專利名稱：應用中國天壇濟南蛛細胞毒種制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種應用CTN細胞毒種制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法。
目前的制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法為毒種的來源狂犬病毒aG株是用狂犬病固定毒北京株在地鼠腎細胞傳代適應后，通過豚鼠腦內交替?zhèn)鞔m應而成，由中國藥品生物制品檢定所保存與分發(fā)。
生產(chǎn)用毒種的制備選擇體重120-200克豚鼠，腦內注射aG株病毒，選潛伏期80-100小時，具有典型狂犬病癥狀者放血致死，無菌取腦，此毒種作為生產(chǎn)用毒種。
制備地鼠腎細胞取12-14克地鼠，無菌取腎，用胰蛋白酶消化，分種于轉瓶內，37℃養(yǎng)至單層。
病毒接種將aG株腦毒種按一定比例接種于已長成單層的細胞瓶內，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
病毒收獲接種病毒后，培養(yǎng)24-48小時后洗換，去掉生產(chǎn)液，換成維持液，33℃培養(yǎng)適當天數(shù)，收獲病毒液。
病毒液的滅活、濃縮與純化于病毒液中加入1/4000-1/5000的甲醛溶液，滅活一定天數(shù)，然后超濾濃縮50-100倍，經(jīng)柱層析純化，制成半成品。
分裝與銷售將檢定合格的半成品無菌分裝于安瓶中，待成品檢定合格后銷售。
目前制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法存在一定的不足疫苗生產(chǎn)用的毒種為豚鼠腦組織毒種，這種毒種不僅含有腦組織成份，可造成人體接種后的過敏反應，而且使用的豚鼠不是清潔級動物，可能導致外源因子污染，嚴重地影響著產(chǎn)品的質量。
針對現(xiàn)有犬苗生產(chǎn)工藝中存在的毒種問題，本發(fā)明的目的在于提供一種毒株是細胞毒株，不含有腦組織成分，并可以完全排除外源因子的污染，有利于提高狂犬疫苗的質量的應用CTN細胞毒種制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的生產(chǎn)工藝過程為毒種來源→毒種的制備→制備地鼠腎細胞→病毒接種→病毒收獲→病毒液的滅活、濃縮與純化→分裝與銷售。
毒種的來源狂犬病毒CTN株是狂犬病固定毒經(jīng)Vero細胞傳代適應，可用于Vero細胞狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株，由中國生物制品檢定所保存與分發(fā)。
毒種的制備將Vero細胞適應株CTN株進行地鼠腎細胞的適應傳代，使之由Vero細胞適應株逐步馴化成為地鼠腎細胞適應株，經(jīng)過10-20代的傳代適應，CTN株逐步適應地鼠腎細胞其毒力由開始的4.0左右至5.5logLD50/0.03ml，并穩(wěn)定在5.5logLD50/0.03ml左右，然后選擇10-20代建立基礎毒種庫和生產(chǎn)用毒種庫，并將CTN地鼠腎細胞適應株命名為CTN-LS，并對毒種進行全面檢定，所有檢測結果均符合規(guī)格要求。毒種 項目 無菌.無支 外源因純毒試驗 毒力 免疫效率類型 原體檢測子檢查中和指數(shù) logLD50/0.03ml IU/2ml基礎毒種 合格 合格 100005.53.05CTN-LS-11 ＞500為合格生產(chǎn)用毒種合格 合格 7943 5.53.42CTN-LS15-20制備地鼠腎細胞取12-14克地鼠，無菌取腎，用胰蛋白酶消化分種于轉瓶中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
病毒接種將CTN地鼠腎細胞適應毒種CTN-LS按適當比例接種于已長成單層的細胞內，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
病毒收獲接種病毒后培養(yǎng)24-48小時，洗換，去掉生產(chǎn)液，換成維持液，33℃培養(yǎng)適當天數(shù)收獲病毒液。
病毒液的滅活，濃縮與純化于病毒液中加入1/4000-1/5000的甲醛溶液，滅活一定時間然后超濾濃縮50-100倍，經(jīng)拄層折純化，制成半成品。
分裝與銷售將檢定合格的半成品無菌分裝于安瓶中待成品檢定合格后銷售。
本發(fā)明與原有的狂犬病疫苗制備方法相比，采用Vero細胞適應株CTN細胞毒種進行地鼠腎細胞傳代適應，最終得到了一株適應地鼠腎細胞的CTN細胞毒株(CTN-LS)，該毒株是細胞毒株，不含有腦組織成分，并可以完全排除外源因子的污染，有利于提高狂犬疫苗的質量。
采用CTN地鼠腎細胞適應株CTN-LS制備疫苗與原毒株制備疫苗其質量比較四批疫苗、CTN-LS株與aG株質量比較毒種 批次 毒力 效力外源因平均毒力 平均效力logLD50/0.03ml 2V/ml 子檢查 logLD50/0.03ml IU/ml991101 4.18 3.05 合格aG株 991201 4.43 3.77 不合格991202 4.56 4.76 合格 4.40 4.36991203 4.41 5.85 合格991101 4.46 4.28 合格CTN- 991201 4.68 6.11 合格LS株 991202 4.94 6.25 合格 4.77 5.80991203 4.82 6.55 合格從結果可以看出，CTN-LS株制備的疫苗，外源因子檢查全部合格，而aG株卻有一批不合格，CTN株比aG株疫苗毒力平均高出0.37logLD50/0.03ml，效力平均高出1.44IU/ml。
下面進一步說明本發(fā)明實施例。
本發(fā)明的生產(chǎn)工藝過程為毒種來源→毒種的制備→制備地鼠腎細胞→病毒接種→病毒收獲→病毒液的滅活、濃縮與純化→分裝與銷售。
毒種的來源狂犬病毒CTN株是狂犬病固定毒經(jīng)Vero細胞傳代適應，可用于Vero細胞狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株，由中國生物制品檢定所保存與分發(fā)。
毒種的制備將Vero細胞適應株CTN株進行地鼠腎細胞的適應傳代，使之由Vero細胞適應株逐步馴化成為地鼠腎細胞適應株，經(jīng)過10-20代的傳代適應，CTN株逐步適應地鼠腎細胞其毒力由開始的4.0左右至5.5logLD50/0.03ml，并穩(wěn)定在5.5logLD50/0.03ml左右，然后選擇10-20代建立基礎毒種庫和生產(chǎn)用毒種庫，并將CTN地鼠腎細胞適應株命名為CTN-LS，并對毒種進行全面檢定，所有檢測結果均符合規(guī)格要求。毒種 項目 無菌.無支外源因純毒試驗毒力免疫效率類型原體檢測 子檢查中和指數(shù)logLD50/0.03ml IU/2ml基礎毒種 合格 合格 100005.5 3.05CTN-LS-11 ＞500為合格生產(chǎn)用毒種合格 合格 7943 5.5 3.42CTN-LS15-20
制備地鼠腎細胞取12-14克地鼠，無菌取腎，用胰蛋白酶消化分種于轉瓶中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
病毒接種將CTN地鼠腎細胞適應毒種CTN-LS按適當比例接種于已長成單層的細胞內，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
病毒收獲接種病毒后培養(yǎng)24-48小時，洗換，去掉生產(chǎn)液，換成維持液，33℃培養(yǎng)適當天數(shù)收獲病毒液。
病毒液的滅活，濃縮與純化于病毒液中加入1/4000-1/5000的甲醛溶液，滅活一定時間然后超濾濃縮50-100倍，經(jīng)拄層折純化，制成半成品。
分裝與銷售將檢定合格的半成品無菌分裝于安瓶中待成品檢定合格后銷售。
權利要求
1.一種應用CTN細胞毒種制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法，其生產(chǎn)工藝過程為毒種來源→毒種的制備→制備地鼠腎細胞→病毒接種→病毒收獲→病毒液的滅活、濃縮與純化→分裝與銷售，其特征在于在毒種的制備過程中，將Vero細胞適應株CTN株進行地鼠腎細胞的適應傳代，使之由Vero細胞適應株逐步馴化成為地鼠腎細胞適應株，并建立了CTN地鼠腎細胞適應株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應用CTN細胞毒種制備地鼠腎細胞狂犬病疫苗的工藝方法,生產(chǎn)工藝為:毒種來源→毒種的制備→制備地鼠腎細胞→病毒接種→病毒收獲→病毒液的滅活、濃縮與純化→分裝與銷售,在毒種的制備過程中,將Vero細胞適應株CTN株進行地鼠腎細胞的適應傳代,使之由Vero細胞適應株逐步馴化成為地鼠腎細胞適應株,并建立了CTN地鼠腎細胞適應株,該毒株是細胞毒株,不含有腦組織成分,并可以排除由于豚鼠腦組織造成的外源因子污染,有利于提高狂犬疫苗的質量。
文檔編號A61K39/205GK1274607SQ0011007
公開日2000年11月29日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權日2000年1月28日
發(fā)明者張玉慧 申請人:遼寧生物技術公司