專利名稱：高產(chǎn)率生產(chǎn)博安霉素的發(fā)酵法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)率生產(chǎn)博安霉素的方法。
博安霉素為一已知抗生素，屬于博萊霉素(Bleomycin,BLM)族，即博萊霉素A6(Bleomycin A6)，其具有下式所示的結(jié)構(gòu) 博萊霉素族的抗生素多數(shù)都具有抗腫瘤活性，首先在臨床上應(yīng)用的是博萊霉素(A2+B2為主)，主要用于治療鱗狀上皮癌，但其突出的缺點是肺毒性大，能夠?qū)е虏豢赡娴姆卫w維化。隨后相繼用于臨床的有匹萊霉素(Pepleomycin,PEP)和平陽霉素(BLM A5)，但其品種還不多，就其活性和毒性來說，臨床上仍然缺乏對某些腫瘤具有特異性抑制作用且毒副作用小，尤其肺毒性小的優(yōu)良品種。臨床研究證明博安霉素具有良好的抗腫瘤作用，對頭頸部癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、食道癌都有較好的療效，尤其對肝癌也有滿意的療效，而且肺毒性極低，也沒有發(fā)現(xiàn)其對心肝腎的毒性，臨床應(yīng)用前景很好。由于博萊霉素族抗生素具有十分相似的結(jié)構(gòu)，在微生物發(fā)酵中，多種博萊霉素族抗生素往往同時產(chǎn)生，博安霉素在其中所占的比例不高。許鴻章等(藥學(xué)學(xué)報，V23(9):667-671,1988)報道了經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var.)72所產(chǎn)生的一系列博萊霉素族抗生素，其中博安霉素按重量計僅占博萊霉素族抗生素總量的約10％。為了降低生產(chǎn)成本，獲得更高的博安霉素產(chǎn)率，迫切需要一種高產(chǎn)率地生產(chǎn)博安霉素的方法。
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)率地生產(chǎn)博安霉素的方法。
為此，發(fā)明人通過深入研究，發(fā)現(xiàn)了一種高產(chǎn)率生產(chǎn)博安霉素的方法，該方法包括向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入博安霉素的末端胺體，然后發(fā)酵培養(yǎng)能夠產(chǎn)生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的微生物，并從培養(yǎng)液中回收博安霉素。該方法的發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量比例按重量計占博萊霉素族抗生素總量的20-70％。
所有能夠產(chǎn)生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌的微生物都在本發(fā)明之列。用于本發(fā)明的較好的微生物是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomycesverticillus var.pingyangensis n.var.)，其中優(yōu)選的菌株是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)72，輪枝鏈霉菌平陽變種Q835。輪枝鏈霉菌平陽變種72為已知菌株，有關(guān)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理特性、碳源利用和抗菌譜等已有文獻(xiàn)記載(趙儀英等，微生物學(xué)報，19(4):361364,1979)。
用于培養(yǎng)上述微生物的培養(yǎng)基中，可采用能夠被其利用的營養(yǎng)源即碳源、氮源、無機(jī)鹽、有機(jī)鹽和能被其利用的痕量營養(yǎng)物，這些成分可予先一次性地加入培養(yǎng)基中，或者間歇或連續(xù)地加入培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)方式可采用靜態(tài)培養(yǎng)、搖蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)或其它方式，但對大量生產(chǎn)來說，優(yōu)選的方式為浸沒培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件(時間、溫度、pH等)隨菌種不同而異，也隨培養(yǎng)基成分的變化有所不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)具體情況選擇。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入的末端胺體是指精胺鹽(如精胺鹽酸鹽，精胺硫酸鹽)或其粗品，或者含精胺鹽的物質(zhì)(這些物質(zhì)可以是植物來源的，如玉米漿，所采用的玉米漿可以是經(jīng)各種方法處理提高了精胺鹽含量的玉米漿)。末端胺體的加入量為每1000升培養(yǎng)基加0.1-1千克(按精胺鹽酸鹽計)，優(yōu)選的加入量為每1000升培養(yǎng)基加0.4-0.6千克(按精胺鹽酸鹽計)。
當(dāng)博安霉素在培養(yǎng)基中積累達(dá)到最大濃度時終止培養(yǎng)，根據(jù)其性質(zhì)采用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行分離純化。博安霉素可以游離的形式得到分離，也可以藥學(xué)上可接受的鹽的形式(如鹽酸鹽、硫酸鹽或有機(jī)酸鹽，尤其是鹽酸鹽的形式)得到分離，如果需要，可以用常規(guī)方法將博安霉素的鹽形式轉(zhuǎn)化成游離形式。
任何能夠從培養(yǎng)物中分離純化博安霉素的方法均在本發(fā)明之列。一般可使用吸附、洗脫、柱層析、冷干等方法，這些方法在每一分離步驟中可以單獨使用，也可以結(jié)合使用，在整個分離過程中還可以重復(fù)使用。
吸附方法包括以活性炭吸附，大孔樹脂吸附或離子交換樹脂吸附等。大孔吸附樹脂可以是非極性大孔吸附樹脂，也可以是中等極性的大孔吸附樹脂，還可以是高極性的大孔吸附樹脂。離子交換樹脂可采用弱酸性陽離子交換樹脂或強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
洗脫方法包括用酸性溶液洗脫、不同濃度的中性鹽溶液洗脫、單一溶劑洗脫、混合溶劑洗脫或溶劑與無機(jī)鹽的混合溶劑洗脫等。
柱層析包括吸附柱層析、離子交換柱層析、離子排斥柱層析、親合柱層析、分子排阻柱層析和反相柱層析等。
下列實施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的方法。
實施例1以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基的投料體積為1000L，加入0.6千克精胺鹽酸鹽。其培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的70％。
發(fā)酵培養(yǎng)液800升用草酸調(diào)pH至3.0，再用5NNaOH調(diào)pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型)13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01 N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0 N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱進(jìn)行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到10.5克藍(lán)色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例2以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基投料體積為1000L，加入0.4千克精胺鹽酸鹽。其培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的60％。
將發(fā)酵培養(yǎng)液用草酸調(diào)pH至3.0，再用5NNaOH調(diào)pH至6.5，過濾。將800升濾液通過離子交換樹脂D151(H+型)柱(柱床10升)，用無鹽水沖洗，再用0.3N HCl洗脫，收集活性部份，調(diào)PH至6.5，將其通過大孔吸附樹脂4006柱脫鹽(柱床10升)。用10％丙酮(含0.01NHCl)洗脫樹脂柱。收集活性部份，減壓濃縮至小體積，濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，上CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)。用無鹽水沖洗后用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并。經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱脫鹽后，冷凍干燥。得10克博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例3以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及1 80～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基的投料體積為1000L，加入玉米漿20千克。培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，在培養(yǎng)過程中，每隔8小時添加一次玉米漿，添加量為20千克，共添加14次(與投料時所加入的玉米漿的總合為300千克，相當(dāng)于加入0.15千克精胺鹽酸鹽)，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的20％。
發(fā)酵培養(yǎng)液800升用草酸調(diào)pH至3.0，再用5N NaOH調(diào)pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122H+20升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱進(jìn)行脫鹽操作后，濃縮，冷凍干燥。得到3.1克藍(lán)色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例4以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基投料體積為1000L，加入0.4千克精胺硫酸鹽。其培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的50％。
將發(fā)酵培養(yǎng)液用草酸調(diào)pH至3.0，再用5NNaOH調(diào)pH至6.5，過濾。將800升濾液通過離子交換樹脂D151(H+型)柱(柱床10升)，用無鹽水沖洗，再用0.3N HCl洗脫，收集活性部份，調(diào)PH至6.5，將其通過大孔吸附樹脂4006柱脫鹽(柱床10升)。用10％丙酮(含0.01NHCl)洗脫樹脂柱。收集活性部份，減壓濃縮至小體積，濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，進(jìn)行CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱層析(柱床2.5升)。用無鹽水沖洗后用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并。經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱脫鹽后，冷凍干燥。得9.1克藍(lán)色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例5-8發(fā)酵條件和提取方法同實施例1，只是采用其它菌株，所加入的末端胺體有所不同，如下表
實施例9(對照實施例)以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、 NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種72菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基的投料體積為1000L。其培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的10.1％。
發(fā)酵培養(yǎng)液800升用草酸調(diào)pH至3.0，再用5N NaOH調(diào)pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型) 13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01 N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0 N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱進(jìn)行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到1.6克藍(lán)色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
實施例10(對照實施例)以葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、淀粉1.0％、NaCl0.5％和瓊脂2.0％(pH7.2-7.5)為斜面培養(yǎng)基，120℃下滅菌30分鐘，制成斜面，置于37℃恒溫室中3天至表面水分稍干，無雜菌生長時，接種輪枝鏈霉菌平陽變種Q835菌種孢子，于28℃培養(yǎng)8天。在多個500ml錐形瓶中分別裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、豆餅粉3.5％、KH2PO40.1％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、pH6.0-6.5)。于120℃滅菌30分鐘后，進(jìn)行接種，28℃振蕩培養(yǎng)48小時，將該培養(yǎng)物作為種子。準(zhǔn)備500L發(fā)酵罐，投料體積200L，培養(yǎng)基組成與種子培養(yǎng)基相同，120℃滅菌30分鐘，接種量為0.5％，在1∶1通氣量，29℃，以及180～200轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種至2噸發(fā)酵罐，培養(yǎng)基的投料體積為1000L。其培養(yǎng)基組成為淀粉2.5％、葡萄糖0.5％、玉米粉2.0％、豆餅粉3.2％、玉米漿3.0％、NaCl0.5％、KH2PO40.015％、ZnSO40.05％、CuSO40.01％、玉米油0.3％、pH6.0-6.5，在130℃-150℃連續(xù)滅菌后接種，接種量為15-20％。在罐溫29℃，通氣量1∶1至1∶1.5，攪拌速度145轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)7天，至pH7.5以上，效價達(dá)到高峰時終止培養(yǎng)。經(jīng)高效液相色譜檢測(色譜柱YWG C1810μ3.9×300mm；流動相A甲醇，B 5mM己烷磺酸鈉加0.5％冰醋酸，用濃氨水調(diào)pH至4.3,A∶B=32∶68；流速1ml/min)，發(fā)酵培養(yǎng)液中博安霉素的含量按重量計占博萊霉素族抗生素總量的9.8％。
發(fā)酵培養(yǎng)液800升用草酸調(diào)pH至3.0，再用5N NaOH調(diào)pH至6.5。加入陽離子交換樹脂122(H+型)13升，攪拌3小時。收集樹脂，用無鹽水沖洗后將樹脂裝入柱中用0.3N HCl洗脫，收集活性部份。用5N氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，將活性溶液通過大孔吸附樹脂4006柱(柱床10升)脫鹽，用10％丙酮(含0.01N HCl)洗脫。收集活性部份，減壓濃縮。濃縮液用氨水調(diào)pH至6.5，將其通過CM-Sephadex-C-25(NH4+型)柱(柱床2.5升)，先用0.05N的NH4Cl沖洗后，再用0.1-1.0N NH4Cl梯度洗脫，洗脫液總體積約相當(dāng)于柱體積的15倍。按峰位收集，合并，經(jīng)大孔吸附樹脂4006柱進(jìn)行脫鹽操作后，冷凍干燥。得到1.5克藍(lán)色博安霉素鹽酸鹽(含銅品)。
權(quán)利要求
1．一種高產(chǎn)率生產(chǎn)博安霉素(博萊霉素A6)的方法，該方法包括向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入博安霉素的末端胺體，然后發(fā)酵培養(yǎng)能夠產(chǎn)生博安霉素的屬于輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的微生物，并從培養(yǎng)液中回收所說的博安霉素。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomvces verticillus var.pingyangensis n.var)。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌平陽變種是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)72。
4．按照權(quán)利要求2的方法，其中所說的輪枝鏈霉菌平陽變種是輪枝鏈霉菌平陽變種(Streptomyces verticillus var.pingyangensis n.var)Q835。
5．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的末端胺體是精胺鹽。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所說的精胺鹽是精胺鹽酸鹽或精胺硫酸鹽。
7．按照權(quán)利要求5或6的方法，其中所說的精胺鹽是精胺鹽的粗品。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的末端胺體是含精胺鹽的物質(zhì)。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所說的含精胺鹽的物質(zhì)是玉米漿。
10．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的末端胺體的加入量為每1000升培養(yǎng)基加0.1-1千克(按精胺鹽酸鹽計)。
11．按照權(quán)利要求10的方法，其中所說的末端胺體的加入量為每1000升培養(yǎng)基加0.4-0.6千克(按精胺鹽酸鹽計)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)率生產(chǎn)博安霉素(博萊霉素A6)的方法,該方法包括向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入博安霉素的末端胺體,然后發(fā)酵培養(yǎng)能夠產(chǎn)生博安霉素的輪枝鏈霉菌(Streptomyces verticillus),并從培養(yǎng)液中回收博安霉素。與現(xiàn)有方法相比,該方法的發(fā)酵產(chǎn)物中博安霉素的含量比例可提高2－7倍。
文檔編號C12P19/58GK1303949SQ9911105
公開日2001年7月18日 申請日期1999年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者許鴻章, 張瑞, 戴敦華, 陳汝賢, 石蓮英, 魯敏, 王麗菲 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所