專利名稱：菊歐氏桿菌小分子細菌素及其發(fā)酵提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明菊歐氏桿菌小分子細菌素及其發(fā)酵提取方法，屬于微生物發(fā)酵工藝和化學(xué)領(lǐng)域，專用于菊歐氏桿菌小分子細菌素的發(fā)酵提取。
菊歐氏桿菌(Erwinia chrysanthemi)是一種重要的植物病原細菌，能引起馬鈴薯、大白菜軟腐和水稻基腐等重要植物病害。產(chǎn)細菌素是細菌中存在的普遍現(xiàn)象。絕大多數(shù)的細菌素研究僅限于一般的性狀描述，對其理化性質(zhì)、遺傳背景等問題均未加以闡明，鑒定了細菌素分子結(jié)構(gòu)的例子就更少，這在一定程度上限制了細菌素的開發(fā)利用。菊歐氏桿菌的細菌素最早于1961年由Y.Homan發(fā)現(xiàn)和研究。1979年，E.Echandi對菊歐氏桿菌的細菌素的形態(tài)和性狀進行了詳細研究，認為菊歐氏桿菌的細菌素是一種熱不穩(wěn)定、抗蛋白酶，形態(tài)上與噬菌體尾部相似的高分子蛋白。1985年，E.Dominique等對9株菊歐氏桿菌產(chǎn)生的細菌素進行了研究，認為菊歐氏桿菌的細菌素為低分子蛋白，對熱不敏感，與大腸桿菌素相似。1987年，發(fā)明人在以B3菌株為材料研究菊歐氏桿菌細菌素時發(fā)現(xiàn)菊歐氏桿菌產(chǎn)生能通過透析膜的小分子細菌素，命名為Echcin。
Echcin對多種動植物病原菌，甚至癌細胞具有很強的抑制作用。然而，菊歐氏桿菌B3菌株在多種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)都不分泌Echcin，這給提取分離工作帶來了困難。
本發(fā)明的目的在于提供細菌素Echcin發(fā)酵提取工藝，提高發(fā)酵產(chǎn)量，將Echcin提取純化，鑒定Echcin分子結(jié)構(gòu)，為Echcin的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明所提供的菊歐氏桿菌小分子細菌素Echcin為一類生物堿。分子量為600-900，其化學(xué)結(jié)構(gòu)基本骨架為
0≤n≤3，含有5個氨基和1個羥基，氨基可位于R1，R2，R3，R4，R5，R6六個位置中任意5個位置。
其中四種細菌素的結(jié)構(gòu)分別為①1，11，19，27，35-五氨基-3-羥基四十烷，分子量為653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羥基四十三烷，分子量為695。③6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羥基四十三烷，分子量為739；④7，18，26，34，42-五氨基-10-羥基四十九烷，分子量為793。
Echcin可以與鹽酸形成鹽酸鹽，其鹽酸鹽極易溶于水，但在水中加入氯化納時可使細菌素的溶解度大幅度降低。
本發(fā)明所述Echcin的發(fā)酵方法為(1)種子培養(yǎng)菊歐氏桿菌B3菌株活化后挑取單菌落，NB培養(yǎng)基28℃-30℃下培養(yǎng)15-28hr。
(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)采用10升的發(fā)酵罐在26-28℃，pH為5-8，每小時通氣500-800升，攪拌器轉(zhuǎn)速500-600轉(zhuǎn)/分\罐壓0.4-0.6磅/立方厘米的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為28-30hr。接種量為1-10％。發(fā)酵期間用溴麝香草酚藍對發(fā)酵質(zhì)量進行快速檢測。
發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)配方為糖5-20克，氨基酸1-3克，鹽0.5-3克，氨水調(diào)pH至7。
本發(fā)明所述Echcin的提取方法為1.發(fā)酵液離心后取上清液，用NaOH調(diào)pH8-12，離心后得上清液A和沉淀物B。
2.取上述沉淀物B加無水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。
3.取上清液A調(diào)pH4-5后，加NaCl至0.5-1.5M，再加10-30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加90-100％乙酸乙酯(V∶V)后得沉淀物E和液相F。
4.沉淀物E和不溶物D合并，加5-20％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取水溶液調(diào)pH8-12，離心后得沉淀物，即為Echcin I粗品，定為組分I。
5.液相F加40％-60％水(V∶V)，取下相與乙醇液C合并后，調(diào)pH8-12，加90-100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加40-60％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至1-3M，加5-15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加2-8倍體積乙酸乙酯，析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定為組分II。
6.組分I主要含Echcin I型細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法獲得Echcin I純品。
7.組分II中含有Echcin II-V型四種細菌素，分離方法是7.1)將組分II的樣品溶解在0.5M NaCl水溶液中做為第一管的下相，加入等體積的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振搖，待兩相分層后，吸上相到已裝有0.5M NaCl(等體積)的第2號分溶管中，第一號分溶管補加新鮮的上相溶液，兩管子同時振搖，待靜置分層后，2號管的上相再移入3號管，1號管的上相再移入2號管，新鮮上相再補充1號管。如此反復(fù)操作，使分配系數(shù)不同的樣品在各分溶管的不斷分配中被分離。逆流分溶20管，回收2-6管的細菌素定為組分III，11-18管的細菌素定為組分IV。
7.2)組分III中含有Echcin II、III兩種細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法將Echcin II和III分開，電洗脫回收獲得Echcin II、Echcin III純品。
7.3)組分IV中含有Echcin IV、V兩種細菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3為逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液為流動上相，逆流分溶60管，將EchcinIV和V分開。在3-9管中含EchcinV，在11-17管中含EchcinIV，回收后獲得Echcin IV、V純品。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的細菌素為一類新的化合物(江蘇省科技情報所查新中心查新結(jié)果)，分子量小。本發(fā)明所提供的細菌素具廣譜抗菌活性，對多種動植物病原細菌、病原真菌和癌細胞具有很強的抑殺活性，最低抑菌濃度分別為0.05-10μg/mL、5-50μg/mL和1-10μg/mL。對耐藥性金黃色球菌的最低抑菌濃度為0.075-1.25μg/mL。采用本發(fā)明所提供的細菌素發(fā)酵方法，細菌素的發(fā)酵效價為512。對工廠化生產(chǎn)具有重要參考意義。本發(fā)明還將細菌素進行分離提純，提取方法得率為61％，并分析其理化性質(zhì)，鑒定其分子結(jié)構(gòu)，為生產(chǎn)開發(fā)研究新藥打下了基礎(chǔ)。


圖1為Echcin I純品和Echcin II、III、IV、V粗品提取流程圖。
圖2為Echcin II、III、IV、V粗品進一步提純流程圖實施例本發(fā)明所述Echcin的發(fā)酵方法為(1)種子培養(yǎng)菊歐氏桿菌B3菌株活化后挑取單菌落，NB培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)28hr。
(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)采用10升的發(fā)酵罐在28℃，pH為6.8，每小時通氣600升，攪拌器轉(zhuǎn)速550轉(zhuǎn)/分\罐壓0.5磅/立方厘米的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為30hr。接種量為2％。發(fā)酵期間用溴麝香草酚藍對發(fā)酵質(zhì)量進行快速檢測。
發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)配方為蔗糖10克，谷氨酸1克，(NH4)2SO41克，氨水調(diào)pH至7。
該方法發(fā)酵效價為512。
上述Echcin的提取方法為1.發(fā)酵液離心后取上清液，用2N NaOH調(diào)pH11，3000rpm離心20′后得上清液A和沉淀物B。
2.取上述沉淀物B加無水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。
3.取上清液A加2N HCl調(diào)pH4后，加NaCl至1M，再加30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加95％乙酸乙酯(V∶V)后得沉淀物E和液相F。
4.沉淀物E和不溶物D合并，加10％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取水溶液加用2NNaOH調(diào)pH11，3000rpm離心20′后得沉淀物，即為Echcin I粗品，定為組分I。
5.液相F加50％水(V∶V)，取下相與乙醇液C合并后，用2N NaOH調(diào)pH11，加100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加50％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至3M，加15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加3倍體積乙酸乙酯，析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定為組分II。
6.組分I主要含Echcin I型細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法獲得Echcin I純品。
7.組分II中含有Echcin II-V型四種細菌素，分離方法是7.1)將組分II的樣品溶解在0.5M NaCl水溶液中做為第一管的下相，加入等體積的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振搖，待兩相分層后，吸上相到已裝有0.5M NaCl(等體積)的第2號分溶管中，第一號分溶管補加新鮮的上相溶液，兩管子同時振搖，待靜置分層后，2號管的上相再移入3號管，1號管的上相再移入2號管，新鮮上相再補充1號管。如此反復(fù)操作，使分配系數(shù)不同的樣品在各分溶管的不斷分配中被分離。逆流分溶20管，回收2-6管的細菌素定為組分III，11-18管的細菌素定為組分IV。
7.2)組分III中含有Echcin II、III兩種細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法將Echcin II和III分開，電洗脫回收獲得Echcin II、Echcin III純品。
7.3)組分IV中含有Echcin IV、V兩種細菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3為逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液為流動上相，逆流分溶60管，將EchcinIV和V分開。在3-9管中含Echcin V，在11-17管中含Echcin IV，回收后獲得Echcin IV、V純品。
該提取方法得率為61％。
Echcin I純品是淡褐色粉末狀固體，其鹽酸鹽易溶于水，不溶于醇、醚、酯等有機溶劑，游離型的Echcin I不溶于水和醇、醚、酯等有機溶劑。Echcin II、III、IV和V純品是白色粉末狀固體，其鹽酸鹽易溶于水、甲醇、乙醇和正丁醇，不溶于丙酮和乙酸乙酯，其游離型不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮，微溶于吡啶和乙酸乙酯，不溶于苯、石油醚和氯仿。Echcin II、III、IV和V鹽酸鹽在含氯化鈉的水溶液中易形成簇晶，各類型細菌素晶形相似，Echcin I不能形成結(jié)晶，在鹽水中只能析出絮狀沉淀。
Echcin II、III、IV和V經(jīng)紅外、紫外、質(zhì)譜和核磁共振光譜分析鑒定，EchcinII、III、IV和V的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為1，11，19，27，35-五氨基-3-羥基四十烷，分子量為653；4，14，22，30，38-五氨基-6-羥基四十三烷，分子量為695；6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羥基四十三烷，分子量為739；7，18，26，34，42-五氨基-10-羥基四十九烷，分子量為793。
權(quán)利要求
1.菊歐氏桿菌小分子細菌素，分子量為600-900，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的基本骨架為
0≤n≤3，含有5個氨基和1個羥基，氨基可位于R1，R2，R3，R4，R5，R6六個位置中任意5個位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊歐氏桿菌細菌素，其特征在于，上述細菌素指的是以下四種①1，11，19，27，35-五氨基-3-羥基四十烷，分子量為653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羥基四十三烷，分子量為695；③6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羥基四十三烷，分子量為739；④7，18，26，34，42-五氨基-10-羥基四十九烷，分子量為793。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的菊歐氏桿菌細菌素，其特征在于，細菌素指的是①1，11，19，27，35-五氨基-3-羥基四十烷，分子量為653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羥基四十三烷，分子量為695。
4.權(quán)利要求1或2所述的菊歐氏桿菌細菌素Echcin的發(fā)酵方法為4.1)種子培養(yǎng)菊歐氏桿菌B3菌株在NB培養(yǎng)基28-30℃下培養(yǎng)15-28hr；4.2)發(fā)酵罐培養(yǎng)在26-28℃，pH為5-8，每小時通氣500-800升，攪拌器轉(zhuǎn)速500-600轉(zhuǎn)/分、罐壓0.4-0.6磅/立方厘米的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為28-30hr，接種量為1-10％(V/V)，發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)配方糖5-20克，氨基酸1-3克，鹽0.5-3克，氨水調(diào)pH至7。
5.權(quán)利要求1-3之一所述的菊歐氏桿菌細菌素Echcin的提取方法為5.1)發(fā)酵液離心后取上清液，用NaOH調(diào)pH8-12，離心后得上清液A和沉淀物B。5.2)取上述沉淀物B加無水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。5.3)取上清液A調(diào)pH3-5后，加NaCl至0.5-1.5M，再加10-30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加90-100％(V∶V)乙酸乙酯后得沉淀物E和液相F。5.4)沉淀物E和不溶物D合并，加5-20％鹽酸水(pH4.0，V∶V)水，取水溶液調(diào)pH8-12，離心后得沉淀物，即為Echcin I粗品，定為組分I。5.5)用液相F加40％-60％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取下相與乙醇液C合并，調(diào)pH8-12h后，加90-100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加40-60％鹽酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至1-3M，加5-15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇加2-8倍體積乙酸乙酯，析出析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定為組分II。5.6)組分I主要含Echcin I型細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法純化，電洗脫回收獲得Echcin I純品。5.7)組分II中含有Echcin II-V型四種細菌素，分離方法是5.7.1)將組分II的樣品溶解在0.5M NaCl水溶液中做為第一管的下相，加入等體積的正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1的混合液(上相)振搖，待兩相分層后，吸上相到已裝有0.5M NaCl(等體積)的第2號分溶管中，第一號分溶管補加新鮮的上相溶液，兩管子同時振搖，待靜置分層后，2號管的上相再移入3號管，1號管的上相再移入2號管，新鮮上相再補充1號管。如此反復(fù)操作，使分配系數(shù)不同的樣品在各分溶管的不斷分配中被分離。逆流分溶20管后，回收2-6管的細菌素定為組分III，11-18管的細菌素定為組分IV。5.7.2)組分III中含有Echcin II、III兩種細菌素，采用瓊脂糖凝膠電泳方法將Echcin II和III分開，電洗脫回收獲得Echcin II、Echcin III純品。5.7.3)組分IV中含有Echcin IV、V兩種細菌素，采用氯仿∶正丁醇∶甲醇＝5∶5∶3為逆流分溶下相，以0.5M NaCl溶液為流動上相，逆流分溶60管，將EchcinIV和V分開。在3-9管中含Echcin V，在11-17管中含Echcin IV，回收后獲得Echcin IV、V純品。
全文摘要
本發(fā)明菊歐氏桿菌小分子細菌素Echcin及其發(fā)酵提取方法,屬于微生物發(fā)酵工藝和化學(xué)領(lǐng)域。菊歐氏桿菌B3菌株能產(chǎn)生生物堿類小分子細菌素,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為0≤n≤3,含有5個氨基和1個羥基,氨基可位于R
文檔編號C12P13/00GK1245164SQ9911436
公開日2000年2月23日 申請日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月10日
發(fā)明者王金生, 劉景晶, 吳健勝, 范豪, 韋忠民 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)