來自谷粒的谷蛋白的脫毒方法
【專利說明】來自谷粒的谷蛋白的脫毒方法
[0001]本發(fā)明提出了一種用于來自谷粒的谷蛋白，特別是來自小麥顆粒的谷蛋白脫毒的方法，目的在于從小麥獲得用于制備面包和意大利面食的脫毒面粉，優(yōu)選適用于乳糜瀉病人的營養(yǎng)補(bǔ)給，但其感官特征和其他方面對于全體人群的營養(yǎng)補(bǔ)給也是合適的。
[0002]摶術(shù)說曰月
[0003]谷蛋白是主要由蛋白質(zhì)組成的食品成分。醇溶谷蛋白占谷物穎果中存在的整個(gè)蛋白質(zhì)部分的約80%并且主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成。
[0004]麥醇溶蛋白是通常歸類為α、β、γ和ω (根據(jù)電泳迀移率)的單體分子，單體條件是由于不存在半胱氨酸支架，如在ω -麥醇溶蛋白的情況中，或是由于僅存在分子內(nèi)二硫鍵(剩余的麥醇溶蛋白)。
[0005]然而，麥谷蛋白是復(fù)雜的聚合物，由高(HMW-GS)和低(LMW-GS)分子量的亞基組成，通過分子間二硫化物橋接來穩(wěn)定。麥醇溶蛋白和麥谷蛋白賦予面粉技術(shù)特性；麥醇溶蛋白有助于面團(tuán)的粘性，而麥谷蛋白負(fù)責(zé)面團(tuán)的彈性和韌性。
[0006]特別地，麥谷蛋白聚合物的數(shù)量和大小與面團(tuán)的技術(shù)特性成正相關(guān)。
[0007]因此，麥谷蛋白聚合物的這些特征取決于單獨(dú)的亞基形成或多或少伸長的聚合物的能力。特別地，谷蛋白不存在于谷物穎果中，而是在稍后的時(shí)刻形成；作為蛋白質(zhì)復(fù)合物的谷蛋白因面團(tuán)的水合和捏合而形成，并且構(gòu)成用于面粉和面包生產(chǎn)的必要成分，因?yàn)槠滟x予面團(tuán)粘性和彈性。如已知的，當(dāng)將水加入到面粉中時(shí)，麥醇溶蛋白(由單鏈蛋白質(zhì)組成)開始彼此結(jié)合，形成細(xì)纖維(小而細(xì)的纖維)，其賦予谷蛋白物質(zhì)可延展性。同時(shí)，麥谷蛋白(由不同的蛋白質(zhì)亞基細(xì)成)也被此結(jié)合，形成較大尺寸的纖維并形成穩(wěn)定且非常粘的結(jié)構(gòu)，其賦予面團(tuán)稠度和一定的耐延伸性。因此，面團(tuán)的強(qiáng)度和發(fā)酵程度取決于面粉中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白含量之間的比例。這兩類蛋白質(zhì)之間的關(guān)系取決于谷物的品種并且賦予谷蛋白變形和抵抗膨脹的能力。
[0008]在捏合的機(jī)械作用過程中，麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的纖維的細(xì)纖維開始彼此纏繞，形成結(jié)合淀粉顆粒(圖1)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、水和氣泡的三維網(wǎng)，氣泡是酵母酒精發(fā)酵非常重要的產(chǎn)物。將酵母加入面團(tuán)時(shí)，酒精和二氧化碳的產(chǎn)生決定了谷蛋白網(wǎng)的膨脹，其變寬并且松弛，以增大所述面團(tuán)的體積。隨后的烹調(diào)決定了蛋白質(zhì)并且因此決定了谷蛋白的變性/凝固，失去延伸的能力，以不可逆的方式穩(wěn)定了面團(tuán)的結(jié)構(gòu)和形狀。
[0009]作為蛋白質(zhì)復(fù)合物的谷蛋白不具有特別的營養(yǎng)特性，因?yàn)槠渌谋匦璋被?如賴氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)很少。
[0010]膳食中這種化合物的缺失不涉及任何特定的營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)。
[0011]另一方面，谷蛋白能夠產(chǎn)生毒性活性，特別是針對腸粘膜；因此，將小麥的谷蛋白以及黑麥、大麥和燕麥的相應(yīng)蛋白質(zhì)的永久性不耐受性(其能夠產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的炎性級聯(lián))定義為乳糜瀉。
[0012]最初，認(rèn)為谷蛋白的毒性作用歸因于α麥醇溶蛋白部分；隨后證明了甚至ω麥醇溶蛋白和麥谷蛋白以及相關(guān)谷物的醇溶谷蛋白(如大麥(ordeine)、黑麥(黑麥醇溶蛋白(secaline))和燕麥(燕麥堿(avenine)))，也能夠誘發(fā)腸粘膜的損傷。
[0013]最近關(guān)注的是所述α -麥醇溶蛋白的33個(gè)氨基酸的肽(稱為33_mer)的研宄；所述肽能夠抵抗到達(dá)完整腸粘膜(腸粘膜對組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶具有高親和性)的消化酶的蛋白水解活性，其在處于風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中發(fā)揮出有效的致免疫作用；將來自肽的毒性表位脫氨基后，通過釋放炎性細(xì)胞因子的TCD4的淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈激活，將會(huì)決定這種作用(Shuppan 等，2009)。
[0014]此外，已經(jīng)顯示出α -麥醇溶蛋白的其他毒性表位能夠誘發(fā)源自乳糜泄病人的腸粘膜外植體的腸上皮細(xì)胞的凋亡。
[0015]因此，谷蛋白通過激活細(xì)胞因子的炎性級聯(lián)，并且通過引起直接的毒性作用，發(fā)揮對腸粘膜的有害作用。乳糜泄的膳食治療最初是基于在出現(xiàn)不耐受癥狀(如腹痛、腹脹、胃炎、口瘡性口炎、心境障礙、頭痛等)時(shí)，從膳食中完全排除所有谷物和含有谷蛋白的食物(尤其是面包和意大利面食，這些是公知的從小麥獲得的產(chǎn)品，以及其他地中海營養(yǎng)補(bǔ)給的食物)；如果存在典型的損傷，這種治療允許病人獲得癥狀的減輕和腸粘膜結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。然而，這種治療涉及時(shí)間持續(xù)的困難性，因?yàn)檫@對病人的膳食形成了巨大的限制，并且因此對涉及食物的社會(huì)活動(dòng)形成了巨大的限制；為了解決這些問題，決定為谷蛋白不耐受人群生產(chǎn)無谷蛋白食物，或其中谷蛋白不會(huì)激活炎性反應(yīng)的食物，使得病人通過食用味道和外觀部分類似面包和意大利面食的食物來具有正常的生活方式。
[0016]目前，已知一些部分消除谷蛋白毒性作用的方法。
[0017]尚未顯示出所需效果的試驗(yàn)階段的方法通過遺傳操作形成了脫毒的小麥，S卩，以這樣的方式修飾為不含控制谷蛋白毒性表位(其可以刺激淋巴T細(xì)胞)產(chǎn)生的免疫原性序列。
[0018]這種方法的第一個(gè)限制在于鑒別控制谷蛋白的主要結(jié)構(gòu)內(nèi)含有的免疫活性肽編碼的所有基因序列(目前約四十個(gè)，位于兩條不同染色體的六個(gè)基因座上)；此外，這種方法不能確保有某種結(jié)果，因?yàn)榇嬖诰哂猩形传@知的編碼其他毒性表位的基因序列的高可能性。
[0019]另一個(gè)限制是缺乏消費(fèi)者長時(shí)間消費(fèi)“遺傳修飾”產(chǎn)品的信心，并且因此，這樣的產(chǎn)品難以進(jìn)入通常目的在于整個(gè)人群的市場。
[0020]然而，現(xiàn)有技術(shù)的另一種方法提供了使用酶(Rizzello等，2007)，其是面粉制備過程中添加的細(xì)菌來源的內(nèi)肽酶的補(bǔ)充，能夠發(fā)酵谷蛋白，并且特別是所述的33-mer片段。這種方法的限制在于是非常昂貴的，因?yàn)槠渖婕笆褂眉兓拿福粷撛诘挠猛緝H在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因?yàn)楦叩纳a(chǎn)成本，因此變得非常昂貴。
[0021]這種方法的第二個(gè)限制在于這些酶的使用導(dǎo)致谷蛋白網(wǎng)絡(luò)的破壞，并且因此面團(tuán)失去技術(shù)特性，不能用于面包或意大利面食中的轉(zhuǎn)化過程，并且因此必須借助技巧，使此類物質(zhì)(樹膠、多糖、預(yù)糊化淀粉、瓊脂等)結(jié)構(gòu)化。
[0022]現(xiàn)有技術(shù)中已知的另一種方法是在賴氨酸甲酯的存在下使用微生物酶(谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)，以通過脫酰胺作用使小麥麥醇溶蛋白中存在毒性表位脫毒(Gianfrani等，2007) ο這種方法與之前的方法相比，具有優(yōu)勢，保存了谷蛋白網(wǎng)絡(luò)并且因此維持了面粉的技術(shù)特性。這種方法的限制在于非常昂貴，因?yàn)槠渖婕笆褂眉兓拿?；潛在的用途僅在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因?yàn)楦叩纳a(chǎn)成本，因此變得非常昂貴。
[0023]另一個(gè)重要限制是脫毒取決于毒性蛋白和微生物酶的濃度，以及反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。出于這些原因，實(shí)驗(yàn)不可能獲得特定的結(jié)果。
[0024]解決谷蛋白不耐受問題的替代方案是可以使用連蛋白(zonulin)的抑制劑(Fasano，2008)，連蛋白是一種似乎在改變腸滲透性中起著關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。
[0025]然而，這種方法忽視了毒性麥醇溶蛋白的傳遞只通過胞內(nèi)途徑(其可以通過連蛋白的抑制劑阻斷)是不會(huì)發(fā)生而是通過胞外途徑發(fā)生的事實(shí)。
[0026]由于這種需要，S卩，生產(chǎn)地中海飲食的典型食物，如源自小麥的面包和意大利面食，其中谷蛋白對于乳糜瀉病人是無毒的，并且對于風(fēng)味和外觀，可以被整個(gè)人群消費(fèi)，因此形成了本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明的目的是通過提出一種谷蛋白的脫毒方法來克服所述的現(xiàn)有技術(shù)缺陷，特別是來自小麥谷粒以及其他谷物谷粒的谷蛋白，通過在經(jīng)歷水合處理后，將這些谷粒暴露于微波。
[0028]實(shí)際上，本發(fā)明的目的特別在于解決打算用于乳糜瀉病人的食物、面包和意大利面食生產(chǎn)的技術(shù)問題，以及使面粉失去有毒的谷蛋白作用，而沒有失去其形成面團(tuán)的技術(shù)特性。
[0029]更特別地，本發(fā)明通過用微波處理成熟谷粒，主要是想要解決具有脫毒谷蛋白的面粉的生產(chǎn)技術(shù)問題，同時(shí)，所述面粉適用于意大利面食、面包的技術(shù)生產(chǎn)以及從小麥生產(chǎn)烘焙產(chǎn)品，而沒有失去谷蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成。
[0030]最后，本發(fā)明通過從谷蛋白的有毒表位脫毒的面粉的生產(chǎn)并且因此食品(如，面包和意大利面食)的生產(chǎn)，目的在于生產(chǎn)源自小麥并且味道和外觀與地中海營養(yǎng)補(bǔ)給中常用的那些相當(dāng)?shù)氖称?，其通過及時(shí)以及被大部分人群，不僅是乳糜瀉人群的使用，確定了人群中乳糜瀉發(fā)病率的降低并且因此還確定了用于乳糜瀉人群的特定食品的生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響。
[0031]使用根據(jù)權(quán)利要求1的脫毒方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這一目的。
[0032]附圖簡沐
[0033]現(xiàn)在將以說明性的方式而不是限制，特別參照附圖，來描述本發(fā)明，其中:
[0034]圖1顯示了在捏合的機(jī)械作用過程中，從麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的結(jié)合，結(jié)合了淀粉顆粒并且在水的存在下形成的三維網(wǎng)絡(luò)；
[0035]圖2顯示了從不同樣品(A、B、C、D、E、F、G、H)提取的麥醇溶蛋白的電泳譜，其中樣品A和B用本發(fā)明的脫毒方法處理；
[0036]圖3顯示了通過SE-HPLC分析的脫毒粗粒小麥粉的蛋白質(zhì)譜(圖3a是可溶性蛋白質(zhì)，圖3b是不溶性蛋白質(zhì));
[0037]圖4顯示了一張圖，所述圖顯示了在乳糜瀉病人的腸黏膜產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞系中的干擾素的產(chǎn)生；
[0038]圖5顯示了在微波處理成熟谷粒后形成的谷蛋白網(wǎng)絡(luò)(a)和天然形成的谷蛋白網(wǎng)絡(luò)(b)；
[0039]圖6顯示了脫毒處理后有毒表位的遮掩模式，如產(chǎn)生了在腸水平下谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶不可接近和/或不可識(shí)別的麥醇溶蛋白連接位點(diǎn)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶在乳糜瀉病癥中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0040]發(fā)曰月描沐
[0041]在本發(fā)明中，描述了提供谷蛋白(特別是來自小麥谷粒的)脫毒的方法。
[0042]通過谷蛋白的有毒表位脫毒來制備所述面粉的方法包括以下階段:
[0043]A)用自來水將谷粒(特別是小麥的谷粒)水合約I小時(shí)；對于100克成熟谷粒，加入500ml水。這個(gè)階段是引發(fā)谷蛋白脫毒的化學(xué)反應(yīng)功能所需的。
[0044]B)除去水。通過用篩網(wǎng)排水來進(jìn)行這一階段，以保留谷粒并除去水。
[0045]C)使用1000瓦的功率，將水合的谷粒微波處理兩分鐘。在這個(gè)階段，重要的不是烤箱中的溫度，而是通過谷粒中所含水弓I發(fā)脫毒反應(yīng)的電磁波的功率。
[0046]D)在室溫(20-22 °C )下將用微波處理過的谷物谷粒冷卻。
[0047]上述所有階段都是必須遵循的:谷粒水合一小時(shí)使得種子累積在電磁波的存在下引發(fā)谷蛋白脫毒反應(yīng)所需的水量。
[0048]根據(jù)之前描述的程序施用的1000瓦的功率持續(xù)兩分鐘足以使得水累積的能量促進(jìn)通過細(xì)胞代謝(過氧化物酶、脂肪氧合酶等)產(chǎn)生單態(tài)氧基、羥基或氫。小麥種子內(nèi)部的這些高反應(yīng)性化合物通過分子間鍵和/或分子內(nèi)鍵涉及位于穎果以外的其他部分中的谷蛋白(糊粉層中存在的蛋白質(zhì)顆粒和胚乳中存在的蛋白質(zhì)顆粒)的聚合反