專利名稱：Aβ－肽的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定γ-分泌酶活性的方法，本方法的各成分及其應用。
阿爾茨海默(Alzheimer)病是一種腦部的神經(jīng)變性疾病，在細胞水平，其伴隨著外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞大腦皮層內(nèi)大量神經(jīng)元的丟失。在受累的大腦部位，從分子水平來講，蛋白的沉積-通稱為“老年斑”-可在分子水平被檢測到，這是阿爾茨海默病的基本特征。在這些斑塊內(nèi)的主要蛋白為由40-42個氨基酸組成的多肽，其被稱為Aβ-肽。這種肽是由695-770個氨基酸組成的大分子蛋白即β-淀粉樣前體蛋白(APP)的裂解產(chǎn)物。
APP是一個完整的跨膜蛋白，其首先橫跨脂質(zhì)雙層。該蛋白分子的大部分暴露在細胞外，只有小部分C-末端區(qū)域存在于胞漿內(nèi)(

圖1)。Aβ-肽在圖1被示為暗灰色。大約2/3的Aβ-肽分子來自APP的細胞外區(qū)域，而余下的1/3來自其跨膜區(qū)。
除了與膜結(jié)合的APP外，可檢測到一種分泌型淀粉樣前體蛋白，其由APP大的細胞外區(qū)域組成，被稱為APPsec(“分泌型APP”)。APPsec是由APP被蛋白水解斷裂而成，此過程由α-分泌酶完成。這一發(fā)生在APP氨基酸序列內(nèi)部的蛋白水解的斷裂位點處于Aβ-肽氨基酸序列內(nèi)(Aβ-肽第16位氨基酸殘基后)。因此，由α-分泌酶對APP的蛋白水解不能形成Aβ-肽。
那么，Aβ-肽只能由APP其它的加工途徑產(chǎn)生。有一種假說提出，另外兩種蛋白酶參與了這一加工途徑。其中之一為β-分泌酶，在APP分子內(nèi)的Aβ-肽的N-末端斷裂；第二個蛋白酶被稱為γ-分泌酶，可釋放Aβ-肽的C-末端(Kang，J.等，Nature，325，733)(圖1)。
到目前為止，尚無法鑒別三種分泌酶或蛋白酶(α-分泌酶，β-分泌酶，γ-分泌酶)中的任何一種。然而，對于這些分泌酶的了解和認識是一項很有意義的課題，尤其是對阿爾茨海默病的探討及鑒別參與其中的蛋白質(zhì)，從而作為進一步研究的靶蛋白。從一方面講，通過抑制β-分泌酶，尤其是γ-分泌酶可導致Aβ-肽合成減少；另一方面，激活α-分泌酶可增加APP的加工合成APPsec，從而同時降低Aβ-肽的合成。正是根據(jù)這樣的研究方案，人們發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲(C.elegans)，這一發(fā)現(xiàn)報道在未公開的德國專利申請19849 073.9號中。
大量的實驗證據(jù)表明，Aβ-肽是阿爾茨海默病發(fā)病的關(guān)鍵因素。其中，Aβ-原纖維的神經(jīng)毒性在細胞培養(yǎng)中得到了證實(Yankner，B.A等，(1990)，Proc Natl Acad Sci USA，87，9020)。對于患有唐氏綜合征的病人，即此種病人具有一份額外的APP基因拷貝，甚至在30歲的年齡腦內(nèi)就有阿爾茨海默病的神經(jīng)病理學特征。在這里，有人認為是由于APP的過多表達，從而導致轉(zhuǎn)換合成Aβ-肽增加(Rumble，B等，(1989)，N.Engl.J.Med.，320，1446)。
關(guān)于Aβ-肽重要作用的最強證據(jù)可能要屬家族性阿爾茨海默病了。這里，在APP基因內(nèi)圍繞β-和γ-分泌酶的裂解位點或在另外兩個阿爾茨海默病相關(guān)基因(presenilins)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多個突變，從而導致培養(yǎng)細胞內(nèi)的Aβ-肽的產(chǎn)量明顯增加(Scheuner，D.等，(1996)，Nature Medicine，2，864)。
已有大量的實驗證據(jù)表明，在加工過程中，APP首先被β-分泌酶裂解為Aβ-多肽，然后，后者作為γ-分泌酶的反應底物(Maruyama，K.Y.等，(1994)Biochem.Biophys Res Commun，202，1517；Estus，S.等，(1992)，Science，255，726)。因此，γ-分泌酶在Aβ-肽的形成中具有重要作用。為了檢測γ-分泌酶的活性，通常是通過測定Aβ-肽，然而，這通常是很困難的。
這種困難的重要原因是只有小部分的APP被轉(zhuǎn)化成Aβ-肽(SimonsM等，Neurosci(1996)1；16(3)899-908)。此外，Aβ-肽是唯一很小的裂解片段，大約4kDa，同時，由于它具有疏水性，很易自聚，因此在生理狀態(tài)下很易沉淀(Hilbich，C.等，(1991)J.Mol.Biol.，218，149)。
檢測真核細胞內(nèi)的Aβ-肽是通過免疫生物學的方法進行的，比如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀和蛋白雜交(Suzuki，N.等，Science 1994，27，264(5163)1336；Haass，C.等，(1992)Nature，359，322)。這些檢測方法的工作量相對較大，因為它們牽扯到要與合適的抗體溫育和必需破壞所用細胞，這些細胞可能來源于培養(yǎng)細胞或生物體模型(如秀麗新小桿秀麗新小桿線蟲秀麗新小桿線蟲)。
本發(fā)明涉及一種測定γ-分泌酶活性和檢測γ-分泌酶的新方法；本方法的特定實施方案一方面涉及對γ-分泌酶或編碼γ-分泌酶的cDNA的鑒定方法；另一方面涉及對可抑制γ-分泌酶活性的有效物質(zhì)的鑒定方法。這些物質(zhì)具有特別重要的意義，例如，因為它們可被當作藥理學活性化合物，比如，可用于治療阿爾茨海默病。
本發(fā)明涉及一種檢測γ-分泌酶的方法，其中1.制備和應用一種轉(zhuǎn)基因，其編碼一個融合蛋白和包含下列組成成分a)第一核苷酸序列，其編碼的蛋白包含氨基酸序列
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼一個信號肽的第二核苷酸序列，c)一個啟動子，和d)如果必要，額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎麅?nèi)，并表達融合蛋白；3.該融合蛋白被細胞內(nèi)的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列內(nèi)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4.檢測第一片段蛋白和/或第二片段蛋白。本發(fā)明還涉及一種γ-分泌酶活性的測定方法，其中1.制備和應用一種轉(zhuǎn)基因，其編碼一個融合蛋白和包含下列組成成分a)第一核苷酸序列，其編碼包含氨基酸GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼一個信號肽的第二核苷酸序列。
c)一個啟動子，和，d)如果必要，額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎麅?nèi)，并表達融合蛋白；3.該融合蛋白被細胞內(nèi)的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列內(nèi)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白；4.測定第二片段蛋白的含量，且由第二片段蛋白的形成量確定γ-分泌酶活性。
這些方法(“Aβ-肽篩選方法”，“γ-分泌酶測定方法”)適合于在體測定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性，并有可能被廣泛應用，例如，其甚至可用于高通量篩選技術(shù)(“HTS”)。本系列方法避免了上述常規(guī)檢測方法的弊端，尤其是不需要費力的分離和檢測布驟。這一方案的根據(jù)是，APP的C-末端片段被γ-分泌酶裂解成兩個片段，第一個片段蛋白包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)，第二個片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)，包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白可擴散到細胞的胞漿中(圖2)。在胞漿內(nèi)的該第二個片段蛋白很容易被檢測到，比如，借助于一個報告基因；從而用于檢測γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性。γ-分泌酶的裂解位點位于APP的跨膜區(qū)域(Kang，J.等，(1987)Nature，325，733)。APP跨膜區(qū)域的氨基酸序列為GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVITLVML。γ-分泌酶在V40、A42或T43之后的氨基酸位點斷裂。與此相比，培養(yǎng)的真核細胞產(chǎn)生的Aβ-肽被分泌到上清培養(yǎng)液內(nèi)。
借助于適當?shù)膱蟾嫦到y(tǒng)，釋放的第二片斷蛋白可激活報告蛋白的表達，這一蛋白在真核細胞內(nèi)可被檢測到。通過對報告蛋白的檢測，可以證明在APP分子中發(fā)生了γ-分泌酶裂解作用。結(jié)果，γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性可被定性或定量地測定。
這一測量方法的組成可更為詳細地描述如下第一核苷酸序列編碼淀粉樣前體蛋白(APP)或其部分。優(yōu)選地，第一核苷酸序列編碼的蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO.4；SEQ IDNO.4包含SEQ ID NO.1。
第二核苷酸序列編碼一個信號肽，優(yōu)選APP的信號肽(此后縮寫為SP”)。例如，這個信號肽(SP)包含氨基酸序列SEQ IDNO.5。
作為啟動子，最可能使用可調(diào)節(jié)的或組成型啟動子。比如，可為適合在哺乳細胞、秀麗新小桿線蟲、酵母或果蠅細胞內(nèi)表達蛋白的啟動子。比如適合于哺乳細胞的啟動子有CMV(如，Clontech，Heidelberg，德國)、HSV TK(如，Clontech)、RSV(如，Invitrogen，NV Leek，荷蘭)、SV40(如，Clontech)和LTR(如，Clontech)。再如，用于秀麗新小桿線蟲的啟動子有uncl19，unc54，hsp16-2，GOA1和sel-12。對于酵母表達，啟動子ADH1(組成型)(Vlckova等(1994)Gene，25(5)，472-4)，Gal1(條件性可誘導的)(Selleck等(1987)Nature 325，173-7)，MET3(條件性)(Cherest等，(1987)Mol Gen Genet 210，307-13)和Met25更為合適。對于果蠅，舉例說明，可能用啟動子MT(金屬硫蛋白)(如，Invitrogen)，Ac5(Invitrogen)或Ds47(Invitrogen)。
優(yōu)選地，真核細胞被用于本檢測方法，如人類細胞或非人類的細胞，如猴、倉鼠、小鼠、果蠅、斑馬魚或酵母。比如，使用HeLa，293，H4，SH-SY5Y，H9，Cos，CHO，N2A，SL-2或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞。本發(fā)明的一個具體實施方案中使用了秀麗新小桿線蟲細胞。這個細胞可以是一個轉(zhuǎn)基因的非人動物的組成部分。在一個具體實施方案中，轉(zhuǎn)基因細胞可以是轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的組成部分。本發(fā)明特別涉及使用酵母細胞的檢測方法，如來自MAV203菌株(Life Technologies公司，Rockville鎮(zhèn)，馬里蘭州，美國)或EGY48(OriGene Technologies，Inc.，Rockville鎮(zhèn)，馬里蘭州，美國)的細胞。
所述轉(zhuǎn)基因編碼一個融合蛋白；這個融合蛋白由第一和第二核苷酸序列和必要時的額外的核苷酸序列編碼的部分蛋白組成。因此，這個融合蛋白包含了第一片段蛋白和第二片段蛋白及適當時的其它片段蛋白。這個融合蛋白的氨基酸序列例如為SEQ ID NO.6。
詳細地講，具有核苷酸序列SEQ ID NO.8的轉(zhuǎn)基因可用于本測定方法。在本發(fā)明方法的一個特別優(yōu)選的實施方案中，這個轉(zhuǎn)基因存在于一個表達載體上。該重組表達載體上有核苷酸序列SEQ ID NO.9。本發(fā)明的該具體方案也被稱為SP-C100-Gal 4-VP16系統(tǒng)。此時，一個由APP信號肽、APP的C100片段、Gal4和VP16組成的融合蛋白被表達。這個蛋白位于跨膜區(qū)域，在C100片段和第二片段蛋白-即包含部分C100片段、Gal4和VP16的融合蛋白部分-內(nèi)被裂解，在報告質(zhì)粒的協(xié)助下可被檢測。
除了轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體SPC100-Gal4-VP16外，其它報告基因構(gòu)建體也是很可行的，例如，轉(zhuǎn)錄激活域可被插到SPC100跨膜區(qū)和胞漿區(qū)之間，或一個標簽(Tag，如MYC，F(xiàn)LAG)插在N-和C-末端及在SPC100跨膜區(qū)和胞漿區(qū)之間。
所述額外的編碼核苷酸序列可編碼例如一種蛋白，且這個蛋白可用于第二片段蛋白的檢測。優(yōu)選該額外的編碼核苷酸序列位于第一核苷酸序列的3’末端。該額外的編碼核苷酸序列例如編碼一種嵌合蛋白或另一蛋白，這一蛋白由數(shù)個不同功能域構(gòu)成，如包含DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域的蛋白。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，該額外的編碼核苷酸序列編碼一個由Gal4-結(jié)合域和VP16的轉(zhuǎn)錄激活域(Gal4-VP16)組成的蛋白，該另外的片段蛋白優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ IDNO.7。對于酵母細胞，這個額外蛋白還有LexA-結(jié)合域(即，LexA-VP16)。這個額外蛋白特別適合于應用酵母細胞株EGY48的本檢測方法。
特別是，本發(fā)明涉及其中所用細胞共轉(zhuǎn)染了報告質(zhì)粒的檢測方法。報告質(zhì)粒包含的報告基因是在可調(diào)控啟動子控制之下的。舉例說明，這個報告基因可編碼綠色熒光蛋白(GFP)和它的衍生物，如增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)、EBFP、EYFP、d2EGFP、GFPuv或熒光素酶(如，Promega，Mannheim，德國)、CAT(如，Promega)、SEAP(如Clontech)、βGal(如Clontech)或細胞凋亡誘導因子，如Fas、TNF-R1、死亡域和類似物(Tartaglia等(1993)Cell 74，845-53)、ced3、ced4、ced9。對于可調(diào)啟動子，報告質(zhì)?？砂鏗IV的最小啟動子、CD4啟動子或mec7啟動子。對于最適合的可調(diào)啟動子的選擇主要取決于所用的轉(zhuǎn)錄-激活域。
本發(fā)明的一個具體實施方案涉及測定方法的具體執(zhí)行，所用細胞為酵母細胞。作為酵母表達載體pDBTRP(Life Technologies Inc.)(SEQ ID NO.11)-其中在一具體方案中使用MET-25啟動子(見SEQ IDNO.12)-的替代，可以選擇帶有不同啟動子(如誘導型Gal1啟動子和MET-25啟動子或組成性活性ADH1啟動子)和不同選擇標記(ADE，LEU，TRP，HIS，LYS，PHE)的其它大量表達載體。
一個具體實施方案中，使用酵母細胞，其包含穩(wěn)定地整合在基因組或存在于染色體外的Gal4或Lex可誘導性報告基因。
對于這些實施方案，優(yōu)選使用酵母細胞株MaV203(LifeTechnologies，Rockville，MD，U.S.A.)或EGY48(OrigeneTechnologies，Inc.Rockville，MD，U.S.A.)。
本發(fā)明方法的的一個具體實施方案涉及使用被額外的重組載體轉(zhuǎn)染了的細胞。優(yōu)選，這些實施方案中所用細胞正常情況下沒有或幾乎沒有內(nèi)源性γ-分泌酶或用上述提到的測定方法不能檢測到內(nèi)源性γ-分泌酶的活性。這類細胞可被額外的表達載體轉(zhuǎn)化，這個表達載體含有編碼γ-分泌酶的核苷酸序列-優(yōu)選cDNA。例如，可以使用cDNA文庫。此外，本發(fā)明方法的該實施方案可特別用于鑒定γ-分泌酶或編碼γ-分泌酶的cDNA。用于搜索γ-分泌酶的cDNA文庫可從細胞或組織制備，如，B淋巴細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、腦海馬細胞、全腦、胎盤、腎臟。優(yōu)選，由人類細胞或人類組織制備cDNA，但也可由其動物生物體(如，豚鼠、大鼠、小鼠、狗、猴)制備。
如果在細胞未被轉(zhuǎn)染的情況下不表現(xiàn)γ-分泌酶的活性，而轉(zhuǎn)染cDNA文庫后可表現(xiàn)γ-分泌酶活性，則存在于細胞內(nèi)的cDNA可編碼γ-分泌酶。通過已知的方法可從表現(xiàn)上述行為的細胞內(nèi)分離和鑒別cDNA。
本發(fā)明還涉及一種編碼一個融合蛋白并包含如下組成成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，c)啟動子，和d)在第一核苷酸序列的3’-末端、編碼一個DNA-結(jié)合域和一個轉(zhuǎn)錄激活域的至少一個額外的核苷酸序列。
優(yōu)選第一核苷酸序列編碼APP或部分APP。舉例說明，這個轉(zhuǎn)基因擁有的核苷酸序列SEQ ID NO.8。這個轉(zhuǎn)基可構(gòu)建到一個表達載體上。例如，這個表達載體的核苷酸序列為SEQ ID NO.9。
本發(fā)明方法涉及轉(zhuǎn)基因和/或表達載體用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細胞的應用。這類細胞可以是非人生物體的組成部分。例如，該轉(zhuǎn)基因和/或表達載體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。在另一個具體實施方案中，該轉(zhuǎn)基因和/或表達載體可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因酵母細胞，如釀酒酵母細胞。
本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生非人類生物如轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的方法，其中轉(zhuǎn)基因和/或包含一個轉(zhuǎn)基因的表達載體被微注射到生物體的性細胞內(nèi)，例如秀麗新小桿線蟲的性細胞。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的細胞和含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選存在于適當?shù)妮d體中)的細胞，尤其是酵母細胞。本發(fā)明尤其涉及含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因還有cDNA文庫的細胞，優(yōu)選酵母細胞。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因或重組細胞、優(yōu)選酵母細胞或轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲在測定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性方法中的應用；這些細胞或轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲在鑒定γ-分泌酶活性抑制劑中的應用和該測定方法本身。
尤其是，本發(fā)明涉及鑒定γ-分泌酶活性抑制劑的方法，該方法包含如下步驟1.產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因生物如轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲或釀酒酵母或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞，該非人類轉(zhuǎn)基因生物或轉(zhuǎn)基因細胞包含一個具有如下組成成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列5’-末端的第二編碼信號肽的第二核苷酸序列，和c)啟動子，及非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞還含有一個報告質(zhì)粒，該報告質(zhì)粒載有一個蛋白結(jié)合位點、一個最小啟動子和一個報告基因，及，如果適宜，一個編碼γ-分泌酶的cDNA，其中該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞表達該轉(zhuǎn)基因及適當時所述cDNA編碼的γ-分泌酶；2.將該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞與被研究的物質(zhì)一起保溫，及3.檢測第二片段蛋白的含量。本發(fā)明還涉及一種鑒別γ-分泌酶活性抑制物的方法，其中1.制備包含如下成分的轉(zhuǎn)基因a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，和c)啟動子，及，d)適當時額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2.將該轉(zhuǎn)基因和一個報告質(zhì)粒及適當時一個編碼γ-分泌酶的cDNA引入到細胞內(nèi)，且在被研究物質(zhì)存在的情況下表達由轉(zhuǎn)基因編碼的融合蛋白和適當時cDNA編碼的γ-分泌酶，3.該融合蛋白被，A)裂解或B)不被細胞內(nèi)的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)裂解，這是由于下列原因之一，a)形成了含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，或b)沒有形成可檢測的第一和/或第二片段蛋白。
4.確定第二片段蛋白是否形成。
本發(fā)明還涉及可抑制γ-分泌酶活性的物質(zhì)的鑒別方法，其中編碼含有一個信號肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因在被研究物質(zhì)和報告質(zhì)粒存在下表達，確定研究物質(zhì)對第二片段蛋白形成量的影響，第二片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法鑒別的γ-分泌酶抑制劑。
本發(fā)明還涉及一種藥物生產(chǎn)方法，將利用上述方法鑒定出的藥物活性化合物通過配制和/或與藥學上可接受的載體混合進一步加工。
本發(fā)明還涉及一個用于實施上述方法的檢驗試劑盒。
本發(fā)明方法尤其可與例如C100-Gal4-VP16系統(tǒng)(即一個由C100，Gal4和VP16組成的融合蛋白或用編碼此融合蛋白的核苷酸序列)聯(lián)合使用，用于1.γ-分泌酶活性的鑒定和測定(定性和/或定量)。
2.在不同組織、細胞和生物體或物種中對γ-分泌酶的鑒定。編碼γ-分泌酶的有關(guān)cDNA的鑒定和分離，及這一cDNA的進一步應用。
3.對例如酵母細胞(釀酒酵母)或秀麗新小桿線蟲的在體篩選，且可能在不用免疫生物學方法的情況下測定γ-分泌酶活性。
4.本發(fā)明方法可用于鑒定和分離一些物質(zhì)，如藥理活性化合物，這類化合物可調(diào)節(jié)γ-分泌酶的活性，如γ-分泌酶的抑制劑。尤其是，本發(fā)明方法可用于高通量篩選(HTS，High ThroughputScreening)。比如，可鑒定一些物質(zhì)，這類物質(zhì)可用于阿爾茨海默病的治療和/或預防性治療。
5.對于阿爾茨海默病發(fā)病機理的探討，如，利用APP的突變體或C100。
6.所描述的融合蛋白/轉(zhuǎn)基因如SP-C100-Gal4-VP16內(nèi)的C100可被完整的APP和γ-分泌酶所替代，可利用本方法類似地研究其活性和調(diào)節(jié)。
圖1圖1所示為淀粉樣前體蛋白(同形體APP695和同形體APP770或APP751)和分泌酶的裂解產(chǎn)物。
圖2圖解顯示本發(fā)明方法所基于的原理β-分泌酶的裂解位點在N-末端；γ-分泌酶的裂解位點在跨膜區(qū)域內(nèi)；C100＝APP的C100片段；Gal4-V16＝DNA-結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活域(由DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活子組成)，其可與報告質(zhì)粒DNA上的蛋白-結(jié)合域結(jié)合。
圖3表達質(zhì)粒SP-C100-Gal4-VP16的構(gòu)建aa＝氨基酸；SacI，Hind III和Kpn I限制性內(nèi)切酶位點所示為質(zhì)粒上斷裂位點的位置。
圖4表達質(zhì)粒pDBTRP-MET25-SP-C100-Ga14-VP16在酵母細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)基因表達的表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
實施例實施例1表達質(zhì)粒SP-C100-Gal4-VP16的構(gòu)建這個質(zhì)粒編碼APP的信號肽，即融入了APP C-末端的100個氨基酸殘基(C100)。C100開始于Aβ-肽的N-末端，結(jié)束于APP的C-末端。它必須被γ-分泌酶進一步裂解才可釋放出Aβ-肽。
將Gal4-VP16融入了SP-C100的C-末端。Gal4-VP16是由酵母細胞轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的頭147個氨基酸殘基和單純皰疹病毒的轉(zhuǎn)錄激活因子VP16的C-末端78個氨基酸殘基組成。作為一個融合蛋白，Gal4蛋白片段接管與DNA結(jié)合的功能，而VP16蛋白片段激活轉(zhuǎn)錄(Sadowski等，(1988)Sciences 335，563)。pcDNA3.1+購自荷蘭Invitrogen，作為一個載體質(zhì)粒。
實施例2報告質(zhì)粒pGL2 MRG5 EGFP的構(gòu)建報告質(zhì)粒pGL2 MRG5在HIV-TATA盒前有5個Gal4結(jié)合位點。為了便于在細胞培養(yǎng)物內(nèi)檢測，pGL2 MRG5上的熒光素酶基因與購自Clontech，Heidelberg的pEGFP N1載體上的EGFP(增強型綠色熒光蛋白)基因進行了互換。
實施例3人成神經(jīng)細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)用上述兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，然后，在波長480nm的光照射下，通過其所激發(fā)的EGFP在顯微鏡下進行了分析。在某些情況下，可以檢測到細胞所發(fā)射出的強綠色光。
因為在沒有特異激活的情況下，這種效應也可能基于報告質(zhì)粒對EGFP的表達，所以還只用該報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了SH-SY5Y細胞。在這些細胞內(nèi)，檢測不到綠色熒光。因此，EGFP的表達必須被Gal4-VP16激活，它預示APP C-末端被蛋白水解后釋放。到目前為止，除了γ-分泌酶，未提到其它的蛋白水解活性能在跨膜區(qū)域或在胞質(zhì)內(nèi)部分進行蛋白水解加工APP。因此，我們認為與Gal4-VP16融合的APP C-末端的釋放系基于γ-分泌酶的活性。
實施例4應用C100-Gal4-VP16系統(tǒng)在cDNA文庫中檢測編碼γ-分泌酶的cDNA將SPC100-Gal4-VP16克隆到由MET25啟動子控制的酵母表達載體pDBTRP(Life Technologies，Rockville，MD，U.S.A.)中，并用這一表達載體轉(zhuǎn)化了酵母細胞株MaV203(Life Technologies)。酵母細胞株MaV203已在基因水平上被修飾，且包含三個穩(wěn)定地整合到基因組內(nèi)的GAL4-誘導性報告基因(URA3，HIS3，LacZ)。在MaV203內(nèi)，SPC100-Gal4-VP16 cDNA的表達只提供低水平的報告蛋白的活性，因此本系統(tǒng)適合于在cDNA文庫內(nèi)搜尋γ-分泌酶。
實施例5由實施例4構(gòu)建的重組MaV203細胞可應用于例如鑒定γ-分泌酶或篩選人類B淋巴細胞cDNA文庫(American Type Culture Collection，Manassas，VA，U.S.A.)。類似地，整合到酵母表達載體p415-MET25(ATCC，Nucleic Acid Research，1994，Vol.22，No.25，5767)或p415-ADH1(ATCC，GENE，1995，158119-122)中的人類海馬細胞cDNA文庫也可用于篩選編碼γ-分泌酶的cDNA或具有γ-分泌酶活性的蛋白。(SEQ lD NO.1)GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML第一片段蛋白(SEQ ID NO.2)GAIIGLMVGGVV第二片段蛋白(SEQ ID NO.3)VIVITLVMLC100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)LDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITLVMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQNAPP信號肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)MLPGLALFLL AAWTARASP-C100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQQNGYENPTYK FFEQMQN轉(zhuǎn)錄-激活域VP16和Gal4結(jié)合域(Gal4-VP16)(SEQ ID NO.7)MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLTRAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQDNVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEFPGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFTPHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG編碼SP-C100-Gal4-VP16的轉(zhuǎn)基因核苷酸序列(SEQ ID NO.8)GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACTTAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA AGAACAACTGGGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG ACTAGGGCAC ATCTGACAGAAGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGACCTTGACATG ATTTTGAAAA TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATTATTTGTACAA GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGACTGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT CGGAAGAGAGTAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGACCGATGTCAGC CTGGGGGACG AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGCCGACGCGCTA GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGGATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT TCGAGTTTGAGCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1+(荷蘭Invitrogen公司)的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCAPP的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAGACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGCGCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCCGCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT GCTGGCTGAACCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAGTGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAGTATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCAGTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTTGTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGACAAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCACACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTGCTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAAGAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGCGGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAGGAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGTGATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGCATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACAACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAATGAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATGTCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCTGATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCAGCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAATGACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGGCCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAGCACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATCCGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCCCTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTTCAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATCAGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTCCTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCTGACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA GTTGAGCCTG TTGATGCCCG CCCTGCTGCCGACCGAGGAC TGACCACTCG ACCAGGTTCT GGGTTGACAA ATATCAAGAC GGAGGAGATCTCTGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCCGA CATGACTCAG GATATGAAGT TCATCATCAAAAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATGGTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAACAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAGCGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAGCAGATGCAGA ACTAGACCCC CGCCACAGCA GCCTCTGAAG TTGGACAGCA AAACCATTGCTTCACTACCC ATCGGTGTCC ATTTATAGAA TAATGTGGGA AGAAACAAAC CCGTTTTATGATTTACTCAT TATCGCCTTT TGACAGCTGT GCTGTAACAC AAGTAGATGC CTGAACTTGAATTAATCCAC ACATCAGTAA TGTATTCTAT CTCTCTTTAC ATTTTGGTCT CTATACTACATTATTAATGG GTTTTGTGTA CTGTAAAGAA TTTAGCTGTA TCAAACTAGT GCATGAATAGATTCTCTCCT GATTATTTAT CACATAGCCC CTTAGCCAGT TGTATATTAT TCTTGTGGTTTGTGACCCAA TTAAGTCCTA CTTTACATAT GCTTTAAGAA TCGATGGGGG ATGCTTCATGTGAACGTGGG AGTTCAGCTG CTTCTCTTGC CTAAGTATTC CTTTCCTGAT CACTATGCATTTTAAAGTTA AACATTTTTA AGTATTTCAG ATGCTTTAGA GAGATTTTTT TTCCATGACTGCATTTTACT GTACAGATTG CTGCTTCTGC TATATTTGTG ATATAGGAAT TAAGAGGATACACACGTTTG TTTCTTCGTG CCTGTTTTAT GTGCACACAT TAGGCATTGA GACTTCAAGCTTTTCTTTTT TTGTCCACGT ATCTTTGGGT CTTTGATAAA GAAAAGAATC CCTGTTCATTGTAAGCACTT TTACGGGGCG GGTGGGGAGG GGTGCTCTGC TGGTCTTCAA TTACCAAGAATTCTCCAAAA CAATTTTCTG CAGGATGATT GTACAGAATC ATTGCTTATG ACATGATCGCTTTCTACACT GTATTACATA AATAAATTAA ATAAAATAAC CCCGGGCAAG ACTTTTCTTTGAAGGATGAC TACAGACATT AAATAATCGA AGTAATTTTG GGTGGGGAGA AGAGGCAGATTCAATTTTCT TTAACCAGTC TGAAGTTTCA TTTATGATAC AAAAGAAGAT GAAAATGGAAGTGGCAATAT AAGGGGATGA GGAAGGCATG CCTGGACAAA CCCTTCTTTT AAGATGTGTCTTCAATTTGT ATAAAATGGT GTTTTCATGT AAATAAATAC ATTCTTGGAG GAGC質(zhì)粒pDBTRP的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAA 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權(quán)利要求
1.一種γ-分泌酶活性的檢測方法，其中1)應用一個轉(zhuǎn)基因，其編碼一個融合蛋白并包含如下組成成分a)第一編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，c)啟動子，及d)適當時的額外編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因引入細胞，并表達所述融合蛋白；3)該融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)被細胞內(nèi)γ-分泌酶裂解，從而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4)檢測第一片段蛋白和/或第二片段蛋白。
2.一種γ-分泌酶活性的檢測方法，如下，1)應用一個轉(zhuǎn)基因，其編碼一個融合蛋白并包含如下組成成分a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，c)啟動子，及d)適當時的額外編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因引入細胞，并表達所述融合蛋白；3)該融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)被細胞內(nèi)γ-分泌酶裂解，從而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及4)測定第二片段蛋白的量，由第二片段蛋白的形成量確定γ-分泌酶的活性。
3.如權(quán)利要求1和2之一所述的方法，其中第一核苷酸序列編碼淀粉樣前體蛋白(APP)或其部分。
4.如權(quán)利要求1至3之一所述的方法，，其中第一核苷酸序列編碼一個氨基酸序列為SEQ ID NO.4的蛋白。
5.如權(quán)利要求1至4之一所述的方法，其中第二核苷酸序列編碼APP的信號肽(SP)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其中信號肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.5。
7.如權(quán)利要求1至6之一所述的方法，其中啟動子是用于在哺乳動物細胞、秀麗新小桿線蟲、酵母或果蠅內(nèi)表達的啟動子。
8.如權(quán)利要求1至7之一所述的方法，其中啟動子為CMV、HSVTK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16-2、GoA1、sel-12、ADH1、Gal1、MET3、MET25、MT、Ac5或Ds47啟動子。
9.如權(quán)利要求1至8之一所述的方法，其中細胞為真核細胞。
10.如權(quán)利要求1至9之一所述的方法，其中細胞為人類細胞。
11.如權(quán)利要求1至9之一所述的方法，其中細胞為非人類細胞。
12.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細胞為HeLa，293，H4，SH-SY5Y，H9，Cos，CHO，N2A，SL-2或釀酒酵母細胞。
13.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細胞為秀麗新小桿線蟲細胞。
14.如權(quán)利要求12中所述的方法，其中細胞為轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲細胞。
15.如權(quán)利要求11中所述的方法，其中細胞為酵母細胞。
16.如權(quán)利要求1至15之一所述的方法，其中融合蛋白具有或包含氨基酸序列SEQ ID NO.6。
17.如權(quán)利要求1至16之一所述的方法，其中所述額外編碼核苷酸序列位于第一核苷酸序列的3’-末端。
18.如權(quán)利要求1至17之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一個蛋白，該蛋白與第一片段蛋白和第二片段蛋白一起作為融合蛋白表達，并可用于第二片段蛋白的檢測。
19.如權(quán)利要求1至18之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一種含有DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄-激活域的蛋白。
20.如權(quán)利要求1至19之一所述的方法，其中所述額外的編碼核苷酸序列編碼一種由Gal4-結(jié)合域和VP16的轉(zhuǎn)錄-激活域(Gal4-VP16)組成的蛋白。
21.如權(quán)利要求1至20之一所述的方法，其中由報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述細胞，該報告質(zhì)粒包含一個受可調(diào)節(jié)啟動子控制的報告基因。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中方法所述可調(diào)節(jié)啟動子可被轉(zhuǎn)錄-激活域激活。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述報告質(zhì)粒編碼一個EGFP(增強型綠色熒光蛋白)報告基因，和所述可調(diào)節(jié)啟動子含有Gal4結(jié)合位點和HIV的最小啟動子。
24.如權(quán)利要求1至23之一所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.8。
25.如權(quán)利要求1至24之一所述的方法，其中轉(zhuǎn)基因存在于載體上。
26.如權(quán)利要求1至25之一所述的方法，其中所述重組載體具有核苷酸序列SEQ ID NO.9。
27.如權(quán)利要求1至26之一所述的方法，其中所述細胞中沒有可檢測的內(nèi)源性γ-分泌酶活性。
28.如權(quán)利要求1至27之一所述的方法，其中細胞用cDNA文庫共轉(zhuǎn)染。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中從人類或非人類組織、或人類或非人類細胞制備的cDNA存在于cDNA文庫。
30.權(quán)利要求27至29之一的方法在鑒別編碼γ-分泌酶之cDNA中的應用，其中a)鑒別在其中可檢測到γ-分泌酶活性的細胞，和b)從該細胞分離編碼γ-分泌酶的cDNA。
31.一種轉(zhuǎn)基因，其含有a)編碼含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼一個信號肽的第二核苷酸序列，c)啟動子，及d)在第一核苷酸序列的3’-末端的編碼DNA-結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄-激活域的至少一個額外核苷酸序列。
32.如權(quán)利要求31中所述的轉(zhuǎn)基因，其中第一核苷酸序列編碼APP或APP的一部分。
33.如權(quán)利要求31和32之一所述的轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.12。
34.含有如權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的載體。
35.權(quán)利要求34所述的載體，其具有核苷酸序列SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.12。
36.一種轉(zhuǎn)基因細胞的產(chǎn)生方法，其中用權(quán)利要求34和35之一所述的載體轉(zhuǎn)染細胞。
37.一種轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲的產(chǎn)生方法，其中將權(quán)利要求31至33之一所述的轉(zhuǎn)基因微注射到秀麗新小桿線蟲的性細胞中。
38.含有權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的細胞。
39.含有秀麗新小桿線蟲權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因秀麗新小桿線蟲。
40.含有權(quán)利要求31至33之一所述轉(zhuǎn)基因的酵母細胞。
41.一種含有如下成分的細胞a)權(quán)利要求31至33之一所述的轉(zhuǎn)基因b)cDNA文庫，和c)報告質(zhì)粒。
42.權(quán)利要求41的細胞在鑒別編碼γ-分泌酶的cDNA中的應用。
43.一種鑒別γ-分泌酶cDNA的方法，其中1)制備如權(quán)利要求41所述的細胞，及2)測定是否有第二片段蛋白形成。
44.權(quán)利要求41中所述的細胞在γ-分泌酶活性抑制劑鑒別方法中的應用。
45.抑制γ-分泌酶活性物質(zhì)的鑒別方法，該方法包括下列步驟1)制備非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞，該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞包含具有下列成分的轉(zhuǎn)基因a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5’-末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，c)啟動子，及d)適當時額外的非編碼和/或編碼性核苷酸序列；包含報告質(zhì)粒，該報告質(zhì)粒攜帶蛋白結(jié)合位點、一個最小啟動子、和一個報告基因，以及適當時編碼γ-分泌酶的cDNA，其中，該非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞表達該轉(zhuǎn)基因，和適當時的由所述cDNA編碼的γ-分泌酶；2)將所述非人類轉(zhuǎn)基因生物體或轉(zhuǎn)基因細胞與被研究的物質(zhì)溫育，及3)測定第二片段蛋白的含量。
46.抑制γ-分泌酶活性物質(zhì)的鑒別方法，其中1)使用一種轉(zhuǎn)基因，其包括下列成分a)編碼包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，b)在第一核苷酸序列的5L末端的編碼信號肽的第二核苷酸序列，和c)啟動子，及d)適當時額外的編碼和/或非編碼性核苷酸序列；2)將該轉(zhuǎn)基因和一個報告質(zhì)粒及適當時編碼γ-分泌酶的cDNA引入到細胞中，在所研究的物質(zhì)存在下表達由所述轉(zhuǎn)基因編碼的融合蛋白及適當時由所述cDNA編碼的γ-分泌酶，3)該融合蛋白被a)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ IDNO.3)的第二片段蛋白，或b)未被細胞內(nèi)存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1內(nèi)裂解可，因此沒有可檢測到的第一和/或第二片段蛋白的形成，4)測定第二片段蛋白的含量。
47.鑒別抑制γ-分泌酶活性之物質(zhì)的方法，其中將編碼一個含有信號肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因在所研究物質(zhì)存在下表達，并鑒定這種被研究物質(zhì)對第二片段蛋白形成量的影響，所述第二片段蛋白含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ IDNO.3)。
48.藥物的生產(chǎn)方法，包括如權(quán)利要求45至47之一所述的方法，且最后將鑒定出的抑制劑與藥學上可接受的載體混合。
49.如權(quán)利要求45至47之一項或多項所述的方法，還包括方法將所鑒定出的抑制劑配制成制藥學上可接受的形式。
50.用于定性和/或定量檢測γ-分泌酶活性的試劑盒，包括一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.1的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及γ－分泌酶活性的測定方法,該方法的各成分及其應用。本發(fā)明提供了一種測定γ－分泌酶活性及檢測γ－分泌酶的新穎方法;該方法的具體實施方案涉及γ－分泌酶或編碼γ－分泌酶的cDNA的鑒定方法和對可抑制γ－分泌酶活性的有效物質(zhì)的鑒定方法。此類物質(zhì)具有特殊的意義,因為它們可作為藥物活性物質(zhì),比如用于阿爾茨海默病的治療。
文檔編號C12N1/15GK1329674SQ99814204
公開日2002年1月2日 申請日期1999年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月7日
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