專利名稱：一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白純化領域，具體地說，涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)成熟肽的純化生產(chǎn)方法。
背景技術：
1965ip, E^Urist (Urist MR. Bone format ion byautoinduction. Science, 1965,150(698) :893-899)發(fā)現(xiàn)脫鈣的骨間質(zhì)有異位成骨作用，并將新發(fā)現(xiàn)的具有誘導新骨形成的蛋白質(zhì)命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic protein,BMP) 0隨后，又發(fā)現(xiàn)了眾多的BMP，除了 BMP-1，它們都是TGF-beta超家族成員，無論在基因或者蛋白質(zhì)結(jié)構上，還是在生物學功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，產(chǎn)業(yè)化研究也最為廣泛。人BMP-2全長為396個氨基酸殘基，具有成骨作用的是成熟肽，由114個氨基酸組成，在55位的天冬酰胺殘基上有糖基化位點，但是糖基化與否并不影響其生物活性。此外BMP-2疏水性很強，幾乎不溶于各種溶劑，其活性形式以二聚體形式存在，其中單體各形成3對二硫鍵，在兩個單體之間形成一對鏈間二硫鍵。二硫鍵的正確配對與否直接影響其生物活性和穩(wěn)定性。體內(nèi)外試驗證明BMP-2具有促進成骨細胞分化和誘導體外成骨的能力(Riley, EH ；Lane, JM ；Urist, MR, et al. Bone morphogenetic protein-2 :Biology and applications. ClinOrthop Relat Res. 1996Mar ； (324) :39-46)。但是天然的 BMP-2 在各種組織中的含量極低，需要采用基因重組的方法進行大量生產(chǎn)。在BMP-2的產(chǎn)業(yè)化研究方面，主要是真核表達載體和大腸桿菌為代表的原核表達體系兩種基因重組方案。真核表達載體國內(nèi)還未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，1988年，wozney等(Wozney J. Μ. , Rosen V., Celeste A. J. etal. Novel regulators of bone formation :molecular clones and activities. Science 16 December 1988 ;242 0885) :1528-1534.)獲得了 C0S-1 真核表達的 BMP-2 ； 1992 年，Israel DI 獲得了 CHO 真核表達的 BMP-2 (Israel DI, Nove J, Kerns KM, Moutsatsos IK, Kaufman RJ. Expressionand characterization of bone morphogenetic protein-2 in Chinese hamsterovary cells. Growth Factors 1992 ；7 :139-50)；美國 Medtronic SofamorDanek 公司研制的 INFUSE 骨移植劑和 LT-CAGE 腰椎融合器械在2002年7月獲得FDA批準用于治療椎間盤退行性疾病(McKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review ofrecombinant human bone morphogenetic protein-2(INFUSE Bone Graft). Int Orthop. 2007 Dec ；31 (6) :729-34)； Wyeth公司開發(fā)的hductOs(TM) (rhBMP-2/ACS)于2002年9月獲得歐洲委員會(EC)的批準，用于成人急性脛骨骨折的治療(Govender S, Csimma C, GenantHK, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 fortreatment of open tibial fractures -.a prospective, controlled, randomizedstudy of four hundred and fifty patients. J Bone Joint Surg Am. 2006Jun ；88 (6) :1258-65)。INFUSE 骨移植劑和 hductOs 的表達體系都為CHO細胞，表達量低，生產(chǎn)成本很高，并不適合中國發(fā)展現(xiàn)狀。
在原核表達體系方面，1994年趙明(趙明，王會信，周廷沖.重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽在大腸桿菌中的表達及其誘導成骨活性[J].中國生物化學與分子生物學報， 1994，10 (03)319-3 )、1995年陳蘇民等(盧茲凡，劉新平，陳蘇民，陳南春.人骨形成蛋白 2碳端肽在大腸桿菌中的高表達及活性測定.第四軍醫(yī)大學學報，1995，16 (6) :429-431)完成了 BMP-2的在大腸桿菌中的高效表達，表達產(chǎn)物為包涵體，因此需要進行體外復性。2002 ^tIH Vallejo φ (Gross G, Weich HA, Rinas U. 2002. Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 producedas inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinantEscherichia coli. J Biotechnol. 2002 Mar 28 ；94 (2) :185-94)在大腸桿菌實現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)，每升培養(yǎng)液可獲得細胞干重75克， 750mg的純化BMP-2。稀釋法進行復性4天后進行肝素柱親和層析純化。但是對于BMP-2， 肝素柱載量太小，平均每毫升肝素親和凝膠不到2mg的結(jié)合量。純化過程需要進行透析更換緩沖液，純化后還需要超濾濃縮。2004 年，德國 Vallejo 等(Vallejo LF, Rinas U. 2004. Optimizedprocedure for renaturation of recombinant human bone morphogeneticprotein-2 at high protein concentration. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar20 ；85 (6) :601-9)成功開發(fā)了高濃度的復性方案，可獲得高達0. 87mg/mL的活性蛋白，復性率最高達到43%，但所使用的試劑2-環(huán)己基乙磺酸(CHES)，尼古丁酸(NA)等都很昂貴，純化方案仍為肝素柱親和層析。國內(nèi)研究者孫奮勇等在2004年進行了復性工藝研究(孫奮勇，汪炬，孫晉華，戴云，邱垂源，洪岸，重組人骨形成蛋白-2在大腸桿菌中的表達、純化和復性(英文)，中國病理生理雜志，2005，21 (8) 1480-1485) ； 2005年姚少華等利用羥基磷灰石柱層析先純化包涵體變性蛋白再進行復性(Yao，SH ；Zhang, LL ；Cheng, SY, etal. . 2005. Refolding and Purification of rhBMP-2 Expressed as InclusionBodies in E.coli with Hydroxyapatite Chromatography. KEYENGINEERING MATERIALS. 2005, VOL 288-289 661-664) ；2008年陳蘇民進行了高濃度條件下的復性(王馥麗，陳蘇民，陳南春，趙瑋欽.rhBMP-aii在高濃度條件下的復性.第四軍醫(yī)大學學報，2008，29 (12) 1071-1074)，雖然蛋白濃度高達6mg/mL，但BMP-2變性蛋白需要進行離子交換層析純化后再變性，透析法復性規(guī)模較小，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外研究者大多采用肝素柱親和層析進行BMP-2活性蛋白的純化(Ruppert， R ；Hoffmann, E ；Sebald, W.1996. Human bonemorphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifiesits biological activity. Eur J Biochem. ,1996 Apr 1 ；237(1) :295-302)，并不具備真正意義的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。2006年，徐放(CN 200510050610. 3)開發(fā)了離子交換和疏水作用層析法的純化工藝，純化方案主要為離子交換為Q Sepharose FF,使用25_100mM的2-環(huán)己基乙磺酸 (CHES)，ρΗ7· 5-9. 5，1-3Μ尿素，5-20 %二甲基甲酰胺組成的緩沖液做平衡液，0. 1-1. OM的氯化鈉濃度遞增的梯度洗脫。采用疏水作用層析則采用苯基瓊脂糖凝膠，以25-100mM的 2-環(huán)己基乙磺酸，pH7. 5-9. 5，1-3M尿素，5_20 %二甲基甲酰胺，1-4M氯化鈉組成的緩沖液做平衡液，進行鹽濃度遞減的梯度洗脫。該方案仍使用較高濃度的CHES，尿素濃度也較高， 二甲基甲酰胺最高濃度為20%，總體上回收率大于15%，純度大于95%，但生產(chǎn)成本較高。2007年，劉國安等(CN200610049151. 1)開發(fā)了兩步離子交換層析法純化工藝⑴sepharose和CM sepharose)，純化方案為復性液首先用低鹽緩沖液稀釋10倍以上進行Q 柱陰離子交換層析，以20mM三羥甲基氨甲烷-HCl、pH8. 5緩沖液做平衡液，進行氯化鈉濃度逐步遞增的梯度洗脫(目標蛋白在0. 18M梯度)，然后稀釋5倍進行CM柱陽離子交換層析， 采用15mM磷酸、pH6. 5平衡液做平衡液，進行氯化鈉濃度逐步遞增的梯度洗脫(目標蛋白在0. 21M梯度)。但由于復性液濃度僅為0. 08-0. lmg/mL,純化時首先需要大量的稀釋(10 倍)，上樣體積很大，不利于規(guī)?；a(chǎn)，再者兩步的離子交換層析都沒有添加助溶劑，洗脫時BMP-2目標蛋白溶出很慢，甚至不溶解，導致純化效果變差，不能真正的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術生產(chǎn)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP1)成熟肽還無法實現(xiàn)高效工業(yè)化生產(chǎn)的技術缺陷，本發(fā)明提供了一種有別于上述方法的、操作簡便、成本低廉、 適合大規(guī)模放大的生產(chǎn)高純度、高活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的分離純化方法。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP_2)成熟肽的原核體系構建和表達，包涵體的制備、增溶和復性方法已有文獻充分公開，詳細可參考徐放(CN01116754.8 ;CN 200510050610. 3)和劉國安等(CN200610049151. 1)，上述文獻在此全部引入作為參考。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP1)成熟肽可以是全長114個氨基酸殘基或者N末端加入甲硫氨酸的115氨基酸殘基；也可以是截短型的成熟肽，一個例子為108個氨基酸殘基的截短型成熟肽(文獻參考 CNOl 116754. 8)，具體序列為MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHA FYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR包涵體經(jīng)過復性以后，上述的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP_2)成熟肽單體以二聚體形式存在，其中單體各形成3對二硫鍵，在兩個單體之間形成一對鏈間二硫鍵。本發(fā)明提供了一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMPD成熟肽的分離純化方法， 該方法包括以下步驟(1)將復性好的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽溶液上樣于經(jīng)平衡好的疏水層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N-二甲基甲酰胺、1-3M氯化鈉或者硫酸銨，pH為 7. 0-9. 0 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度洗脫，收集目標峰，所述的洗脫緩沖液包含10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N, N-二甲基甲酰胺，pH為 7. 0-9. O0上述方法中，疏水層析柱介質(zhì)可自苯基瓊脂糖凝膠(包括但不限于Wienyl Sepharose 6 Fast Flow(low sub), Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub), Phenyl Sepharose High Performance)，丁基瓊脂糖凝膠(包括但不限于 Butyl Sepharose 4Fast Flow, Butyl-SSepharose 6 Fast Flow, Butyl Sepharose High Performance),辛基瓊月旨糖凝膠(包括但不限于Octyl Sepharose 4 Fast Flow)，乙基聚合樹脂(SOURCE ΕΤΗ)，異丙基聚合樹脂(SOURCE 15IS0)，苯基聚合樹脂(SOURCE 15PHE)。上述方法中，平衡緩沖液和洗脫緩沖液可進一步含有10_50mM三羥甲基氨甲烷-HC1，以更好的維持緩沖液體系pH為7. 0-9. 0。
為進一步提高目標峰的蛋白純度，純化方法可以是多步疏水作用層析或者與離子交換層析聯(lián)合使用。作為優(yōu)選方案之一，純化方法可以是多步疏水作用層析。一步疏水層析得到的目標峰再經(jīng)1-2次疏水層析，可有效提高蛋白純度至97%以上。作為優(yōu)選方案之一，純化方法可為疏水層析和陰離子交換層析聯(lián)用，層析介質(zhì)為Q 瓊脂糖凝膠快速流Ο -s印harose Fast Flow)、Q瓊脂糖凝膠高分辨率^hs印harose HP)或者Q聚合樹脂(SOURCE 15Q, SOURCE 30Q)，平衡緩沖液包含10_50mM三羥甲基氨甲烷-HC1、 10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N，N-二甲基甲酰胺，pH為8. 0-9. 0 ；洗脫液為添加了 1-3M NaCl的平衡緩沖液。該方法除上述疏水層析步驟外，進一步包含以下步驟(1)將疏水層析得到的目標峰經(jīng)平衡緩沖液稀釋后，上樣于經(jīng)平衡好的陰離子交換層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10_50mM 三羥甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N，N-二甲基甲酰胺，PH 為 8. 0-9. 0 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰，所述的洗脫緩沖液包含10-50mM三羥甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和 2-10% N, N- 二甲基甲酰胺、1-3M NaCl, pH 為 8. 0-9. 0。作為優(yōu)選方案之一，純化方法可為疏水層析和陽離子交換層析聯(lián)用，層析介質(zhì)為羧甲基瓊脂糖凝膠快速流(CM-kpharose Fast Flow)，平衡緩沖液包含10_50mM磷酸二氫鈉-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N, N-二甲基甲酰胺，pH為 6.0-6.5。洗脫液為添加了 1-3M NaCl的平衡緩沖液。該方法除上述疏水層析步驟外，進一步包含以下步驟(1)將疏水層析得到的目標峰經(jīng)平衡緩沖液稀釋后，上樣于經(jīng)平衡好的陽離子交換層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10_50mM 磷酸二氫鈉-HCl、10-30mM2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺，pH 為 6. 0-6. 5 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰，所述的洗脫緩沖液包含10-50mM磷酸二氫鈉-HCl、10-30mM2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N， N-二甲基甲酰胺、l_3MNaCl，pH 為 6. 0-6. 5。本發(fā)明由于采用了上述的方案，成功實現(xiàn)了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明通過多次試驗摸索，發(fā)現(xiàn)采用高濃度的尿素和DMF做助溶劑，將增大重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的極性，在疏水層析過程中將降低與疏水介質(zhì)的結(jié)合度，從而降低蛋白純化的效率和分離度。本發(fā)明通過系統(tǒng)研究，意外發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整純化緩沖液的組成，即使用較低濃度的尿素和DMF做助溶劑，并減少了 CHES的用量，可有效提高蛋白純化的效率和分離度，目標蛋白的純度也更高。而且由于降低了尿素、DMF和CHES的用量，生產(chǎn)成本可降低50%以上。本純化方法與徐放的發(fā)明(CN200510050610.3)相比，具有操作更簡便、成本更低廉、純化收率更高(大于20% )、純度更高(SDS-PAGE、HPLC及HPCE 均大于97% )等優(yōu)點。該法適用于重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的工業(yè)化純化生產(chǎn)。


圖1疏水作用層析純化BMP-2層析圖。其中1為UW80nm，2為UW60nm，3為溶液電導，4為洗脫梯度。峰1為洗脫梯度1，峰2為洗脫梯度2，峰1和峰2含有較多的目標蛋白，峰3為洗脫梯度3，含有較少的目標蛋白，峰4為清洗峰，主要為雜蛋白和單體蛋白，多聚體等。圖2典型的rhBMP-2電泳圖(銀染)。圖示Lanel 復性液，lane2 峰1和峰2合并，lane3 峰 1，lane4 峰 2，lane5 峰 3，lane6 峰 4，lane7 蛋白質(zhì)分子量 marker (從上下分別為 97. 4、，66. 1、43、，31、20、14. 4KDa)。圖3典型的rhBMP-2電泳圖(銀染)。圖示Lanel 復性液，lane2 一步疏水柱洗脫峰1，lane3 —步疏水柱洗脫峰峰2，lane4 兩步疏水洗脫主峰，lane5 一步疏水、一步陰離子交換后主峰，lane6 —步疏水、一步陽離子交換后主峰，lane7 蛋白質(zhì)分子量marker (從上下分別為97. 4,66. 1、43、31、20、14. 4KDa)，lane 8 兩步疏水洗脫峰濃縮樣品。圖4rhBMP-2的毛細管電泳純度分析，UV214nm檢測。采用面積歸一法計算純度為
97.4%。圖5rhBMP-2的毛細管電泳純度分析，UV214nm檢測。采用面積歸一法計算純度為
98.0%。圖6rhBMP-2的毛細管電泳純度分析，UV214nm檢測。采用面積歸一法計算純度為 98. 5%。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步說明，實施例中涉及的是截短型108個氨基酸殘基的BMP-2成熟肽。本領域的技術人員可以理解，由于其與全長的BMP-2成熟肽性質(zhì)相似，因而也適合于全長型的BMP-2成熟肽的分離純化。實例1包涵體的增溶以1克包涵體20mL裂解液的比例將包涵體溶解到裂解液中(7M鹽酸胍，50mM Tris-HCl，pH8. 0，ImM EDTA, IOmM DTT)在室溫下攪拌2小時以上或者4°C攪拌過夜。然后在12000rpm、4°C下離心20min，棄沉淀取離心上清液。采用Bradford法測定蛋白濃度?；蛴靡韵路椒ㄔ鋈堋Ｒ?克包涵體20mL裂解液的比例將包涵體溶解到裂解液中 (8M 尿素，50mM Tris-HCl, pH8. 5, ImM EDTA, IOmM DTT)在室溫下攪拌 2 小時以上或者 4°C 攪拌過夜。然后在12000rpm、4°C下離心20min，棄沉淀取離心上清液。采用Bradford法測定蛋白濃度。實例2包涵體的復性采用稀釋法復性。復性液組成為100mMTris-HCl，0. 5M L-Arg,0. 5M Urea, IM NaCl，2mM EDTA，pH8. 5-9. 5，ImM氧化性谷胱甘肽，5mM還原型谷胱甘肽。將包涵體增溶液緩慢加入到復性液中，控制蛋白終濃度為0. 05-0. :3mg/mL，在4-20度恒溫環(huán)境下復性1_20天。實例3復性液的疏水作用層析首先采用鹽濃度低的疏水作用層析，層析填料為phenyls印harose Fast Flow，平衡液為 phe-A:0. 5M urea,25mM CHES, 15mMTris, pH8. 5,5% N, N-二甲基甲酰胺，IM NaCl。 洗脫液為 phe-B :0. 5Murea，25mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，5% N，N_ 二甲基甲酰胺。首先用平衡液Phe-A平衡，復性液直接上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液phe-A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液Phe-B進行鹽濃度逐步降低的梯度進行洗脫，收集主峰。為進一步提高純度，可對收集主峰繼續(xù)采用鹽濃度高的疏水作用層析。層析填料為 phenyl sepharose Fast Flow，平衡液為 phe_3A :0. 5Murea，25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺，3MNaCl。洗脫液為 phe_3B :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,4% N, N- 二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，上述鹽濃度低的疏水作用層析洗脫樣品補加NaCl到3M后上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液phe-3A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液Phe-IBB進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度進行洗脫(35%， 65%，85% B)，分步收集相應主峰。SDS-PAGE電泳銀染分析樣品純度。典型的層析圖如圖 1所示，電泳圖如圖1和圖2所示。從復性液投料算起，復性率大于50%，最終目標蛋白的收率為21%，用毛細管電泳分析純度，純度為97. 4% (圖4)。實例4疏水作用層析與陰離子交換層析聯(lián)用純化首先采用疏水作用層析，層析填料為phenyl sepharose Fast Flow，平衡液為 phe-3A :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺，3M NaCl。洗脫液為 phe-3B :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，4% N，N-二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，復性液直接上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液phe-3A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液Phe-IBB進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度進行洗脫(35%，65%， 85% B)，分步收集相應主峰。接著進行陰離子交換層析，Q-kpharose Fast Flow，平衡液為Q-A :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,4% N, N-二甲基甲酰胺。洗脫液為 Q-B :0. 8M urea, 15mM CHES, 15mM Tris, ρΗ8· 5,4% N，N- 二甲基甲酰胺，IMNaCl0首先用平衡液Q-A平衡好柱子， rhBMP-2樣品用平衡液Q-A稀釋10倍以上使電導率低于6mS/cm，然后上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液Q-A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液Q-B進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰。SDS-PAGE電泳銀染分析(圖幻和毛細管電泳分析樣品純度為 98. 0% (圖 5)。實例5疏水作用層析與陽離子交換層析聯(lián)用純化首先采用疏水作用層析，層析填料為phenyl sepharose Fast Flow，平衡液為 phe-3A :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris，pH8. 5，2% N，N-二甲基甲酰胺，3M NaCl。洗脫液為 phe-3B :0. 5M urea,25mM CHES, 15mM Tris, pH8. 5,2% N, N-二甲基甲酰胺。首先用平衡液phe_3A平衡，復性液直接上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液phe-3A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液Phe-IBB進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度進行洗脫(35%，65%， 85% B)，分步收集相應主峰。接著進行陽離子交換層析純化，層析填料為CM-kpharose FastFlow，平衡液為 CM-A 0. 5M urea,25mM CHES, 15mM NaAc-HAc,2% N, N- 二甲基甲酰胺，ρΗ6· 5。洗脫液為 CM-B 0. 5M urea,25mMCHES, 15mM NaAc-MAc,2% N, N- 二甲基甲酰胺，IM NaCl, ρΗ6· 5。先用平衡液CM-A平衡好柱子，疏水層析洗脫樣品用平衡液CM-A稀釋5倍以上是電導率低于 6ms/cm,然后上樣，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液CM-A沖洗到紫外到達基線，然后用洗脫緩沖液CM-B進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰。SDS-PAGE電泳銀染分析(圖 3)和毛細管電泳分析樣品純度為98. 5% (圖6)。
權利要求
1.一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將復性好的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽溶液上樣于經(jīng)平衡好的疏水層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N-二甲基甲酰胺、1-3M氯化鈉或者硫酸銨，pH為 7. 0-9. 0 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度洗脫，收集目標峰，所述的洗脫緩沖液包含10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2_10 % N，N-二甲基甲酰胺，pH為 7. 0-9. O0
2.根據(jù)權利要求1所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的疏水層析柱介質(zhì)選自苯基瓊脂糖凝膠，丁基瓊脂糖凝膠，辛基瓊脂糖凝膠，乙基聚合樹脂，異丙基聚合樹脂或苯基聚合樹脂。
3.根據(jù)權利要求1所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液中含有10-50mM三羥甲基氨甲烷-HCl。
4.根據(jù)權利要求1所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的純化方法是多步疏水作用層析，一步疏水層析得到的目標峰再經(jīng)1-2次疏水層析，收集目標峰。
5.根據(jù)權利要求1所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的純化方法為疏水作用層析和離子交換層析聯(lián)合使用。
6.根據(jù)權利要求5所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的離子交換層析為陰離子交換層析聯(lián)用，層析介質(zhì)為Q瓊脂糖凝膠快速流(Q-sepharose Fast Flow)、Q瓊脂糖凝膠高分辨率 to-s印haroseHP)或者 Q 聚合樹脂(SOURCE 15Q, SOURCE 30Q)。
7.根據(jù)權利要求6所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法除疏水層析步驟外，還包含以下步驟(1)將疏水層析得到的目標峰經(jīng)平衡緩沖液稀釋后，上樣于經(jīng)平衡好的陰離子交換層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10-50mM三羥甲基氨甲烷-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2_10% N, N- 二甲基甲酰胺， pH 為 8. 0-9. 0 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰，所述的洗脫緩沖液包含10-50mM三羥甲基氨甲烷-HCl、10-30mM2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素和2-10% N， N- 二甲基甲酰胺、l_3MNaCl，pH 為 8. 0-9. 0。
8.根據(jù)權利要求5所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的離子交換層析為陽離子交換層析聯(lián)用，層析介質(zhì)為羧甲基瓊脂糖凝膠快速流(CM-kpharose Fast Flow)。
9.根據(jù)權利要求8所述的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法除疏水層析步驟外，還包含以下步驟(1)將疏水層析得到的目標峰經(jīng)平衡緩沖液稀釋后，上樣于經(jīng)平衡好的陽離子交換層析柱，上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗到達基線，所述的平衡緩沖液包含10-50mM磷酸二氫鈉-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺，pH為 6. 0-6. 5 ；(2)用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步增加的梯度進行洗脫，收集主峰，所述的洗脫緩沖液包含10-50mM磷酸二氫鈉-HCl、10-30mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸、0. 2-1M尿素、2-10% N，N_ 二甲基甲酰胺、1-3M NaCl，pH 為 6. 0-6.5。
全文摘要
一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的生產(chǎn)方法本發(fā)明涉及一種重組人形態(tài)發(fā)生蛋白2成熟肽的生產(chǎn)方法。該方法通過將復性好的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽溶液上樣于經(jīng)平衡好的疏水層析柱，然后用洗脫緩沖液進行鹽濃度逐步降低的階梯梯度洗脫，收集目標峰。為進一步提高目標峰的蛋白純度，純化方法可以是多步疏水作用層析或者與離子交換層析聯(lián)合使用。該方法具有操作更簡便、成本更低廉、純化收率更高(大于20％)、純度更高(SDS-PAGE、HPLC及HPCE均大于97％)等優(yōu)點，適合用于重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/18GK102336829SQ20101028484
公開日2012年2月1日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權日2010年9月9日
發(fā)明者朱晴羽, 王同映, 郭旺明 申請人:杭州九源基因工程有限公司