雙歧桿菌菌株用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥狀的組合物的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】雙歧桿菌菌株用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥狀的組合 物的應(yīng)用
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年10月02日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880110243.3(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/FR2008/001372)、名稱為"雙歧桿菌菌株用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥狀的組合 物的應(yīng)用"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于制備組合物、尤其是嬰兒配方奶粉（infant formula)的方 法，使得減少過(guò)敏型癥狀成為可能。這些組合物是從雙歧桿菌(Bifidobacterium)培養(yǎng)物中 獲得的，沒(méi)有水解乳蛋白。
【背景技術(shù)】
[0003] 幾十年來(lái)，過(guò)敏性疾病的發(fā)生率在工業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家不斷增長(zhǎng)。因此，當(dāng)前估計(jì)發(fā)達(dá) 國(guó)家的20 %的人口受到過(guò)敏癥狀例如哮喘、遺傳過(guò)敏性皮炎或其它形式的癥狀的影響?，F(xiàn) 今的高發(fā)生率將過(guò)敏置于公共衛(wèi)生問(wèn)題的位置，并因此開(kāi)展了眾多的研究項(xiàng)目，以便試圖 提供有可能限制病變發(fā)展的解決辦法。這些研究已經(jīng)可以確定生命的最初2年是疾病建立 的關(guān)鍵時(shí)期，并且尤其是通過(guò)對(duì)過(guò)敏原的致敏階段來(lái)確定。在這期間兒童發(fā)生致敏作用，處 于以后發(fā)展成過(guò)敏反應(yīng)的極大的風(fēng)險(xiǎn)中。此外，腸內(nèi)菌群在過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病上的作用也開(kāi)始 顯現(xiàn)出來(lái)。實(shí)際上，兒童中腸內(nèi)菌群的建立決定粘膜免疫系統(tǒng)的發(fā)展(Prescott et al.， 2005)，并且菌群建立的模式可以影響免疫的取向朝向口服取向、或者相反地朝向致敏 (Kalliomaki et al·，2001;Sudo et al·，1997)。
[0004] 過(guò)敏反應(yīng)更確切地被定義為涉及免疫機(jī)理的過(guò)敏性反應(yīng)(Johansson et al.， 2001)。過(guò)敏性反應(yīng)引起重現(xiàn)性的癥狀，通過(guò)與抗原接觸而引起，此抗原的劑量在正常個(gè)體 中一般是能容忍的。引起過(guò)敏反應(yīng)的抗原在性質(zhì)上是非常多種多樣的，比如是食物、空氣或 動(dòng)物類型等等。同樣地，觀察到的癥狀有很多變化，并且主要是皮膚、消化或呼吸類型。建議 預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的策略的目的是減少過(guò)敏反應(yīng)的新病例(一級(jí)預(yù)防），或者當(dāng)過(guò)敏已經(jīng)建立時(shí) 限制過(guò)敏反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和發(fā)展(二級(jí)預(yù)防）。
[0005] 在母乳喂養(yǎng)的嬰兒中，最常見(jiàn)的過(guò)敏是食物過(guò)敏，并且尤其是牛乳蛋白過(guò)敏 (CMPA)。風(fēng)險(xiǎn)在特異反應(yīng)性的個(gè)體中更加高（高過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)兒童，尤其是由于已知的過(guò)敏遺 傳），這就證明了在這些兒童中在幼兒期間的食物干預(yù)策略是正確的。延長(zhǎng)的（>6個(gè)月）單一 性的母乳喂養(yǎng)，與逐步多樣化的食物相結(jié)合，是參照的解決方案，母乳喂養(yǎng)對(duì)過(guò)敏性疾病出 現(xiàn)具有潛在的保護(hù)作用(Host and Halken，2005)。對(duì)于處在風(fēng)險(xiǎn)中沒(méi)有母乳喂養(yǎng)有利條件 的兒童，推薦另一策略，包括通過(guò)部分或大量地水解使牛乳蛋白變性，或利用其他動(dòng)物或植 物蛋白作為它們的替代品（Host et al.，1999)。但是，這些解決方案的預(yù)防有效性一直有 爭(zhēng)論(Osborn and Sinn,2006a;0sborn and Sinn,2006b),并且水解過(guò)程的結(jié)果是損害了 感官品質(zhì)和蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，被某些兒童拒絕。在法國(guó)，被水解的配方奶粉還受到特定的 法規(guī)制約，完全地限制它們分配至制藥系統(tǒng)，這對(duì)于處于風(fēng)險(xiǎn)中的兒童的父母是個(gè)附加的 約束。
[0006] Peng等人從機(jī)理角度已經(jīng)描述過(guò)發(fā)酵牛奶的抗過(guò)敏作用。研究的產(chǎn)品是"酸乳"類 型的酸化益生菌發(fā)酵牛奶(pH=3.7)。在被闡述的模型中，是由于測(cè)試產(chǎn)品的兩重組成部分 而起到作用:發(fā)酵和保持發(fā)酵菌活性(>l〇 9cfu/ml)。測(cè)試了五中不同類型的發(fā)酵菌(3種乳 酸桿菌（lactobacilli)、1種嗜熱鏈球菌MC(Streptococcus thermophilus MC)和1種長(zhǎng)雙 歧桿菌屬(Bif idobacterium longum))，并且作者觀察到取決于所使用的菌株，效果有很大 的變化。在動(dòng)物模型中，在測(cè)試的乳酸桿菌菌株上觀察到最顯著的效果。此外，觀察到的效 果是純粹的免疫類型，并非與過(guò)敏類型的癥狀的臨床觀察直接相關(guān)(Peng et al.，2007)。 此外，應(yīng)當(dāng)注意的是，并不是所有的益生菌菌株都適合嬰兒營(yíng)養(yǎng)，D-乳酸是母乳喂養(yǎng)的嬰兒 不能代謝的。
[0007] Terpend等人更具體地研究通過(guò)短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)和嗜熱鏈 球菌發(fā)酵的牛奶的特性。這個(gè)研究結(jié)果表明了腸道屏障對(duì)抗乳蛋白的增強(qiáng)作用。然而，這些 作者沒(méi)有證明這種發(fā)酵牛奶的直接抗過(guò)敏作用(Terpend et al. ,1999)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在本文，發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)出適合嬰兒營(yíng)養(yǎng)的配方，至少可以部分地克服現(xiàn)有技術(shù) 描述的產(chǎn)品的缺點(diǎn)，使得可以給有過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)的兒童的食物安排上提供了一個(gè)不同的方法。
[0009] 被選中的帶來(lái)益處的方法包括:通過(guò)來(lái)源于生物轉(zhuǎn)化或者來(lái)源于通過(guò)雙歧桿菌菌 株發(fā)酵的免疫調(diào)節(jié)活性物質(zhì)，直接調(diào)節(jié)兒童的菌群和腸免疫系統(tǒng)的建立。在以下實(shí)驗(yàn)部分 中闡述的結(jié)果證明了在過(guò)敏癥狀上的直接益處。
[0010] 因此，本發(fā)明首先涉及雙歧桿菌菌株用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏型癥狀的 組合物的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，使用的雙歧桿菌菌株來(lái)源于人的腸內(nèi)菌群。更 優(yōu)選地，該菌株屬于短雙歧桿菌種類。特別適合進(jìn)行本發(fā)明的菌株是菌株BbC50，達(dá)能日爾 維公司（Compagnie Gervais Danone)于1999年5月31日保藏在法國(guó)培養(yǎng)物和微生物國(guó)家保 藏中心(CNCM)，編號(hào)是1-2219。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥狀的組合物的方法，優(yōu)選包括 在雙歧桿菌菌株存在的情況下發(fā)酵牛奶底物的步驟。在上述的雙歧桿菌屬菌株存在的條件 下用于發(fā)酵牛奶底物的步驟可以在有氧或厭氧條件下進(jìn)行。
[0012] "牛奶底物"的表述被理解為指的是至少包含一種乳清蛋白組分和乳糖的含水培 養(yǎng)基。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，乳清蛋白可以被天然的乳清蛋白水解和/或富集。乳清滲透物也可以 被合并入牛奶底物。作為牛奶底物的非限制的例子，可以是提及的牛奶、牛奶濃縮物、嬰兒 乳制食品基質(zhì)、酸乳基質(zhì)等等。
[0013] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明，用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥 狀的組合物的方法包括通過(guò)雙歧桿菌菌株來(lái)生物轉(zhuǎn)化牛奶底物的步驟，此步驟是在不利于 被所述菌株產(chǎn)生酸的條件下進(jìn)行的，如在專利W0 2001/001785中所描述的那樣。這種生物 轉(zhuǎn)化，對(duì)應(yīng)于非酸化或微弱酸化的發(fā)酵，也允許活性代謝物的產(chǎn)生。關(guān)于特別的發(fā)酵的詳細(xì) 條件顯示在以下部分。
[0014] "不利于被雙歧桿菌產(chǎn)生酸的條件"的表述定義為:在此條件下，通過(guò)雙歧桿菌在8 小時(shí)溫育下對(duì)于最初接種大于每毫升1 X 1〇7菌落形成單位（CFU)，培養(yǎng)基的酸化不超過(guò) 0.5pH個(gè)單位。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)，通過(guò)改變尤其是培養(yǎng)基的通氣、它的滲 透壓和/或培養(yǎng)溫度，以及通過(guò)在培養(yǎng)的開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)量pH，可以容易地確定此條件。
[0015] 對(duì)于很多雙歧桿菌菌株，此條件可以是尤其通過(guò)下面所描述的方法獲得：
[0016] -使用來(lái)源于指數(shù)生長(zhǎng)期后面階段的接種物的細(xì)菌種群；
[0017] -在有氧條件下維持，例如伴隨攪拌；
[0018] -在滲透壓相當(dāng)于水活度(WA)0.93至0.97時(shí)維持培養(yǎng)基；
[0019] -在溫度40至48°C下維持；
[0020] 以及這些不同的條件的組合。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施方式中，牛奶底物和雙歧桿菌可以以每毫升牛奶底物107至109CFU 的比率相接觸，并且在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)，最終的雙歧桿菌種群數(shù)在每毫升產(chǎn)品1〇5和 109CFU之間。
[0022] 牛奶底物在與細(xì)菌接觸期間的pH值優(yōu)選6.0至7，并且在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物 的pH值優(yōu)選5.8至7。
[0023] 取決于使用的條件，用于生物轉(zhuǎn)化步驟的牛奶底物和細(xì)菌的接觸時(shí)間可以是4小 時(shí)和24小時(shí)之間。
[0024]當(dāng)然，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，如上所述的生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵步驟是互不排斥的。例 如，這種方法可以包括通過(guò)雙歧桿菌對(duì)牛奶底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的步驟(亦即或大或小程度 地酸化）、繼之以通過(guò)相同細(xì)菌進(jìn)行酸性發(fā)酵的步驟?？晒┻x擇地，兩個(gè)反應(yīng)可以在兩個(gè)不 同的牛奶底物上平行進(jìn)行，然后將兩個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物合并成最終的抗過(guò)敏組合物。
[0025] 取決于想要得到的抗過(guò)敏組合物的本質(zhì)，可以將不同的附加處理應(yīng)用于通過(guò)雙歧 桿菌對(duì)牛奶底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化和/或發(fā)酵的產(chǎn)物。尤其是，在發(fā)酵或生物轉(zhuǎn)化步驟結(jié)束時(shí)優(yōu) 選可以有滅菌和/或分離雙歧桿菌的步驟，尤其是為了獲得具有長(zhǎng)時(shí)間保存期限的產(chǎn)物。同 樣地，取決于想要得到的最終組合物的本質(zhì)，可以進(jìn)行各種過(guò)濾、脫水或者色譜分離步驟。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，用于制備用于預(yù)防和/或治療過(guò)敏癥狀的組合物的產(chǎn)物的例子，尤其 是在專利申請(qǐng)WO 2001/001785(在下面實(shí)施例1中使用的產(chǎn)物）、W0 2004/093898和W0 2004/093899(實(shí)施例2)、以及W0 2006/040485中被描述。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明也可以使用這些 產(chǎn)物的混合物。
[0027] 在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的組合物，除了通過(guò)雙歧桿菌菌株發(fā)酵或 者生物轉(zhuǎn)化牛奶底物的產(chǎn)物之外，還可能包括通過(guò)嗜熱鏈球菌菌株比如菌株ST065發(fā)酵牛 奶底物所產(chǎn)生的物質(zhì)，嗜熱鏈球菌菌株ST065由達(dá)能日爾維公司于1995年8月23日保藏在法 國(guó)培養(yǎng)物和微生物國(guó)家保藏中心(CNCM)，編號(hào)是1-1620。根據(jù)本發(fā)明獲得的組合物可以優(yōu) 選地包含通過(guò)在專利申請(qǐng)W0 96/06924中所描述的方法所獲得的組分。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，獲得的組合物是保健食品（或功能食品），即有健 康益處的食物或食物成分，此情形是為了預(yù)防或