專利名稱：新的人g蛋白亞基及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人G蛋白γ12亞基(humanγ12 subunit of G protein，hG-γ12)的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是牛G蛋白γ12亞基的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
G蛋白(鳥(niǎo)苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白)參與許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑，把細(xì)胞表面受體接受的胞外信號(hào)傳導(dǎo)給胞內(nèi)效應(yīng)物。G蛋白由三個(gè)亞基組成，分別稱為Gα、Gβ和Gγ。當(dāng)三者形成異源三聚體Gαβγ時(shí)處于非活性狀態(tài)，配基激活的受體與這個(gè)異源三聚體偶合后，引起Gα的構(gòu)型變化，釋放鳥(niǎo)苷二磷酸(GDP)，結(jié)合鳥(niǎo)苷三磷酸(GTP)。然后Gβ和Gγ以緊密結(jié)合復(fù)合物的形式(Gβγ)與結(jié)合GTP的Gα發(fā)生解離。游離的Gβγ復(fù)合物和激活的Gα-GTP都能獨(dú)立、協(xié)同、或拮抗地作用于特定的效應(yīng)物分子，從而改變第二信使的濃度，導(dǎo)致特定的細(xì)胞過(guò)程發(fā)生變化。結(jié)合于Gα的GTP水解為GDP，并釋放磷酸，導(dǎo)致Gα失活，Gβγ重新與Gα結(jié)合，最后異源三聚體與受體再次偶合。以上就是G蛋白傳導(dǎo)信號(hào)的機(jī)制(Neer，E.J.1995，Cell 80249-257；Gilman，A.G.1995，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.341406-1419；Dolman，H.G.et al．1991，Annu.Rev.Biochem.60653-688；Casey，P.J.et al．1994 Curr.Opin.Cell.Biol.6219-225)。
G蛋白的三個(gè)亞基都有很多異構(gòu)體。迄今為止，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的β亞基有5種(β1、β2、β3、β4、β5)，γ亞基有11種(γ1、γ2、γ3、γ4、γ5、γ7、γ8、γ10、γ11、γ12、γc)。氨基酸順序比較表明，根據(jù)相似程度的大小，β亞基和γ亞基可分為亞家族，其中γ亞基的差異性更顯著(Gautam，N.et al．1998，Cell Signal 10447-455)。牛γ12亞基的蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)蛋白水解測(cè)序得到，其cDNA序列也相應(yīng)從脾臟中得到。γ12組織分布廣泛，在成纖維細(xì)胞和光滑肌細(xì)胞中含量豐富(Morishila，R.et al．1995，J.Biol.Chem.27029469-26475)。
實(shí)驗(yàn)表明βγ復(fù)合物對(duì)于G蛋白與受體的結(jié)合是必需的，而且是直接起作用的。在某些條件下，βγ復(fù)合物能與受體結(jié)合，且視紫紅質(zhì)(一種受體)C端的肽段能阻礙其相互作用，這提示βγ與受體有直接作用。若G蛋白含有不同的γ亞基，則與視紫紅質(zhì)的偶合效率不同，表明γ亞基直接影響與受體的結(jié)合。從γ1中鑒定出與視紫紅質(zhì)直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，還發(fā)現(xiàn)了與受體結(jié)合所必需的特定殘基(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10447-455)。
βγ復(fù)合物除了對(duì)受體有調(diào)節(jié)作用外，對(duì)效應(yīng)物也有作用。在發(fā)現(xiàn)βγ復(fù)合物能激活K+通道后，其它受βγ復(fù)合物調(diào)節(jié)的效應(yīng)物有腺嘌呤環(huán)化酶、磷脂酶Cβ、電壓門控的Ca+通道、腦Na+通道，這些效應(yīng)物都與βγ復(fù)合物直接作用。其它與βγ復(fù)合物直接作用的蛋白有鈣調(diào)蛋白、β腎上腺素能受體激酶、動(dòng)力蛋白、phosducin、phosducin-like protein，以上這些反應(yīng)會(huì)間接的使細(xì)胞產(chǎn)生變化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10447-455)。
已表明，G蛋白及其亞基與某些疾病相關(guān)。因此，為了治療目的而研究和開(kāi)發(fā)人G蛋白γ亞基及其激動(dòng)劑/抑制劑有重要意義。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸被命名為人G蛋白γ12亞基(human γ12 subunit of Gprotein，簡(jiǎn)稱為“hG-γ12”)基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人hG-γ12蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的hG-γ12多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的hG-γ12核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人hG-γ12蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hG-γ12蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hG-γ12蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人hG-γ12蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人hG-γ12蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為278個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于50-268位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hG-γ12蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中50-268位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框50-268位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中50-268位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少98％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人hG-γ12相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
本發(fā)明的編碼序列可以是DNA或RNA，可以是單鏈或雙鏈。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hG-γ12蛋白多肽”指具有人hG-γ12蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人hG-γ12相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人hG-γ12蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人hG-γ12 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hG-γ12多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hG-γ12多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人hG-γ12多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hG-γ12多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約60個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約70個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人hG-γ12蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hG-γ12多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人hG-γ12保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人hG-γ12多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人hG-γ12的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人hG-γ12多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人hG-γ12的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人hG-γ12核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人hG-γ12多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人hG-γ12 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人hG-γ12基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人hG-γ12基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人hG-γ12蛋白的分子，也包括那些并不影響人hG-γ12蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人hG-γ12基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人hG-γ12基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人hG-γ12或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人hG-γ12功能的抗體以及不影響人hG-γ12功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人hG-γ12基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人hG-γ12基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E..Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人hG-γ12核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆人載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明蛋白的片段，除了用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的43lA型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長(zhǎng)至約2000bp或者更長(zhǎng)的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見(jiàn)Verma等人，Human ChromosomesA Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過(guò)孟德?tīng)?Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(可通過(guò)Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過(guò)連鎖分析來(lái)鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與hG-γ12發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hG-γ12蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hG-γ12蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hG-γ12蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，人hG-γ12的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腎λgtllcDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5′-TTGGACCACACAAAGTCTTACTG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B5＇-CTCTATTCCACTATAAGATGATGC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷約為300bp的目的片段。
對(duì)βγ復(fù)合物的研究發(fā)現(xiàn)，βγ復(fù)合物對(duì)于受體、效應(yīng)物都有作用。βγ復(fù)合物與受體直接作用，受βγ復(fù)合物調(diào)節(jié)的效應(yīng)物有K+通道、腺嘌呤環(huán)化酶、磷脂酶Cβ、電壓門控的Ca+通道、腦Na+通道。還有一些與βγ復(fù)合物直接作用的蛋白鈣調(diào)蛋白、β腎上腺素能受體激酶、動(dòng)力蛋白、phosducin、phosducin-likeprotein，以上這些反應(yīng)會(huì)間接的使細(xì)胞產(chǎn)生變化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10447-455)。
實(shí)驗(yàn)表明γ12性質(zhì)不同于其它γ亞基能被蛋白激酶C磷酸化，磷酸化的βγ12與Gα結(jié)合更緊密(Morishila，R.et al.1995，J.Biol.Chem.27029469-26475)。γ12還能引起成纖維細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加(Ueda，H.et al.1999，J.Biol.Chem.27412124-12128)。
由于本發(fā)明的人hG-γ12具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來(lái)源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒(méi)有)。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人hG-γ12與牛G蛋白γ12亞基(bG-γ12)和大鼠G蛋白γ12亞基(rG-γ12)亞基等3種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標(biāo)出，相似的氨基酸用“.”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人hG-γ12的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以人腎λgtllcDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用-對(duì)寡核苷酸為引物--A5＇-TTGGACCACACAAAGTCTTACTG-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B5′-CTCTATTCCACTATAAGATGATGC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、62℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷約300bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物AB與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共278bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO3，其中開(kāi)放讀框位于50-268位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出人hG-γ12的氨基酸序列，共72個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO4。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人hG-γ12的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平和蛋白水平上與牛G-γ12(gb｜U37561)、大鼠G-γ12(gb｜AF022091)都有較高同源性。在核苷酸水平hG-γ12與牛、大鼠G-γ12的同一性達(dá)分別達(dá)到90％、86％。在蛋白水平上hG-γ12推導(dǎo)蛋白與牛、大鼠G-γ12蛋白的同一性達(dá)都到94％，相似性達(dá)97％、98％(hG-γ12與牛、大鼠三者的同源比較見(jiàn)圖1)。
根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相關(guān)的生物學(xué)原理，可以根據(jù)已知的不同物種中的基因及其編碼蛋白的功能來(lái)推測(cè)本發(fā)明hG-γ12的生物學(xué)功能。
γ亞基有一共同特征翻譯后被脂質(zhì)基團(tuán)-法呢基或牻牛爾牻牛爾基修飾(Fukada，Y.et al.1990，Nature 346658-660)，這一類異戊二烯基團(tuán)連接于離C末端四個(gè)氨基酸的半胱氨酸殘基上，然后γ亞基的最后三個(gè)殘基被水解，羧基被甲基化。這一修飾的脂質(zhì)可能有把蛋白定位于膜上的功能，穩(wěn)定βγ復(fù)合物與α亞基、受體、效應(yīng)物的互相作用。本發(fā)明hG-γ12離C末端四個(gè)氨基酸的殘基是半胱氨酸，提示存在類異戊二烯基團(tuán)的翻譯后修飾以及這一修飾的穩(wěn)定蛋白作用的功能。
βγ復(fù)合物的功能是多方面的，對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)中的受體和效應(yīng)物都有作用。在某些條件下，βγ復(fù)合物能與受體結(jié)合，且視紫紅質(zhì)(一種受體)C端的肽段能阻礙其相互作用，提示βγ與受體有直接作用。若G蛋白含有不同的γ亞基，則與視紫紅質(zhì)的偶合效率不同，表明γ亞基直接影響與受體的結(jié)合。從γ1中鑒定出與視紫紅質(zhì)直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，還發(fā)現(xiàn)了與受體結(jié)合所必需的特定殘基(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10447-455)。
βγ復(fù)合物除了對(duì)受體有調(diào)節(jié)作用外，對(duì)效應(yīng)物也有作用。在發(fā)現(xiàn)βγ復(fù)合物能激活K+通道后，其它受βγ復(fù)合物調(diào)節(jié)的效應(yīng)物有腺嘌呤環(huán)化酶、磷脂酶Cβ、電壓門控的Ca+通道、腦Na+通道，這些效應(yīng)物都與βγ復(fù)合物直接作用。其它與βγ復(fù)合物直接作用的蛋白有鈣調(diào)蛋白、β腎上腺素能受體激酶、動(dòng)力蛋白、phosducin、phosducin-like protein，以上這些反應(yīng)會(huì)間接的使細(xì)胞產(chǎn)生變化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10447-455)。
β亞基和γ亞基種類多，順序上相似，且βγ復(fù)合物功能多樣，這提示各種γ亞基的功能基本相似但又稍有不同。
對(duì)牛γ12亞基的研究表明其性質(zhì)不同于其它γ亞基能被蛋白激酶C磷酸化，磷酸化位點(diǎn)為Ser2。磷酸化的βγ12與Gα結(jié)合更緊密(Morishila，R.et al.1995，J.Biol.Chem.27029469-26475)，但減弱了βγ12激活Ⅱ型腺苷酸環(huán)化酶的活性(Yasuda，H.et al．1998，J.Biol.Chem.27321958-21965)。γ12的另一個(gè)特點(diǎn)是能與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合(Ucda，H.et al．1997，J.Cell Sci.1101503-1511)。雖然不同的α亞基、β亞基、以及參與信號(hào)傳導(dǎo)的酶也與細(xì)胞骨架有作用，但其重要性還不甚清楚。Ueda等人的實(shí)驗(yàn)表明，γ12的表達(dá)能引起成纖維細(xì)胞顯著的變化細(xì)胞變圓，運(yùn)動(dòng)性增加。γ12的這一作用通過(guò)βγ12復(fù)合物發(fā)揮，而且磷酸化也是必須的，因?yàn)棣?2磷酸化位點(diǎn)的缺失(Ser2被替換)導(dǎo)致上述效應(yīng)消失。(Ueda，H.et al.1999，J.Biol.Chem.27412124-12128)。
hG-γ12蛋白的第二位氨基酸為Ser，與牛γ12一致，提示hG-γ12具有蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，是蛋白激酶C的底物。
本發(fā)明的人hG-γ12除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hG-γ12還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hG-γ12的N端與大鼠G-γ12的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人hG-γ12的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hG-γ12核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hG-γ12的表達(dá)水平或者抑制人hG-γ12的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人hG-γ12蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hG-γ12缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人hG-γ12在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人hG-γ12的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hG-γ12 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5-CAAGGTCGACATGTCCAGCAAAACAGCAAG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有SalⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人hG-γ12編碼序列的20個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGAAGCTTCTATAAGATGATGCAAGTT-3(SEQ ID NO.6)，該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人hG-γ12的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacⅠ阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人hG-γ12的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)物以1100-1250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解培養(yǎng)物，收集細(xì)胞裂解液并將其稀釋于6M鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人hG-γ12。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人hG-γ12?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約8kDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人hG-γ12在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人hG-γ12的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hG-γ12cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-CAAGAAGCTTATGTCCAGCAAAACAGCAAG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindⅢ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人hG-γ12編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5-TAGGGGATCCCTATAAGATGATGCAAGTT-3(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人hG-γ12的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，EcoRV酶切驗(yàn)證人hG-γ12的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris· HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為8kDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各l0個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人hG-γ12基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人G蛋白亞基及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.1TTGGACCACA CAAAGTCTTA CTG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2CTCTATTCCA CTATAAGATG ATGC24(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度278bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.31TTGGACCACA CAAAGTCTTA CTGATTTCAG GTAAAAACAA TAATTGAAGA TGTCCAGCAA61 AACAGCAAGC ACCAACAATA TAGCCCAGGC AAGGAGAACT GTGCAGCAGT TAAGATTAGA121 AGCCTCCATT GAAAGAATAA AGGTTTCGAA GGCATCAGCG GACCTCATGT CCTACTGTGA181 GGAACATGCC AGGAGTGACC CTTTGCTGAT AGGAATACCA ACTTCAGAAA ACCCTTTCAA241 GGATAAAAAA ACTTGCATCA TCTTATAGTG GAATAGAG(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度72個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.41 Met Ser Ser Lys Thr Ala Ser Thr Asn Asn Ile Ala Gln Ala Arg16 Arg Thr Val Gln Gln Leu Arg Leu Glu Ala Ser Ile Glu Arg Ile31 Lys Val Ser Lys Ala Ser Ala Asp Leu Met Ser Tyr Cys Glu Glu46 His Ala Arg Ser Asp Pro Leu Leu Ile Gly Ile Pro Thr Ser Glu61 Asn Pro Phe Lys Asp Lys Lys Thr Cys Ile Ile Leu(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.5CAAGGTCGAC ATGTCCAGCA AAACAGCAAG 30(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.6TAGGAAGCTT CTATAAGATG ATGCAAGTT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.7CAAGAAGCTTATGTCCAGCAAAACAGCAAG 30(2)SEQ ID NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.8TAGGGGATCC CTATAAGATG ATGCAAGTT 29
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列。
4．一種分離的人hG-γ12蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hG-γ12蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hG-γ12蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人hG-γ12蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人hG-γ12蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求4所述的人hG-γ12蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種探針?lè)肿?，其特征在于，它含有?quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的編碼人G蛋白γ12亞基(human γ12 subunit of G protein,hG－γ12)的cDNA序列;該cDNA編碼的蛋白是牛G蛋白γ12亞基的同系物。本發(fā)明還提供了由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1287169SQ9911854
公開(kāi)日2001年3月14日 申請(qǐng)日期1999年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月2日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 張宏來(lái), 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)