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      由芽孢桿菌獲得的新β-葡聚糖酶的制作方法

      文檔序號(hào):452853閱讀:593來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:由芽孢桿菌獲得的新β-葡聚糖酶的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種酶,它能夠?qū)⒔惶娴匾?,3-和1,4-β-葡糖苷鍵連接的混合葡聚糖水解裂解成低聚糖,以及涉及形成該酶的微生物。
      這種酶屬于內(nèi)切-1,3-1,4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶類(lèi)(EC3.2.1.73;地衣酶)或者內(nèi)切-1,3-β-D-葡糖苷酶類(lèi)(EC 3.2.1.39;昆布多糖酶)。在本發(fā)明中,這里這樣的酶被稱作β-葡聚糖酶或者Beta-葡聚糖酶。
      實(shí)際上在存在的所有谷物產(chǎn)品中或多或少地包括上述種類(lèi)的聚合混合葡聚糖。尤其在食品工業(yè)、飲料工業(yè)和飼料工業(yè)、紡織工業(yè)和淀粉加工業(yè)中需要能夠裂解它們的酶(R.Borriss,“裂解β-葡聚糖的酶”(“β-Glucan-spaltende Enzyme”)H.Ruttloff的《工業(yè)用酶》(“IndustrielleEnzyme”),第11.5章,Behr’s Verlag,Hamburg,1994)。β-葡聚糖酶的主要應(yīng)用之一是在飲料工業(yè)和釀造工業(yè)中使用,這里這種酶用于分解麥芽-和大麥芽-β-葡聚糖。正如例如德國(guó)專利DD 226 012 A1中描述的,對(duì)此使用的酶通常由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生,或者由解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生,雖然由其它的微生物,例如半月形無(wú)色桿菌、藤黃節(jié)桿菌、棘孢曲霉、黑色曲霉、Disporotrichum dimorphosporum、Humicola insolens、Penicillium emersonii、繩狀青霉或Trichoderma reesei獲得的β-葡聚糖酶也是已知的。商業(yè)上例如以商標(biāo)Cereflo(制造商N(yùn)ovo NordiskA/S)購(gòu)得的產(chǎn)品可以在釀造業(yè)中使用。
      迄今為止已知的β-葡聚糖酶具有在弱酸至中性范圍內(nèi)的最佳pH值,這樣其被限制為只能在該pH值下進(jìn)行的方法中應(yīng)用。申請(qǐng)人的目的是,擴(kuò)大β-葡聚糖酶的應(yīng)用范圍,開(kāi)發(fā)出這樣的β-葡聚糖酶,其在堿性環(huán)境中進(jìn)行的工業(yè)方法中應(yīng)用時(shí),在該條件下具有足夠的穩(wěn)定性。
      本發(fā)明的內(nèi)容是由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的酶,其具有開(kāi)頭提及的葡聚糖分解活性,產(chǎn)生β-葡聚糖酶的微生物嗜堿芽孢桿菌DSM 9956和編碼來(lái)自嗜堿芽孢桿菌DSM 9956的β-葡聚糖酶的基因,其是在完成本發(fā)明的過(guò)程中被鑒定和測(cè)序(SEQ ID-NO.2)的,也屬于本發(fā)明的范圍。如果需要,該基因可以原則上已知的方式克隆在其它細(xì)菌中,并且在這里表達(dá)β-葡聚糖酶。因此,本發(fā)明的又一內(nèi)容是通過(guò)基本上微生物的方法獲得包括上述基因的宿主生物。從來(lái)自嗜堿芽孢桿菌的β-葡聚糖酶-基因的序列推導(dǎo)出的由該微生物獲得的本發(fā)明β-葡聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID-NO1)描述在附

      圖1的字母密碼中。來(lái)自嗜堿芽孢桿菌DSM9956的包括信號(hào)肽在內(nèi)的β-葡聚糖酶由308個(gè)氨基酸組成,其中信號(hào)肽在通過(guò)微生物的細(xì)胞壁之后通過(guò)信號(hào)肽酶被分裂掉,并且在與現(xiàn)有技術(shù)中已知的數(shù)據(jù)[M.E.Louw,S.J.Reid,Watson,《微生物生物技術(shù)的應(yīng)用》(Appl.Microbiol.Biotech.)39(1993),507-513]相比之后被推測(cè)包括31個(gè)氨基酸。相應(yīng)的微生物是革蘭氏陽(yáng)性的,其細(xì)胞形狀為桿狀(寬約O.7至0.9微米,長(zhǎng)約2.5至4.0微米);它被申請(qǐng)人于1995年4月13日保藏在DSM-德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏有限公司,Mascheroder Weg1b,38124 Braunschweig,保藏號(hào)是DSM 9956。
      優(yōu)選本發(fā)明β-葡聚糖酶與來(lái)自嗜堿芽孢桿菌DSM 9956的β-葡聚糖酶具有超過(guò)70%,特別是75至99%的同源性。這也適用于其基礎(chǔ)基因。
      本發(fā)明酶優(yōu)選的應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè),特別是飲料和釀造工業(yè),并且特別是在清潔這些工業(yè)部門(mén)的膜和其它設(shè)備時(shí)除去葡聚糖和/或地衣淀粉(Lichenan)。
      本發(fā)明的又一內(nèi)容是在清潔食品工業(yè),特別是釀造工業(yè)的膜和其它設(shè)備時(shí)使用本發(fā)明β-葡聚糖酶除去葡聚糖和/或地衣淀粉的方法。
      實(shí)施例實(shí)施例1用Sau3A部分消化來(lái)自嗜堿芽孢桿菌C/M2-3的染色體DNA,并且用凝膠電泳分離3至8kb大的片段的部分。在連接入質(zhì)粒pMK4的BamH1-位之后(所述質(zhì)粒為大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體[M.A.Sullivan等《基因》(Gene)29(1984),21-26]),它被轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α-細(xì)胞中。具有β-葡聚糖酶活性的重組克隆通過(guò)在具有0.2%地衣淀粉(pH8.5)的LB-板上用剛果紅染色來(lái)鑒定。
      從大腸桿菌DH5α-pmK4中的克隆的細(xì)胞上清液中提純出β-葡聚糖酶。在無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)20mM磷酸鈉緩沖溶液(pH7.5)透析之后,將透析液加至Q-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)上,并用0至1MNaCl(在25mM的磷酸鈉緩沖液中)(pH7.5或pH9.0)線性洗脫。
      葡聚糖分解活性的測(cè)定是以改進(jìn)的M.Lever在《生物化學(xué)分析》(Anal.Biochem.)47(1972),273-279和《生物化學(xué)分析》(Anal.Biochem.)81(1977),21-27中描述的方法為基礎(chǔ)的。為此使用β-葡聚糖(Sigma No.G6513)于50mM甘氨酸緩沖液(pH9.0)中的0.5重量%的溶液。將250微升該溶液加入250微升包含待試驗(yàn)葡聚糖分解活性試劑的溶液中,在40℃下溫育30分鐘。隨后,加入1.5毫升包含1mM硝酸鉍和1mM酒石酸鉀鈉的、對(duì)羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)于0.5M氫氧化鈉中的1重量%溶液,并在70℃下加熱該溶液10分鐘。在冷卻(2分鐘0℃)之后,在室溫下,使用葡萄糖-校準(zhǔn)曲線與空白值相對(duì)比測(cè)定在410納米下的吸收(例如使用光度計(jì)Uvikon930)。空白值涉及這樣一種溶液,它如測(cè)量溶液一樣制備,不同的是僅在加入PAHBAH溶液之后加入葡聚糖溶液。1U相當(dāng)于在這些條件下產(chǎn)生1μmol葡萄糖/分鐘的酶量。
      這樣獲得的酶的比活性為4390mU/mg蛋白質(zhì),而起始溶液具有更低約152倍的活性。該酶在SDS-聚丙烯酰胺-凝膠電泳中被染色成均勻的帶(銀染色)。
      借助于標(biāo)志蛋白質(zhì)(細(xì)胞色素c、馬肌紅蛋白、胰凝乳蛋白酶原、卵白蛋白、牛血清白蛋白)作為內(nèi)標(biāo),通過(guò)SDS聚丙烯酰胺-凝膠電泳估計(jì)由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的β-葡聚糖酶的分子量約是30000。
      在等電聚焦(pH3至9)中,借助于活性染色測(cè)定β-葡聚糖酶的等電點(diǎn)為pH5.2。
      實(shí)施例2pH曲線在40℃下,在Davies-通用緩沖液(21.01克檸檬酸·H2O、13.61克KH2PO4、19.07克Na2B4O7·10H2O、12.11克三羥甲基氨基甲烷(Tris)和7.46克KCl于1升蒸餾水中;使用0.4N氫氧化鈉將50毫升該原液調(diào)節(jié)至所需pH并用蒸餾水補(bǔ)足至200毫升)中溫育30分鐘之后測(cè)定不同pH值下的葡聚糖分解活性。從附圖2中描述的pH曲線(相對(duì)葡聚糖分解活性(相對(duì)A)與pH值的關(guān)系圖)清楚地看出,在pH6至pH10.5的范圍中酶的活性最高。在pH9下為最佳值。
      實(shí)施例3溫度曲線在甘氨酸/氫氧化鈉中,在pH9下,通過(guò)溫育15分鐘之久來(lái)測(cè)定由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的β-葡聚糖酶的葡聚糖分解活性與溫度的關(guān)系。調(diào)節(jié)試液的pH值,因?yàn)樵摼彌_液與溫度的關(guān)系是約pH0.033/℃。由附圖3已知,葡聚糖分解活性的最大值在60℃,其中附圖3是根據(jù)溫度(T)變化描繪的酶的相對(duì)葡聚糖分解活性(相對(duì)A)。
      序列記錄一般信息申請(qǐng)人姓名Cognis Gesellschaft fuer Biotechnologie mbH街道Henkelstrasse 67,Gebaeude Y20地點(diǎn)杜塞爾多夫州名北萊茵-威斯特法倫州郵編40589電話0211-7976763傳真0211-7987607發(fā)明名稱由芽孢桿菌獲得的新β-葡聚糖酶序列的數(shù)目2通信地址收信人Cognis Gesellschaft fuer Biotechnologie mbH街道Henkelstrasse 67,Gebaeude Y20地點(diǎn)杜塞爾多夫州名北萊茵-威斯特法倫州郵編40589計(jì)算機(jī)可讀文本數(shù)據(jù)載體磁盤(pán)計(jì)算機(jī)IBM PC-kompatibel操作系統(tǒng)MS-WINDOWS軟件MS WORD97對(duì)SEQ ID-NO1的說(shuō)明序列特征長(zhǎng)度308個(gè)氨基酸種類(lèi)氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知分子種類(lèi)蛋白質(zhì)假設(shè)的無(wú)序列描述SEQ ID-NO1Met Lys Arg Lys Thr Phe Val Leu Phe Ser Leu Phe Thr Leu Leu Ile1 5 10 15Gly Met Phe Ser Thr Gly Phe Ala Asn Thr Gly Val Val Gln Ala Glu20 25 30Asp Gly Arg Pro Met Gly Ser Thr Phe His Glu Thr Phe Asp Thr Phe35 40 45Asn Thr Asp Arg Trp Ser Thr Ala Gly Val Trp Thr Asn Gly Ala Met50 55 60Phe Asn Ala Thr Trp Tyr Pro Glu Gln Val Thr Ile Ser Asp Gly Lys65 70 75 80Met Lys Leu Gln Ile Asp Lys Glu Asp Asp Glu Asp Ala Thr Pro Glu85 90 95Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Arg Thr Asn Gln Phe Tyr Gln Tyr Gly Leu100 105 110Phe Glu Val Asn Met Lys Pro Ala Lys Ser Thr Gly Thr Val Ser Ser115 120 125Leu Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Trp Asp Trp Asp Asn Asp Pro Trp Asp130 135 140Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Arg Val Gln Phe145 150 155 160Asn Tyr Phe Thr Asn Gly Val Gly Asn Asn Glu His Tyr His Glu Leu165 170 175Gly Phe Asp Ala Ser Glu Ser Phe Asn Thr Tyr Ala Phe Glu Trp Arg180 185 190Pro Glu Ser Ile Ser Trp Tyr Val Asn Gly Glu Leu Val Tyr Thr Ala195 200 205Thr Glu Asn Ile Pro Gln Thr Pro Gln Lys Ile Met Met Asn Leu Trp210 215 220Pro Gly Ile Gly Val Asp Gly Trp Thr Gly Val Phe Asp Gly Glu Asp225 230 235 240Thr Pro Val Val Thr Glu Tyr Asp Trp Val Arg Tyr Thr Pro Leu Glu245 250 255Glu Leu Asp Asn Asn Gly Glu Gln Pro Lys Pro Val Val Pro Gly Lys260 265 270Pro Glu Lys Pro Gly Lys Pro Gly Lys Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn275 280 285Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Glu Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ile Arg290 295 300Lys Thr Ser Ser305 308對(duì)SEQ ID-NO2的說(shuō)明序列特征長(zhǎng)度927個(gè)堿基對(duì)種類(lèi)核酸鏈形狀雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子種類(lèi)染色體組-DNA假設(shè)的無(wú)反義無(wú)最初來(lái)源菌株嗜堿芽孢桿菌DSM 9956序列描述SEQ ID-NO2ATG AAA AGG AAG ACA TTT GTA TTA TTT TCT TTA TTT ACG TTG TTA45ATT GGT ATG TTC TCA ACA GGG TTT GCA AAT ACA GGT GTG GTT CAG90GCA GAA GAT GGG AGA CCA ATG GGG TCG ACG TTT CAT GAA ACG TTT135GAT ACC TTT AAT ACG GAC CGC TGG TCA ACA GCT GGG GTA TGG ACA180AAT GGA GCA ATG TTT AAT GCG ACA TGG TAT CCA GAA CAG GTG ACC225ATT TCA GAT GGG AAA ATG AAG TTG CAA ATT GAC AAG GAA GAT GAT270GAA GAT GCA ACC CCA GAA TAT AAG GCT GGG GAA TTA AGA ACG AAT315CAG TTT TAT CAA TAC GGG TTG TTT GAA GTC AAT ATG AAG CCA GCG360AAA TCA ACA GGA ACC GTC TCT TCA CTC TTT ACA TAT ACG GGT CCA405TGG GAT TGG GAT AAT GAT CCT TGG GAT GAA ATC GAT ATT GAG TTC450CTT GGA AAG GAT ACA ACA AGA GTC CAA TTT AAC TAT TTT ACT AAC495GGA GTA GGA AAC AAT GAA CAT TAC CAC GAA TTA GGG TTC GAT GCA540TCA GAA TCT TTT AAT ACG TAT GCT TTT GAA TGG AGA CCA GAA TCA585ATT AGT TGG TAC GTA AAC GGA GAA TTA GTA TAT ACA GCA ACA GAA630AAT ATC CCG CAA ACA CCA CAA AAA ATT ATG ATG AAC TTA TGG CCT675GGA ATT GGA GTG GAT GGA TGG ACA GGC GTT TTT GAC GGA GAA GAC720ACT CCA GTT GTA ACG GAG TAT GAT TGG GTA AGG TAC ACT CCA CTA765GAG GAA TTA GAT AAT AAC GGA GAA CAA CCG AAA CCT GTA GTG CCA810GGA AAA CCA GAA AAA CCA GGA AAA CCA GGG AAA AAC CAG AAA AAC855CAG GAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC CAG GAA AAC CAG AAA AAC900CAA AAA ATC AGA AAA ACC AGT AGT TGA 92權(quán)利要求
      1.產(chǎn)生β-葡聚糖酶的嗜堿芽孢桿菌DSM 9956。
      2.由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的酶,其具有β-葡聚糖分解活性。
      3.權(quán)利要求2的酶,其特征在于,它具有附圖1中描述的氨基酸序列或者其與具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有高于70%的同源性。
      4.權(quán)利要求3的酶,其特征在于,其與具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有75%至99%的同源性。
      5.基因,其用于編碼權(quán)利要求2至4之任一項(xiàng)的酶。
      6.權(quán)利要求5的基因,其特征在于,其具有在SEQ ID-NO2中描述的序列,或與該序列的同源性高于70%。
      7.權(quán)利要求6的基因,其特征在于,其與在SEQ ID-NO2中描述的序列具有75%至99%的同源性。
      8.基本上通過(guò)微生物方法獲得的宿主生物,其包含權(quán)利要求5至7之任一項(xiàng)的基因。
      9.由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的具有β-葡聚糖分解活性的酶的用途,其用于在清潔食品工業(yè),特別是釀造工業(yè)的膜和設(shè)備時(shí)除去葡聚糖和/或地衣淀粉。
      10.權(quán)利要求9的用途,其特征在于,酶具有附圖1中描述的氨基酸序列或者其與具有在SEQ ID-NO1中描述的氨基酸序列的酶具有高于70%,特別是75%至99%的同源性。
      11.在清潔食品工業(yè),特別是釀造工業(yè)的膜和設(shè)備時(shí)除去葡聚糖和/或地衣淀粉的方法,其特征在于,使用由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的具有β-葡聚糖分解活性的酶。
      全文摘要
      本發(fā)明的目的是擴(kuò)大通常在弱酸至中性環(huán)境中使用的β-葡聚糖酶的應(yīng)用范圍,以便在堿性環(huán)境中進(jìn)行的工業(yè)方法中使用時(shí),它們?cè)谶@樣的環(huán)境下也具有足夠的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明使用由嗜堿芽孢桿菌DSM 9956獲得的具有葡聚糖分解活性的酶。
      文檔編號(hào)C12N1/20GK1265703SQ98807684
      公開(kāi)日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月30日
      發(fā)明者W·希倫, K-H·莫勒 申請(qǐng)人:亨克爾兩合股份公司
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