專利名稱：同源重組中的正負(fù)篩選的制作方法
發(fā)明描述本發(fā)明涉及一種通過同源重組將外源DNA引入目標(biāo)細(xì)胞的基因組的方法，以及用于同源重組的適當(dāng)?shù)腄NA構(gòu)建體。
通過同源重組用于將外源DNA引入真核細(xì)胞的方法已知(如WO-90/11354，WO91/09955)。在此方法中，用含有至少一種，優(yōu)選為兩種DNA序列的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染起始細(xì)胞，其中DNA序列部分與待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組之區(qū)域同源，構(gòu)建體中還含有正選擇標(biāo)記基因和任選地負(fù)選擇標(biāo)記基因。此外，如果意在活化一種在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中通常為沉默的基因，DNA構(gòu)建體可含有異源表達(dá)控制序列。在存在正選擇標(biāo)記基因篩選的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該基因一經(jīng)表達(dá)即導(dǎo)致一種可篩選的表型。
為了區(qū)分發(fā)生同源重組的細(xì)胞和其中載體僅隨機(jī)整合入宿主細(xì)胞基因組中的細(xì)胞，通常進(jìn)行第二個篩選步驟。為此使用負(fù)選擇標(biāo)記基因，如HSV胸苷激酶基因(HSV-TK)，其中存在篩選劑如9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤時，該基因一旦表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞破壞。同源重組中，細(xì)胞喪失了HSV胸苷激酶基因，使得細(xì)胞可耐受9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤。靶向載體通過隨機(jī)非同源性重組整合入基因組中的細(xì)胞，不喪失HSV-TK基因，因此對9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤敏感。優(yōu)選用這類通過HSV-TK/9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤篩選的細(xì)胞，其含有非功能性胸苷激酶基因(如獲自O(shè)gden Bioservices公司，Rockville MD，美國的CEMtk-，Cat.No.491).
然而，用于同源重組的其他宿主細(xì)胞具有其自身的胸苷激酶基因。但此細(xì)胞胸苷激酶基因在負(fù)篩選中引起背景問題。因此。例如同源重組的克隆可在篩選中喪失。對于編碼這樣一種基因產(chǎn)物的其它負(fù)選擇標(biāo)記基因而言也有類似的問題，所述基因產(chǎn)物的表達(dá)必須在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行相反的篩選。
已知使用定位于細(xì)胞表面的多肽作為陽性轉(zhuǎn)染標(biāo)記。如WO95/06723描述了使用特地刪除了細(xì)胞表面受體基因的一種標(biāo)記細(xì)胞的方法。
為了避免先前使用的負(fù)選擇標(biāo)記基因出現(xiàn)的問題，根據(jù)本發(fā)明使用一種負(fù)選擇標(biāo)記基因，其編碼一種定位于細(xì)胞表面上的多肽。
因此，本發(fā)明涉及一種通過同源重組將外源DNA引入宿主細(xì)胞中的方法，其中宿主細(xì)胞已用一種含有兩個側(cè)翼核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)染，所述側(cè)翼核苷酸序列與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源，側(cè)翼核苷酸序列內(nèi)側(cè)存在編碼正選擇標(biāo)記的核苷酸序列，以及側(cè)翼序列外側(cè)有編碼負(fù)選擇標(biāo)記的核苷酸序列，編碼正選擇及負(fù)選擇標(biāo)記的各個核苷酸與在宿主細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列有效連接，其中至少一種編碼定位于細(xì)胞表面的多肽的核苷酸序列用做負(fù)選擇標(biāo)記基因，使得DNA構(gòu)建體通過同源重組整合入細(xì)胞基因組后，負(fù)選擇標(biāo)記基因不表達(dá)；載體隨機(jī)整合入細(xì)胞基因組后負(fù)選擇標(biāo)記基因表達(dá)，其產(chǎn)物出現(xiàn)在細(xì)胞表面。
因此，根據(jù)本發(fā)明在載體中使用編碼定位于表面的多肽之負(fù)選擇標(biāo)記基因，用于在適當(dāng)位點(diǎn)同源重組，以避免使用對細(xì)胞有毒性的負(fù)篩選劑的負(fù)篩選方法。優(yōu)選使用編碼通常不在宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽的負(fù)選擇標(biāo)記基因。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，不存在用TK篩選描述的毒性或背景信號的問題。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點(diǎn)是為檢測目標(biāo)基因表達(dá)所必須檢查的轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)大大減少。
宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，特別優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，最優(yōu)選人細(xì)胞。
為了鑒定并分離已發(fā)生同源重組的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行一個篩選正選擇標(biāo)記基因存在的步驟，以及進(jìn)行進(jìn)一步的篩選負(fù)選擇標(biāo)記基因的篩選步驟。
可用傳統(tǒng)方法進(jìn)行正選擇標(biāo)記基因存在的篩選步驟?？捎萌魏芜x擇標(biāo)記基因作為正選擇標(biāo)記基因，特別是那些適于真核細(xì)胞的其表達(dá)導(dǎo)致可選擇表型的基因，如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型。優(yōu)選使用抗生素抗性基因，如新霉素、卡那霉素、遺傳霉素或潮霉素抗性基因。優(yōu)選的正選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
用于根據(jù)本發(fā)明方法的負(fù)選擇標(biāo)記基因編碼一種呈現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面，優(yōu)選為膜基多肽的基因產(chǎn)物。優(yōu)選的這種膜基多肽為LNGF、CD24、LDL或trk受體，或含有各個受體之配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的膜基受體片段。合適的受體片段中胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域已被全部或部分刪除，或被修飾，使得呈現(xiàn)在表面的受體不能引起信號傳導(dǎo)，見WO 95/06723所述。特別優(yōu)選的這樣的受體片段的例子是LNGF受體缺失突變體(dLNGFR)，其是神經(jīng)生長因子人低親和力受體的片段，其胞內(nèi)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域均已缺失(WO95/06723)。
利用dLNGFR負(fù)選擇的同源重組原理示意于

圖1。此選擇原理當(dāng)然可應(yīng)用于編碼表面結(jié)合多肽的其它選擇標(biāo)記基因。使用一種質(zhì)粒作為重組載體，其含有與目標(biāo)靶序列同源的兩個側(cè)翼核酸片段(HR1、HR2)，片段之間為正選擇標(biāo)記基因新霉素抗性基因(NeoR)。將編碼dLNGFR的核苷酸序列安排在質(zhì)粒上，兩個側(cè)翼同源核苷酸序列之外。
當(dāng)在靶基因(HR)區(qū)域中發(fā)生同源重組，HR1、NeoR和HR2被整合入基因組。然而，編碼dLNGFR的序列不被整合入基因組。相反，當(dāng)質(zhì)粒隨機(jī)整合入宿主細(xì)胞基因組后，dLNGFR基因仍保留為一種可表達(dá)的形式。
根據(jù)本發(fā)明，篩選轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中不存在負(fù)選擇標(biāo)記基因優(yōu)選包括如下步驟(a)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與可結(jié)合負(fù)選擇標(biāo)記基因之基因產(chǎn)物的結(jié)合分子接觸，(b)分離含有結(jié)合的結(jié)合分子的細(xì)胞。
用做結(jié)合分子的物質(zhì)可特異性地，且優(yōu)選以高親和力與負(fù)選擇標(biāo)記結(jié)合。優(yōu)選使用不干擾宿主細(xì)胞其它表面組分交叉反應(yīng)性的那些結(jié)合分子。結(jié)合分子的例子有抗體，如多克隆或單克隆抗體；抗體片段等，其直接針對負(fù)選擇標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物。對dLNGFR的合適抗體例如為從WO 95/06723已知的那些。當(dāng)使用一種受體作為負(fù)選擇標(biāo)記，顯然可使用受體的天然結(jié)合伴侶，如受體的配體或其類似物，作為結(jié)合分子。這種受體配體的例子為NGF，其是LNGFR的配體。
為了便于經(jīng)負(fù)選擇標(biāo)記所標(biāo)記的細(xì)胞的分離，可使用這樣的結(jié)合分子，其能偶聯(lián)于固相載體，且此偶聯(lián)可通過吸附、共價結(jié)合或通過高親和力結(jié)合配對(如抗生蛋白鏈菌素/生物素)實(shí)現(xiàn)。通常，固相載體的類型對根據(jù)本發(fā)明的方法并不關(guān)鍵，優(yōu)選地，使用可使呈現(xiàn)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞容易地與未標(biāo)記的細(xì)胞分離的那些固相載體。因此，固相載體可以如層析柱的形式存在，但特別優(yōu)選可特別簡便地分離的顆?；滔噍d體如微珠，特別是磁性微珠。
或者，轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可與游離結(jié)合分子接觸。在此情況中，游離結(jié)合分子優(yōu)選地攜帶一種標(biāo)記和/或一種固相載體結(jié)合基團(tuán)。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記和/或固相載體結(jié)合基團(tuán)的例子有生物素、生物素衍生物，如亞氨基生物素、氨基生物素或脫硫生物素；半抗原，如地高辛、熒光素；酶，如過氧化物酶或堿性磷酸酶；或染料，如熒光染料如熒光素、藻紅蛋白、羅丹明、多甲藻黃素(peridinine)-葉綠素蛋白質(zhì)、德克薩斯紅或其衍生物。
如果使用攜帶固相載體結(jié)合基團(tuán)的結(jié)合分子，如生物素、生物素衍生物或半抗原，用結(jié)合分子標(biāo)記的細(xì)胞可以與這種固相載體偶聯(lián)，該固相載體可與結(jié)合分子的固相載體結(jié)合基團(tuán)反應(yīng)。如果使用帶有生物素基團(tuán)的結(jié)合分子，則可鑒定例如表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞，并通過與抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素包被的固相載體結(jié)合，從未標(biāo)記的細(xì)胞中分離標(biāo)記的細(xì)胞。
如果使用帶有酶標(biāo)記基團(tuán)的結(jié)合分子，可在加入酶底物后通過酶催化的顏色反應(yīng)鑒定表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞，以及任選地從未標(biāo)記細(xì)胞中分離?？赏ㄟ^例如將細(xì)胞置于載玻片上且隨后用顯微鏡分析進(jìn)行這樣的鑒定。
如果使用帶有熒光染料的結(jié)合分子，可通過流式細(xì)胞分析鑒定表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞，并從未標(biāo)記細(xì)胞中分離。此種分離方法快速簡便，且可在可設(shè)定熒光窗口和細(xì)胞分選的傳統(tǒng)FACS儀器中進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個方面是適于在根據(jù)本發(fā)明的方法中用做轉(zhuǎn)染載體的重組載體。此載體包含(a)與細(xì)胞中的目標(biāo)序列同源的兩個側(cè)翼核苷酸序列，
(b)編碼受在細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列控制的正選擇標(biāo)記之核苷酸序列，其位于根據(jù)(a)的兩個側(cè)翼序列內(nèi)側(cè)，(c)編碼受在細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列控制的負(fù)選擇標(biāo)記之核苷酸序列，其位于側(cè)翼同源核苷酸序列外側(cè)，其表達(dá)產(chǎn)物是一種位于細(xì)胞表面的多肽。
如果意在使用重組載體活化宿主細(xì)胞的內(nèi)源基因，其含有在宿主細(xì)胞中有活性的額外的異源表達(dá)控制序列，該序列位于兩個側(cè)翼同源核苷酸序列之間。此表達(dá)控制序列含有啟動子，優(yōu)選的還含有增強(qiáng)表達(dá)序列，如增強(qiáng)子。啟動子可為可調(diào)節(jié)型或組成型啟動子。啟動子優(yōu)選為一種強(qiáng)病毒啟動子，如SV40或CMV啟動子。特別優(yōu)選CMV啟動子/增強(qiáng)子。
如果期望在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中擴(kuò)增目標(biāo)基因，重組載體含有位于兩個側(cè)翼序列之間的擴(kuò)增基因。適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增基因的例子為二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、鳥嘌呤脫羧酶等。一種特別優(yōu)選的擴(kuò)增基因是二氫葉酸還原酶基因，特別是編碼二氫葉酸還原酶精氨酸突變體的基因，該突變體對篩選劑(氨甲蝶呤)的敏感度低于野生型多肽(Simonsen等人，美國國家科學(xué)院院報，80(1983)，2495)。
如上所述，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的核苷酸序列可優(yōu)選地選自膜基受體或含有相應(yīng)受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的膜基受體片段。
與目標(biāo)序列同源的側(cè)翼核苷酸序列可選自待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組之任何染色體區(qū)域，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)選地為真核細(xì)胞，特別優(yōu)選的為哺乳動物細(xì)胞，最優(yōu)選為人細(xì)胞。在人細(xì)胞的情況下，側(cè)翼同源核苷酸序列優(yōu)選地衍生自人細(xì)胞因子基因的區(qū)域，如EPO、tPA、G-CSF、GM-CSF、TPO、白細(xì)胞介素、干擾素、生長因子、胰島素、胰島素樣生長因子等。
側(cè)翼同源核苷酸序列可包括目標(biāo)基因或其片段的編碼區(qū)域。在此部分其可被篩選，使得同源重組時與細(xì)胞中存在的內(nèi)源序列相比，其在成熟目標(biāo)多肽的編碼區(qū)域中引起突變。此突變包括個別氨基酸或全部氨基酸部分的替代、刪除和插入。
本發(fā)明的另一方面是膜基表面受體作為負(fù)選擇標(biāo)記在同源重組方法中的用途。
本發(fā)明還通過如下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說明。
圖1.顯示根據(jù)本發(fā)明通過dLNGFR利用負(fù)選擇的同源重組原理示意圖。
圖2.顯示質(zhì)粒pSV-dLNGFR的限制性酶切圖。
圖3a和b.顯示表達(dá)dLNGFR和不表達(dá)dLNGFR的細(xì)胞之FACS分析結(jié)果。
圖4.顯示質(zhì)粒p187-dLNGFR的限制性酶切圖。
圖5.顯示dLNGFR陰性和陽性細(xì)胞之間差異的FACS分析結(jié)果。
實(shí)施例方法重組DNA技術(shù)如Sambrook，J.等人，分子克隆實(shí)驗室手冊，冷泉港出版社，冷泉港，紐約。根據(jù)制造商說明使用分子生物學(xué)試劑。人細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)和克隆使用以1μg/μl濃度溶于雙蒸水的載體。為了確保高轉(zhuǎn)染效率，在先前已確定優(yōu)化的條件下(960μF/260 MV/18-22μS)借助電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞(BioRad，GenepulserTM)。以107個細(xì)胞/0.8ml濃度使用貼壁生長的人纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080(ATCC CCL 121)作為適當(dāng)?shù)募?xì)胞系。為重構(gòu)細(xì)胞膜，在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于冰上約10分鐘。
將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種入T-175培養(yǎng)瓶中，于37℃下7％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后通過加入G418(0.8μg/ml)進(jìn)行篩選。
培養(yǎng)14天后，在培養(yǎng)皿中出現(xiàn)抗性菌落。生長出較大菌落斑后，用PBS洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化并以單細(xì)胞懸液染色。FACS分析使用105個細(xì)胞/制品在冰上進(jìn)行染色步驟。來自小鼠的抗dLNGFR抗體用做初級抗體，其通過加入來自山羊(a-mIgG-FITC，1∶25，Caltag)的次級抗體檢測。單獨(dú)用次級抗體染色的細(xì)胞作為非特異性結(jié)合的對照。通過加入碘丙錠(10μg/ml)檢測死亡細(xì)胞。根據(jù)制造商說明在FACS-Vantage(Becton Dickinson Co.)上進(jìn)行分析。在FL-1通道記錄表達(dá)dLNGFR的細(xì)胞之特異性熒光，在FL-3通道記錄死亡細(xì)胞。實(shí)施例1dLNGFR表達(dá)構(gòu)建體的制備借助PCR方法擴(kuò)增含有965bp的dLNGFR基因(WO-95/06723，Boehringer Mannheim GmbH)。所用引物在兩端引入EcoRI和SalI位點(diǎn)。擴(kuò)增后，用這兩種酶切割PCR片段。
也用EcoRI和SalI酶切割含有早期SV40啟動子和SV40polyA-信號的載體pSV1(Okayama和Berg，分子細(xì)胞生物學(xué)3(1983)，280_289；Muligan和Berg，美國國家科學(xué)院院報78(1981)，2072_2076)。
分離的載體具有3490bp大小。將dLNGFR片段連接入載體pSV1。dLNGFR基因在早期SV40啟動子和SV40聚(poly)信號的表達(dá)控制之下。整個表達(dá)盒含有1900bp。所得載體pSV-DLNGFR示于圖2。實(shí)施例2表達(dá)盒功能性測試如上述用質(zhì)粒pSV-DLNGFR瞬時轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞系的細(xì)胞。生長兩天后，借助單克隆抗dLNGFR抗體分析細(xì)胞的dLNGFR表達(dá)。結(jié)果示于圖3，顯示可通過FACS分析，區(qū)分表達(dá)dLNGFR的細(xì)胞與不表達(dá)dLNGFR的細(xì)胞。也顯示抗dLNGFR抗體的反應(yīng)特異于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)施例3克隆dLNGFR表達(dá)盒入基因靶向載體使用限制性酶Not I和Pvu II從pSV-DLNGFR分離dLNGFR表達(dá)盒。用NotI和EcoRV酶切人EPO基因的靶向載體‘p187’(述于EP97 112 649.5和EP 97 112 640.5，見圖4b)。分離14551bp的較大載體片段，與dLNGFR表達(dá)盒連接(圖4)。將所得質(zhì)?！鋚187-DLNGFR′轉(zhuǎn)染入大腸桿菌，并在其中增殖。實(shí)施例4在FACS掃描中負(fù)選擇的測試用p187-DLNGFR轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞，選擇穩(wěn)定的整合，即轉(zhuǎn)染后24小時將G418加入培養(yǎng)基。在生長約3周后，即在合并的細(xì)胞第一次形成轉(zhuǎn)化灶后進(jìn)行首次FACS分析。如圖5所示，在這種情況下，占細(xì)胞群落14％的dLNGFR陰性細(xì)胞通過FACS分析，可在此時從表達(dá)dLNGFR的細(xì)胞中區(qū)分出來。
除了極其罕見的同源重組事件發(fā)生外，此細(xì)胞群落還含有其表面受體密度過低因而不被檢測系統(tǒng)識別的細(xì)胞。然而，通過此方法，大大降低了必須經(jīng)過隨后測試目標(biāo)基因表達(dá)之克隆的數(shù)目(此種情況中為14％)。
如果在一個轉(zhuǎn)染制品中不存在含有同源重組靶向載體的克隆，則與傳統(tǒng)篩選相比，這種情況可用大大減少的工作鑒定出。通過與抗dLNGFR抗體100％反應(yīng)的群落的出現(xiàn)證實(shí)不存在同源重組的克隆。在這種情況下，不必進(jìn)行進(jìn)一步關(guān)于目標(biāo)基因表達(dá)的篩選。
權(quán)利要求
1.一種通過同源重組將異源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，其中宿主細(xì)胞用含有兩個側(cè)翼核苷酸序列的重組載體轉(zhuǎn)染，所述側(cè)翼核苷酸序列與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源，且編碼正選擇標(biāo)記的核苷酸位于兩個側(cè)翼核苷酸序列內(nèi)側(cè)，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的核苷酸序列位于兩個側(cè)翼序列外側(cè)，選擇標(biāo)記基因與在宿主細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列有效連接，其中使用至少一種編碼位于細(xì)胞表面多肽的核苷酸序列作為負(fù)選擇標(biāo)記，使得在載體通過同源重組整合入細(xì)胞基因組后負(fù)選擇基因不表達(dá)，在載體通過隨機(jī)整合入細(xì)胞基因組后負(fù)選擇基因表達(dá)，且其基因產(chǎn)物出現(xiàn)在細(xì)胞表面。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中進(jìn)行篩選存在正選擇標(biāo)記基因的步驟，還進(jìn)行篩選不存在負(fù)選擇標(biāo)記基因的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，其中篩選不存在負(fù)選擇標(biāo)記基因的步驟包括如下步驟(a)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與可與負(fù)選擇標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物結(jié)合的結(jié)合分子接觸，且(b)分離含有結(jié)合的結(jié)合分子的細(xì)胞。
4.前述任一權(quán)利要求的方法，其中使用一種負(fù)選擇標(biāo)記基因，其編碼LNGF、CD24、LDL、trk受體或膜基受體或含有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的膜基受體片段。
5.權(quán)利要求3-4中任一項的方法，其中使用針對負(fù)選擇標(biāo)記基因的基因產(chǎn)物的抗體作為結(jié)合分子。
6.權(quán)利要求3-4中任一項的方法，其中使用負(fù)選擇標(biāo)記的天然結(jié)合伴侶或其類似物作為結(jié)合分子。
7.權(quán)利要求3-6中任一項的方法，其中使用偶聯(lián)于一種固相載體的結(jié)合分子。
8.權(quán)利要求7方法，其中使用磁性微珠作為固相載體。
9.權(quán)利要求3-8中任一項的方法，其中使用攜帶標(biāo)記和/或固相載體結(jié)合基團(tuán)的結(jié)合分子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中標(biāo)記和/或固相載體結(jié)合基團(tuán)選自生物素、生物素衍生物、半抗原、酶和染料。
11.權(quán)利要求10的方法，其中使用選自亞氨基生物素、氨基生物素和脫硫生物素的生物素或生物素衍生物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中使用堿性磷酸酶或過氧化物酶作為酶。
13.權(quán)利要求10的方法，其中使用熒光染料作為染料。
14.權(quán)利要求13的方法，其中使用熒光素、藻紅蛋白、羅丹明、多甲藻黃素-葉綠素蛋白質(zhì)或德克薩斯紅作為熒光染料。
15.權(quán)利要求11的方法，其中通過結(jié)合于抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素包被的固相載體鑒定表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
16權(quán)利要求12的方法，其中通過酶催化顏色反應(yīng)鑒定表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
17.權(quán)利要求13或14中任一項的方法，其中通過流式細(xì)胞分析鑒定表達(dá)負(fù)選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
18.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞，優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，特別優(yōu)選人細(xì)胞。
19.一種重組載體，其包含(a)與細(xì)胞中目標(biāo)基因同源的兩個側(cè)翼核苷酸序列，(b)一種受在細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列控制的編碼正選擇標(biāo)記的核苷酸序列，其位于根據(jù)(a)的兩個側(cè)翼序列內(nèi)側(cè)，及(c)一種受在細(xì)胞中有活性的表達(dá)控制序列控制的編碼負(fù)選擇標(biāo)記的核苷酸序列，其位于側(cè)翼同源核苷酸序列外側(cè)，且其表達(dá)產(chǎn)物是位于細(xì)胞表面的多肽。
20.權(quán)利要求19的載體，其中側(cè)翼同源核苷酸序列選自EPO、tPA、G-CSF、GM-CSF、TPO、白細(xì)胞介素、干擾素、生長因子、胰島素或胰島素樣生長因子。
21.權(quán)利要求19或20的載體，其中編碼正選擇標(biāo)記的核苷酸序列是新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、遺傳霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。
22.權(quán)利要求19-21中任一項的載體，其中編碼負(fù)選擇標(biāo)記的核苷酸序列是編碼LNGF、CD24、LDL、trk受體或膜基受體或含有其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的膜基受體片段的序列。
23.權(quán)利要求19-22中任一項的載體，其中在側(cè)翼序列內(nèi)側(cè)還含有一種異源表達(dá)控制序列。
24.權(quán)利要求23的載體，其中表達(dá)控制序列含有CMV啟動子。
25.權(quán)利要求19-24中任一項的載體，其中在側(cè)翼序列內(nèi)側(cè)還含有一種擴(kuò)增基因。
26.權(quán)利要求19-25中任一項的載體，其中側(cè)翼同源核苷酸序列含有目標(biāo)基因或其部分的編碼區(qū)域。
27.權(quán)利要求26的載體，其中選擇側(cè)翼同源核苷酸序列，使得在同源重組中發(fā)生成熟目標(biāo)多肽編碼區(qū)域內(nèi)的突變。
28.權(quán)利要求19-27中任一項的載體在同源重組方法中的用途。
29.膜基表面受體作為負(fù)選擇標(biāo)記在同源重組方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過同源重組向目標(biāo)細(xì)胞基因組中導(dǎo)入異源DNA的方法。本發(fā)明還涉及適于同源重組的DNA構(gòu)建體。
文檔編號C12N15/09GK1276836SQ98810394
公開日2000年12月13日 申請日期1998年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月20日
發(fā)明者J·奧爾, R·斯賓杰, K·霍諾德 申請人:羅切診斷學(xué)有限公司