專利名稱：用于哺乳動物基因表達(dá)的人雜合宿主細(xì)胞的制作方法
相關(guān)申請Cho和Chan的稱作MSB-7254(美國系列號09/209,915)的申請“具有EB病毒末端重復(fù)序列的載體”和Cho等的稱作MSB-7255(美國系列號09/309,916)的申請“因子VIII的表達(dá)系統(tǒng)”包含相關(guān)主題。兩個申請在1998年12月10提交。
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及用于生產(chǎn)生物活性蛋白的遺傳工程化的哺乳動物細(xì)胞系。具體而言，本發(fā)明涉及由人胚胎腎(293S)細(xì)胞和非洲淋巴瘤細(xì)胞融合而來的人雜合細(xì)胞克隆。這些人雜合細(xì)胞可用于生產(chǎn)異源蛋白。
背景迄今為止，多數(shù)治療性重組蛋白由非人哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)。一些實(shí)例是具有可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記二氫葉酸還原酶(Kaufman et al.，1982，Mol.Biol.159601-621；Gasser et al.，1982，Proc Natl Acad Sci USA 796522-6526)的中國倉鼠卵巢(CHO)(dhfr)細(xì)胞(Urlaub et al.，1980，Proc NatlAcad Sci USA 774216-4220)已被用于生產(chǎn)治療性重組蛋白。
已知有多種重組治療性蛋白在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)，如重組因子VIII(rFVIII)(Kaufman et al.，1988，J Biol Chem 1636352-6362)、組織纖溶酶原激活物(tPA)(Goeddel等的美國專利4,766,075，1988)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)(1987年授予Lin的美國專利4,703,008)和單克隆抗體(mAbs)(Boss等的美國專利4,816,397，1989)。
幼倉鼠腎(BHK21)細(xì)胞在G418選擇和氨甲喋呤(MTX)擴(kuò)增G418抗性細(xì)胞后被用于生產(chǎn)rFVIII(Capon等的美國專利4,965,199，1990)。
小鼠骨髓瘤(NSO)細(xì)胞被用于生產(chǎn)工程化的人抗TNF抗體(EHAT)(Boss等的美國專利4,816,397，1989)。但是，這種細(xì)胞系生產(chǎn)的蛋白具有小鼠特異性碳水化合物譜，這對人用是不利的。
一種人細(xì)胞系Namalwa(非洲淋巴瘤來源的)被Wellcome ResearchLaboratory用來生產(chǎn)α干擾素，Tokyo Research Laboratories使用其生產(chǎn)原脲激酶(Satoh et al.，1996，Cytotechnology 18167-185，1996)、組織纖溶酶原激活物(t-PA)(Khan et al.，1995，Biochem Soc Trans 23S99)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Okamoto et al.，1991，Arch BiochemBiophys 286562-568)、干擾素和淋巴毒素(Hosoi et al.，1991，Cytotechnology 517-34)以及粒細(xì)胞集落刺激因子(Hosoi et al.，1991，Cytotechnology 725-32)。但是，這些細(xì)胞很難用DNA轉(zhuǎn)染。
Walls等(1989，Gene 81139-149)報導(dǎo)了在人胚胎腎細(xì)胞(293S細(xì)胞)中使用dhfr/MTX共擴(kuò)增策略表達(dá)功能性蛋白C。已知293細(xì)胞(Stillman et al.，1985，Mol.Cell.Biol.52051-2060)在懸浮液中形成大聚集物，特別是在高鈣濃度下(＞100μM)，高鈣濃度會導(dǎo)致更大的聚集物和更低的細(xì)胞活力(Peshwa et al.，1993，Biotech and Bioeng41179-187)。此處引用的所有參考文獻(xiàn)本文引為參考。
發(fā)明概述現(xiàn)已建立了容易通過電轉(zhuǎn)化或陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并容易改造適于在懸浮培養(yǎng)物中生長的雜合人細(xì)胞克隆。異源蛋白可以使用在人細(xì)胞環(huán)境中低水平(50-100nM)MTX擴(kuò)增來表達(dá)。此外，該細(xì)胞容易改造適于在無血清培養(yǎng)基中生長。
這些細(xì)胞是人胚胎腎(293S)細(xì)胞和非洲淋巴瘤細(xì)胞融合的產(chǎn)物。概況參見

圖1。這些稱為HKB的雜合克隆攜帶有來自HH514-16的缺陷EBV基因組，HH514-16是來自非洲淋巴瘤細(xì)胞P3HR1的細(xì)胞系(Hinuma et al.，1967，J Virol 11045-1051)。P3HR1細(xì)胞攜帶非永生化的EBV。HH514-16是攜帶非永生化EBV的P3HR1的克隆(Hinuma etal.，1967，J Virol 11045-1051)。HH514-16在克隆過程中失去了激動DNA，即潛伏破壞DNA(Rabson et al.，1 983，Proc Natl Acad Sci USA873660-3664)。因此，HKB克隆的EBV是非永生化的病毒，保持在潛伏狀態(tài)。
HKB是適合重組生產(chǎn)治療性蛋白的人雜合宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞通過分別具有不同優(yōu)勢特征的不同親本細(xì)胞系的雜交獲得。具有每一親本細(xì)胞系的優(yōu)勢特征的宿主細(xì)胞由雜交產(chǎn)生的細(xì)胞獲得。
宿主細(xì)胞可以經(jīng)遺傳工程改造來高水平表達(dá)多種蛋白?？赏ㄟ^工程化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白包括但不限于可溶性ICAM-1、重組白介素-4(IL-4)、tPA、EPO、rFVIII和BDD-FVIII(B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII變體)和這些蛋白的衍生物。因子VIII的結(jié)構(gòu)域排列為A1-A2-B-A3-C1-C2，作為一個2351氨基酸的單鏈多肽合成，在轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔時，19氨基酸的信號肽被切除。由于因子VIII是高度糖基化的，高水平表達(dá)(＞0.2 pg/c/d)因子VIII難以實(shí)現(xiàn)(Lind et al.，1995，Eur J Biochem.23219-27；Kaufman et al.，1989，Mol Cell Biol.91233-1242)。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)因子VIII通常比使用類似載體和途徑表達(dá)其它基因要低2-3個數(shù)量級。因子VIII的生產(chǎn)細(xì)胞系的生產(chǎn)率為0.5-，1U/c/d(0.1-0.2pg/c/d)。
現(xiàn)已證實(shí)，因子VIII的B結(jié)構(gòu)域是前凝血劑活性不可或缺的。幾個研究小組報導(dǎo)，使用截短的因子VIII變體獲得了哺乳動物中因子VIII的更高的表達(dá)(Lind et al.，1995，Eur J Biochem 23219-27；Tajima et al.，1990，Proc 6th Int Symp H.T.p.51-63；Almstedt的美國專利5,661,008，1997)。但是，因子VIII變體從一個穩(wěn)定細(xì)胞克隆的表達(dá)水平仍低于1pg/c/d。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管內(nèi)源免疫球蛋白(Ig)沒有表達(dá)，工程化宿主細(xì)胞的重組Ig表達(dá)較高。HKB11細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白具有人特異性糖基化模式。因此，該克隆是生產(chǎn)基因工程Ig和其它蛋白的最佳宿主細(xì)胞。
在本文中，非洲淋巴瘤來源的細(xì)胞是指非洲淋巴瘤細(xì)胞的一種細(xì)胞，來源于非洲淋巴瘤細(xì)胞，來源于非洲淋巴瘤來源的其它細(xì)胞，或是一種上述任一種細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的細(xì)胞?！皝碓从凇痹诖税ǖ幌抻谡Ｓ薪z分裂和轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合或其它用來改變細(xì)胞或制備具有新特性的細(xì)胞的遺傳工程或細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)等過程。同樣，人胚胎腎細(xì)胞來源的細(xì)胞是指人胚胎腎細(xì)胞的一種細(xì)胞，來源于人胚胎腎細(xì)胞，來源于人胚胎腎細(xì)胞來源的另一種細(xì)胞，或是一種上述任一種細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的細(xì)胞。同樣，293S來源的細(xì)胞是指293S細(xì)胞的一種細(xì)胞，來源于293S細(xì)胞，來源于293S來源的另一種細(xì)胞，或是一種上述任一種細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的細(xì)胞。2B8來源的細(xì)胞是指2B8細(xì)胞的一種細(xì)胞，來源于2B8細(xì)胞，來源于2B8來源的另一種細(xì)胞，或是一種上述任一種細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生的細(xì)胞。異源蛋白是指一種細(xì)胞經(jīng)過程改造后產(chǎn)生的蛋白。
附圖簡述圖1顯示HKB細(xì)胞來源的概況。
圖2顯示文中提及的表達(dá)載體的物理圖譜。所有質(zhì)?；趐BR322骨架構(gòu)建，含有dhfr表達(dá)單位。所有編碼目標(biāo)蛋白的基因處于CMV增強(qiáng)子/啟動子(CMVe/p)的調(diào)控之下；5′內(nèi)含子(MIS或CIS)位于基因的5′端，但BZLF1除外。Poly A信號區(qū)標(biāo)記為pA。兩個質(zhì)粒pSH157和pCIS25DTR均含有EBV-TR序列(402bp)。
圖3顯示瞬時轉(zhuǎn)染分析中用于基因表達(dá)的宿主細(xì)胞系的比較。轉(zhuǎn)染在相同條件下進(jìn)行同樣數(shù)量的293S、2B8和HKB11細(xì)胞以等量的質(zhì)粒DNA使用相同的轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后2天收集組織培養(yǎng)液。蛋白生產(chǎn)水平通過ELISA(IgG和ICAM-1；表示為ng蛋白/106細(xì)胞/2日)和Coatest分析試劑盒(rFVIII，表示為毫單位/107/2日)確定。
具體實(shí)施方案材料與方法HH514-16由Dr.George Miller(Yale University)惠贈。293S細(xì)胞獲自Dr.Brad Zerler(Molecular Therapeutic Institute，West Heaven，CT)。293S細(xì)胞是經(jīng)改造適于生長在懸浮培養(yǎng)物中的293S細(xì)胞(ATCCCRL-1573)(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 52051-2060)。
質(zhì)粒本文中使用的所有表達(dá)載體基本上是具有功能性dhfr基因表達(dá)片段的基于pBR322的質(zhì)粒。表達(dá)載體的物理圖譜見圖2。質(zhì)粒pSH157和pCIS25DTR也具有EB病毒的末端重復(fù)序列(EBV-TR)。關(guān)于EBV-TR序列，參見Cho和Chan的稱作MSB-7254的申請“提高藥物選擇比例的EB病毒末端重復(fù)序列”。載體pSH131已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC 98879，它可用來產(chǎn)生選定蛋白的表達(dá)載體，如Cho和Chan所述(MSB-7254，上文)。
ELISA為測定tICAM-1分泌，將ICAM-1的單克隆抗體C92.5(McClellandet al.，1991，Proc Natl Acad Sci USA 887993-7997)吸附在圓底微量板上。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液處理封閉培養(yǎng)板，然后與含有tICAM-1的樣品溫育。平板然后用洗滌緩沖液(PBS加0.005％Tween 20)洗滌，再與抗tICAM-1的另一個表位的第二種單克隆抗體生物素化C78.5(McClelland et al.，1991，上文)溫育。洗滌后，平板與HRP-鏈親和素溫育。平板再用洗滌緩沖液洗滌，與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)，用1N鹽酸終止反應(yīng)。通過450/570nm讀OD值并與純化tICAM-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定tICAM-1濃度。
為了測定免疫球蛋白(Ig)分泌，用抗Ig抗體包被平板，用生物素化抗Ig抗體作為檢測抗體。已知濃度的Ig分子被用作標(biāo)準(zhǔn)。其它方面保持不變。
為了測定白介素-4(IL-4)分泌，用抗IL-4抗體包被平板，用生物素化抗IL-4抗體作為檢測抗體。純化的IL-4分子被用作標(biāo)準(zhǔn)。
測定rFVIII分泌的試驗rFVIII分子用CoatestVIIIC/4試劑盒(Chromogenix，Molndal，Sweden)的試劑定量。被稱為MEGA1的美國標(biāo)準(zhǔn)的抗嗜血因子(因子VIII) (Office of Biologics Research and Review，Bethesda，MD)被用作測定在Select Heat Blocks(VWR Scientific，San Francisco，CA)上預(yù)先加熱到37℃的EIA/RIA A/2平板(Corning，Corning，NY)的標(biāo)準(zhǔn)。將因子IXa、因子X、磷脂和氯化鈣加入各個樣品中，溫育10分鐘以激活因子X。然后加入生色底物(S2222)，溫育10分鐘以釋放生色團(tuán)pNA。該反應(yīng)通過加入50％乙酸終止。然后在SPCETRAmax250分光光度計微量板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于405/450納米測定比色吸收值，數(shù)據(jù)通過Molecular Devices提供的SOFTmaxPRO軟件計算。
HAT敏感和G418抗性非洲淋巴瘤細(xì)胞系的衍生為了獲得HAT敏感細(xì)胞，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷細(xì)胞系(Szybalska et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026-2034，1962；Littlefield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 50568-576，1963)通過Siadak等(美國專利4,834,975，1989)介紹的標(biāo)準(zhǔn)方法建立。
不含EBV激動DNA(Rabson et al.，1983，Proc Natl Acad Sci USA873660-3664)的HH514-16細(xì)胞(獲自Dr.G.Miller，Yale University)用RPMI-1640懸浮培養(yǎng)基(Life Science，Gaithersburg，MD)中的300μg/ml甲磺酸乙酯(MSE)(Sigma，St.Louis，MO)處理24小時，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有15％胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)。用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，細(xì)胞在含有6-巰基鳥嘌呤(6-TG)(Sigma)(5μg/ml)的培養(yǎng)基中鋪平板，以選擇HGPRT陰性細(xì)胞。在6個月的選擇期間，6TG的濃度從5μg/ml增加到30μg/ml。然后測試細(xì)胞對含有HAT的培養(yǎng)基的敏感性。單細(xì)胞克隆(SCC)由HAT敏感群體A5的有限稀釋克隆(96孔板中每孔一個細(xì)胞)獲得。一個SCC即A5/1D7用pSV2neo轉(zhuǎn)染以得到G418抗性細(xì)胞，pSV2neo含有在pBR載體中SV40啟動子控制下的neo基因。一個被稱為2B8的G418(1.5mg/ml)抗性SCC(保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CRL-12569)用于融合。
實(shí)施例1細(xì)胞融合和單細(xì)胞克隆的衍生細(xì)胞融合主要按照Kenentt(1979，Meth Enzymol 585-359)所述的聚乙二醇(PEG)融合法進(jìn)行。處于對數(shù)生長期的293S和2B8細(xì)胞各5,000,000用無鈣離子和鎂離子的PBS洗滌(Life Technologies，Rockville，MD)，接種到用花生凝集素(Sigma，5μg/ml)預(yù)處理的6孔板的一個孔中。裝載有細(xì)胞的6孔板在Beckman J-6M/E離心機(jī)(Beckman，PaloAlto，CA)中于400g離心6分鐘。從細(xì)胞中除去PBS后，細(xì)胞用2ml 40％(w/v)PEG(Sigma)處理1分鐘。作為對照的一個孔不用PEG處理。細(xì)胞用5ml含5％DMSO的PBS洗滌3次，然后用PBS洗滌3次。細(xì)胞與補(bǔ)加有15％FBS的新鮮培養(yǎng)基溫育25分鐘。使用含G418(1mg/ml)和HAT(Life Technology)并補(bǔ)加有15％FBS的新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞接種到96孔板(1.2×106細(xì)胞/板)。細(xì)胞每周兩次使用選擇培養(yǎng)基飼喂。在該實(shí)施例中，初次選擇時，293S細(xì)胞具有對含HAT培養(yǎng)基不敏感的所需特征，類似的是，2B8細(xì)胞具有抗G418的所需特征。
盡管融合細(xì)胞在選擇條件下生長，混合細(xì)胞不在相同條件下生長。選擇后3周，起始群體轉(zhuǎn)移到較大的單元中。為了獲得SCC，將穩(wěn)定生長的20個群體混合，使用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行有限稀釋克隆(一孔一細(xì)胞)。使用顯微鏡仔細(xì)觀察單個克隆，從15×96孔板中選擇出了19個SCC。來源于融合試驗的SCC被稱為HKB細(xì)胞(人腎和B細(xì)胞雜合細(xì)胞)。從轉(zhuǎn)染試驗中選擇7個SCC。進(jìn)一步測試這7個SCC穩(wěn)定生產(chǎn)各種蛋白的情況。7個SCC中的一個HKB11被選作生產(chǎn)異源蛋白的優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞宿主。概況參見圖1。
實(shí)施例2
HKB克隆的鑒定盡管所有雜合細(xì)胞均在選擇條件下選擇，雜合狀態(tài)通過計數(shù)細(xì)胞中的染色體數(shù)目確證。確實(shí)，所有HKB具有90-110的染色體數(shù)目。這些數(shù)目類似于293S和2B8染色體數(shù)目(分別為64和47，根據(jù)ATCC數(shù)據(jù))的總和。293S(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 52051-2060)是適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的293(ATCC CRL-1573)。
通過使用甲醇固定細(xì)胞的直接免疫熒光試驗測定所有雜合細(xì)胞克隆的內(nèi)源Ig(μ和κ)表達(dá)，以確定哪些細(xì)胞克隆分泌內(nèi)源Ig。在較長期的重復(fù)試驗中，根據(jù)免疫熒光試驗(表1)和ELISA(數(shù)據(jù)未示出)觀察到這些細(xì)胞μ和κ鏈表達(dá)是陰性的。
表1 Ig基因表達(dá)的檢測
表1顯示3類細(xì)胞免疫熒光試驗觀察到的結(jié)果。細(xì)胞重懸于PBS中，制成玻璃涂片。細(xì)胞干燥后，在冷(-20℃)甲醇中固定涂片5分鐘。細(xì)胞用FITC-抗人κ和抗人μ鏈(1∶20稀釋)(Zymed Laboratories，Inc.，So.Fan Francisco，CA)在濕盒中37℃染色45分鐘。用PBS洗涂片10分鐘后，涂片用PBS/甘油(1∶1)以蓋玻片封固。細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)。
α(2-6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的人特異性模式唾液酸連鍵使用FITC輟合的西洋接骨木凝集素(SNA)(Sigma，St.Louis，MO)通過HKB細(xì)胞的FACS分析證實(shí)。通過寡糖足跡法(數(shù)據(jù)未示出)分析，HKB細(xì)胞分泌的蛋白(克隆1G2)顯示α(2-3)和α(2-6)連鍵唾液酸的糖基化模式。這表明由293S和2B8細(xì)胞融合得到的HKB細(xì)胞保持了人特異性糖基化酶。
為了測試這些雜合細(xì)胞是否具有表達(dá)外源基因的能力，細(xì)胞用ICAM-1和IgG(抗TNF抗體)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。為了測試IgG的分泌，HKB細(xì)胞(5×106細(xì)胞)通過電轉(zhuǎn)化以10μg提供重鏈(γ)和輕鏈(κ)的功能性表達(dá)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。為了測試可溶性ICAM-1的分泌水平，HKB細(xì)胞(5×106細(xì)胞)通過電轉(zhuǎn)化以10μg提供可溶性ICAM-l的功能性表達(dá)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。通過ELISA確定IgG或ICAM-1的分泌水平。所有19個SCC在瞬時轉(zhuǎn)染試驗中分泌相對高水平的ICAM-1(100-500ng/ml/ad)和IgG(30-200ng/ml/2d)(表2)。這些數(shù)據(jù)表明，這些雜合細(xì)胞支持轉(zhuǎn)染Ig基因的表達(dá)，盡管內(nèi)源Ig基因表達(dá)終止。
表2.克隆早期獲得的HKB克隆IgG和可溶性ICAM分泌瞬時轉(zhuǎn)染試驗，數(shù)值是蛋白的分泌水平(ng/ml/2d)
nd＝未試驗
EB病毒(EBV)在2B8細(xì)胞中以附加體形式存在。所有SCC的EBNA-1表達(dá)陽性(數(shù)據(jù)未示出)，這表明它們是EBV陽性的。但是，尚不清楚在雜合細(xì)胞中是否還存在完整EBV基因組。因此，雜合細(xì)胞中EBV基因組的狀態(tài)通過用EBV基因組片段BZLF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞來測定，BZLF1是潛伏破壞反式激活基因。HKB細(xì)胞(5×106細(xì)胞)用允許BZLF1功能性表達(dá)的10μg質(zhì)粒DNA(pSH121)轉(zhuǎn)染。EBV衣殼抗原(EBV-VCA)使用含有抗EBV-VCA滴度和FITC輟合的抗人IgG的人血清通過間接免疫熒光進(jìn)行檢測。免疫熒光的技術(shù)細(xì)節(jié)如上所述。如表3所示，模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的EBV衣殼抗原(EBV-VCA)表達(dá)是陰性的，這表明其中EBV復(fù)制是陰性的。但是，少量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗原表達(dá)是陽性的。這些數(shù)據(jù)表明雜合細(xì)胞攜帶潛伏形式的EBV基因組。
表3.BZLF1轉(zhuǎn)染的EBV復(fù)制誘導(dǎo)
在搖瓶中通過依次2倍稀釋FBS使雜合細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。2周后，細(xì)胞生長在無FBS的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在搖瓶中長成小聚集物。與293S細(xì)胞不同，雜合細(xì)胞容易適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)。添加有轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素的無血清和無白蛋白培養(yǎng)基中，雜合細(xì)胞可以使用搖瓶作為懸浮培養(yǎng)物維持1年以上。
為了比較轉(zhuǎn)染基因產(chǎn)物的水平，一個克隆HKB11與親本細(xì)胞293S和2B8用pSM98(可溶性ICAM-1)、pSH125(抗TNF IgG)和pCISF8(rFVIII)轉(zhuǎn)染。如圖3所示，HKB11細(xì)胞中ICAM-1和IgG的分泌水平大大高于293S細(xì)胞(約10倍)。2B8的2種蛋白分泌水平不可檢測。HKB11細(xì)胞中rFVIII的分泌水平類似于293S細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明HKB11細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于親本細(xì)胞。
實(shí)施例3穩(wěn)定分泌異源蛋白的HKB克隆的衍生在基因擴(kuò)增系統(tǒng)(dhfr/MTX)中測試雜合克隆的穩(wěn)定蛋白表達(dá)。細(xì)胞首先用合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞(通常每個96孔板上106細(xì)胞)接種到無次黃嘌呤和胸腺嘧啶但添加了FBS和MTX(50nm)的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇/擴(kuò)增。對平板進(jìn)行第一輪篩選后，選擇高分泌孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到6孔板上。6孔板上的細(xì)胞以含有更高濃度MTX(100、200和400 nM)的培養(yǎng)基進(jìn)一步擴(kuò)增。對6孔板上的起始群體進(jìn)行進(jìn)一步篩選以衍生最后的群體。最后，這些群體用來克隆單細(xì)胞衍生的克隆。如表4所示，HKB11細(xì)胞最適合用來產(chǎn)生高水平異源人蛋白。用于生產(chǎn)ICAM-1、Ig和IL-4衍生物時，HKB11細(xì)胞同CHO細(xì)胞一樣優(yōu)良(數(shù)據(jù)未示出)。但是，HKB克隆生長較CHO克隆更快，容易適應(yīng)懸浮培養(yǎng)和無血清條件。用于生產(chǎn)BDD-FVIII時，HKB11克隆顯示出較CHO克隆高10倍的產(chǎn)率。上述結(jié)果表明，HKB11細(xì)胞是用于表達(dá)治療性人蛋白的最佳人細(xì)胞宿主。
表4.HKB克隆的異源蛋白生產(chǎn)蛋白細(xì)胞宿主MTX擴(kuò)增特異性產(chǎn)率ICAM-1HKB11 100nM 10pg/c/d1Ig HKB13 50nM 12pg/c/dBDD-FVIII HKB11 400nM 5-10uU/c/d2IL-4SA HKB11 100nM 5pg/c/d31.HKB克隆的ICAM-1生產(chǎn)水平類似于293S細(xì)胞。分泌ICAM-1的HKB克隆容易適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，而293S克隆難以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。
2.BDD-FVIII分泌水平高于以相同表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞衍生的克隆約10倍3.使用HKB11轉(zhuǎn)染后6個月可以產(chǎn)生克數(shù)級IL-4SA(T13D/R121E)，而使用相同表達(dá)載體和類似方法在相同試驗中采用CHO細(xì)胞所需時間要多幾個月。
上述方法衍生的細(xì)胞系包括(i)在100nM MTX中擴(kuò)增后以pSM98轉(zhuǎn)染的HKB11細(xì)胞衍生的可溶性ICAM-1分泌克隆(10pg/細(xì)胞/日)，(ii)在50nM MTX中擴(kuò)增和無MTX有限稀釋克隆后以pSS125轉(zhuǎn)柒的HKB13細(xì)胞衍生的單克隆抗體(抗TNF)分泌單細(xì)胞克隆(12pg/細(xì)胞/日)，(iii)在400nM MTX中擴(kuò)增和無MTX有限稀釋克隆后以pCIS25DTR轉(zhuǎn)染的HKB11細(xì)胞衍生的截短的rFVIII(BDD-FVIII)分泌單細(xì)胞克隆(5-10μU/c/d，無血清條件下)，(iv)MTX擴(kuò)增后以pSH157轉(zhuǎn)染的HKB11細(xì)胞衍生的IL-4衍生物(IL-4選擇性激動劑IL-4SA；兩個位置氨基酸突變，即T13D和R121E)分泌克隆(5pg/c/d)。IL-4SA分泌HKB克隆1G2用來相對快速生產(chǎn)少量蛋白(克數(shù)級)。上述表達(dá)載體的物理圖譜參見圖2。
討論本文所述雜合人細(xì)胞系表現(xiàn)出其親本細(xì)胞系具有的有利特征。HKB細(xì)胞系是通過人胚胎腎細(xì)胞(或來源于人胚胎腎細(xì)胞的細(xì)胞)與非洲淋巴瘤細(xì)胞(或來源于非洲淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞)的融合產(chǎn)生的，它可用于發(fā)展表達(dá)異源蛋白的細(xì)胞系。
建立293S和2B8雜合細(xì)胞系的最初目的是解決293S細(xì)胞的聚集問題，它們在懸浮培養(yǎng)時容易結(jié)塊(不利的特征)。由雜合過程得到的HKB細(xì)胞在T形瓶中培養(yǎng)時長成單層。但是，這些細(xì)胞以懸浮方式培養(yǎng)時以懸浮細(xì)胞形式生長(不形成大的聚集物)。HKB細(xì)胞容易轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率大大高于293S細(xì)胞。
盡管在產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系的大多數(shù)情況下需要的轉(zhuǎn)化或雜交事件可能導(dǎo)致改變的糖基化模式(Yamashita，1989，J Biol Chem 2642415-2423)，但發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞雜合細(xì)胞系HKB11具有典型的人糖基化酶，例如α(2-3)和α(2-6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶。而且，轉(zhuǎn)染HKB細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白具有α(2-3)和α(2-6)唾液酸連鍵的正常人糖基化模式。
總而言之，HKB是具有各個親本細(xì)胞系的有利特征的雜合人細(xì)胞，即在懸浮培養(yǎng)時無聚集(同2B8細(xì)胞)，容易轉(zhuǎn)染和有利的分泌特征(同293S細(xì)胞)。優(yōu)選的雜合人細(xì)胞系HKB11同293S細(xì)胞一樣，免疫球蛋白基因表達(dá)是陰性的。這一性狀在重組生產(chǎn)人細(xì)胞的單克隆抗體時是有利的。發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞融合產(chǎn)生了具有有利特征的細(xì)胞的事實(shí)會促進(jìn)使用293S和B細(xì)胞來源的其它細(xì)胞系如Namalwa和6F11進(jìn)行人細(xì)胞融合的進(jìn)一步研究，從而由不同親本細(xì)胞系融合得到的雜合細(xì)胞中獲得性狀的新組合。
上述實(shí)施例旨在說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易設(shè)想到其它改變形式。因此，本發(fā)明范圍僅由權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.由人胚胎腎來源的一種細(xì)胞與非洲淋巴瘤來源的一種細(xì)胞融合衍生的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中人胚胎腎來源的細(xì)胞是293來源的一種細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中人胚胎腎來源的細(xì)胞是293S來源的一種細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中非洲淋巴瘤來源的細(xì)胞是2B9細(xì)胞(ATCC保藏號CRL-12569)
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其表達(dá)一種異源蛋白。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中異源蛋白選自FVIII、BDD-FVIII、單克隆抗體、抗TNF抗體、rIL4、tPA和EPO。
7.一種稱為HKB11的細(xì)胞系(ATCC保藏號CRL-12568)。
8.一種表達(dá)異源蛋白的細(xì)胞系，該細(xì)胞系來源于稱為HKB11的細(xì)胞系(ATCC保藏號CRL-12568)。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是ICAM-1。
10.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是BDD-FVIII。
11.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是單克隆抗體。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞系，其中單克隆抗體是抗TNF。
13.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是rIL4。
14.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是FVIII。
15.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是tPA。
16.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是EPO。
17.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是IL-4SA(T13D/R121E)，所述細(xì)胞系稱為1G2(ATCC保藏號PTA-87)。
18.權(quán)利要求8的細(xì)胞系，其中蛋白是具有人糖基化模式的人蛋白。
19.制備用于表達(dá)異源蛋白的雜合人細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)獲得具有第一種有利特征的人胚胎腎來源的細(xì)胞，b)獲得具有第二種有利特征的人非洲淋巴瘤來源的細(xì)胞，c)將步驟a)的細(xì)胞與步驟b)的細(xì)胞在允許細(xì)胞融合的條件下接觸，d)由步驟c)獲得的細(xì)胞篩選具有步驟a)和步驟b)的細(xì)胞的至少一種有利特征的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中人胚胎腎來源的細(xì)胞是293來源的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的方法，其中人胚胎腎來源的細(xì)胞是293S來源的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中非洲淋巴瘤來源的細(xì)胞是2B8細(xì)胞(ATCC保藏號CRL-12569)。
全文摘要
人/人雜合細(xì)胞可通過人胚胎腎細(xì)胞(293S)和改良非洲淋巴瘤細(xì)胞(2B8)的融合制備。融合細(xì)胞可用作重組表達(dá)哺乳動物基因的宿主細(xì)胞。使用這些稱作HKB的人腎－和B－細(xì)胞雜合克隆進(jìn)行哺乳動物基因表達(dá)的優(yōu)勢包括(ⅰ)細(xì)胞是免疫球蛋白表達(dá)陰性的,(ⅱ)細(xì)胞在搖瓶或發(fā)酵罐中的無血漿蛋白的培養(yǎng)基(添加或不添加重組胰島素)中作為懸浮培養(yǎng)物容易培養(yǎng),(ⅲ)細(xì)胞極易為DNA轉(zhuǎn)染,以及(ⅳ)細(xì)胞分泌高水平異源重組蛋白,如重組單克隆抗體、可溶性ICAM－1、rIL－4和rFVIII。
文檔編號C12N5/16GK1339063SQ99814299
公開日2002年3月6日 申請日期1999年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月10日
發(fā)明者M·S·曹 申請人:美國拜爾公司