專利名稱：長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2及其基因工程制備方法。
背景技術(shù)：
骨折延遲愈合及骨不連、骨缺損的修復(fù)一直是骨科領(lǐng)域懸而未決的重大問題。長期以來，骨缺損的修復(fù)主要采用自體骨移植、同種異體骨移植和采用生物材料和制品進(jìn)行替換、修復(fù)三種治療方法。自體骨受來源數(shù)量限制，且取骨手術(shù)至少存在10％的外科并發(fā)癥，植入后需要較長時(shí)間的爬行替代過程；異體骨存在不同程度的免疫排異反應(yīng)及潛在的病源傳播危險(xiǎn)。因此，具有特殊功能的生物材料和制品在臨床上備受關(guān)注。盡管目前已經(jīng)有不少的生物材料在臨床上獲得使用，但傳統(tǒng)生物材料的活性和降解性的不足嚴(yán)重影響了其在臨床上的使用效果。
對骨生長和修復(fù)有明顯生物活性的細(xì)胞因子——骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogenetic Protein，BMP)，為骨不連、骨缺損的治療提供了新的方法。BMP既是多功能形態(tài)發(fā)生因子，同時(shí)又具有突出的誘骨成骨活性，具有巨大的基礎(chǔ)研究價(jià)值和廣闊的臨床應(yīng)用前景。
早在1965年，美國醫(yī)師Urist首先發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨基質(zhì)中存在著具有異位誘導(dǎo)成骨作用的物質(zhì)，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)二十種BMP，分別命名為BMP-1，BMP-2，...。BMPs(除BMP-1以外)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族。BMP在胚胎發(fā)育時(shí)就存在，不僅在胚胎早期參與調(diào)節(jié)多種器官的發(fā)育和細(xì)胞的定向分化，在生后仍能誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨和骨細(xì)胞，在骨和牙齒的生成發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。骨折后骨愈合過程中局部BMP的表達(dá)水平明顯增高，并且局限于骨折骨痂形成區(qū)。將BMP植入軟組織內(nèi)，可異位誘導(dǎo)新骨的形成，這已被用作考察BMP活性的一個(gè)依據(jù)。
BMP-2是所有骨生長因子中對骨的形成作用最強(qiáng)的生長因子，對其結(jié)構(gòu)與功能的研究也最為深入。天然人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)是一種疏水性非膠原酸性糖蛋白，不溶于水，易溶于高濃度的尿素和鹽酸胍。由于BMP-2蛋白的非水溶性特性，給其分離、提取以及基因工程制備帶來困難。BMP-2分子上有一疏水核，有30％的酸性氨基酸，其pI為5.0左右。BMP-2蛋白一級結(jié)構(gòu)中含有非常保守的七個(gè)半胱氨酸殘基，組成三對鏈內(nèi)二硫鍵和一對鏈間二硫鍵橋，這對于維持分子的天然活性構(gòu)像具有重要作用。若使用還原劑將二硫鍵打開，其骨誘導(dǎo)活性將完全喪失。成熟的BMP-2分子以二聚體形式存在，由2個(gè)單體通過二硫鍵結(jié)合而成，每個(gè)活性單體均由114個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約13KDs，含有糖基化位點(diǎn)。Sampath等對直接從牛骨基質(zhì)中提取的一種具有誘骨活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)去糖基后，由16KD和14KD多肽組成的二聚體仍有誘骨活性，說明糖基化對活性并非必需。這使采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備BMP-2成為可能。
在體內(nèi)，BMP-2首先被合成為分子量較大的前體，前體由信號肽和100-125個(gè)氨基酸組成的羧基端(C-端)組成。BMP-2在其羧基C-端部分包括特征性的7個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，這些殘基對于前體互相正確結(jié)合成二聚體具有重要作用。當(dāng)BMP-2的C-端被裂解釋放后，2個(gè)單體以二硫鍵相結(jié)合發(fā)生二聚作用，有活性的同鏈或異鏈二聚體BMP-2即被分泌出來。BMP-2前體沒有TGF-β1和TGF-β2前體序列所含的Arg-Gly-Asp潛隱性組織識別序列，成熟肽N端富含堿性氨基酸，可使其易于吸附于細(xì)胞外基質(zhì)上，以延長其生物半衰期，充分發(fā)揮其誘骨活性或在發(fā)育和分化階段使其形成hBMP-2信號梯度[Biochem Biophys Res Commun，2004；318(3)704]。
BMP-2可從動物組織內(nèi)提純(p-BMP2)，也可用基因工程構(gòu)建重組細(xì)胞表達(dá)合成(rhBMP-2)。早在1979年Urist[UAnn Thorac Surg，1990；49(6)864-5]領(lǐng)導(dǎo)的小組率先從兔脫鈣骨中成功地分離純化了兔的BMP-2，于1982年從牛骨中提取出牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bBMP)，1987年Urist[Clin Orthop Relat Res.，1987(214)295-304]建立了一套從人及牛骨中提取BMP的標(biāo)準(zhǔn)步驟。目前，pBMP-2大多從牛、豬、羊、馬、兔、鼠等動物的正常骨中提取。天津中津藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的金世植骨靈重組合異種骨(RBX)中的成骨誘導(dǎo)因子就是從牛骨中提取，然后再同牛骨復(fù)合而成，用于治療骨折延遲連接、不連接和骨缺損治療。
自然界中BMP雖然廣泛存在于各種動物的骨組織中，但其含量甚微，每公斤濕重新鮮骨僅含有幾微克BMP，且不同來源BMP在理化性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)上存在較大差別，誘導(dǎo)成骨活性和穩(wěn)定性也都有所不同，。由于骨組織中各種BMP與不溶性非膠原蛋白(insoluble noncollagenous protein，iNCP)緊密結(jié)合，很難從中分離出單一的任何一種BMP分子。因此，從動物骨組織中分離BMP，過程繁雜，重復(fù)性差，收率低，蛋白純度不高并且不可避免地存在差異；對BMP的復(fù)性要求高，蛋白活性難以維持穩(wěn)定。同時(shí)，這種動物來源的蛋白在人體使用，會引起不同程度的免疫排斥反應(yīng)和潛在的病源傳播危險(xiǎn)。因此，完全依靠動物骨提取，難以滿足實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中的需求量。
利用基因工程方法生產(chǎn)人BMP-2，不僅可保證大量生產(chǎn)，還可避免免疫排斥反應(yīng)，是極具發(fā)展前景和吸引力的方法。自1988年Wozney等以牛骨為來源的BMP-2基因，并在重組大腸桿菌中成功表達(dá)后，基因工程大量生產(chǎn)人的BMP-2也就成為可能(WozneyJM，Rosen V，Celeste AJ，etal，Novel regulators of bone formationmolecular clones andactivities，science，1988；242(4885)1525-34)。
目前，用于表達(dá)BMP-2基因的系統(tǒng)既有真核，也有原核細(xì)胞，兩種表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。Wozney JM(Wozney JM，Overview of bone morphogeneticproteins，Spine.2002，15；27(16 Suppl 1)S2-8)認(rèn)為hBMP-2在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)生成軟骨能力，但無誘導(dǎo)成骨的能力。趙明在真核細(xì)胞COS和CHO中已經(jīng)獲得具有誘導(dǎo)生物活性的重組人BMP-2。Genetics Institute的Wozney等從人U-20s細(xì)胞的eDNA文庫中克隆了hBMP-2，結(jié)果顯示hBMP-2的cDNA全長為1587bp，編碼有396個(gè)氨基酸的多肽，可在蛋白酶作用下生成有活性的成熟肽[Sugiura T.，Biochem J.1999，338(Pt2)433-40]，其長度為114個(gè)氨基酸。專利US Appl.No.118363用COS、CHO等哺乳動物細(xì)胞表達(dá)人rhBMP-2。
由于使用哺乳動物細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物多為分泌型的，有更好的翻譯后修飾，可以糖基化，活性相對較高，是BMP基因較理想的表達(dá)體系。真核細(xì)胞表達(dá)的BMP-2是第一個(gè)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明具有誘骨活性的BMP分子。如將未經(jīng)純化的細(xì)胞培養(yǎng)液直接植入肌肉內(nèi)，并不表現(xiàn)誘導(dǎo)活性，必須在純化后才能顯示出與劑量相關(guān)的誘骨活性。目前，由Medtromic Sofamor Danek公司采用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的BMP-2產(chǎn)品——InfuseTMBone Graft已用于脊柱融合和骨缺損填充修復(fù)。由Stryker Biotech公司采用CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的OP-1TmImplant(OP-1，又稱rhBMP-7)已被FDA批準(zhǔn)并開始應(yīng)用于臨床。但真核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是表達(dá)率低，生產(chǎn)成本很高，產(chǎn)品價(jià)格昂貴，無法滿足科研和臨床的大量需要。
與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)易于進(jìn)行基因操作，表達(dá)效率高，細(xì)胞外有細(xì)胞壁，不如哺乳動物細(xì)胞嬌嫩，營養(yǎng)要求低，對培養(yǎng)環(huán)境的耐受性強(qiáng)，易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，具有很強(qiáng)的競爭力。盡管原核表達(dá)系統(tǒng)不能使BMP糖基化，表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體形式出現(xiàn)，且受復(fù)性過程難控制、制備工藝相對復(fù)雜等問題困擾，但對于BMP的表達(dá)，由于糖基化并不是BMP活性的必需條件，無糖基化修飾并不影響它們的生物活性[J.M.Wozney，Science，1988，24 215 28-15]。因此，原核表達(dá)系統(tǒng)也被用于BMP的表達(dá)和生產(chǎn)。
在國外，Kubler NP[Int J oral Maxillofac Surg，1998，2730]和Ruppert R[Eur J Biochem，1996；237295-302]均在E.Coli中成功表達(dá)了hBMP-2完整成熟肽基因，表達(dá)量達(dá)30％。在國內(nèi)，不同長短的hBMP-2成熟肽基因在E.Coli中也獲得成功表達(dá)，而且重組hBMP-2具有一定的異位誘導(dǎo)成骨活性。但是國內(nèi)外的研究機(jī)構(gòu)卻因無法進(jìn)一步進(jìn)行可重復(fù)性的復(fù)性和純化大腸桿菌產(chǎn)生的人全長成熟肽BMP-2，使工作停留在實(shí)驗(yàn)室水平(只能得到毫克量)，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。林松等[生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1996，28(1)8]發(fā)現(xiàn)hBMP-2愈接近完整成熟肽的長度，其成骨活性愈好。專利CN 01116754.8利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)制備了具生物活性的截短型rhBMP-2-108蛋白。表達(dá)的基因長324bp，編碼的截短型的rhBMP-2由108個(gè)氨基酸組成。該發(fā)明雖能實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但因生物半衰期短、體內(nèi)穩(wěn)定性差而限制了應(yīng)用?？梢姡鄬τ谕暾墒祀幕蜷L度的rhBMP-2而言，截短型的rhBMP-2-108蛋白總體生物活性相對較低，影響其對骨折延遲愈合及骨不連、骨缺損等的重建修復(fù)效果。
對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是基因工程領(lǐng)域經(jīng)常采用的一種方法，包括天然蛋白內(nèi)氨基酸序列的改變、截短型的構(gòu)建和長鏈型的構(gòu)建等，目的是提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)、活性和穩(wěn)定性等，如長鏈型IGF-1(insulin-like growth factors-1)等。雖然已經(jīng)有天然型hBMP-2和截短型hBMP-2的基因工程構(gòu)建研究和專利報(bào)道，但到目前為止還沒有長鏈型rhBMP-2的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于公開一種長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2及其制備方法和應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中復(fù)性難、分離難、蛋白活性低且在體內(nèi)不穩(wěn)定等造成難以產(chǎn)業(yè)化的問題。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備rhBMP-2，可克服真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)率低，生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)，但復(fù)性過程難控制、制備工藝相對復(fù)雜。rhBMP-2的活性、復(fù)性等制備過程的難易在一定程度上取決于肽鏈的長度和組成。因此，本發(fā)明在hBMP-2的成熟肽全長114個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上，針對hBMP-2自身分子結(jié)構(gòu)的特征和原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，在其N端設(shè)計(jì)增加一段特定的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對hBMP-2的氨基酸肽段的一級結(jié)構(gòu)修飾，形成長鏈型rhBMP-2；采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備該長鏈型rhBMP-2。所設(shè)計(jì)的肽鏈段的引入，可使rhBMP-2具有良好的活性和穩(wěn)定性，并提高其表達(dá)，促進(jìn)蛋白復(fù)性時(shí)正確折疊，延長生物半衰期，以克服非長鏈型rhBMP-2復(fù)性難、分離難、活性低及難以產(chǎn)業(yè)化等問題。
本發(fā)明所說的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，是由人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的114個(gè)氨基酸和連接在所述的氨基酸的N端的氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，形成長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)；所說的多肽鏈的特征為不干擾BMP-2二聚體的形成，不影響B(tài)MP-2活性中心的空間三維結(jié)構(gòu)。
所說的多肽鏈為Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu LysArg，或以以上肽鏈為基礎(chǔ)的較短的多肽鏈，以所列的多肽鏈為最優(yōu)。
蛋白單鏈分子量約為13-15KD，經(jīng)復(fù)性后該活性蛋白為二聚體，分子量約為25-30KD；優(yōu)選的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的氨基酸序列如SEQ IDNO1或SEQ IDNO2或SEQ IDNO3所示SEQ IDNO1長度131aa類型氨基酸序列鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源基因工程合成。
Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys ArgGln Ala Lys1 5 10 15 20His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe25 30 35 40Ser Asp val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys45 50 55 60His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val65 70 75 80Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu85 90 95 100Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr
105 110 115120Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg EndSEQ IDNO2長度125aa類型氨基酸序列鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源基因工程合成。
Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys ArgGln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg1 5 10 15 20Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn25 30 35 40Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe45 50 55 60Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser65 70 75 80Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met85 90 95 100Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu105 110 115 120Gly Cys Gly Cys Arg EndSEQ IDNO3長度 119aa類型 氨基酸序列鏈型單鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源基因工程合成。
Met Arg Glu Lys Arg Gln Ala LysHis Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15 20Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Tsp Ile Val Ala Pro25 30 35 40Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu45 50 55 60Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro65 70 75 80Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn85 90 95 100Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg End105 110 115本發(fā)明所設(shè)計(jì)的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，由hBMP-2的成熟肽全長114個(gè)氨基酸以及連接在氨基酸殘基的N端的一個(gè)多肽鏈構(gòu)成；分子量為28～32KD。
編碼所說的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因序列如SEQ IDNO4或SEQ IDNO5或SEQ IDNO6所示SEQ IDNO4長度396bp類型脫氧核糖核酸鏈型雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成。
ATG AAA AGA CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT 51MK R H D G K G H P L H K R E K R 17CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 102QA KH K Q R K R L K S S C K R H 34CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 153PL Y V D F S D V G W N DW IV A 51CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 204
P P G Y HA F Y C HG E C P F P L 68GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 255A D H L N S T N H A I V QT L V N 85TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 306SV N S K I P K A CC V P T E L S 102GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 357A I S M L YL D EN E K V VL K N 119TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 3’396Y Q D M V V E G C G C R*132SEQ IDNO5長度378bp類型脫氧核糖核酸鏈型雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成。
ATG GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT 33M G H P L H K R E K R11CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 84Q A K H K Q R KR L K S S C K R H 28CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 135PL Y V D F S D V G W N D W I V A45CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 186PP GY H A F Y C H GE C PF P L62GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 237AD H L N S T N HA IV Q T LV N79TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 288S VN S K IP K A C CV P TE L S96
GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 339A I S M L Y L D E N E KV V L K N113TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 3’ 378Y Q D M V V E G C G C R*126SEQ IDNO6長度360bp類型脫氧核糖核酸鏈型雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性來源人工合成。
ATG AGA GAA AAA CGT 15M R E K R5CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 66Q A K H KQ R KR L K S S CK R H22CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 117P L Y VD F S D VG W N D W I V A39CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 168P P G Y H A F Y C H G E C PF P L 56GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 219A D H L N S T N H A I V Q T L V N 73TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 270SV N S K IP K A C C V P T E L S 90GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 321A I S M L Y L DE NE K V V LK N107TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 3’ 360Y Q D M V V E G C G C R*120
本發(fā)明的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的制備方法，包括步驟如下步驟①培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S(購自美國ATCC)，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，以BMP-F和BMP-R為引物，擴(kuò)增出編碼羧基端自然結(jié)構(gòu)成熟肽完整114個(gè)氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前增加一段核苷酸，使其對應(yīng)的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到長鏈型rhBMP-2基因。得到一條大小為不大于396bp的DNA片段，回收上述片段，構(gòu)建成長鏈型的人BMP-2基因，在多克隆位點(diǎn)將其插入載體pBV220中，得到rhBMP-2表達(dá)質(zhì)粒pBV220-hBMP-2，擴(kuò)增后經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證插入片段與設(shè)計(jì)一致；所說的引物的DNA序列為BMP-F5’GGGGAATTCATGCAAGCCAAACACAAACAG 3’BMP-R5’CCCGGATCCATACTAGCGACACCCACAA 3’；②采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備感受態(tài)表達(dá)系統(tǒng)后，用①步所得的表達(dá)質(zhì)粒pBV220-BMP2進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，最后測序，證實(shí)表達(dá)載體序列正確；所說的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、草生歐文菌或谷氨酸棒桿菌；所說的常規(guī)的氯化鈣法B.R.格利克，J.J.帕斯捷爾納克編，陳麗珊、任大明主譯，分子生物技術(shù)，化學(xué)工業(yè)出版社，2005年p71中有詳細(xì)的描述；③從轉(zhuǎn)化后含有正確表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的LB培養(yǎng)液的搖瓶中，在25-38℃的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴振蕩器中培養(yǎng)2-3小時(shí)，再按體積比為1∶8-12的比例將培養(yǎng)物接種到LB培養(yǎng)基中，在100-300rpm、25-38℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.4，培養(yǎng)時(shí)間為10-12小時(shí)；所說的LB培養(yǎng)液為為10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；所說的抗生素選自氨芐青霉素、鏈霉素或卡那霉素；LB培養(yǎng)液中，抗生素的含量為10～100μg/ml；然后接入LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為0.1～2.0∶5，種子液培養(yǎng)液，體積比，pH7.0±0.2，培養(yǎng)溫度為25-38℃，攪拌速度100-600rpm。然后，升溫至40～42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，在7500-10000rpm 4±2℃條件下，離心分離，收集菌體，菌體裂解后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在15KD分子量處，與誘導(dǎo)前的重組菌及不含質(zhì)粒的出發(fā)菌相比，有清晰條帶增加，說明已經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生了目標(biāo)蛋白質(zhì)。
④菌體破碎、洗滌將步驟③收集的菌體，與TE溶液，按1g∶5-15ml的比例混合，再按1g∶0.3-5mg的比例，與溶菌酶混合，采用細(xì)胞破碎技術(shù)進(jìn)行菌體破碎，然后在6000-10000rpm離心，收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗滌液的比例加入洗滌液，攪拌2～4h后，4±2℃離心收集沉淀物，再用洗滌液進(jìn)行二次洗滌，之后，以1g沉淀物∶20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵體；所說的TE溶液為6mM的Tris，和10mM的EDTA，pH7.50；洗滌液為磷酸鹽緩沖液、尿素水溶液、曲拉通水溶液等；所說的細(xì)胞破碎技術(shù)包括反復(fù)凍融法、超聲波破碎法或高壓均質(zhì)法，在李宏軍等人的文獻(xiàn)(黑龍江醫(yī)藥，2002，15(2)124)中有詳細(xì)的報(bào)道；⑤包涵體裂解、復(fù)性和純化以1g包涵體∶5～20ml裂解液的比例加入裂解液，在4±2℃下，攪拌裂解8～12小時(shí)，離心，離心轉(zhuǎn)速6000～12000rpm，離心溫度為4±2℃，離心時(shí)間為20～30分鐘，棄沉淀，取離心上清液，稀釋至蛋白含量為0.1-1mg/ml的樣品，按體積比為1∶10～100的比例加入復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性2-20天，然后經(jīng)過疏水柱、親和層析柱和凝膠色譜柱等進(jìn)行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30～7℃下凍干，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，經(jīng)非還原電泳SDS-PAGE檢測產(chǎn)品純度超過95％，分子量約為30KD；HPLC鑒定其純度超過95％。經(jīng)測定，N末端與C末端測定均與理論值一致。
所說的包涵體裂解液可為6M Gu-HCl或8M尿素、20mM PBS、10mM DTT等。
所說的復(fù)性液為20mMNa2HPO4·12H2O、1.5mMNaH2PO4·2H2O、140mMNaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。
采用本發(fā)明上述的方法，獲得的蛋白，電泳結(jié)果表明，條帶清晰，基本無雜帶，其純度達(dá)95％以上。
試驗(yàn)證明，本發(fā)明的蛋白，具有較高的誘導(dǎo)成骨活性，可單獨(dú)使用或與載體材料復(fù)合使用；將本發(fā)明研制的長鏈型rhBMP-2植入到昆明種小白鼠的大腿肌肉內(nèi)，并以空白組作為對照，通過測定不同劑量rhBMP-2植入相同時(shí)間和相同劑量rhBMP-2植入不同時(shí)間的堿性磷酸酶(AKP)活性和成骨量，以檢測rhBMP-2的異位成骨活性。結(jié)果表明，植入本發(fā)明方法制備的長鏈型rhBMP-2后，組織的AKP活性約為空白對照組的10倍；異位成骨量隨rhBMP-2植入量和時(shí)間的增加而增加，具有劑量和時(shí)間呈正相關(guān)，而空白組并沒有新骨生成。
將本發(fā)明研制的長鏈型rhBMP-2填充到新西蘭白兔的去骨膜的1.5cm橈骨節(jié)段缺損內(nèi)，并以空白組作為對照，考察了骨缺損區(qū)域新骨形成、骨密度、骨痂生長、骨愈合情況。結(jié)果顯示，采用本發(fā)明方法制備的長鏈型rhBMP-2具有優(yōu)異的原位成骨活性，rhBMP-2植入12周后1.5cm的橈骨骨缺損即能完全為新生骨質(zhì)所充填，基本恢復(fù)正常骨形態(tài)，并形成正常的骨皮質(zhì)。
采用物理吸附法、均相包埋法或非均相包埋法將本發(fā)明研制的長鏈型rhBMP-2或其微囊與載體材料進(jìn)行復(fù)合制備活性硬組織修復(fù)材料；結(jié)果表明，制備的活性硬組織修復(fù)材料能延緩蛋白的釋放，且釋放速度易控制。
所述的載體材料包括無機(jī)生物材料(如羥基磷灰石HAP，磷酸三鈣，磷酸鈣骨水泥，聚合磷酸鈣，天然珊瑚，生物玻璃或微晶玻璃等或其復(fù)合物)、高分子材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚β-羥基丁酸酯，聚原酸酯、聚碳酸酯等或其復(fù)合物)、天然生物材料(包括膠原、明膠等天然蛋白，殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖等天然多糖等)或相互間的復(fù)合物。以rhBMP-2的重量計(jì)，所述的載體的含量為rhBMP-2的0-3000倍。
本發(fā)明采用原核表達(dá)制備的長鏈型rhBMP-2不僅具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)成骨能力，而且穩(wěn)定性好、表達(dá)率高、生產(chǎn)成本低，是一種理想的骨生長因子?？蓡为?dú)或與載體復(fù)合后應(yīng)用于脊柱外科、整形外科、口腔科、骨科(尤其在骨不連、骨延遲愈合方面)等領(lǐng)域。
本發(fā)明的特色和優(yōu)點(diǎn)在于1、與現(xiàn)有的專利和文獻(xiàn)報(bào)道不同的是，本發(fā)明設(shè)計(jì)制備出的是長鏈型rhBMP-2，即在人BMP-2成熟肽的114個(gè)氨基酸的基礎(chǔ)上，在N末端增加一段多肽鏈，對人BMP-2進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，形成長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。該多肽片段的引入，具有很多優(yōu)點(diǎn)①不影響B(tài)MP-2的C端保守區(qū)活性的發(fā)揮，又可提高其表達(dá)量；②復(fù)性時(shí)能促進(jìn)蛋白正確折疊；③增加了目標(biāo)蛋白的親和結(jié)合位點(diǎn)，有利于蛋白的分離純化；④延長體內(nèi)生物半衰期，增加其體內(nèi)的使用效果?？傊?，長鏈型rhBMP-2可以克服非長鏈型rhBMP-2(包括天然型和截短型)異源表達(dá)時(shí)存在的復(fù)性難、分離難、活性低及難以產(chǎn)業(yè)化等問題。此結(jié)構(gòu)是在創(chuàng)新思路下構(gòu)建的完全不同于現(xiàn)有的rhBMP-2的新蛋白；2、該蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)制備。此長鏈型結(jié)構(gòu)是針對hBMP-2自身分子結(jié)構(gòu)的特征和原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，蛋白可以高表達(dá)，原核表達(dá)形成的包涵體裂解后復(fù)性時(shí)易正確折疊復(fù)性，易于后續(xù)的分離純化。即此長鏈蛋白與此原核表達(dá)系統(tǒng)的制備工藝是相互關(guān)聯(lián)的，該蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)制備具創(chuàng)新性。
3、采用E.Coli.發(fā)酵制備長鏈型rhBMP-2時(shí)采用LB培養(yǎng)基，省卻了采用真核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)需要的含動物血清培養(yǎng)基，即避免使用動物源性物質(zhì)。經(jīng)過分離、純化后得到的樣品純度高(可達(dá)95％以上)，消除了潛在的病源傳播危險(xiǎn)降低了生產(chǎn)成本。
4、制備出的長鏈型rhBMP-2易于生成、質(zhì)量易控制，優(yōu)于天然提取的BMP


圖1為長鏈型rhBMP-2的單鏈蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖2為長鏈型rhBMP-2的復(fù)性后的雙鏈蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖3為純化的長鏈型rhBMP-2的毛細(xì)管電泳分析(PDA-280nm)，表明其純度超過98％，橫坐標(biāo)為時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)為吸光度。
圖4制備的長鏈型rhBMP-2的HPLC圖。
圖5不同植入量長鏈型rhBMP-2植入小鼠異位成骨量的組織照片圖6小鼠異位成骨組織的組織切片照片。圖7為圖6的放大圖。
圖8為500 g的長鏈型rhBMP-2植入小鼠在不同時(shí)間內(nèi)新骨組織的堿性磷酸酶(AKP)活性圖。
圖9和10分別為橈骨節(jié)段缺損模型中4周、12周對照組的X線。
圖11和12分別為橈骨節(jié)段缺損模型中4周、12周實(shí)驗(yàn)組的X線。
圖13和14分別為橈骨節(jié)段缺損模型中12周對照組和實(shí)驗(yàn)組的組織形態(tài)照片。
圖15為長鏈型rhBMP-2的可控釋放圖。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1長鏈型rhBMP-2及其制備方法①培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S(購自美國ATCC)，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前加上一段編碼所設(shè)計(jì)氨基酸殘基序列(Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro LeuHis Lys Arg Glu Lys Arg)的核苷酸序列，然后進(jìn)行以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條大小為396bp的DNA片段，回收上述片段，將其插入表達(dá)載體pBV220中，構(gòu)建成長鏈型的重組人BMP-2基因表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，其基因編碼序列如SEQ IDNO4所示。長鏈型重組人BMP-2的氨基酸殘基序列如SEQ IDNO1所示。
②采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。再將①步所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，證實(shí)長出的菌落含有①步所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，至此完成大腸桿菌工程菌的構(gòu)建。
③在含葡萄糖和相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)長鏈型重組人BMP-2的基因工程菌按3％的接種量將基因工程菌接入一定量的LB培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)2-3小時(shí)，培養(yǎng)溫度為25℃。
④長鏈型重組人BMP-2的基因的誘導(dǎo)表達(dá)按10％的比例將培養(yǎng)物接種到含有2000ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以300rpm、25℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2，培養(yǎng)時(shí)間為12小時(shí)。然后，升溫至42℃誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。最后在10000rpm、4℃離心5分鐘收集菌體，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定說明已經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生了目標(biāo)蛋白。(見附圖1)。
⑤菌體破碎、洗滌將離心菌體按1g∶5ml的TE溶液比例攪拌均勻，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，攪拌均勻，并放入4℃冰箱冷藏過夜。在80MPa壓力下采用高壓均質(zhì)法破碎細(xì)胞，均質(zhì)次數(shù)為5次。然后在6000rpm離心30分鐘收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗滌溶液的比例，加入洗滌溶液，均勻攪拌3h后4℃離心30分鐘，收集沉淀物；再用洗滌溶液進(jìn)行二次洗滌，之后再往洗滌溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵體。冷凍保存。
⑥包涵體裂解、復(fù)性和純化以1g包涵體20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下攪拌裂解過夜。對裂解溶液離心，離心轉(zhuǎn)速12000rpm，離心溫度為4℃，離心時(shí)間為20分鐘，棄沉淀取離心上清液。將稀釋后蛋白含量為1mg/ml樣品按1∶10的比例倒入復(fù)性液中，復(fù)性2天，然后經(jīng)過疏水柱、陽離子柱、親和層析柱和凝膠柱進(jìn)行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-20℃下進(jìn)行無菌凍干，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，記為rhBMP-2-L1。經(jīng)非還原電泳SDS-PAGE檢測產(chǎn)品純度超過98％(見附圖2)。毛細(xì)管電泳鑒定其純度超過98％(見附圖3)。HPLC鑒定其純度超過95％(見附圖4)。經(jīng)測定，其等電點(diǎn)PI約為8.2，N末端與C末端測定均與理論值一致。
實(shí)施例2長鏈型rhBMP-2及其制備方法①培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S(購自美國ATCC)，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前加上一段編碼所設(shè)計(jì)氨基酸殘基序列(Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu LysArg)的核苷酸序列，然后進(jìn)行以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條大小為378bp的DNA片段，回收上述片段，將其插入表達(dá)載體pBV220中，構(gòu)建成長鏈型的重組人BMP-2基因表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，基因編碼序列如SEQ IDNO5所示。長鏈型重組人BMP-2的氨基酸殘基序列如SEQ IDNO2所示。
②采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。再將①步所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，證實(shí)長出的菌落含有①步所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，至此完成大腸桿菌工程菌的構(gòu)建。
③在含葡萄糖和相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)長鏈型重組人BMP-2的基因工程菌按5％的接種量將基因工程菌接入一定量的LB培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)2-3小時(shí)，培養(yǎng)溫度為32℃。
④長鏈型重組人BMP-2的基因的誘導(dǎo)表達(dá)按10％的比例將培養(yǎng)物接種到含有2000ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以300rpm、32℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2，培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)。然后，升溫至42℃誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。最后在10000rpm、4℃離心5分鐘收集菌體，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定說明已經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生了目標(biāo)蛋白。(見附圖1)。
⑤菌體破碎、洗滌將離心菌體按1g∶5ml的TE溶液比例攪拌均勻，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，攪拌均勻，并放入4℃冰箱冷藏過夜。在80MPa壓力下采用高壓均質(zhì)法破碎細(xì)胞，均質(zhì)次數(shù)為6次。然后在6000rpm離心30分鐘收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗滌溶液的比例，加入洗滌溶液，均勻攪拌3h后4℃離心30分鐘，收集沉淀物；再用洗滌溶液進(jìn)行二次洗滌，之后再往洗滌溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵體。冷凍保存。
⑥包涵體裂解、復(fù)性和純化以1g包涵體20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下攪拌裂解過夜。對裂解溶液離心，離心轉(zhuǎn)速12000rpm，離心溫度為4℃，離心時(shí)間為20分鐘，棄沉淀取離心上清液。將稀釋后蛋白含量為0.5mg/ml樣品按1∶10的比例倒入復(fù)性液中，復(fù)性10天，然后經(jīng)過疏水柱、陽離子柱、親和層析柱和凝膠柱進(jìn)行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-20℃下進(jìn)行無菌凍干，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，記為rhBMP-2-L2。經(jīng)非還原電泳SDS-PAGE檢測產(chǎn)品純度超過97％。毛細(xì)管電泳鑒定其純度超過96％。HPLC鑒定其純度超過95％。經(jīng)測定，N末端與C末端測定均與理論值一致。
實(shí)施例3長鏈型rhBMP-2及其制備方法①培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S(購自美國ATCC)，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，人工合成引物，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前加上一段編碼所設(shè)計(jì)氨基酸殘基序列(Met Arg Glu Lys Arg)的核苷酸序列，然后進(jìn)行以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條大小為360bp的DNA片段，回收上述片段，將其插入表達(dá)載體pBV220中，構(gòu)建成長鏈型的重組人BMP-2基因表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，基因編碼序列如SEQ IDNO6所示。長鏈型重組人BMP-2的氨基酸殘基序列如SEQ IDNO3所示。
②采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備枯草桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。再將①步所得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草桿菌，在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，證實(shí)長出的菌落含有①步所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，至此完成枯草桿菌工程菌的構(gòu)建。
③在含葡萄糖和相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)長鏈型重組人BMP-2的基因工程菌按7％的接種量將基因工程菌接入一定量的LB培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)2-3小時(shí)，培養(yǎng)溫度為37℃。
④長鏈型重組人BMP-2的基因的誘導(dǎo)表達(dá)按10％的比例將培養(yǎng)物接種到含有2000ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以300rpm、37℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2，培養(yǎng)時(shí)間為8小時(shí)。然后，升溫至42℃誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。最后在10000rpm、4℃離心5分鐘收集菌體，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定說明已經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生了目標(biāo)蛋白。(見附圖1)。
⑤菌體破碎、洗滌將離心菌體按1g∶5ml的TE溶液比例攪拌均勻，再按1g∶0.3mg溶菌酶比例，加入溶菌酶，攪拌均勻，并放入4℃冰箱冷藏過夜。在80MPa壓力下采用高壓均質(zhì)法破碎細(xì)胞，均質(zhì)次數(shù)為4次。然后在6000rpm離心30分鐘收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗滌溶液的比例，加入洗滌溶液，均勻攪拌3h后4℃離心30分鐘，收集沉淀物；再用洗滌溶液進(jìn)行二次洗滌，之后再往洗滌溶液中再加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗二次，收集沉淀，得包涵體。冷凍保存。
⑥包涵體裂解、復(fù)性和純化以1g包涵體∶20ml裂解液(6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT)的比例在4℃下攪拌裂解過夜。對裂解溶液離心，離心轉(zhuǎn)速12000rpm，離心溫度為4℃，離心時(shí)間為20分鐘，棄沉淀取離心上清液。將稀釋后蛋白含量為0.1mg/ml樣品按1∶10的比例倒入復(fù)性液中，復(fù)性20天，然后經(jīng)過疏水柱、陽離子柱、親和層析柱和凝膠柱進(jìn)行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-20℃下進(jìn)行無菌凍干，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，記為rhBMP-2-L3。經(jīng)非還原電泳SDS-PAGE檢測產(chǎn)品純度超過95％。毛細(xì)管電泳鑒定其純度超過95％。HPLC鑒定其純度超過96％。經(jīng)測定(見圖4)，N末端與C末端測定均與理論值一致。
實(shí)施例4長鏈型rhBMP-2的中試放大①同實(shí)施例1的①②同實(shí)施例1的②③同實(shí)施例1的③④長鏈型重組人BMP-2的基因的誘導(dǎo)表達(dá)按10％的比例將培養(yǎng)物接種到含有2000ml的LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以300rpm、32℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2，培養(yǎng)時(shí)間為8小時(shí)。然后，接入100L反應(yīng)器中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。接種量為5∶1(培養(yǎng)液∶種子液)，pH7.0，繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)，然后將培養(yǎng)溫度迅速升到為42℃，攪拌速度調(diào)到500rpm，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。最后在10000rpm、4℃離心5分鐘收集菌體。
⑤同實(shí)施例1的⑤⑥同實(shí)施例1的⑥，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，記為rhBMP-2-L4，電泳結(jié)果同圖3相似，表明用于制備長鏈型rhBMP-2的本發(fā)明工藝產(chǎn)量高，可成功實(shí)現(xiàn)過程進(jìn)行100升發(fā)酵規(guī)模的中試放大。
實(shí)施例5長鏈型rhBMP-2的異位成骨活性檢測實(shí)施例1合成的長鏈型rhBMP-2-L1的AKP活性。取不同劑量的rhBMP-2-L1植入小鼠后，分別在1周、2周、3周、4周和8周取出植入部位的新生鮮骨，剔除軟組織后，進(jìn)行拍照，顯示異位成骨量同劑量的依賴關(guān)系(見圖5)。取1000 g植入的樣品所形成的骨組織組織進(jìn)行切片，觀察其形成的組織情況，結(jié)果見圖6，圖7為圖6的放大圖。表明周邊骨組織已類似骨皮質(zhì)，內(nèi)有骨髓腔，間有骨小梁和脂肪空泡及大量的成骨細(xì)胞，表明異位成骨活性高。樣品經(jīng)4℃的生理鹽水中漂洗。37℃烘干后稱重。取植入500 g的rhBMP-2的加入1ml生理鹽水，進(jìn)行勻漿和離心，然后用分光光度計(jì)測定其蛋白含量和堿性磷酸酶活性(AKP)，并將AKP與蛋白含量的比值(AKP/Protein)以及AKP與骨組織重量的比值(AKP/Weight)作圖，見附圖8。結(jié)果表明，材料植入后，無論是以骨組織重量還是以蛋白含量為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，含rhBMP-2植入物組織的AKP活性均在1周內(nèi)迅速達(dá)到最高，且全都為堿性磷酸酶(AKP)，然后逐漸降低。由此進(jìn)一步證實(shí)，采用該法制備的rhBMP-2具有較高的成骨活性。
實(shí)施例6長鏈型rhBMP-2植入兔骨內(nèi)原位成骨實(shí)驗(yàn)研究通過動物實(shí)驗(yàn)對實(shí)施例1制備的長鏈型rhBMP-2植入兔原位成骨性能進(jìn)行評價(jià)。
①評價(jià)方法實(shí)驗(yàn)動物新西蘭白兔，平均2.5kg，清潔級(上海第二醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。
對照組空白，對骨缺損不進(jìn)行處理。
實(shí)驗(yàn)方法對受試動物進(jìn)行麻醉后，取側(cè)臥位固定于手術(shù)臺，在雙側(cè)前肢剃毛備皮，常規(guī)消毒鋪巾，無菌單包裹雙前足。在橈骨中下三分之一皮膚做2cm切口，分離軟組織，直達(dá)骨面。充分暴露，使用牙科鉆在橈骨中下制造長1.5cm包含骨膜在內(nèi)的骨節(jié)段性缺損，止血，然后植入rhBMP-2或不處理。術(shù)后4周、12周進(jìn)行兔雙側(cè)前肢正位X線攝影和組織形態(tài)學(xué)，觀察骨缺損區(qū)域新骨形成、骨密度、骨痂生長和骨愈合情況。
②評價(jià)結(jié)果x線檢查結(jié)果見圖9(空白組4周)、圖10(空白組12周)、圖11(實(shí)驗(yàn)組4周)和圖12(實(shí)驗(yàn)組12周)。由圖可見，空白組4周骨創(chuàng)緣稍模糊，骨缺損中心位置為低密度軟組織影像。12周骨缺損有所縮小，但主要為軟組織影像，斷端處皮質(zhì)呈各自融合影像。實(shí)驗(yàn)組4周可見到缺損中心為充填材料橋連，缺損外側(cè)可見到殼狀不透射影像，跨越在缺損上方。12周骨缺損皮質(zhì)骨橋連而得到修復(fù)，中央髓腔再通，皮質(zhì)骨完整，外形基本恢復(fù)正常。
組織形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖13(空白組)和圖14(實(shí)驗(yàn)組)。由圖可見，空白組12周缺損中心為大量的纖維組織和肌肉組織所覆蓋，缺損未愈合。實(shí)驗(yàn)組12周骨缺損修復(fù)基本完成，新的骨皮質(zhì)和骨髓腔形成，骨改建已完成，骨皮質(zhì)基本恢復(fù)正常形態(tài)。
由此可見，本發(fā)明制備的rhBMP-2原位成骨活性好，對1.5cm節(jié)段性骨缺損有良好的修復(fù)效果。
實(shí)施例7長鏈型rhBMP-2/CPC的復(fù)合及其可控釋放取2％的殼聚糖溶解在1％醋酸溶液中，加入5mg實(shí)施例1合成的長鏈型rhBMP-2，按1ml∶10ml的比例逐滴滴加到聚電解質(zhì)溶液中，反應(yīng)一定時(shí)間后，過濾得到載rhBMP-2殼聚糖微球；分別將載有1mg、3.2mg和5mg的rhBMP-2的殼聚糖微球混入1g CPC骨水泥粉末中，使之充分混合均勻，加入固化液，調(diào)和成漿，稍干后將其充入D＝12mm的有機(jī)玻璃模具中，待變硬后將其頂出，放置在37℃100％濕度環(huán)境的恒溫箱內(nèi)固化24小時(shí)；用756MC紫外可見光分光光度計(jì)測定1d、2d、4d、7d、14d和30d時(shí)rhBMP-2的緩釋量。結(jié)果表明，采用該法制備的rhBMP-2不影響CPC載體材料的固化和水化產(chǎn)物的形成；CPC能延緩rhBMP-2的釋放，從而使蛋白得以有效利用，結(jié)果見附圖15。
序列表<110>上海瑞邦生物材料有限公司<120>長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2及其制備方法和應(yīng)用<130>SPI068325<160>6<170>Patent In versinon 3.1<210>1<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>單鏈<222>(1～17)<223>mutation<400>1Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu1 5 10 15Lys ArgGln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser20 25 30Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp35 40 45Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys50 55 60His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr65 70 75Ser Asp Val Gly Trp Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys8085 90Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser95 100 105
Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr1 10 115 120Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg125 130<210>2<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>單鏈<222>(1～15)<223>mutation<400>2Met Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys His1 5 10 15Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu20 25 30Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala35 40 45Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe50 55 60Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln65 70 75Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys80 85 90Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu95 100 105
Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu110 115 120Gly Cys Gly Cys Arg125<210>3<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>單鏈<222>(1～8)<223>mutation<400>3Met Arg Glu Lys Arg Gln Ala Lys HisLys Gln Arg Lys Arg Leu15 10 15Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp20 25 30Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala35 40 45Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu50 55 60Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val65 70 75Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser80 8590Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu95100 105Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg110 115
<210>4<211>396bp<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>4ATG AAA AGA CAT GAT GGA AAA GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT 51CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 102CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 153CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 204GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 255TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 306GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 357TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 396<210>5<211>378bp<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>5ATG GGG CAT CCT CTC CAC AAA AGA GAA AAA CGT33CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 84CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 135CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAATGC CCT TTT CCT CTG 186
GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 237TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 288GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 339TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 378<210>6<211>360bp<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>6ATG AGA GAA AAA CGT 15CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC CTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA CAC 66CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT GTG GCT 117CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT TTT CCT CTG 168GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG ACG TTG GTC AAC 219TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC CCG ACA GAA CTC AGT 270GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA AAG GTT GTA TTA AAG AAC 321TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG TGT CGC TAG 360
權(quán)利要求
1.一種長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其特征在于，是由人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的114個(gè)氨基酸和連接在所述的氨基酸的N端的氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，所說的多肽鏈為Met Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg，或以以上肽鏈為基礎(chǔ)的較短的多肽鏈。
2.根據(jù)權(quán)利1要求所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其特征在于，所說的多肽鏈的特征為不干擾BMP-2二聚體的形成，不影響B(tài)MP-2活性中心的三維空間結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其特征在于，蛋白單鏈分子量約為13-15KD，經(jīng)復(fù)性后該活性蛋白為二聚體，分子量約為25-30KD。
4.根據(jù)權(quán)利1要求所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO2或SEQ IDNO4或SEQ IDNO6所示。
5.編碼權(quán)利要求4所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的基因序列如SEQ IDNO1或SEQ IDNO3或SEQ IDNO5所示。
6.制備權(quán)利要求1所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的方法，包括如下步驟①培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取mRNA，以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，以BMP-F和BMP-R為引物，擴(kuò)增出編碼羧基端自然結(jié)構(gòu)成熟肽完整114個(gè)氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前增加一段核苷酸，使其對應(yīng)的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到長鏈型rhBMP-2基因，得到一條大小為不大于396bp的DNA片段，回收，構(gòu)建成長鏈型的人BMP-2基因，在多克隆位點(diǎn)將其插入載體pBV220中，得到rhBMP-2表達(dá)質(zhì)粒pBV220-hBMP-2；所說的引物的DNA序列為BMP-F5’GGGGAATTCATGCAAGCCAAACACAAACAG3’BMP-R5’CCCGGATCCATACTAGCGACACCCACAA3’。②以氯化鈣法制備感受態(tài)表達(dá)系統(tǒng)后，用①步所得的表達(dá)質(zhì)粒pBV220-BMP2進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在抗性平板中挑取單菌落，經(jīng)培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒；③從轉(zhuǎn)化后含有正確表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的LB培養(yǎng)液的搖瓶中，在25-38℃的條件下以100-300rpm的轉(zhuǎn)速在氣浴振蕩器中培養(yǎng)2-3小時(shí)，再按體積比為1∶8-12的比例將培養(yǎng)物接種到LB培養(yǎng)基中，在100-300rpm、25-38℃的條件下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2-1.4，培養(yǎng)時(shí)間為10-12小時(shí)；然后接入LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為0.1～2.0∶5，種子液∶培養(yǎng)液，體積比，pH7.0±0.2，培養(yǎng)溫度為25-38℃，攪拌速度100-600rpm。然后，升溫至40～42℃，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后，在7500-10000rpm 4±2℃條件下，離心分離，收集菌體；④菌體破碎、洗滌將步驟③收集的菌體，與TE溶液，按1g∶5-15ml的比例混合，再按1g∶0.3-5mg的比例，與溶菌酶混合，采用細(xì)胞破碎技術(shù)進(jìn)行菌體破碎，然后在6000-10000rpm離心，收集沉淀，以1g沉淀物∶20ml洗滌液的比例加入洗滌液，攪拌2～4h后，4±2℃離心收集沉淀物，再用洗滌液進(jìn)行二次洗滌，之后，以1g沉淀物∶20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵體；⑤包涵體裂解、復(fù)性和純化以1g包涵體∶5～20ml裂解液的比例加入裂解液，在4±2℃下，攪拌裂解8～12小時(shí)，離心，離心轉(zhuǎn)速6000～12000rpm，離心溫度為4±2℃，離心時(shí)間為20～30分鐘，棄沉淀，取離心上清液，稀釋至蛋白含量為0.1-1mg/ml的樣品，按體積比為1∶10～100的比例加入復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性2-20天，然后經(jīng)過疏水柱、親和層析柱和凝膠色譜柱等進(jìn)行層析純化，并經(jīng)過無菌過濾后，在-30～7℃下凍干，得到長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所說的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、草生歐文菌或谷氨酸棒桿菌，所說的抗生素選自氨芐青霉素、鏈霉素或卡那霉素；LB培養(yǎng)液中，抗生素的含量為10～100μg/ml。
8根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所說的TE溶液為6mM的Tris，和10mM的EDTA，pH7.50；洗滌液為磷酸鹽緩沖液、尿素水溶液、曲拉通水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的應(yīng)用，其特征在于，用于誘導(dǎo)成骨，可單獨(dú)使用或與載體材料復(fù)合使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的應(yīng)用，其特征在于，所述的載體材料包括無機(jī)生物材料(如羥基磷灰石HAP，磷酸三鈣，磷酸鈣骨水泥，聚合磷酸鈣，天然珊瑚，生物玻璃或微晶玻璃等或其復(fù)合物)、高分子材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚β-羥基丁酸酯，聚原酸酯、聚碳酸酯等或其復(fù)合物)、天然生物材料(包括膠原、明膠等天然蛋白，殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖等天然多糖等)或相互間的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中制備長鏈型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2。本發(fā)明以人骨肉瘤細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增出編碼羧基端自然結(jié)構(gòu)成熟肽完整114個(gè)氨基酸的核苷酸序列，并在正向引物5’端第一個(gè)密碼子之前增加一段核苷酸，使其對應(yīng)的氨基酸序列在N端增加一段多肽，得到長鏈型rhBMP－2基因，分子量約為30KD，純度達(dá)95％以上。該長鏈型rhBMP－2具有活性高、體內(nèi)穩(wěn)定性好，利于重組蛋白的表達(dá)、復(fù)性和分離純化，利于活性蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定及活性的穩(wěn)定發(fā)揮，適合于骨缺損填充、融合植骨等，尤其適合于椎體融合、骨折延遲愈合、骨不連、大段骨缺損的填充修復(fù)。
文檔編號C12N15/12GK1951964SQ20061011800
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月6日
發(fā)明者劉昌勝, 林俊, 陳芳萍, 曹雪華 申請人:上海瑞邦生物材料有限公司