專利名稱：人膽固醇酯合成酶－1基因啟動子7的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因表達(dá)調(diào)控，具體涉及人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7。
人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7即人?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1基因啟動子7(以下簡稱人ACAT-1基因P7啟動子)調(diào)控該基因的表達(dá)。人ACAT-2由不同的基因編碼，在此不作進(jìn)一步討論。
膽固醇酯合成酶催化膽固醇和長鏈酯酰輔酶A形成膽固醇酯，膽固醇酯合成酶即酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(Acyl-coenzyme Acholesterolacyltransferase，簡稱ACAT，EC2.3.16)。它是一種胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的酶，廣泛存在于人和其它生物的各種組織、細(xì)胞中。ACAT在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。包括貯存細(xì)胞內(nèi)膽固醇，減少膽固醇對細(xì)胞膜的潛在毒性，肝臟脂蛋白的裝配，膽固醇的吸收以及甾醇的合成等。ACAT在發(fā)育分化過程中的作用機(jī)理還知之甚少。以大鼠為材料觀察到胚胎鼠肝細(xì)胞中ACAT的活性極低，新生鼠肝細(xì)胞中ACAT活性很快升高。表明ACAT是個體生長發(fā)育所必須的(Smith JL，et al.1995，J.Lipid.Res，36641-52)。在單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞過程中，ACAT的表達(dá)也明顯升高，表明ACAT在細(xì)胞分化過程中起重要作用。敲除酵母細(xì)胞的ARE基因(與ACAT基因高度同源)，酵母的有絲分裂不能進(jìn)行，表明ACAT是正常細(xì)胞周期所必須的。
在病理條件下，體內(nèi)ACAT表達(dá)過高或過低都會引起病變，如動脈粥樣硬化癥和智力低下。由ACAT合成的膽固醇酯的聚集是動脈粥樣硬化病灶中泡沫細(xì)胞形成的主要標(biāo)志。如果能特異地抑制巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞及動脈壁細(xì)胞的ACAT活性，將能直接有效的阻斷動脈動脈粥樣硬化癥的發(fā)生。
因此，篩選ACAT的特異的抑制劑成為一些制藥公司競相研究的熱點。目前通過建立的幾種體外、體內(nèi)測活方法篩選到大量ACAT的抑制劑，這些抑制劑作用機(jī)理是1.增加細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ACAT可利用的膽固醇剝脫；2.有些抑制劑是膽固醇或單鏈不飽和脂肪酸的類似物，可競爭抑制ACAT與其天然底物的結(jié)合；3.直接抑制動脈壁細(xì)胞中ACAT的活性。但這些抑制劑的特異性較差，毒副作用較大，而且，由于天然形式的ACAT蛋白還沒有純化成功，因此尋找ACAT特異有效的抑制劑還很困難。
1993年美國Dartmouth醫(yī)學(xué)院的T.Y.Chang實驗室利用ACAT缺陷的CHO細(xì)胞突變株AC29首次克隆了人ACAT-1基因的cDNA(Chang CCY，HubHY，Cadigan KM，Chang TY，1993，J.Biol.Chem，26820747-55)。在克隆過程中，將人成纖維細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染AC29細(xì)胞，經(jīng)過兩代穩(wěn)定遺傳，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ACAT活性的轉(zhuǎn)化株。利用人特異的Alu重復(fù)序列為探針，從其基因組DNA中篩選到一個1.2kb的人基因組DNA片段ACAT G2。再以此探針從制備人cDNA庫篩選到全長的人ACAT-1基因cDNA，命名為ACATcDNA K1。人ACAT cDNA K1長4011bp，包含有一個1.65kb的開放閱讀框架(編碼550個氨基酸)、1396bp長的5’-UTR和965bp長的3’UTR。人ACAT cDNA K1的片段在昆蟲細(xì)胞(不含內(nèi)源性ACAT活性)得到高表達(dá)，表明ACAT cDNA K1能編碼ACAT蛋白。迄今為止，兔(Pape ME，et al.1995，J.Lipid.Res，36823-38)、小鼠(Uelmen PT，et al.，1995，J.Biol.Chem，27026192-201)、CHO細(xì)胞(Cao G，et al.，1996，J.Biol.Chem，27114642-48)的ACAT基因cDNA已被克隆，酵母的兩種形式的膽固醇酯化基因(Yang H，et al.，1996，Science，2721353-56)及ACAT-2基因cDNA也被克隆，但至今尚未有哺乳類基因組DNA克隆的報道。
由于啟動子在基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，而人ACAT-1基因的啟動子尚未報道。
為此，本發(fā)明的目的是提供人膽固醇酯合成酶-1啟動子7，即人酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1啟動子7(以下簡稱人ACAT-1基因P7啟動子)。首先通過PCR方法篩選得到含有人ACAT-1基因組DNA片段的克隆，然后亞克隆、序列測定和轉(zhuǎn)錄活性分析鑒定了人ACAT-1基因P7啟動子。該啟動子可以作為藥物作用的靶，從而為治療膽固醇相關(guān)疾病(包括動脈粥樣硬化癥)提供一種可能的途徑。
本發(fā)明提供人ACAT-1基因P7啟動子。首先通過PCR方法篩選得到了含有人ACAT-1基因組DNA片段的P1噬菌體質(zhì)粒陽性克隆，將包含人ACAT-1基因P7啟動子的基因組DNA片段亞克隆至轉(zhuǎn)移載體中，測定并分析人ACAT-1基因P7啟動子的序列，構(gòu)建了含有人ACAT-1基因P7啟動子的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞瞬時表達(dá)，進(jìn)行啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析，確定了該啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點。本發(fā)明使可能通過作用于該啟動子，在特定時期、特定組織里能改變ACAT的表達(dá)水平，為治療膽固醇相關(guān)疾病(如動脈粥樣硬化癥等)提供另一可能的途徑；另外，也可利用人ACAT-1基因P7啟動子在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白。
本發(fā)明得到了1個P1噬菌體質(zhì)粒陽性克隆，它含有人ACAT-1基因P7啟動子和外顯子Xa。用人ACAT-1基因外顯子Xa特異的引物，通過PCR方法篩選人基因組DNA的P1文庫，得到了一個陽性克隆P1 4651。經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜、亞克隆和DNA序列測定等分析，發(fā)現(xiàn)它含與ACATcDNA K1的3～1279bp相對應(yīng)的序列，但不含有與ACAT cDNA K1 1280～4011bp對應(yīng)的基因組DNA片段，后者所對應(yīng)的相關(guān)基因組DNA序列克隆參考專利《人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子1》。經(jīng)深入研究分析，所獲得的實驗證據(jù)表明人ACAT-1基因至少有兩個啟動子人ACAT-1基因P1啟動子和人ACAT-1基因P7啟動子。
本發(fā)明構(gòu)建了一系列含人ACAT-1基因P7啟動子的重組質(zhì)粒并測定、分析了人ACAT-1基因P7啟動子的序列。根據(jù)P1 4651的限制性內(nèi)切酶圖譜，將人ACAT-1基因外顯子Xa的上游序列克隆入載體pBluscript SK(+/-)中，并測定外顯子Xa上游612bp的DNA序列。分析表明這段序列中有兩個CCAAT Box；一個反向的TFIID結(jié)合位點特征序列；一個Sp1結(jié)合位點，一個Ap2結(jié)合位點和一段Insulin增強(qiáng)子序列。表明這段序列是典型的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)。
本發(fā)明將人ACAT-1基因外顯子Xa的上游序列分不同長度接在報告基因上游，構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明通過將上述真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，分析了人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄活性和主要轉(zhuǎn)錄活性所在區(qū)段。
本發(fā)明確定了人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點。應(yīng)用引物延伸方法，發(fā)現(xiàn)人ACAT-1基因P7啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點G(圖5)。
綜上，本發(fā)明優(yōu)點如下首次得到并鑒定了含人ACAT-1基因外顯子Xa的基因組DNA的P1噬菌體質(zhì)粒陽性克??；確定了這個陽性克隆的限制性內(nèi)切酶圖譜；確定了該陽性克隆所包含的基因組DNA與ACAT cDNA K1的對應(yīng)關(guān)系；亞克隆含人ACAT-1基因外顯子Xa的基因組DNA片段并進(jìn)行DNA序列測定；將不同長度的人ACAT-1基因P7啟動子區(qū)插入報告基因上游構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒；把這些表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，瞬時表達(dá)，分析了人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；利用引物延伸方法確定了人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點。本發(fā)明無論對基礎(chǔ)理論研究還是對膽固醇相關(guān)疾病(包括動脈粥樣硬化癥)的診斷與治療及藥物篩選都具有重要意義；并可利用本發(fā)明在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白。


圖1.人ACAT-1基因P7啟動子序列。-612～-1bp的序列命名為序列1圖2.P1 4651克隆的限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖3.人ACAT-1外顯子Xa和其旁側(cè)序列的亞克隆。
圖4.真核表達(dá)質(zhì)粒和人ACAT-1基因P7啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析。將人ACAT-1外顯子Xa的上游旁側(cè)序列(-612～+163bp)分不同長度接入熒光素酶報告基因載體pGL2-E上游，用lipofecTAMINE方法轉(zhuǎn)染AC29細(xì)胞，測定相對熒光素酶活性。
圖5.確定人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點。*表示轉(zhuǎn)錄起始位點。
本發(fā)明通過以下實施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1人ACAT-1基因組DNA的克隆、鑒定為獲得含有人ACAT cDNA K1序列的1～1289bp的基因組DNA片段，設(shè)計合成一對引物，引物序列如下引物15’-GCACGGGTTAAGATCT-3’引物25’-GATAACCCACTGGAAG-3’引物1對應(yīng)于人ACAT cDNA K1的982-997位核苷酸，引物2對應(yīng)于人ACAT cDNA K1的1181～1196位核苷酸。將這對引物送往GenomicSystems，Inc.(St.Louis，MO)，利用PCR方法篩選人基因組DNA的P1文庫，得到一個陽性克隆P1 4651。
選用多種限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行單獨和組合酶切，1％瓊脂糖電泳，EB(溴化乙錠)染色，通過與標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA(購自GIBCO BRL)比較來確定酶切產(chǎn)物的大小。大于4kb的片段經(jīng)亞克隆后重新酶切以進(jìn)一步確定其長度。最后獲得P1 4651中插入人基因組DNA的物理圖譜(見圖2)。合適的限制性酶切片段被亞克隆到pBluescript載體(Stratagene公司)中以備測序。以P1克隆或/和亞克隆片段為模板，得到DNA序列。測序方法按dsDNAcycle sequencing system kit(購自GIBCO BRL)。
詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，P1 4651克隆中所插入的人基因組DNA包含了ACATcDNA K1的5’端外顯子及其上游序列近60kb和下游序列約23kb(圖2)。
實例2.含人ACAT-1基因P7啟動子的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析根據(jù)P1 4651中插入人基因組DNA的物理圖譜，分離1.9kb的SacI-SacI片段、1.7kb的SacI-SacI片段和0.9kb的SacI-XhoI片段(這3個片段包含了人ACAT-1基因5’外顯子Xa及其上游2.5kb和下游0.7kb的序列，圖3)。將這些片段分別克隆入pBluescript SK(+/-)中，得到三個亞克隆pSK+D0，pSK+D1，pSK-D2(圖3)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行酶譜和亞克隆分析，得到如圖3所示的一系列亞克隆。
以這些亞克隆為模板測序，方法按dsDNA cycle sequencing system kit(購自GIBCO BRL)。結(jié)果表明，P1 4651克隆包含對應(yīng)于ACAT cDNA K1的3～1279bp的核苷酸序列，即ACAT cDNA K1 5′端1279bp序列片段為一個外顯子，命名為外顯子Xa。同時測定了其上游的612bp序列。在此所測定的片段序列中，集中了一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的特征序列這段序列中雖然沒有典型的TATA Box位點，但在-160bp和-575bp有兩個CCAAT Box；-5bp處有一個反向的TFIID結(jié)合位點特征序列；-29bp處一個Sp1結(jié)合位點，-135bp處是Ap2結(jié)合位點，-475bp處是Insulin增強(qiáng)子序列。說明這段序列是典型的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)，將其命名為人ACAT-1基因P7啟動子，以區(qū)別于人ACAT-1基因P1啟動子。
實施例3.含人ACAT-1基因P7啟動子的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為確定人ACAT-1基因P7啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，利用高靈敏的熒光素酶報告基因載體pGL-E2，將人ACAT-1基因外顯子Xa上游序列分不同長度接在報告基因上游，構(gòu)建了一系列真核表達(dá)質(zhì)粒，參圖4。
實施例4.細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和人ACAT-1基因P7啟動子活性分析AC29細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)(K.M.Cadigan，J.G.Heider and T.Y.Chang，J.Biol.Chem.1988，263274-282)，在F12培養(yǎng)基(含10％FBS，10μg/mlstreptomycin，10u/ml penicillin)中，培養(yǎng)條件為濕度95％，5％CO2，37℃。
轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種到直徑為35mm的六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為100,000-300,000，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞豐度達(dá)30-80％。分別將pGL2-0.78-E(+)、pGL2-0.55-E、pGL2-A5-E、pGL2-0.66-E、pGL2-A6-E、pGL2-0.5-E、陽性對照質(zhì)粒pGL2-C(含SV40啟動子)和陰性對照質(zhì)粒pGL2-E(不含啟動子)以lipofectAMINE(GIBCO BRL)方法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞突變株25-RA進(jìn)行瞬時表達(dá)研究。轉(zhuǎn)染方法如下2μg樣品DNA加1μg內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒pCH110在200μl無血清F12培養(yǎng)基中，用5μl lipofectAMINE在室溫包裝45分鐘；此時細(xì)胞用PBS洗兩次。包裝好的DNA-脂質(zhì)體混合物用無血清F12培養(yǎng)基稀釋到1ml，37℃轉(zhuǎn)染細(xì)胞5小時，然后換含10％FBS的F12培養(yǎng)基，44小時后收集細(xì)胞。
收集細(xì)胞測定luciferase活力，方法參照Promega公司的產(chǎn)品說明書。根據(jù)luciferase活性判斷其上游啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而共表達(dá)的β-半乳糖苷酶活性作為內(nèi)標(biāo)，用以校正因細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境(細(xì)胞密度、細(xì)胞微分布、培養(yǎng)瓶內(nèi)壁等)不同而造成的轉(zhuǎn)染效率差異。相對熒光素酶活力的計算公式為
其中
測定時以熒光素酶基因上游不帶啟動子的pGL2-E作陰性對照，帶SV40啟動子的pGL2-C為陽性對照。同一批樣品之間的β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)染效率(β-半乳糖苷酶活力O.D.420/對應(yīng)的蛋白量)的波動應(yīng)小于15％，每一實驗作3份平行樣品。CHO細(xì)胞突變株AC29，其內(nèi)源性ACAT活性不到野生型的1％，但能高表達(dá)外源的人ACAT-1基因。實驗結(jié)果(圖4)表明人ACAT-1基因外顯子Xa的上游612bp序列具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性，將其命名為人ACAT-1基因P7啟動子；當(dāng)插入片段的5’端從-612bp處縮短至-402bp時，其轉(zhuǎn)錄活性略有提高；當(dāng)將3’端-65bp～+163bp的片段缺失掉時，轉(zhuǎn)錄活性均明顯增加，pGL2-A6-E轉(zhuǎn)化子表達(dá)的熒光素酶活性是pGL2-0.78-E(+)轉(zhuǎn)化子的將近兩倍。這些結(jié)果說明，上游-402bp～-65bp區(qū)段是ACAT遠(yuǎn)端啟動子的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，在本實驗系統(tǒng)中，其轉(zhuǎn)錄活性約為SV40啟動子的三分之一。
類似方法轉(zhuǎn)染人A293細(xì)胞，得到相似結(jié)果。
實施例5.人ACAT-1基因P7啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的確定為確定ACAT基因5′端轉(zhuǎn)錄起始位點，設(shè)計了一長度為22個堿基的引物DP1，與外顯子Xa的71～92bp配對。
DP15’-ATCCCAGCACTTTAGGAGGCCG-3’參照SuperscriptTM II RNaseH-Reverse Transcriptase(GIBCO BRL)的使用說明書，1pmol的5′端標(biāo)記的ACAT特異性引物DP1(5′-ATCCCAGCACTTTAGGAGGCCG-3′)與2μg人肝mRNA在70℃溫育10分鐘，然后在42℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50分鐘；同時以含有相應(yīng)基因組DNA序列的亞克隆為模板，DP1為引物，用GIBCO BRL公司的dsDNA cycle sequencingsystem kit進(jìn)行測序反應(yīng)，產(chǎn)生序列l(wèi)adder。延伸產(chǎn)物和序列l(wèi)adder均在8％測序膠上進(jìn)行電泳。所得結(jié)果與5’-RACE(rapid amplification of the cDNA5’-end)結(jié)果一致，表明圖5所示G是主要的轉(zhuǎn)錄起始位點。
權(quán)利要求
1.一種人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7，其特征在于該啟動子7具有下列DNA序列之一a.序列1長度為-612～-1如下-612GAGCTCCACCTCCTGTCAAATCAGATTATCCAATCAGAAACAGCATTAGATTCTACAGTATGCCAAACCC -543AATTGTGAACTGTACATGCAAGGGATCTAGGTTGCATGCTCCTAATGAAAATCTAACTAGTGGAAAAACT -473GTCTTCCACGAAACCGGACCCTGGTGACAAAAAGGCTGGGGACCCCGATCTATGGCATTTGTGGAGAATT -403TTATGGCTAGCACACTTGGTAAACAAATTCAAAAGAAAACGAATCTTATCTCATTAAAAATGAACATATT -333TACATGCACAAACATAAGTTGGAATGGGGAAATTTATGTAGTTGGAAAATAGCTATTAAATGTAAACAAA -263CATAATTATAGTGTAGATTAAGGACTAGCAATCTTTTCAGAGGTAATAATAACACCAATGTTGTACATTC -193ATCCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGCCTGGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGG -123CCCGATCTCGGCTCACTGCAACGTCCGCCTCCCAAGTTCATGCCATTCTCCTGGCTCAGCCTCTCGAGTA -53GCTGGGACTACAGGCACCCGCCACCACGTTTGGCGAATTTTTTGTATTTTTA-1b.a序列1的互補(bǔ)序列；c.a或b序列中具有啟動子活性的片段的序列；d.可與a、b、c中的任意一種或兩種以上組成雜交的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子7，其特征在于該啟動子7可以構(gòu)建含有該啟動子7的重組DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的啟動子7，其特征在于所述的重組DNA分子是帶有異源基因的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的啟動子7，其特征在于所述的異源基因是報告基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子7，其特征在于該啟動子7可以構(gòu)建含有該啟動子7的重組轉(zhuǎn)移載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的啟動子7，其特征在于所述重組表達(dá)載體可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的啟動子7，其特征在于所述的哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞。
8.一種人膽固醇酯合成酶-1基因啟動子7的應(yīng)用，其特征在于該啟動子7可以作為治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物作用的靶。
全文摘要
本發(fā)明提供人膽固醇酯合成酶－1基因啟動子7。通過PCR方法篩選得到了P1噬菌體質(zhì)粒陽性克隆,它含有人膽固醇酯合成酶－1(ACAT－1)外顯子Xa的基因組DNA片段,進(jìn)一步亞克隆、序列測定和轉(zhuǎn)錄活性分析鑒定了人膽固醇酯合成酶－1基因啟動子7,該啟動子可用于篩選治療動脈粥樣硬化癥的藥物以及在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白。
文檔編號C12N15/113GK1271013SQ9911363
公開日2000年10月25日 申請日期1999年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月15日
發(fā)明者李伯良, 張大元, 段治軍, 李夏璐, 宋保亮, 何崇堯, 楊新穎 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所