本發(fā)明屬于煙草薄片制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改善煙草薄片質(zhì)量的酶解-醇化法。
背景技術(shù)：
造紙法煙草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一種煙草資源再生利用的產(chǎn)品。它是利用一些煙草廢棄料、邊角料，如煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，經(jīng)過浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香工藝過程，制成煙葉薄片，用作卷煙填充物。造紙法煙草薄片，不僅在改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、燃燒性能及降低卷煙的煙氣煙堿和焦油量等方面具有優(yōu)勢，同時(shí)還能降低煙葉單耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，可以說是煙草工業(yè)近年最重要的成果之一。而近年來，生物技術(shù)與造紙法煙草薄片技術(shù)在生產(chǎn)中的結(jié)合應(yīng)用，不僅發(fā)揮了造紙法煙草薄片的工藝優(yōu)勢，而且利用生物技術(shù)有選擇地改變煙草化學(xué)成分，明顯改善了煙草薄片的品質(zhì)。
研究表明，煙草原料中的纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)在高溫下均會產(chǎn)生芳烴類化合物。其中果膠是一種膠體性物質(zhì)，沉積在初生細(xì)胞壁和胞間層，并與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及一些蛋白質(zhì)相互交聯(lián)。果膠在熱解過程中主要生成甲醇等有害物質(zhì)。果膠的去除不僅能夠減少這類物質(zhì)的生成，而且還能夠改變煙草細(xì)胞結(jié)構(gòu)，讓細(xì)胞變的更松散透氣，有利于提高煙草燃燒能力，減少熱解的發(fā)生。
現(xiàn)有技術(shù)中，針對煙草薄片濃縮液（浸取液）中果膠類物質(zhì)的降解主要是采用傳統(tǒng)的果膠酶進(jìn)行的。但是由于煙草薄片中果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，而現(xiàn)有技術(shù)中的果膠酶普遍存在對于煙草薄片濃縮液中果膠降解針對性不強(qiáng)、降解不夠充分、降解過程難以控制的缺陷，因而急需探討新的果膠酶及其在煙草薄片加工中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種利用特定菌株發(fā)酵制備的果膠酶，利用該果膠酶可對煙草薄片濃縮液中的果膠有針對性的進(jìn)行降解，同時(shí)配合后續(xù)酶解-醇化法對美拉德反應(yīng)的優(yōu)化，從而較好改善煙草薄片質(zhì)量。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所述。
一種鮮綠青霉發(fā)酵制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得：
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中25℃～35℃活化培養(yǎng)2~3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號為41001的鮮綠青霉(penicilliumviridiatum)；該菌株為可公開獲得菌株；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體可采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l（200g馬鈴薯），葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)36~48h左右（優(yōu)選，26℃、160r/min培養(yǎng)48h），制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠5g/l，蛋白胨10g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，ph=6.0～6.5；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)3.95~14.05h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)（優(yōu)選：26℃、160r/min搖床培養(yǎng)12h左右）；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體可按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、蛋白胨2.0g/l，ph=6.0～6.5；
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用。
所述鮮綠青霉發(fā)酵制備的果膠酶在煙草中的應(yīng)用，用于降解煙草薄片濃縮液中果膠成分。
具體使用時(shí)，以上述步驟（4）所制備粗酶液直接應(yīng)用為例，將果膠酶粗酶液稀釋0~40倍后，煙草薄片濃縮液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml，將煙草薄片濃縮液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解2~6h；
優(yōu)選處理?xiàng)l件為，將所述果膠酶粗酶液稀釋10倍，煙草薄片濃縮液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：3ml，50℃、酶解6h。
一種改善煙草薄片質(zhì)量的酶解-醇化法，具體包括如下步驟：
（1）制備粗酶液，按照上述步驟（1）至步驟（4）方法制備粗酶液，稀釋0~40倍備用；
（2）將步驟（1）中稀釋后粗酶液用于煙草薄片濃縮液，煙草薄片濃縮液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml，將煙草薄片濃縮液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解2~6h；
（3）將步驟（2）中酶解后煙草薄片濃縮液在60~80℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)10~15h（優(yōu)選70℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)13h），提高香味物質(zhì)含量；美拉德反應(yīng)結(jié)束后，即可將煙草薄片濃縮液按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行后續(xù)生產(chǎn)以制備煙草薄片。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線是：將特定菌種首先混合發(fā)酵，篩選優(yōu)化最佳發(fā)酵溫度條件，獲得最高果膠酶酶活的粗酶液，然后將粗酶液直接用于煙草薄片濃縮液處理以降低其果膠含量，通過優(yōu)化處理工藝，獲得最佳降解效果，進(jìn)一步將酶解后濃縮液通過美拉德反應(yīng)以增加香味物質(zhì)含量，從而最終改善煙草薄片質(zhì)量。
初步試驗(yàn)表明，本發(fā)明采用特定菌種發(fā)酵所得粗酶液的酶活最高可達(dá)2872.36u/ml，具有較好的應(yīng)用潛力。進(jìn)一步用于煙草薄片濃縮液處理后，可將煙草薄片濃縮液中果膠含量由2.00%降低到1.51%，降解率達(dá)到24%左右。進(jìn)一步進(jìn)行美拉德反應(yīng)處理后，將處理后煙草薄片濃縮液制備成煙草薄片用于卷煙后，進(jìn)一步的感官抽吸評價(jià)表明，添加有酶解和美拉德反應(yīng)后煙草薄片濃縮液制備成煙草薄片所制成的卷煙樣品相較于未處理的樣品，卷煙香氣更加細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤感有所增強(qiáng)且刺激性減輕，口感發(fā)澀程度減小，雜氣減少，勁頭足，且燃燒性更好，從而較好的改善了煙草的吸食品質(zhì)。
需要解釋的是，本申請中所述酶解-醇化法主要是指對煙草薄片中果膠降解時(shí)酶解溫度的調(diào)控和美拉德反應(yīng)中溫度調(diào)控兩個(gè)方面，通過相關(guān)工藝參數(shù)的優(yōu)化，從而最終改善煙草質(zhì)量。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中果膠含量測定、果膠降解率的計(jì)算方法簡要介紹如下。
果膠含量測定
下述實(shí)施例中對于煙草薄片濃縮液中的果膠含量采用咔唑比色法測定，具體測定步驟如下：
1、樣品預(yù)處理，取待測樣品，稱取10ml，樣品于250ml錐形瓶中，加入150ml加熱至沸騰的0.05mol/l的hcl溶液，裝上冷凝器，于90℃水浴中加熱回流1h，冷卻后把濾液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，搖勻，收集濾液即得總果膠提取液，備用；
2、以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，咔唑比色法測定果膠含量，取步驟a中所得總果膠提取液1ml于含有6ml濃硫酸的試管中，搖勻；
85℃水浴加熱15min；冷卻，加入0.15%咔唑無水乙醇溶液0.3ml，搖勻，暗置30min；530nm下測吸光度；
3、根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，求得待測液果膠含量；
所述公式為：果膠（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量（μg/ml)，v：果膠提取液原液體積（ml），k：果膠提取液稀釋倍數(shù)，w：樣品質(zhì)量（g），106：質(zhì)量單位換算系數(shù)；
所述咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：
首先準(zhǔn)確稱取0.1000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用ph為3的鹽酸定容；
然后分別取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8個(gè)100容量瓶中，用ph為3的hcl定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
最后以上述方法測定，然后繪制咔唑比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
果膠降解率計(jì)算
下述實(shí)施例中果膠降解率按以下公式計(jì)算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果膠的降解率，c0：空白對照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶處理的煙草薄片濃縮液中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；空白對照樣和酶處理的煙草薄片濃縮液中果膠含量測定均按上述咔唑比色法進(jìn)行測定。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中所提供的利用鮮綠青霉發(fā)酵所制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中30℃活化培養(yǎng)3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為黑龍江省輕工科學(xué)研究院在中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號為cicc41001的鮮綠青霉(penicilliumviridiatum)；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基（馬鈴薯300g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l，ph自然，121℃滅菌）；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體采用劃線法接種。
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，26℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h，制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠5g/l，蛋白胨10g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，ph=6.0～6.5，具體裝液量為：100/250ml錐形瓶。
從活化培養(yǎng)基中挑取菌株時(shí)，具體按如下方法進(jìn)行：
用打孔器在活化培養(yǎng)基平板上靠近菌株生長邊緣的位置取兩塊0.5cm2的、長滿新生菌絲的接種塊，再接種于種子培養(yǎng)基中；
還需解釋的是，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后后，可加入滅菌的磁珠和適量的玻璃珠，使用磁力攪拌器攪拌2h左右，以使將培養(yǎng)物打碎，便于作為種子液接種用于進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)擴(kuò)增使用。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160r/min搖床培養(yǎng)12h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、蛋白胨2.0g/l，ph=6.2。
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用。
所制備粗酶液酶活進(jìn)行測定，最高酶活檢測結(jié)果為2872.36u/ml。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1所制備粗酶液用于降解煙草薄片濃縮液中果膠，所述具體使用方法為：
將實(shí)施例1中所制備果膠酶粗酶液（酶活為2872.36u/ml，理論而言，實(shí)施例1中所制備任意酶活的粗酶液均可用于降解果膠應(yīng)用，但為確定較好降解條件及對煙草實(shí)際改善效果，因而僅以實(shí)施例1所制備的酶活為2872.36u/ml的粗酶液為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋后粗酶液根據(jù)不同配比情況，煙草薄片濃縮液（干重，所述干重為將濃縮液在低溫狀態(tài)下烘至無明顯液體揮發(fā)即可）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml，在40℃~50℃條件下，酶解2~6h；
酶解結(jié)束后，迅速將處理后煙草薄片濃縮液放70℃的烘箱中，使粗酶液中的果膠酶失活，測定處理后樣品中的果膠含量。
同樣操作條件下，以加入失活酶液（將粗酶液煮沸失活）作為對照組，最終計(jì)算果膠降解率。
實(shí)驗(yàn)過程中，為獲得最佳的降解率，發(fā)明人采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，選用l9(34)正交表對果膠降解條件（粗酶液稀釋倍數(shù)a、物料配比b、酶解溫度c、酶解時(shí)間d）進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將粗酶液稀釋10倍、物料配比1g:3ml、反應(yīng)溫度50℃、處理時(shí)間6小時(shí)，在此條件下煙草薄片中濃縮液果膠降解率達(dá)到最大，為24%左右。
為進(jìn)一步檢測酶解處理后煙草薄片濃縮液所制備的煙草薄片對于煙草吸食效果的改進(jìn)程度，以上述最佳酶解處理?xiàng)l件處理后煙草薄片濃縮液為例，發(fā)明人對其進(jìn)行了實(shí)際卷煙抽吸實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。
實(shí)施例3
將實(shí)施例2中最佳酶解條件處理后煙草薄片濃縮液原料，進(jìn)行美拉德反應(yīng)，70℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)13h，以美拉德反應(yīng)后濃縮液為涂布液，涂布到煙草片基上并制備為煙草薄片。
將此草薄片在40℃條件下進(jìn)行適當(dāng)烘干（至濕度65%）后，切絲，然后置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡（相對濕度(60±5)%，溫度(22±2)℃）48h；
按煙絲重量15%（即稱取0.12g樣品）與平衡后85%的配方煙絲（許昌b2f）均勻混合后按現(xiàn)有技術(shù)制備抽吸用卷煙，此即為試驗(yàn)組卷煙。
相同條件及相同方法下，采用僅活酶處理的煙草薄片濃縮液制備的煙草薄片卷煙記為對照組（缺少美拉德反應(yīng)處理），以滅活酶處理的煙草薄片濃縮液所制備的制備的煙草薄片卷煙記為空白組。
將各組卷煙樣品（每支煙只總重0.80±0.01g）在溫度(22±2)℃、相對濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24h后，依據(jù)國家現(xiàn)行成品煙評析標(biāo)準(zhǔn)gb5606.4-2005對卷煙進(jìn)行質(zhì)量評吸鑒定和評價(jià)。
具體評價(jià)結(jié)果如下表所示：
從上述評價(jià)結(jié)果可以看出，酶解和美拉德處理后的煙草薄片添加與卷煙后，可使卷煙的香氣更加細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，同時(shí)能夠增加甜潤感且減輕刺激性，口感發(fā)澀程度減小，余味純凈舒適，勁頭足，且燃燒性更好，卷煙的吸食品質(zhì)得到了較好改善。