效應(yīng)物，在權(quán)利要求16至17的一項(xiàng)或兩項(xiàng)中是可鑒定的，優(yōu)選地是鎂螯合酶的抑制劑或激活劑，特別優(yōu)選地是鎂螯合酶的具有除草活性的抑制劑或鎂螯合酶的具有植物檢疫和/或促進(jìn)生長(zhǎng)作用的激活劑。
20.一種控制不需要的營(yíng)養(yǎng)體的方法，包括應(yīng)用一種或多種具有除草活性的鎂螯合酶抑制劑于植物、植物的種子和/或植物所生長(zhǎng)的地區(qū)，該抑制劑在權(quán)利要求16至17的一項(xiàng)或多項(xiàng)中是可鑒定的。
21.一種促進(jìn)有用植物作物生長(zhǎng)的方法，包括應(yīng)用一種或多種作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的鎂螯合酶激活劑于植物、植物的種子和/或植物所生長(zhǎng)的地區(qū)，該激活劑在權(quán)利要求16至17的一項(xiàng)或多項(xiàng)中是可鑒定的。
22.一種保護(hù)有用植物作物免受除草劑毒害植物作用的方法，包括應(yīng)用一種或多種具有植物檢疫作用的鎂螯合酶激活劑于植物、植物的種子和域植物所生長(zhǎng)的地區(qū)，該激活劑在權(quán)利要求16至17的一項(xiàng)或多項(xiàng)中是可鑒定的。
23.在權(quán)利要求19中所要求的效應(yīng)物在作物保護(hù)中的應(yīng)用，其用于控制不需要的營(yíng)養(yǎng)體，促進(jìn)有用植物作物生長(zhǎng)或保護(hù)有用植物作物免受除草劑的毒害植物作用。
24.一種含有啟動(dòng)子的非天然發(fā)生的嵌合基因，該啟動(dòng)子有效地融合到在權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的DNA分子上。
25.一種含有在權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子的載體。
26.一種表達(dá)在權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子的重組宿主細(xì)胞，優(yōu)選地是用在權(quán)利要求25中所要求的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的。
27.一種含有權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物器官、轉(zhuǎn)基因植物種子、轉(zhuǎn)基因繁殖材料。
28.一種通過(guò)權(quán)利要求26的重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物器官、轉(zhuǎn)基因植物種子、轉(zhuǎn)基因繁殖材料的方法。
29.一種產(chǎn)生在權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子的方法，包括通過(guò)已知的產(chǎn)生核酸的方法產(chǎn)生在權(quán)利要求1至6的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼一種具有植物鎂螯合酶CHLD亞基的蛋白質(zhì)或其活性片段的核酸分子;具有植物鎂螯合酶CHLD亞基的蛋白質(zhì)或其活性片段功能,優(yōu)選地是一種重組蛋白質(zhì);一種測(cè)定植物鎂螯合酶亞基的相互作用的方法,其中用在權(quán)利要求1至3的一項(xiàng)或多項(xiàng)中所要求的DNA序列以及至少用編碼另一種鎂螯合酶亞基的DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,其方式為鎂螯合酶基因產(chǎn)物的相互作用可導(dǎo)致直接或間接、定性或定量可測(cè)的信號(hào),優(yōu)選地是通過(guò)激活標(biāo)志基因,以及含有上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物器官、轉(zhuǎn)基因植物種子、轉(zhuǎn)基因繁殖材料。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1253592SQ98804486
公開日2000年5月17日 申請(qǐng)日期1998年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月25日
發(fā)明者B·格里姆, J·帕彭布洛克, F·哈奈爾, S·格拉夫, F·施米特, W·斯特雷伯 申請(qǐng)人:赫徹斯特-舍林農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司