一種微生物飼料添加劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及其培養(yǎng)和應(yīng)用技術(shù)，具體涉及一種含有凝結(jié)芽孢桿菌FM603 的飼料添加劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素是微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)其它微生物具有抗菌活性。20世紀(jì)40年 代，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)飼喂動(dòng)物低劑量的抗生素可以改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，提高經(jīng)濟(jì)效益。在之 后的幾十年內(nèi)，抗生素廣泛的應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，添加于飼料中用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，或者在 養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)用作治療藥劑?？股氐氖褂蔑@著的提高了動(dòng)物的生長(zhǎng)效率和飼料轉(zhuǎn)化率，對(duì)畜 牧行業(yè)的發(fā)展起到了重要的作用。但是抗生素的使用也帶來(lái)了諸多問(wèn)題，比如耐藥細(xì)菌的 傳播、二次感染及動(dòng)物產(chǎn)品中的藥物殘留等。耐藥菌的出現(xiàn)嚴(yán)重的威脅到人類(lèi)健康，以抗甲 氧苯青霉素金黃色葡萄球菌為例，感染該抗藥菌株的死亡率是普通菌株的三倍，而且治療 費(fèi)用和住院時(shí)間也增加很多。在美國(guó)和英國(guó)，約有40-60%的金黃色葡萄球菌具有甲氧苯青 霉素抗性，在中國(guó)，約60-70%的大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)抗生素不敏感。大量使用抗生素，并 違反停藥期規(guī)定則容易導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品中的藥物殘留超標(biāo)，這樣的動(dòng)物產(chǎn)品很難進(jìn)入國(guó)際市 場(chǎng)，也會(huì)對(duì)人的健康存在潛在威脅。近些年來(lái)我國(guó)食品安全事故時(shí)有報(bào)道，2013年初的速生 雞事件和禽流感的爆發(fā)給家禽養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)了巨大損失，消費(fèi)者們對(duì)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的關(guān)注 也日漸增多，如何保證動(dòng)物的高生產(chǎn)性能，同時(shí)生產(chǎn)出安全的肉、蛋、奶產(chǎn)品，關(guān)系到畜牧養(yǎng) 殖行業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。歐盟于2006年全面禁止抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加在飼料中，韓 國(guó)也于2011年禁用了抗生素類(lèi)生長(zhǎng)促進(jìn)劑。中國(guó)如今也面臨著是否禁止飼料中添加抗生 素的問(wèn)題，這也促使飼料和養(yǎng)殖企業(yè)，以及農(nóng)牧院校的研究人員積極致力于生物制劑的開(kāi) 發(fā)和使用，以減少或者替代抗生素的應(yīng)用。
[0003] 芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性、產(chǎn)芽孢的一類(lèi)桿菌，廣泛的存在于自然界中。芽孢桿菌 在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為芽孢形式，芽孢對(duì)外界不良環(huán)境如高溫、高壓、紫外線等有極強(qiáng)的 抵抗力。芽孢桿菌在工業(yè)上用作淀粉酶和蛋白酶的生產(chǎn)菌種，也長(zhǎng)期的用于發(fā)酵類(lèi)食品的 制作。芽孢桿菌有益于食物的消化和腸道健康，能夠促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能，因此也用作食品 補(bǔ)充劑和動(dòng)物益生菌。大量的研究數(shù)據(jù)表明，芽孢桿菌能夠提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，減少病原 菌感染幾率，提高動(dòng)物機(jī)體免疫，降低養(yǎng)殖環(huán)境的氨氣濃度，是抗生素類(lèi)生長(zhǎng)促進(jìn)劑的良好 替代品。芽孢桿菌通過(guò)刺激動(dòng)物腸絨毛發(fā)育，提高非特異性免疫，產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)發(fā)揮作 用。細(xì)菌素是芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)之一，是微生物通過(guò)核糖體合成的多肽類(lèi)抗菌 物質(zhì)，對(duì)很多病原菌包括耐藥菌具有良好的抗菌活性。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生細(xì)菌素類(lèi)抗菌物 質(zhì)，如subtilin、sublancin、subtilosin、lichenin等。細(xì)菌素是益生菌的重要功能性物 質(zhì)，考克大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌可以有效的減少單核增生李斯特菌對(duì)小 鼠的感染，但是在單核增生李斯特菌獲得該細(xì)菌素的免疫基因后，乳酸菌失去對(duì)小鼠的保 護(hù)功能。有研究表明，細(xì)菌素可以降低動(dòng)物腸道中的葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酸酶活性，促 進(jìn)肉雞增重，提高生產(chǎn)性能，機(jī)理與抗生素相似。因此，相比起普通芽孢桿菌，產(chǎn)細(xì)菌素的芽 孢桿菌對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有更為良好的促進(jìn)作用，在實(shí)際生產(chǎn)中具有更大的應(yīng)用潛力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種微生物飼料添加劑，所述飼料添加劑中含有凝結(jié)芽孢桿 菌FM603或其發(fā)酵培養(yǎng)物。凝結(jié)芽孢桿菌FM603發(fā)酵培養(yǎng)物中含有細(xì)菌素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌具有良好的抗菌作用。該細(xì)菌素分子量為4276. 4?a，部分氨基酸序列為Ala-Gly-His -Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro。該細(xì)菌素可改變革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離 子外流。
[0005] 凝結(jié)芽孢桿菌FM603可采用常規(guī)培養(yǎng)基在普通條件下發(fā)酵培養(yǎng)，但是在改良胰蛋 白胨培養(yǎng)基中能獲得更高生物量，改良胰蛋白胨培養(yǎng)基組成為：質(zhì)量體積百分比，胰蛋白胨 1. 5 %，葡萄糖1. 5 %，酵母浸粉0. 5 %，玉米漿干粉0. 2 %，硫酸銨0. 05 %，氯化鈉0. 1 %、磷 酸二氫鈉0.05%、蒸餾水100011^4117.0，培養(yǎng)條件為30°(：，150印111培養(yǎng)2011。
[0006] 本發(fā)明提供一種上述微生物飼料添加劑的制備方法，是用凝結(jié)芽孢桿菌FM603菌 株發(fā)酵生產(chǎn)，包括如下步驟：將FM603劃線于LB瓊脂板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于 10mLLB培養(yǎng)基，150rpm，30°C過(guò)夜培養(yǎng)作為1級(jí)種子液，將1級(jí)種子液按1%接種量接種于 1000mL改良胰蛋白胨培養(yǎng)基，150rpm，30°C過(guò)夜培養(yǎng)得到2級(jí)種子液，將2級(jí)種子液按10% 接種量接種于100L改良胰蛋白胨培養(yǎng)基，150rpm，30°C發(fā)酵24h得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液與滅 菌后的棕櫚仁柏按照1:1比例混合均勻后30°C發(fā)酵36h，烘干至含水量10 %以?xún)?nèi)，碎粉至過(guò) 40目篩網(wǎng)即得。
[0007] 本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌FM603,該菌株已于2014年12月17日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類(lèi)命名為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans)，保藏號(hào)為CGMCCNO. 10221。
[0008] 本發(fā)明菌株FM603在常溫和常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落在胰蛋白胨瓊脂上呈白 色，不規(guī)則，表面粗糙。革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢。將該菌的16SrRNA序列在美國(guó)國(guó)家生物 技術(shù)信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，與凝結(jié)芽孢桿菌的同源性為99%，經(jīng)API50CHB 試劑盒（bioMerieux,France)鑒定該菌與凝結(jié)芽孢桿菌的相似度為99. 7%，因此判定該菌 為凝結(jié)芽孢桿菌，命名FM603。
[0009] 本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)上述細(xì)菌素的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)發(fā)酵上清液制備：將凝結(jié)芽孢桿菌FM603接種于10mL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜， 將lmL培養(yǎng)液接種于1000mL改良胰蛋白胨培養(yǎng)基，200rpm，30°C培養(yǎng)20h，lOOOOrpm離心除 去菌體，得到發(fā)酵上清液；
[0011] 2)細(xì)菌素粗提液制備：將離子柱用50mM、pH6. 5的磷酸鹽緩沖液平衡，發(fā)酵上清 液以50mL/min的流速通過(guò)離子柱，將通過(guò)離子柱的上清液棄去，用磷酸鹽緩沖液沖洗離子 柱后，以含1MNaCl的磷酸鹽緩沖液（50mM，pH6. 5)洗脫離子柱，流速為10mL/min，收集洗 脫液100mL，將洗脫液通過(guò)C18固相萃取柱，用100%的乙腈洗脫固相萃取柱并收集洗脫 液，將洗脫液冷凍干燥后，溶解在50mM、pH6. 5的磷酸鹽緩沖液中，過(guò)濾后得到類(lèi)細(xì)菌素粗 提液；
[0012] 3)細(xì)菌素的純化：類(lèi)細(xì)菌素粗提液用高效液相色譜純化，使用C18反相柱 (250_^10111111，5 11粒徑），流動(dòng)相分別為八：100%乙腈，8:水，上樣量為100 1^，洗脫時(shí)間 為40分鐘，流速為lmL/min，收集每分鐘洗脫的溶液，重復(fù)多次上樣純化后將相同時(shí)間點(diǎn)的 洗脫液合并，冷凍干燥后溶于50mM磷酸鹽緩沖液，并檢測(cè)洗脫液的抗菌活性，以Listeria innocua為指示菌，獲得純化的細(xì)菌素。
[0013] 與已報(bào)道的芽孢桿菌細(xì)菌素相比，F(xiàn)M603生產(chǎn)的細(xì)菌素在生物學(xué)特性及抗菌活性 方面存在較大區(qū)別。
[0014] FM603產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)熱、酸穩(wěn)定，在60-70°C水浴10分鐘保持90%以上活性， 在80-100°C水浴10分鐘保持80%活性；在pH2-8范圍內(nèi)處理2h活性損失小于10%，在 PH9-10范圍內(nèi)處理2h活性存留60%。該細(xì)菌素在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋 白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶處理lh后活性存留率大于90%，鏈霉蛋白酶處理lh后剩余 20 %活性（詳細(xì)見(jiàn)表2)。
[0015] 該細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌如金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、蠟樣芽孢 桿菌和耐藥菌如抗甲氧西林金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抗菌活性（抑菌圈直徑>20mm)，對(duì) 厭氧產(chǎn)芽孢梭菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌和堅(jiān)強(qiáng)梭菌具有較強(qiáng)的抗菌活性（抑菌圈直徑17_18mm)， 對(duì)