專利名稱：人、豬共患囊蟲病核酸疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，特別是由豬帶絳蟲囊尾蚴保護性抗原基因以及相關(guān)細胞因子基因組成的真核生物表達質(zhì)粒作為具有預防及治療人、豬共患囊蟲病功能的核酸疫苗。
豬帶絳蟲囊蟲病是我國主要的人畜共患病之一，在我國大部分省、市、自治區(qū)有著廣泛流行區(qū)域，特別在華北、東北、西北地區(qū)流行十分嚴重。不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且直接威脅著廣大人民群眾的身體健康。由于豬帶絳蟲及其囊尾蚴的體積較大、結(jié)構(gòu)復雜、生活史伴有宿主轉(zhuǎn)換、體內(nèi)移行、發(fā)育階段高度變態(tài)以及寄生部位多變等特點，決定了宿主的免疫應答相應表現(xiàn)為極其復雜的連鎖過程，給囊蟲病的預防帶來了很大困難。有關(guān)囊蟲病的免疫保護性研究，目前國內(nèi)尚未見有意義的報道，國際上僅報道從蟲體中提取粗抗原，分離其中一種或幾種抗原成分，免疫動物后可檢測到一定程度的體液免疫反應(Evans-CA，et al.Immunotherapy for porcine cysticercosisimplications for prevention of human disease.Cysticercosis working Group in Peru.Am-J-Trop-Mexd-Hyg 1997；56(1)33-7.Molinari-JL，et al.Field trial for reducing porcine Teania solium cystcercosis in Mexico by systematic vaccination ofpigs.Vet-Parasitol 1997；69(1-2)55-63.)，但由于其成分復雜，交叉反應嚴重且抗原量少，其診斷及預防價值均十分有限。雖然，利用基因工程技術(shù)可獲得大量的高純度的亞單位疫苗，并可誘發(fā)被免疫動物較強的體液反應(Johnson-KS，et al.Vaccination against ovine cysticercosisusing a defined recombinant antigen.Nature 1989；338(6216)585-7.)，但是，蛋白純化工藝十分復雜，成本較高，且對單一抗原的體液免疫應答仍難以對復雜的囊蟲感染產(chǎn)生十分有效的保護作用。
核酸疫苗作為繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，正在成為一個新的研究熱點。其基本過程是把抗原基因克隆到真核質(zhì)粒表達載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA通過某種方式導入動物體內(nèi)，使外源抗原基因在活體內(nèi)表達，激活機體免疫系統(tǒng)、誘發(fā)免疫應答反應。其優(yōu)點是(1)能誘發(fā)體液及細胞全方位免疫應答；(2)能針對多種抗原構(gòu)建多價疫苗進行多級免疫，使免疫保護更全面；(3)安全性好；(4)免疫保護效果長；(5)生產(chǎn)簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運方便。雖然有學者報道用肥頭絳蟲的某一抗原基因構(gòu)建了核酸疫苗(Gabriela Rosas，et al.J.Parasitol.84(3)，p516-523，1998)，但未見人、豬共患豬帶絳蟲囊蟲病核酸疫苗的研究報道。
本發(fā)明的目的是提供一種具有廣譜、長效、簡便、全方位誘導免疫反應等特點的囊蟲病核酸疫苗。
本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達載體的基本骨架為pcDNA3(購自Invitrogen公司，其序列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過程以及制備過程中，質(zhì)粒擴增所用的宿主菌為DH10B(購自GIBCO公司)；插入的外源基因為豬帶絳蟲囊尾蚴的三種保護性抗原基因(cC1、cC3、cC4)、細胞因子基因豬γ干擾素(IFN-γ)和豬白細胞介素5(IL-5)，其基因結(jié)構(gòu)分述如下(1)豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC1a)序列特征長度1300bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型cDNAc)來源豬帶絳蟲囊尾蚴d)序列描述SEQ ID NOcC11 GAATTCGAGG ATCCGGGTAC CATGGCCTAC TGTCGCTCCC TGGTTCATCT ATATGCCCCC61 AATGGAGAGA AGTACAAACC GACTATTACC CCAACACCCG GGTTCTCACC GACCGCTGAT121 GCTGAGCACT TGAAGCGTGC AATGCGAGGA CTTGGCACGA ATGAACGTGC GATCATTGAC181 ATTCTTGGAA ACCGAACTTC AGCCCAAAGA ATGGCCATTC GTGACGCCTA TCCGTCGATT241 TCCAGCAAGA CCCTGCACGA TGCTCTAACC AGCGAGCTGA GTGGCAAGTT CCGGAGGTTC301 GCCTTGTTGC TAATCCAATC ACCGTGGCAG GTGATGGCAG AGGCTCTTTA CGACGCCATG361 AAGGGGGCTG GCACTAAGGA ACGCGTACTC AATGAAATTA TTGCCGGGTG TTCAAAGGAT421 GACATCCCTC AGTTGAAAAA AGCTTTTGAA GAAGTGAGCG GAGGAGAAAC CCTTGATGAT481 GCGATCAAGG GGGACACGAG TGGCGACTAC CGCGAGGCCC TTCTGCTAGC GCTCGCCGGT541 CAGGCTGATG AACCACAGGC GATGCAACTC AAAAACCTAA CACCCTCCAC TCTCAGTCAG601 GTTGTGAATC CCGGCCTTGC TGAAACGGAT GCGAAGGAGC TGTACGCCTG CGGTGAGGGG661 CGCCCGGGCA CAGCAGAGAG TCGTTTCATG CGTCCTATCG TCAATCGCTC ATTCCTTCAA721 TTAAACGCAA CGAATGAGGC TTACAATCGG GCCTACGGTC ACCCGTTGAT TGATGCAATA781 AAGAAGGAGA CGTCGAGAGA CCTTGAGGAC TTTCTCATAA CTAGAGTTCG CTACGCCACT841 GATCGCGCCA GTCTGTTTGC CGAACTCCTT CACTTTGCCA TGAGAGGAGC TGGCACCAAG901 GACTCCACTT TGCAACGTGT TCTTGCCTTG AGGGCTGATA CTGATCTAGG AAGCATCAAG961 GAGAAGTATG CGGAGCTCTA TGGTGAAACC TTGGAAGCGG CAATCAAGGG TGATACTTCT1021 GGTGACTATG AGGCTCTCTG CTTGAAACTC ATCGGCCCTG CATAACTGCA GTGGTGACAA1081 ATTGGTTCCC ACATGCTGGT TAAAGTTCTC CACCTCCTCC TACATCATCT CGTGGTTTTA1141 ATTTCGACTT TTCTGCAGCA CAAATTCCTC GATTAACTCC TTTCTCTGTT CTTCGTCAGT1201 TTGTGGAAGG TTAAACTTGA TGATGAAATT CACTCCAATA AAAATAATGC ACACTTACGT1261 ACTGAGTGTG AGTGCGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA(2)豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC3a)序列特征長度694bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型cDNAc)來源豬帶絳蟲囊尾蚴d)序列描述SEQ ID NOcC31 GGCTTGGCGG GTTCACTAGC CGTACTCCTT TCGTTACCTC ACCCTAATCA TCAAAATGAA61 TATGATCCGT CAAAATTTCC ACGATGAATG CGAAGTGGGC ATCAATCGTC AAATTAACAT121 GGAGCTCTAC GCCAGCTACC TCTACCTAGC TATGTCTCAA CACTTTGACC GGGAAGACGT181 CGCCCTTCCA GGCTTCAAGA AATTTTTTGC CAAGGCCTCG GAAGAGGAGC GTGAACACGC241 GATAAAGCTC ATGTGTTATC AATGTAAACG TGGTGGCCGC ATTGTCTATC AAGACATTGC301 CAAACCCCAG AAAAGTGAAT GGGCAACCGG TCTGGAAGCC ATGGAAACGG CGCTCAAAAT361 CGAGCGAGAG GTCAATGAGT CCCTCCTTGC TTTGTGTGAT GTCGCTGTCA AACACAGCGA421 CAACCATTTC TCTGATTTCT TGGAAAATGA ATACTTGGGA GAACAAGTAG ACGCTATTAA481 GCAGTTGGCA GACTATGTGA CAAACCTCCG TCGATGCGGA CCCGGACTGG GAGAGTATCT541 ATTTGACAAG GAAACCCTTA ACGGTGGTGA GGACTAAAAA AACCAGCTGT GCTCGGGGCA601 ATTTTTTGTT CCTTTCTCTT TGCCATGTTG TGATTTACAA AAACTATTCA CAATTATGAC661 TAATCTTTAC CAAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA(3)豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC4a)序列特征長度1776bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型cDNAc)來源豬帶絳蟲囊尾蚴d)序列描述SEQ ID NOcC41 CCTACTGGAGATGAAAGGCA TATCTGGCCC ACTAGTTTTA GCAATCTTCA CGACATGTTT61 TGGCTCATCA TTTCTCTTGG GCTACAACCT GGGCGTCGCA AATCTGCCTG GAGATAACAT121 CAAGAAATTT CTGGTTAACT ACTACAAGCC GGACAACTCA TCTGCTTTGA ATGCCAACTT181 CCTCTACGGA CAGGTAACCT CCGTGCTGGT CATCTGTGCC GCCATTGCAG CCTTCACGTG241 TGGTTGGGTT GCTGACGGCC TGGGCAGAAA GCGCAGTCTG ATGGTGAACA ACGGCATTGG301 CATTGTGGGA TCAGTAATCT CCTCTGTGTG TGTGGTGGCA AATCAGCCTG CTTTGCTGTA361 TGTGGGACGT GCGATCAGTG GTCTGAACAG CGGTCTGAGC ATTGGCATGG CAGCGATGTT421 CCTCACGGAG ATTGCGCCAC GCCATCTGCG GGGCATGATT GGAGCCTGCA ACCAACTGGC481 TATCACCATC GGCATTGTCA TCTCCTACGT GCTCACGCTG TCGCACCTTC TGAACACACC541 TACCCTCTGG CCAGTCGCCA TGGGCGTCGG CGCCATTCCT GCTGTGATCG CTCTCATCAT601 TTCCCCCTTC ACCGTTGAGT CGCCGCGTTG GCTCTACCTC AAGAAGAAGG ATGAGAAAGC661 TGCCCGCGAA GCCTTCGCTC GCATCAATGG CTCCGAGAAT GTGGATATGT TCATCGCCGA721 GATGCGTGAA GAGCTAGAGG TAGCCCAGAA CCAACCAGAG TTCAAATTTA CTGAGCTCTT781 CCGTCGCAGA GATCTTCGCA TGCCTGTCAT CATAGCGGTT CTCATTCAAG TCATGCAGCA841 ACTCTCAGGA ATTAATGCTG TGGTTGCGAA TTCCTCGGAG ATGTTGAAAA GTGCCAAGGT901 GTCGCCAGAC ATGCTGGAGT ACTTTGTGGT AGGTCTGGGC CTGCTCAACG TCATCTGCAC961 AATCGTGGCG CTGCCGCTGC TGGAAAAGGC GGGTCGGCGC ACCCTTCTGT TATGGCCTTC1021 CCTCGTAGTG GCAATAATAC TGCTGCTTCT GGTGATCTTC GTCAATATCG CCAACTACGG1081 AGGCGTCGTA AACAAGACGC CCTTCGTTCT CGTTTCTGCC GTCCTCGTCT TCATTTATGT1141 CGCCGCTTTC GCCATGGGTC TTGGCCCAAT GCCTGCGCTC ATCGTCGCCG AAATCTTCCG1201 TCAGGGTCCT CGCGCCGCCG CCTATTCCCT CAGTCAAAGC ATTCAGTGGG CCTGCAATCT1261 CATTGTCGTA GCCTCATTTC CTTCGCTCAA CGAGCTATTA AAGGGCTACG TTTATCTGCC1321 GTATCTGGTT GTGGTGGCAG TTTGCTGGGT GGTATTCTTC CTCTTCATGC CGGAGACAAA1381 GAATCGCACC TTTGATGAGG TGGCACGGGA TCTGGCCTTC GGGAGCATCG TGGTGGGTAA1441 ACGCACTGCG GCGCTACAAG CTCCCGTCTT CACCAAGGAG GACGAGGAGG CCGCTACCGC1501 CCTCCGCCGC AGCCACGAAG AGGACGCCAA GGTCGACGCC TAGACTACTC TCTTCACTTT1561 TCCCCCCTTC CTCATCTCTT CATAAAGTGC TGCACTCCCT CCTGTTGTTT GTGTCTCCGT1621 TTTCCCCCAT TCACGCATTC ACTTGCCTTG CATCTCTTTT TACTCAACCT CCGTAGACAA1681 GGTTACTGCG AGGCCAACTC TTCCCTCTCC ATTCTTCCTA TAGATGCGGA AGGTCAGTCA1741 GGATTTCACC ATAGTTTTTG ATGATGAAAA AAAAAA(4)豬γ干擾素基因(IFN-γ)a)序列特征長度626bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型cDNAc)來源豬外周血B細胞d)序列描述SEQ ID NOIFN-γ1 CTGCAGGTCA ACGGATCATC TTCAGATCAG CTATTGCAGA AGAAAGGTCA GCCAAGCGCT61 CTGGGCCTGA TCGACTGTAT ATAGGAGCTT CTGATTTCAA CCAGAAGCTA ACTCTCTCCG121 AAACAATGAG TTATACAACT TATTTCTTAG CTTTTCAGCT TTGCGTGACT TTGTGTTTTT181 CTGGCTCTTA CTGCCAGGCG CCCTTTTTTA AAGAAATAAC GATCCTAAAG GACTATTTTA241 ATGCAAGTAC CTCAGATGTA CCTAATGGTG GACCTCTTTT CTTAGAAATT TTGAAGAATT301 GGAAAGAGGA GAGTGACAAA AAAATAATTC AGAGCCAAAT TGTCTCCTTC TACTTCAAAT361 TCTTTGAAAT CTTCAAAGAT AACCAGGCCA TTCAAAGGAG CATGGATGTG ATCAAGCAAG421 ACATGTTTCA GAGGTTCCTA AATGGTAGCT CTGGGAAACT GAATGACTTG GAAAAGCTGA
481 TTAAAATTCC GGTAGATAAT CTGCAGATCC AGCGCAAAGC CATCAGTGAA CTCATCAAAG541 TGATGAATGA TCTGTCACCA AGATCTAACC TAAGAAAGCG GAAGAGAAGT CAGACTATGT601 TCCAAGGCCA GAGAGCATCA AAATAA(5)豬白細胞介素5基因(IL-5)a)序列特征長度838bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型cDNAc)來源豬外周血B細胞d)序列描述SEQ ID NOIL-51 ATGCACTTTC TTTGCCCAAA GCAAACACTG AGCATTTGAG AGCCATGAGA ATGCTTCTGC61 ATTTGAGTTT GCTAGCTCTT GGGGATGCCT ATGTTTCTGC CATTGCTGTA CAAAGTCCCA121 TGAATAGGCT GGTGGCAGAG ACCTTGGCAC TGCTCTCCAC TCATCGAACT CTACTGATAG181 GCGACGGGAA CCTGATGATT CCTACTCCTG AACATAACAA TCACCAACTG TGCATTGAAG241 AAGTCTTTCA GGGTATAGAC ACATTAAAGA ATCGCACTGT GCCGGGGGAT GCTGTGGAAA301 AGCTTTTCCG AAACTTGTCT TTAATAAAAG AACACATAGA CCGCCAAAAA AAAAAGTGTG361 GAGGAGAAAG ATGGAGAGTA AAAAAGTTCC TAGACTACCT GCAAGTGTTT CTTGGTGTAA421 TAAACACTGA GTGGACAATG GAAAGTTGAG ATGAAACTGG GTTATTGCAG TGAAAGATTC481 TGTAGGAGAA GAAGAATGTT ATTTTTTGCA ATGAGAATGA GGCCCAACCA AGGGTCAGTG541 TAATTAAACT TCAGATGCAA AGCAATTTTT CAGGCATACT GCTACTTTGC TGCTCACATA601 GGCAGAAAGG ATAAAAATAA AATATTTGAG ATATATTTCA GATATCAGAA TCATCGAAGT661 CTTTTCCTCC AGTGTGCTCC AGGCAAAATA AATATGTACT TCAATCTTAT TTAACACAAC721 ATTCTGTAAA ATGTCTATTA ACTTAATATT TATGTATGAA ATGATTGAGA ATTTCATAAA781 TCAATATTTA TTTCAGGTTG GGCTATGTTC CAATAAAACA AAAATAAACA ACTGATTC上述基因的克隆方案均可采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法進行，該方法的大致流程為根據(jù)上述基因的兩端序列設(shè)計PCR引物，然后以各自組織來源的RNA為模板，行反轉(zhuǎn)錄PCR擴增相應基因的cDNA，再將擴增產(chǎn)物克隆測序即可。具體方法及反應體系參見《分子克隆》(科學出版社，1992年出版)相關(guān)章節(jié)。


圖1含cC1、cC3、cC4融合抗原基因及IFN-γ和IL-5基因的共表達質(zhì)粒圖譜圖2 IFN-γ和IL-5完整轉(zhuǎn)錄翻譯單元的構(gòu)建流程3保護性抗原cC1、cC3、cC4融合基因完整轉(zhuǎn)錄翻譯單元的構(gòu)建流程4核酸疫苗pEF-cC134FL的構(gòu)建流程5免疫接種后仔豬體內(nèi)的抗原抗體水平時間曲線6含cC1、cC3、cC4抗原基因的融合表達質(zhì)粒圖譜圖7含cC1、cC2、cC3、cC4、cC5抗原基因的共表達質(zhì)粒圖譜圖8本核酸疫苗與其他相關(guān)疫苗免疫動物后體內(nèi)的抗體效價比較圖9本核酸疫苗與其他相關(guān)疫苗的免疫保護率比較本核酸疫苗的結(jié)構(gòu)是以真核表達載體——pcDNA3為骨架的重組質(zhì)粒DNA分子(大體結(jié)構(gòu)見圖1)。全長約8.6kb(千堿基對)，除含有質(zhì)粒復制起始位點(ColE1)、卡那霉素抗性基因(KanaR)等元件外，還包含了三個完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元豬γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素5(IL-5)以及豬帶絳蟲囊尾蚴的三種保護性抗原的融合基因(cC1、cC3、cC4)；每個單元均含有真核轉(zhuǎn)錄翻譯所必需的元件真核啟動子(PEF即延長因子啟動子)、相應的編碼基因及3’端的多聚腺苷酸(BGH pA)?？傮w上說，本疫苗是一個可在真核細胞中融合表達豬帶絳蟲囊尾蚴的三種保護性抗原，并可共表達豬γ干擾素和白細胞介素5的重組質(zhì)粒DNA。如用于注射人體，亦可將豬γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素5(IL-5)基因換成人干擾素(IFN-γ)、白細胞介素5(IL-5)基因，構(gòu)建方法相同。
本核酸疫苗的構(gòu)建過程如圖2、圖3、圖4所示。圖2顯示了IFN-γ和IL-5完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元的構(gòu)建流程首先利用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法從豬的RNA中分別擴增得到IFN-γ和IL-5基因cDNA的編碼區(qū)，克隆測序確認后，將其定向插入含EF啟動子和pA的真核表達載體pEF-G中，形成pEF-IFN-γ和pEF-IL-5重組質(zhì)粒，用相應的限制性內(nèi)切酶將包含PEF和pA的完整真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元切下，用T4 DNA多聚酶補平末端備用。(具體反應體系及實驗方案參見前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)圖3顯示了保護性抗原融合基因轉(zhuǎn)錄翻譯單元構(gòu)建流程首先用相應的限制性內(nèi)切酶將己克隆測序的cC1、cC3、cC4基因的編碼區(qū)從PUC質(zhì)粒上切下，并在體外將該三片段相互連接，組成cC1、cC3、cC4融合基因；與此同時，酶切處理pEF-G后，將其與融合基因連接，組成pEF-cC134融合表達質(zhì)粒，再用Not1和Sal1將完整真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元切下，用T4DNA多聚酶補平末端備用。
圖4顯示含有三個完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元的重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程首先用相應的限制性內(nèi)切酶將pcDNA-3上的卡那霉素抗性基因(KanaR)及復制子(ColE1)切下，補平后與cC1、cC3、cC4融合基因完整真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元連接；再用相應的限制性內(nèi)切酶將連接產(chǎn)物切開補平后，與包含PEF和pA的IFN-γ完整真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元連接；同理連接包含PEF和pA的IL-5完整真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元；最終構(gòu)建形成可融合表達豬帶絳蟲囊尾蚴的三種保護性抗原，并可共表達豬γ干擾素和白細胞介素5的重組表達質(zhì)粒pEF-cC134FL，此即人、豬共患囊蟲病核酸疫苗。將其導入宿主菌即成工程菌。
上述質(zhì)粒構(gòu)建過程以及將本核酸疫苗pEF-cC134FL導入宿主菌制成工程菌所用的技術(shù)手段均為常規(guī)的CaCl2轉(zhuǎn)化法。具體實施方案為先將宿主菌DH10B于50ml LB培養(yǎng)基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，PH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4時，在4℃下，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心，收集宿主菌；用40ml冰預冷的100mmol/L的CaCl2溶液重懸，冰浴30分鐘；再以5000rpm的轉(zhuǎn)速4℃下離心，收集宿主菌；去除上清后，用1-2ml冰預冷的100mmol/L的CaCl2溶液重懸，制成感受態(tài)細胞備用。取200μl感受態(tài)細胞與10μl連接產(chǎn)物混勻后，冰浴30分鐘，42℃熱處理90秒，冰浴2分鐘，加入800μl的LB，于37℃培養(yǎng)1小時后，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有相應抗生素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12-24小時后，即可獲得單克隆的含有重組質(zhì)粒的宿主菌。在本發(fā)明中，最終將構(gòu)建的核酸疫苗以該方法導入宿主菌DH10B而建成工程菌——DH10B(pEF-cC134FL)。本發(fā)明根據(jù)需要可選用其他細胞因子(如白細胞介素1 IL-1、白細胞介素4 IL-4等)，通過其旁分泌作用，增強機體的抗蟲能力。構(gòu)建的基本骨架也可用其他真核質(zhì)粒表達載體(如pCI Promega公司產(chǎn)品等)。
本發(fā)明核酸疫苗的培養(yǎng)擴增及精制可用上述工程菌株，通過常規(guī)的細菌培養(yǎng)、質(zhì)粒擴增和純化(詳見前述《分子克隆》相關(guān)內(nèi)容)。
培養(yǎng)方式一般為液體培養(yǎng)。少量擴增時可用空氣搖床振蕩培養(yǎng)；用于工業(yè)性生產(chǎn)時需用細菌發(fā)酵罐行高密度懸浮通氣培養(yǎng)。對培養(yǎng)基中的培養(yǎng)源無特殊的要求，一般用LB液體培養(yǎng)基，如需高密度培養(yǎng)，則可選用2×YT(含16％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，PH7.0)或SOC液體培養(yǎng)基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化鈉、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、PH7.0)。必要時也可添加動、植、礦物油等作為消泡劑。培養(yǎng)溫度一般為37℃，培養(yǎng)時間及收集細菌的時機決定于培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式以及通氣量等條件的設(shè)置。
從擴增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，可采用一些常規(guī)的方法。例如可用去垢劑SDS裂解菌體，利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA變復性特征的差異，通過對DNA的變性和復性的處理，將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分開；再利用質(zhì)粒DNA與雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力等方面的差別進行進一步的純化，并去除內(nèi)毒素。具體地說，存在于復性液中的質(zhì)粒DNA經(jīng)過脫鹽處理后，可用陰離子交換樹脂(如DEAE Sepharose)進行交換，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA)緩沖液解吸，即可制得高純度的質(zhì)粒DNA(具體見制造例)。經(jīng)分裝、凍干，即可獲得半透明片狀的本發(fā)明核酸疫苗純品。本品理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，可于常溫下保存與運輸，使用前，用注射用水溶解即可。
本核酸疫苗的體外表達及檢測，是將所構(gòu)建的核酸疫苗通過電穿孔法轉(zhuǎn)染COS7細胞，培養(yǎng)一周后，用ELISA法檢測cC134融合蛋白、IFN-γ和IL-5，結(jié)果表明均有表達；用細胞病變抑制試驗檢測IFN-γ的活性，比活為106IU/mg；MTT法檢測IL-5的活性，比活為104IU/mg。說明本發(fā)明構(gòu)建的核酸疫苗確可在哺乳動物細胞中表達。
本核酸疫苗的體內(nèi)表達及檢測，是將獲得的核酸疫苗純品免疫仔豬后，用ELLSA法檢測血清中的抗原、抗體水平(見實驗1)，結(jié)果如圖5曲線1為豬血清中抗cC134的抗體效價，曲線2為豬血清中cC134融合抗原水平。結(jié)果表明本核酸疫苗免疫動物后，不但可表達豬帶絳蟲囊尾蚴的抗原，而且可有效誘導體內(nèi)的免疫應答反應；同時，從抗體水平的升高使抗原水平下降，說明抗體能有效中和抗原，具有免疫保護作用。
為驗證本發(fā)明的優(yōu)越性，我們將其與我室構(gòu)建的、基于相同免疫保護性抗原的多種其它疫苗分別免疫仔豬，然后從體內(nèi)抗體效價和免疫保護率兩方面進行比較。用于比較的疫苗分別為cC134融合抗原亞單位疫苗、細胞因子(IL-5、IFN-γ)與cC134融合抗原亞單位疫苗聯(lián)合免疫、cC134多價融合表達核酸疫苗(圖6)及cC12345多價共表達核酸疫苗(即含豬帶絳蟲囊尾蚴保護性抗原基因cC1、cC2、cC3、cC4、cC5的共表達質(zhì)粒如圖7)，結(jié)果如下(1) 被免疫仔豬的抗體效價時間曲線結(jié)果如圖8所示，圖中曲線1為本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗(pEF-cC134FL)免疫后的抗體效價，曲線2為融合表達核酸疫苗(pEF-cC134)免疫后的抗體效價，曲線3為細胞因子與亞單位疫苗聯(lián)合免疫后的抗體效價，曲線4為cC134融合亞單位疫苗免疫后的抗體效價，曲線5為共表達核酸疫苗(pEF-cC12345)免疫后的抗體效價。可見本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗所誘發(fā)抗體效價的峰值最高，持續(xù)時間最長。提示免疫保護效果最好。
(具體方法見實驗2)(2) 比較各疫苗間絕對保護率和有效保護率之間的區(qū)別具體方法見實驗3，結(jié)果如圖9所示。圖中柱1為亞單位疫苗的免疫保護率，柱2為細胞因子與亞單位疫苗聯(lián)合免疫后的免疫保護率，柱3為融合表達核酸疫苗(pEF-cC134)的免疫保護率，柱4為共表達核酸疫苗(pEF-CC12345)的免疫保護率，柱5為本發(fā)明核酸疫苗(pEF-cC134FL)的免疫保護率。結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗免疫動物后，對囊尾蚴蟲卵攻擊的絕對保護率和有效保護率均高于其他種類疫苗。
以上兩個實驗的結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗較亞單位疫苗、共表達核酸疫苗(pEF-cC12345)及無細胞因子的融合表達核酸疫苗(pEF-cC134)具有更為全面和有效的免疫保護作用。其理論依據(jù)在于首先，融合表達的抗原蛋白分子cC134不但保持了多價的優(yōu)點，而且因其分子量較大，所以其免疫原性較抗原分子共表達載體表達產(chǎn)生的各自獨立的小分子抗原蛋白的免疫原性強，因而能更為有效地激發(fā)免疫應答反應。其次，細胞因子在活化淋巴細胞和調(diào)節(jié)免疫反應方面有著重要作用，某些細胞因子在寄生蟲感染性疾病中的作用十分重要。有研究表明[Heath A.W，Devey.ME，Brown.IN Interferon-gamma as an adjuvant inimmunocompromised mice.Immunology 1989；67520；Heath.AW，Playfair.JHL.Cytokine-antigen vaccines.Nature 1993；364-493；Mochizuki M，Bartels J，Mallet AI，et al.IL-5 induces eotaxina possible mechanism ofselective eosinophil recruitment in helminth infection and atpy.J Immunol 1998 Jan 1；160(1)60-68]，IL-1可抑制某些寄生蟲蠕蟲的發(fā)育，IL-5可促使嗜酸性粒細胞的增殖，增強機體抗蟲能力，IFN-γ能抑制胞內(nèi)弓形蟲的增埴，且與抗原結(jié)合時有較好的免疫佐劑作用，據(jù)此，構(gòu)建細胞因子與抗原蛋白融合表達或共表達核酸疫苗免疫動物，利用細胞因子的免疫佐劑及共分泌和旁分泌作用，在抗原所在局部發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可獲得滿意的免疫保護效果。
本核酸疫苗的生產(chǎn)純化十分簡便，理化性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲存和運輸，且免疫保護作用全面、有效，加之成本低廉，應用范圍廣泛(包括地域和免疫人群)，使其具有較強的實用性。
使用本發(fā)明的工程菌制備豬帶絳蟲囊蟲病核酸疫苗成品的實施例從-80℃冰箱中取出凍存的工程菌株——DH10B(pEF-cC134FL)，于室溫融化后，用接種環(huán)蘸取少量菌液劃線接種于1.5％的LB瓊脂平板(含卡那霉素50ug/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜后，取單克隆接種于50mlLB液體培養(yǎng)基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，卡那霉素50ug/ml，PH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)40小時，作為種子液。按1∶20的比例將種子液接種于1升SOC液體培養(yǎng)基中(在前述成分的基礎(chǔ)上，另含卡那霉素50ug/ml)，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時；加氯霉素至終濃度為170ug/ml，于37℃劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)16小時。將菌液于4℃以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘；去上清，取菌體，將其重懸于30ml的堿裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris.Cl、10mmoL/L EDTA PH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/LNaOH和1％SDS)，緩慢顛倒5次混勻，室溫放置5分鐘。加45ml冰預冷的溶液III(含鉀離子3mol/L、乙酸根5mol/L)，緩慢顛倒數(shù)次混勻，冰浴10分鐘；于4℃以10000rpm離心10分鐘，取上清，過500ml G25柱除鹽后，上20ml DEAE Sepharose陰離子交換柱，待結(jié)合吸附完畢后，按鹽離子(Cl-)濃度從低到高(0～1mol/L)漸進的梯度洗脫法，用10個柱體積的PBS(PH8.0)和氯化鈉溶液緩慢清洗陰離子交換柱，收集260nm處吸收峰的洗脫液，得到核酸疫苗的粗品。然后進一步純化，加2倍體積的無水乙醇沉淀，12000rpm 4℃離心10分鐘，去上清，用70％的乙醇漂洗涼干后，溶于PBS(PH8.0)溶液中，即得本發(fā)明核酸疫苗的純品；用紫外分光光度法定量后，再按每份10mg/ml分裝、凍干制成成品。
本發(fā)明的免疫方案是免疫接種時，用25％的注射用葡萄糖鹽水1ml溶解后，肌肉注射即可，劑量為1mg/kg體重(也可與局麻藥利多卡因10mg聯(lián)合注射，以利疫苗吸收)。一次接種即可獲得有效免疫保護，如需加強，每年追加免疫一次即可。
實驗1 免疫接種后體內(nèi)的抗原抗體水平檢測試驗將本發(fā)明核酸疫苗(pEF-cC134FL)按1mg/kg體重接種0～1周齡的仔豬后，每周耳部取血1ml，分離血清，以囊蟲病患者的富集血清為抗體、體外表達的cC134融合蛋白為抗原，用ELISA法檢測免疫接種后仔豬體內(nèi)的特異抗原、抗體水平，制作時間曲線。結(jié)果如圖5。
實驗2 本核酸疫苗與其他相關(guān)疫苗免疫動物后的抗體效價比較試驗將五十只0～1周齡的仔豬隨機分為五組，每組均按1mg/kg體重，分別接種等量的亞單位疫苗、細胞因子與亞單位疫苗聯(lián)合免疫、多價共表達核酸疫苗(圖6)、多價融合表達核酸疫苗(圖7)以及本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗(圖1)，每周耳部取血1ml，分離血清，用ELISA法檢測免疫接種后仔豬體內(nèi)的特異抗體水平制作時間曲線，結(jié)果如圖8。
實驗3 本核酸疫苗與其他相關(guān)疫苗間絕對保護率和有效保護率之間的比較試驗將六十只0～1周齡的仔豬隨機分為六組，第一組為陰性對照，其余各組均按1mg/kg體重，分別接種等量的亞單位疫苗、細胞因子與亞單位疫苗聯(lián)合免疫、多價共表達核酸疫苗(圖6)、多價融合表達核酸疫苗(圖7)以及本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗(圖1)，四周后，喂食囊尾蚴蟲卵；八周后，觀察體內(nèi)囊尾蚴數(shù)量，全身未見囊尾蚴的個體數(shù)為絕對保護數(shù)，與陰性對照相比，囊尾蚴數(shù)量減少的個體數(shù)為有效保護數(shù)，保護數(shù)除以每組個體數(shù)則為保護率。實驗結(jié)果見圖9。
根據(jù)以上實驗可以證明，本發(fā)明構(gòu)建的多價復合核酸疫苗能有效地誘發(fā)機體的免疫應答反應，并能高效防止囊尾蚴的感染和囊蟲病的發(fā)生。
權(quán)利要求
1.一種人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于由真核表達載體基本骨架(pcDNA-3)、豬帶絳蟲囊尾蚴抗原基因和細胞因子基因組成。
2.按權(quán)利要求1所述的人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于所述的豬帶絳蟲囊尾蚴抗原基因為保護性抗原基因cC1、cC3、cC4，其序列分別為豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC11 GAATTCGAGG ATCCGGGTAC CATGGCCTAC TGTCGCTCCC TGGTTCATCT ATATGCCCCC61 AATGGAGAGA AGTACAAACC GACTATTACC CCAACACCCG GGTTCTCACC GACCGCTGAT121 GCTGAGCACT TGAAGCGTGC AATGCGAGGA CTTGGCACGA ATGAACGTGC GATCATTGAC181 ATTCTTGGAA ACCGAACTTC AGCCGAAAGA ATGGCCATTC GTGACGCCTA TCCGTCGATT241 TCCAGCAAGA CCCTGCACGA TGCTCTAACC AGCGAGCTGA GTGGCAAGTT CCGGAGGTTC301 GCCTTGTTGC TAATCCAATC ACCGTGGCAG GTGATGGCAG AGGCTCTTTA CGACGCCATG361 AAGGGGGCTG GCACTAAGGA ACGCGTACTC AATGAAATTA TTGCCGGGTG TTCAAAGGAT421 GACATCCCTC AGTTGAAAAA AGCTTTTGAA GAAGTGAGCG GAGGAGAAAC CCTTGATGAT481 GCGATCAAGG GGGACACGAG TGGCGACTAC CGCGAGGCCC TTCTGCTAGC GCTCGCCGGT541 CAGGCTGATG AACCACAGGC GATGCAACTC AAAAACCTAA CACCCTCCAC TCTCAGTCAG601 GTTGTGAATC CCGGCCTTGC TGAAACGGAT GCGAAGGAGC TGTACGCCTG CGGTGAGGGG661 CGCCCGGGCA CAGCAGAGAG TCGTTTCATG GGTCCTATCG TCAATCGCTC ATTCCTTCAA721 TTAAACGCAA CGAATGAGGC TTACAATCGG GCCTACGGTC ACCCGTTGAT TGATGCAATA781 AAGAAGGAGA CGTCGAGAGA CCTTGAGGAC TTTCTCATAA CTAGAGTTCG CTACGCCACT841 GATCGCGCCA GTCTGTTTGC CGAACTCCTT CACTTTGCCA TGAGAGGAGC TGGCACCAAG901 GACTCCACTT TGCAACGTGT TCTTGCCTTG AGGGCTGATA CTGATCTAGG AAGCATCAAG961 GAGAAGTATG CGGAGCTCTA TGGTGAAACC TTGGAAGCGG CAATCAAGGG TGATACTTCT1021 GGTGACTATG AGGCTCTCTG CTTGAAACTC ATCGGCCCTG CATAACTGCA GTGGTGACAA1081 ATTGGTTCCC ACATGCTGGT TAAAGTTCTC CACCTCCTCC TACATCATCT CGTGGTTTTA1141 ATTTCGACTT TTCTGCAGCA CAAATTCCTC GATTAACTCC TTTCTCTGTT CTTCGTCAGT1201 TTGTGGAAGG TTAAACTTGA TGATGAAATT CACTCCAATA AAAATAATGC ACACTTACGT1261 ACTGAGTGTG AGTGCGCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC31 GGCTTGGCGG GTTCACTAGC CGTACTCCTT TCGTTACCTC ACCCTAATCA TCAAAATGAA61 TATGATCCGT CAAAATTTCC ACGATGAATG CGAAGTGGGC ATCAATCGTC AAATTAACAT121 GGAGCTCTAC GCCAGCTACC TCTACCTAGC TATGTCTCAA CACTTTGACC GGGAAGACGT181 CGCCCTTCCA GGCTTCAAGA AATTTTTTGC CAAGGCCTCG GAAGAGGAGC GTGAACACGC241 GATAAAGCTC ATGTGTTATC AATGTAAACG TGGTGGCCGC ATTGTCTATC AAGACATTGC301 CAAACCCCAG AAAAGTGAAT GGGCAACCGG TCTGGAAGCC ATGGAAACGG CGCTCAAAAT361 CGAGCGAGAG GTCAATGAGT CCCTCCTTGC TTTGTGTGAT GTCGCTGTCA AACACAGCGA421 CAACCATTTC TCTGATTTCT TGGAAAATGA ATACTTGGGA GAACAAGTAG ACGCTATTAA481 GCAGTTGGCA GACTATGTGA CAAACCTCCG TCGATGCGGA CCCGGACTGG GAGAGTATCT541 ATTTGACAAG GAAACCCTTA ACGGTGGTGA GGACTAAAAA AACCAGCTGT GCTCGGGGCA601 ATTTTTTGTT CCTTTCTCTT TGCCATGTTG TGATTTACAA AAACTATTCA CAATTATGAC661 TAATCTTTAC CAAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAA豬帶絳蟲囊尾蚴的保護性抗原基因cC41 CCTACTGGAGATGAAAGGCA TATCTGGCCC ACTAGTTTTA GCAATCTTCA CGACATGTTT61 TGGCTCATCA TTTCTCTTGG GCTACAACCT GGGCGTCGCA AATCTGCCTG GAGATAACAT121 CAAGAAATTT CTGGTTAACT ACTACAAGCC GGACAACTCA TCTGCTTTGA ATGCCAACTT181 CCTCTACGGA CAGGTAACCT CCGTGCTGGT CATCTGTGCC GCCATTGCAG CCTTCACGTG241 TGGTTGGGTT GCTGACGGCC TGGGCAGAAA GCGCAGTCTG ATGGTGAACA ACGGCATTGG301 CATTGTGGGA TCAGTAATCT CCTCTGTGTG TGTGGTGGCA AATCAGCCTG CTTTGCTGTA361 TGTGGGACGT GCGATCAGTG GTCTGAACAG CGGTCTGAGC ATTGGCATCG CAGCGATGTT421 CCTCACGGAG ATTGCGCCAC GCCATCTGCG GGGCATGATT GGAGCCTGCA ACCAACTGGC481 TATCACCATC GGCATTGTCA TCTCCTACGT GCTCACGCTG TCGCACCTTC TGAACACACC541 TACCCTCTGG CCAGTCGCCA TGGGCGTCGG CGCCATTCCT GCTGTGATCG CTCTCATCAT601 TTCCCCCTTC ACCGTTGAGT CGCCGCGTTG GCTCTACCTC AAGAAGAAGG ATGAGAAAGC661 TGCGCGCGAA GCCTTCGCTC GCATCAATGG CTCCGAGAAT GTGGATATGT TCATCGCCGA721 GATGCGTGAA GAGCTAGAGG TAGCCCAGAA CCAACCAGAG TTCAAATTTA CTGAGCTCTT781 CCGTCGCAGA GATCTTCGCA TGCCTGTCAT CATAGCGGTT CTCATTCAAG TCATGCAGCA841 ACTCTCAGGA ATTAATGCTG TGGTTGCGAA TTCCTCGGAG ATGTTGAAAA GTGCCAAGGT901 GTCGCCAGAC ATGCTGGAGT ACTTTGTGGT AGGTCTGGGC CTGCTCAACG TCATCTGCAC961 AATCGTGGCG CTGCCGCTGC TGGAAAAGGC GGGTCGGCGC ACCCTTCTGT TATGGCCTTC1021 CCTCGTAGTG GCAATAATAC TGCTGCTTCT GGTGATCTTC GTCAATATCG CCAACTACGG1081 AGGCGTCGTA AACAAGACGC CCTTCGTTCT CGTTTCTGCC GTCCTCGTCT TCATTTATGT1141 CGCCGCTTTC GCCATGGGTC TTGGCCCAAT GCCTGCGCTC ATCGTCGCCG AAATCTTCCG1201 TCAGGGTCCT CGCGCCGCCG CCTATTCCCT CAGTCAAAGC ATTCAGTGGG CCTGCAATCT1261 CATTGTCGTA GCCTCATTTC CTTCGCTCAA CGAGCTATTA AAGGGCTACG TTTATCTGCC1321 GTATCTGGTT GTGGTGGCAG TTTGCTGGGT GGTATTCTTC CTCTTCATGC CGGAGACAAA1381 GAATCGCACC TTTGATGAGG TGGCACGGGA TCTGGCCTTC GGGAGCATCG TGGTGGGTAA1441 ACGCACTGCG GCGCTACAAG CTCCCGTCTT CACCAAGGAG GACGAGGAGG CCGCTACCGC1501 CCTCCGCCGC AGCGACGAAG AGGACGCCAA GGTCGACGCC TAGACTACTC TCTTCACTTT1561 TCCCCCCTTC CTCATCTCTT CATAAAGTGC TGCACTCCCT CCTGTTGTTT GTGTCTCCGT1621 TTTCCCCCAT TCACGCATTC ACTTGCCTTC CATCTCTTTT TACTCAACCT CCGTAGACAA1681 GGTTACTGCG AGGCCAACTC TTCCCTCTCC ATTCTTCCTA TAGATGCGGA AGGTCAGTCA1741 GGATTTCACC ATAGTTTTTG ATGATGAAAA AAAAAA
3.按權(quán)利要求1所述的人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于所述的細胞因子基因為豬γ干擾素(IFN-γ)和豬白細胞介素5(IL-5)。
4.按權(quán)利要求1所述的人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于所述的豬帶絳蟲囊尾蚴抗原基因為保護性抗原基因cC1、cC3、cC4；所述的細胞因子基因為豬γ干擾素(IFN-γ)和豬白細胞介素5(IL-5)。
5.按權(quán)利要求2、4所述的人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于所述的豬帶絳蟲囊尾蚴保護性抗原基因cC1、cC3、cC4為融合表達基因。
6.按權(quán)利要求4所述的人、豬共患囊蟲病核酸疫苗，其特征在于所述的豬帶絳蟲囊尾蚴保護性抗原基因cC1、cC3、cC4，與所述的細胞因子基因豬γ干擾素(IFN-γ)和豬白細胞介素5(IL-5)的關(guān)系是共表達關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,是一種人、豬共患囊蟲病的預防及治療性核酸疫苗。它是由豬帶絳蟲囊尾蚴的三種保護性抗原基因(cC1、cC3、cC4)組成的融合轉(zhuǎn)錄表達單元,與相關(guān)細胞因子[豬γ干擾素(IFN－γ)和豬白細胞介素5(IL－5)]基因的共表達單元共同組成的真核生物表達質(zhì)粒。本核酸疫苗的生產(chǎn)純化工藝十分簡便,理化性質(zhì)穩(wěn)定,便于儲存和運輸,對人、豬共患囊蟲病具有有效的免疫保護作用。
文檔編號C12N15/85GK1231339SQ9911344
公開日1999年10月13日 申請日期1999年1月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者孫樹漢, 戴建新 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學