專利名稱：治療女性性功能障礙的化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療女性性功能障礙(FSD)，特別是女性性喚醒障礙(FSAD)的藥物。
本發(fā)明也涉及治療FSD、特別是FSAD的方法。
本發(fā)明也涉及分析篩選用于治療FSD、特別是FSAD的化合物的方法。
為了方便起見，在權利要求部分之前描述下文中所使用的縮寫表。女性的性反應在陰道和陰蒂以及其他性器官開始發(fā)生生理改變以前，女性的性反應喚醒期與要求期不容易區(qū)分。性興奮和性愉快與血管和神經(jīng)肌肉活動相伴隨，就是導致陰蒂、陰唇和陰道壁充血，增加陰道的潤滑作用和擴張陰道腔(Levin,1980；Ottesen,1983；Levin,1991；Levin,1992；Sjoberg,1992；Wagner,1992；Schiavi等人，1995；Masters等人，1996；Berman等人，1999)。
陰道充血能夠產(chǎn)生滲出物并且該過程起增加陰道潤滑的作用。滲出物使得血漿流經(jīng)上皮并且流到陰道表面上，這種驅(qū)動力增加喚醒期陰道毛細血管床的血流。另外，充血導致陰道長度和陰道腔直徑特別是陰道遠端2/3處直徑的增加。陰道腔擴張是由于陰道壁平滑肌松馳和骨盆底肌肉的骨骼肌松馳一起造成的。某些性交疼痛疾病如陰道痙攣被認為至少部分是由于不充足的松馳阻止了陰道的擴張；尚需確定這主要是平滑肌的問題還是骨骼肌的問題(Levin,1980；Ottesen,1983；Levin,1991；Levin,1992；Sjoberg,1992；Wagner,1992；Schiavi等人，1995；Master等人，1996；Berman等人，1999)。
陰道的脈管系統(tǒng)和微脈管系統(tǒng)受包含神經(jīng)肽和其他神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)支配。這些神經(jīng)遞質(zhì)包括與降鈣素基因有關的肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、一氧化氮合成酶(NOS)、P物質(zhì)和血管活性腸肽(VIP)(Hoyle等人，1996)。以下討論存在于陰蒂中的肽通常與VIP一起存在的一氧化氮合成酶從免疫學方面來看更多表達于深部動脈和靜脈中而不是在propria血管中(Hoyle等人，1996)。女性性功能障礙已知一些人可能患有女性性功能障礙(FSD)。
FSD最好定義為婦女在性表達中難以或不能獲得滿足。FSD是幾種不同的女性性功能障礙的統(tǒng)稱(Leiblum,1998,Berman等人，1999)。婦女可能有性欲缺乏、性喚醒或性高潮困難、性交疼痛等問題或這些問題的組合。一些類型的疾病、藥物治療、損傷或心理上的問題都可引起FSD。
對配偶雙方性功能障礙情況進行調(diào)查的研究結(jié)果顯示多達76％婦女有性功能障礙的抱怨并且在美國有30-50％的婦女經(jīng)歷FSD。
FSD亞型包括低活躍性性欲障礙、女性性喚醒障礙、性高潮障礙或性欲障礙。
正在開發(fā)中的治療方法是靶向治療特定亞型的FSD，主要是性欲障礙和性喚醒障礙。
FSD的類型最好通過將它們與正常如性性反應階段性欲、性喚醒和性高潮相對照來定義(Leiblum1998)。性欲或性沖動是性表達的驅(qū)動力-并且其表現(xiàn)通常包括當在感興趣伙伴的交往中或者當暴露在其他色情刺激中時存在性想法。而性喚醒是血管對性刺激的反應，其重要的組成部分是陰道潤滑和陰道伸長。因此與性欲相比，性喚醒是與生殖器(例如陰道和陰蒂)血流有關的反應并且不必敏感。性高潮是性喚醒達到高潮時性緊張的松馳。因此，一般來說，當婦女在任一階段，通常包括性欲、性喚醒或性高潮中有不充足或不滿意的反應時便發(fā)生FSD。FSD類型包括低活躍性性欲障礙、性喚醒障礙、性高潮障礙和性疼痛病癥。
如果一個婦女沒有或很少有性欲，并且沒有或很少有性想法或性幻想，那么，她可能存在低活躍性性欲障礙。這種FSD可由低睪丸素水平引起，這是由自然絕經(jīng)或外科手術造成的絕經(jīng)引起的。其他原因包括疾病、藥物、疲勞、抑郁和焦慮。
女性性喚醒障礙(FSAD)的特點是生殖器對性刺激不充足的反應。生殖器(例如陰道和/或陰蒂)不經(jīng)歷正常性喚醒特征的充血過程。陰道壁的潤滑性差，所以出現(xiàn)性交疼痛。性高潮可能受到阻止。性喚醒障礙可由絕經(jīng)期、生育孩子后和哺乳期的雌激素減少引起，也可以由與血管組分有關的疾病如糖尿病和動脈粥樣硬化引起。其他原因是由于用利尿藥、抗組胺藥、抗抑郁藥，例如SSRIs或抗高血壓藥治療。下面更詳細地討論FSAD。
性交疼痛病癥(包括交媾困難和陰道痙攣)的特點是插入引起疼痛并且可由減少潤滑的藥物、子宮內(nèi)膜異位、骨盆炎性疾病、炎性腸道疾病或尿道問題引起。
FSD的流行情況難以確定，這是因為該術語包括數(shù)種類型的問題，某些問題難以測量并且也因為最近才對FSD的治療產(chǎn)生興趣。許多婦女的性問題或者與女性年齡增長直接相關或者與慢性疾病如糖尿病和高血壓有關。
對FSD的發(fā)病情況和流行情況有各種各樣的報道，一部分使用不同的評價標準來解釋，但大多數(shù)研究人員報道一定比例的健康婦女中仍有一種或多種FSD亞型癥狀。例如，比較配偶間性功能障礙的研究表明63％的婦女有喚醒或性高潮功能障礙而40％的男性有勃起或射精功能障礙(Frank等人，1978)。
然而，女性性喚醒障礙的流行情況在不同的調(diào)查中有明顯差別。在近來National Health and Social Life Survey調(diào)查中報道19％的婦女有潤滑困難而在門診婦科臨床中14％的婦女有類似的潤滑困難(Rosen等人，1993)。
一些研究也已經(jīng)報道糖尿病婦女中有性喚醒功能障礙(高達47％)，這包括降低陰道潤滑(Wincze等人，1993)。在神經(jīng)病和性功能障礙之間沒有聯(lián)系。
許多研究也顯示總體上有11到48％的婦女可隨年齡增長而性欲降低。類似地，報道11到50％的婦女有喚醒和潤滑問題，所以有性交疼痛的經(jīng)歷。陰道痙攣不常見，大約有1％的婦女受其影響。
有性經(jīng)歷婦女的研究顯示5-10％有原發(fā)性性快感缺失。另外10％偶有性高潮并且還有10％經(jīng)歷不協(xié)調(diào)的性高潮(Spector等人，1990)。
因為FSD由表示性反應周期各個階段癥狀的幾種亞型組成，所以沒有單一的治療方法。目前FSD的治療主要地集中在心理問題或相關問題上。當更多的臨床和基礎科學研究致力于該醫(yī)學問題的研究時，F(xiàn)SD的治療逐漸地展開。從病理生理學方面來看，女性的性抱怨并非都是生理性的，特別是那些可能患有造成所有女性性抱怨原因的血管形成(vasculogenic)功能障礙(例如FSAD)的個體?，F(xiàn)在還沒有特許用于治療FSD的藥物。經(jīng)驗性藥物治療包括給予雌激素(局部給藥或作為激素代替品進行治療)、雄性激素或調(diào)節(jié)情緒的藥物如丁螺環(huán)酮或曲唑酮。由于低功效或無法接受的副作用，這些治療選擇通常不令人滿意。
自從最近關注通過藥物學方法治療FSD以來，治療包括心理指導、不用處方即可購買的性潤滑劑和試驗中的新藥，包括批準用于治療其他疾病的藥物。這些藥物包括激素類藥物如睪丸素或雌激素與睪丸素的組合物和近期證明對男性勃起功能障礙有效的心血管藥物。這些藥物中沒有一種被證明是治療FSD特別有效的。女性性喚醒障礙(FSAD)性喚醒反應包括骨盆血管充血、陰道潤滑及外生殖器擴張和膨脹。性喚醒障礙引起顯著的苦惱和/或與他人接觸困難。對配偶性功能障礙進行研究的研究結(jié)果顯示有大量女性患有性喚醒功能障礙；已知又稱為女性性喚醒障礙(FSAD)。
美國精神病學協(xié)會的診斷和統(tǒng)計手冊(DSM)Ⅳ中將女性性喚醒障礙(FSAD)定義為“一種持續(xù)的或經(jīng)常發(fā)生的無力獲得或保持足夠的性刺激潤滑一膨脹反應直到性活動完成。所述障礙必須引起顯著的苦惱或與他人接觸困難”FSAD是非常普遍的影響絕經(jīng)前、絕經(jīng)期和絕經(jīng)后(±HRT)婦女的性機能障礙。與之有聯(lián)系的伴發(fā)疾病是，如抑郁、心血管疾病、糖尿病和UG疾病。
FSAD的第一個后果是缺乏充血/膨脹，缺乏潤滑和缺乏愉快的生殖器感覺。FSAD的第二個后果是性欲降低、性交疼痛或獲得性高潮困難。
最近有人假設，至少部分具有FSAD癥狀的病人是由于心血管方面的原因(Goldstein等人，1998)，并且動物數(shù)據(jù)支持該觀點(Park等人，1997)。
正處于療效研究中的治療FSAD的新藥主要是促進男性生殖器血液循環(huán)的勃起功能障礙治療劑。它們包括兩種類型的制劑，口服或舌下給藥的藥物(阿樸嗎啡、酚妥拉明、Sildenafil)和經(jīng)男性尿道注射或給予的以及經(jīng)女性生殖器局部給予的前列腺素(PGE1-前列地爾)。
本發(fā)明尋求提供一種治療FSD、特別是FSAD的有效的方法。
本發(fā)明的創(chuàng)新的發(fā)現(xiàn)是利用I:PDE活性劑治療女性FSD(特別是FSAD)的基礎。
按照本發(fā)明，本發(fā)明所述I:PDE稱作“本發(fā)明活性劑”。
本發(fā)明活性劑也可以與一種或多種其他可藥用活性劑一起使用。如果存在或與本發(fā)明活性劑一起使用，所述其他可藥用活性劑可稱作“其他活性劑”。這些活性劑中的一種或多種可以是下述中的一種或多種不同的I:PDE、I:NEP、I:NPY。下面更詳細地討論活性劑組合物。
本發(fā)明活性劑是PDE抑制劑(I:PDE或PDEi),I:PDE水解cAMP(并任選水解cGMP)。術語“水解cAMP”也包括代謝和/或分解cAMP。術語“水解cAMP(并任選水解cGMP)”是指除cAMP以外，本發(fā)明活性劑可水解cGMP。因此，術語“水解cGMP”也包括代謝和/或分解cGMP。然而，可以理解，在本發(fā)明某些實例中，本發(fā)明活性劑不必一定能夠水解cGMP。
本文有關活性劑的一般參考可適用于其他活性劑以及本發(fā)明活性劑。
按照本發(fā)明，本發(fā)明活性劑作用于靶向物，優(yōu)選特異性作用于指定靶向物。該靶有時稱作“本發(fā)明靶向物”。然而，本發(fā)明活性劑可作用于一個或多個其他靶向物。這些其他靶向物有時可稱作“其他靶向物”。同樣地，如果使用其他活性劑，那么，其他活性劑可以靶向本發(fā)明相同的靶向物和/或其他靶向物(不必是本發(fā)明活性劑所作用的相同的其他靶向物)。本文將描述這些靶向物?？梢岳斫猓疚挠嘘P靶向物的一般參考可適用于其他靶以及本發(fā)明靶向物。
本發(fā)明的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)是利用本發(fā)明活性劑促進女性生殖器(例如陰道或陰蒂)血流的基礎。
在試驗中，我們發(fā)現(xiàn)FSAD與生殖器血流減少-特別是陰道和/或陰蒂血流減少有關。因此，可通過用血管活性劑促進生殖器血流來治療婦女的FSAD。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)，cAMP介導陰道和陰蒂的血管舒張并且可通過升高cAMP水平來促進和/或加強生殖器(例如陰道和陰蒂)的血流。這是另一個創(chuàng)新的發(fā)現(xiàn)。
在這方面，以前還沒有人提出可用該方法-即通過直接或間接升高cAMP水平來治療FSAD。此外，本領域沒有學說提出FSAD與cAMP活性和/或水平的有害調(diào)節(jié)有關或者cAMP對調(diào)節(jié)陰道和陰蒂血管舒張起作用。因此，本發(fā)明甚至非常出人意料。
另外，我們發(fā)現(xiàn)，通過使用本發(fā)明活性劑，可增加生殖器的充血并治療FSAD-例如增加陰道的潤滑作用和增加陰道和陰蒂的敏感性。
因此，在廣義的方面，本發(fā)明涉及利用cAMP增效劑來治療FSD、特別是FSAD。
本發(fā)明是有益的，因為它提供一種恢復正常性喚醒反應-即增加生殖器血流導致陰道、陰蒂和陰唇充血的方法。這將導致通過血漿滲出物使陰道的潤滑作用增加、陰道的順應性增加和生殖器(例如陰道和陰蒂)的敏感性增加。因此，本發(fā)明提供一種恢復或加強正常性喚醒反應的方法。
一方面，本發(fā)明涉及用于(或當使用時)治療FSD，特別是FSAD的藥物組合物；包含活性劑的藥物組合物，所述活性劑能夠加強FSD特別是FSAD女性的生殖器中cAMP的作用；其中，所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑是本文所定義的本發(fā)明活性劑。因此，所述組合物(如同本文所提到的任何其他組合物一樣)可進行包裝以便于后來在治療FSD、特別是FSAD中的應用。
另一方面，本發(fā)明涉及利用活性劑來生產(chǎn)用于治療FSD、特別是FSAD的藥物(如可藥用組合物)；其中所述活性劑能夠加強FSD特別是FSAD女性的生殖器中cAMP的作用；并且其中所述活性劑是本文所定義的本發(fā)明活性劑。
另一方面，本發(fā)明涉及治療女性FSD、特別是FSAD的方法；所述方法包括給予所述女性能夠加強生殖器中cAMP作用的活性劑；其中，所述活性劑的量是能夠引起所述女性生殖器中cAMP作用加強的量；其中，所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑是本文所定義的本發(fā)明活性劑。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定可用于治療FSD，特別是FSAD的活性劑的測定方法，所述測定方法包括測定所述活性劑是否可直接或間接加強cAMP的作用；其中在該活性劑存在下cAMP的作用加強說明所述活性劑可用于治療FSD、特別是FSAD；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
作為實施例，本發(fā)明涉及用于鑒定可直接或間接加強cAMP的作用以便治療FSD、特別是FSAD的活性劑的測定方法，所述測定方法包括將活性劑與能夠影響cAMP活性和/或水平的部分接觸；并測定cAMP的活性和/或水平；其中在活性劑存在下cAMP的作用加強說明所述活性劑可用于治療FSD、特別是FSAD；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
作為另一實施例，本發(fā)明涉及用于鑒定可直接或間接加強cAMP的作用以便治療FSD、特別是FSAD的活性劑的測定方法，所述測定方法包括將活性劑與cAMP接觸；并測定cAMP的活性；其中在活性劑存在下cAMP的作用加強說明所述活性劑可用于治療FSD、特別是FSAD；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，它包括步驟(a)、按照本發(fā)明進行測定；(b)、鑒定一種或多種可直接或間接加強cAMP活性的活性劑；和(c)、制備一定量所述一種或多種鑒定的活性劑；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
在該方面，例如，可對步驟(b)中鑒定的活性劑進行改性，以便于把活性增加到最大，然后可重復步驟(a)。這些步驟可重復直至獲得所需要活性或藥動學特征。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，它包括步驟(a1)、按照本發(fā)明進行測定；(b1)、鑒定一種或多種可直接或間接加強cAMP活性的活性劑；(b2)、對一種或多種所述鑒定的活性劑進行改性；(a2)、任選地重復步驟(a1)；和(c)、制備一定量所述一種或多種鑒定的活性劑(即那些已經(jīng)改性過的活性劑)；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及通過用活性劑增強體內(nèi)cAMP的作用來治療FSD、特別是FSAD的方法；其中在體外測定方法中，所述活性劑能夠直接或間接加強cAMP的作用；其中所述體外測定方法是本發(fā)明測定方法；并且其中所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及活性劑在制備用于治療FSD、特別是FSAD的藥物組合物中的應用，其中當通過本發(fā)明測定方法進行體外測定時，所述活性劑能夠直接或間接加強cAMP的作用；并且所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定能夠治療FSD(特別是FSAD)的活性劑的動物模型，所述模型包括麻醉的雌性動物，其中包括測定所述動物骨盆神經(jīng)受刺激后，其陰道和/或陰蒂血流改變的裝置；并且所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定能夠直接或間接加強cAMP的作用以便治療FSAD的活性劑的測定方法，所述測定方法包括給予本發(fā)明動物模型以活性劑；測定cAMP的任何加強和/或所述動物陰道和/或陰蒂血流的增加；并且所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷方法，所述方法包括從雌性動物體內(nèi)分離出樣品；測定所述樣品是否包含一種以引起FSD、特別是FSAD的量存在的實體，或者測定所述樣品的量是否引起FSD、特別是FSAD；其中所述實體對所述雌性動物生殖器中cAMP的水平或活性具有直接的或間接的影響；并且其中所述實體可通過使用活性劑進行調(diào)節(jié)以便獲得有益的影響；并且所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷組合物或試劑盒，它包括檢測分離的雌性動物樣品中實體的裝置；其中所述裝置可用于測定所述樣品是否包含所述實體并且以引起FSD、特別是FSAD的量存在，或者測定所述樣品的量是否引起FSD、特別是FSAD；其中所述實體對所述雌性動物生殖器中的cAMP水平或活性具有直接或間接影響并且其中所述實體可通過使用活性劑進行調(diào)節(jié)以便獲得有益的影響；并且所述活性劑是I:PDE，其中所述PDE是水解cAMP的PDE(并且任選地可水解cGMP)。
為了易于參考，在適宜的章節(jié)標題下討論本發(fā)明這些方面和其他方面。然而，每章節(jié)下的說法不必限制各特定章節(jié)。優(yōu)選的方面優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑用于治療FSAD。
優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑是女性生殖器(例如陰道或陰蒂)血管舒張的介體。
在一個實施方案中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑用于口服給藥。
在另一實施方案中，本發(fā)明活性劑可用于局部給藥。
優(yōu)選地，所述活性劑具有對cAMP的直接加強作用。
在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明述活性劑是抑制劑-即能夠表現(xiàn)抑制功能。
如本文所述，本發(fā)明活性劑是I:PDE(有時寫成PDEi)。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述活性劑是I:PDE1或I:PDE2(有時寫成I:PDEⅡ或PDEⅡi或PDE2i)或I:PDE3或I:PDE4或I:PDE7或I:PDE8，更優(yōu)選地，所述活性劑是I:PDE2。
優(yōu)選地，所述活性劑是選擇性I:PDE。
優(yōu)選地，所述活性劑是I:PDEⅡ(有時寫成I:PDE2或PDEⅡi或PDE2i)。
優(yōu)選地，所述活性劑是選擇性I:PDEⅡ。
在某些應用中，本發(fā)明活性劑可以與另一種可藥用活性劑聯(lián)合給予。所述聯(lián)合給藥不必在同一時間，更不必說通過同一途徑了。聯(lián)合給予的組合物的實例可以是包含本發(fā)明活性劑和其他活性劑的組合物，其中所述其他活性劑可能具有對cAMP的直接加強作用。下面討論組合物的實例。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑具有對cAMP的間接加強作用。所述其他活性劑的實例包括I:NEP和/或I:NPY?；蛘撸谀承弥?，優(yōu)選地，所述其他活性劑不具有對cAMP的直接加強作用?？梢岳斫猓銎渌钚詣┛梢跃哂袑AMP的間接加強作用，它是通過作用于天然發(fā)現(xiàn)和天然定位的直接起作用的活性劑-如天然發(fā)現(xiàn)和定位的VIP起作用的。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑具有對cAMP的直接加強作用。所述其他活性劑的實例包括I:PDE。
在某些應用中，所述其他活性劑是抑制劑-即能夠表現(xiàn)抑制功能。
在某些應用中，所述其他活性劑是拮抗劑。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:PDE(有時寫成PDEi)。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:PDE1或I:PDE2(有時寫成I:PDEⅡ或PDEⅡi或PDE2i)或I:PDE3或I:PDE4或I:PDE7或I:PDE8，更優(yōu)選地所述活性劑是I:PDE2。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:PDE。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:PDEⅡ(有時寫成I:PDE2或PDEⅡi或PDE2i)。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:PDEⅡ。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:NEP(有時寫成NEPi)。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:NEP。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:NEP，其中所述NEP是EC3.4.24.11。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:NEP，其中所述NEP是EC 3.4.24.11。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:NPY(有時寫成NPYi)。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:NPY Y1或I:NPYY2或I:NPYY5，更優(yōu)選地，所述活性劑是I:NPY Y1。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:NPY。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是I:NPY Y1。
在某些應用中，優(yōu)選地，所述其他活性劑是選擇性I:NPY Y1。
在某些應用中，所述活性劑不引起血壓長時間下降(例如在大約5分鐘或更長時間內(nèi))或者以一種不引起血壓長時間下降的方式給予。在該實例中，如果局部給予所述活性劑，那么，該活性劑可能具有引起血壓降低的能力(如通過靜脈內(nèi)給予時)，前提條件是，在局部應用中，所述活性劑通過血流的水平最小。在口服活性劑中，優(yōu)選地，所述活性劑不引起血壓長時間降低。
在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明活性劑不引起心率大的變化-或者以一種不引起心率大的改變的方式給予。治療可以領會，本文所有有關治療的參考包括一種或多種治本治療、治標治療和預防治療。優(yōu)選地，術語治療至少包括治本治療和/或治標治療。女性生殖器按照Gray’s Anatomy,C.D.Clemente,13th American Edition-viz中提供的定義使用術語“女性生殖器”。
“生殖器由內(nèi)生殖器和外生殖器組成。內(nèi)生殖器位于骨盆內(nèi)并且由卵巢、尿管、子宮和陰道組成。外生殖器在泌尿生殖器隔膜表面并且在骨盆弓的下面。它們包括恥骨、大陰唇和小陰唇、陰蒂、前庭、前庭球和較大的前庭腺。”內(nèi)源性cAMP在高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明活性劑可加強內(nèi)源性cAMP的作用-如提高內(nèi)源性cAMP的水平。
術語“內(nèi)源性cAMP”是指由性刺激(性喚醒)產(chǎn)生的cAMP。因此，所述術語不包括不依賴于性驅(qū)動而升高的cAMP水平。
因此，按照本發(fā)明，通過直接或間接加強內(nèi)源性cAMP信號發(fā)出，并因此依次增加陰道血流/潤滑和/或陰蒂血流和促進性喚醒反應來治療FSAD。因此，本發(fā)明治療方法可恢復或加強正常喚醒反應。
在本發(fā)明治療方法中，可通過使用水解cAMP的PDE的抑制劑獲得該結(jié)果。
本文提供動物試驗模型。該動物試驗模型可用于測定因cAMP作用加強而引起的生殖器血流的增加。在該動物試驗模型中，刺激骨盆神經(jīng)-引起模擬性喚醒/反應生理機能的作用。在這些試驗中，本發(fā)明活性劑在該神經(jīng)受刺激后，引起血流增加，其增加程度超出對照值。在神經(jīng)未受刺激的情況下，所述活性劑不具有(或可以忽略的)引起血流增加的作用。典型地，在這些試驗中，刺激神經(jīng)以便增加血流基線。然后，將待試驗的(或現(xiàn)有的)活性劑通過系統(tǒng)或局部途徑，如通過靜脈內(nèi)、局部或口服途徑給予所述動物。與對照值比血流增加表明是本發(fā)明活性劑。性刺激本發(fā)明也包括在性刺激前和/或過程中給予本發(fā)明活性劑。術語“性刺激”可以是與“性喚醒”同義的。本發(fā)明該方面是有利的，因為它可提供系統(tǒng)選擇性。天然的級聯(lián)效應僅發(fā)生在生殖器而不在其他區(qū)域-例如心臟等。因此，可獲得對生殖器的選擇性作用。
因此，在發(fā)明某些方面中，非常需要有性刺激步驟。我們發(fā)現(xiàn)，該步驟可提供系統(tǒng)選擇性。術語“性刺激”可以是一種或多種視覺刺激、身體刺激、聽覺刺激或思維刺激。
因此，優(yōu)選地，在性刺激前或過程中給予本發(fā)明活性劑，特別是當那些活性劑用于口服給予時。
因此，在該優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供本發(fā)明活性劑在生產(chǎn)用于治療FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能夠加強FSAD女性的生殖器中cAMP的作用；并且其中所述女性在給予所述藥物前或過程中受到性刺激。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供本發(fā)明活性劑在生產(chǎn)用于治療FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能夠加強FSAD女性的生殖器中cAMP的作用；其中所述女性在給予所述藥物前或過程中受到性刺激；并且其中所述藥物通過口服途徑給予所述女性。
另外，在該優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供治療女性FSAD的方法；所述方法包括給予所述女性能夠加強生殖器中cAMP作用的本發(fā)明活性劑；其中所述活性劑的量為能夠引起所述女性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述女性在給予所述活性劑前或過程中受到性刺激。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供治療女性FSAD的方法；所述方法包括給予所述女性能夠加強生殖器中cAMP作用的本發(fā)明活性劑；其中所述活性劑的量為能夠引起所述女性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；其中所述女性在給予所述活性劑前或過程中受到性刺激；并且其中所述活性劑通過口服途徑給予所述女性。增強cAMP作用本文所使用的關于cAMP的術語“增強作用”包括下列任何一種或多種作用增強cAMP的效力、增加cAMP的水平、增強cAMP的活性、減少AMP降解的水平、減少cAMP抑制的水平。
所述增強作用可以是一種直接作用。直接作用的實例是通過可增加其表達的活性劑上調(diào)cAMP的水平。
或者，所述增強作用可以是一種間接作用。該作用的實例是對原本可能會抑制和/或降低cAMP水平和/或活性的物質(zhì)發(fā)揮作用。該作用的另一實例是增加可增強cAMP的效力、增加cAMP的水平、增強cAMP的活性、減少cAMP降解的水平或減少cAMP抑制的水平的物質(zhì)的作用。
PcAMP的實例為I:PDEⅡ。cAMP模擬物在本發(fā)明某些方面中，其他活性劑可作為cAMP模擬物。
本文使用的術語“cAMP模擬物”是指在女性生殖器中以一種與cAMP類似的方式發(fā)揮作用(例如具有類似的生物學特征和作用)并且當發(fā)揮作用時，具有下列任何一種或多種作用的活性劑增強cAMP類似物的效力、增加cAMP類似物的水平、增強cAMP類似物的活性、減少cAMP類似物降解的水平、減少cAMP類似物抑制的水平。
cAMP模擬物的實例是毛喉素。我們發(fā)現(xiàn)，毛喉素可增加陰道和陰蒂的血流并且也可以作為陰道舒張劑。
在優(yōu)選的方面中，cAMP模擬物通過口服給予。cAMP激活劑本文所使用的術語“cAMP激活劑”是指一種可在女性生殖器中控制或釋放cAMP的物質(zhì)。所述控制可以是直接的(例如對cAMP本身的作用)或間接的(例如通過激活cAMP)。為了易于參考，我們把這些物質(zhì)稱為AcAMP。靶根據(jù)本發(fā)明，本文所使用的術語“靶向物”是指下列任何物質(zhì)cAMP、AcAMP、IcAMP或AMcAMP。或者本發(fā)明靶向物可稱作PcAMP靶。
本發(fā)明靶向物和/或其他靶向物可以是氨基酸序列和/或編碼其的核苷酸序列和/或負責其表達的表達單位和/或其調(diào)節(jié)劑。
所述靶向物甚至可以是這樣的靶向物的組合?；钚詣┍景l(fā)明活性劑可以是任何適宜的能夠用作PcAMP的活性劑。
所述活性劑(即本發(fā)明活性劑和/或其他活性劑)可以是氨基酸序列或其化學衍生物。所述物質(zhì)甚至可以是有機化合物或其他化學物質(zhì)。所述活性劑甚至可以是核苷酸序列-它可以是有義序列或反義序列。所述活性劑甚至可以是抗體。
因此，術語“活性劑”包括但不限制于可通過任何適宜的途徑獲得或生產(chǎn)的化合物，無論是天然的或非天然的。
所述活性劑可通過化合物庫設計或獲得，它可以包括肽以及其他化合物，如小的有機分子如前導化合物。
作為實例，所述活性劑可以是天然物質(zhì)、生物學大分子或由生物學物質(zhì)(如細菌、真菌或動物(特別是哺乳動物)細胞或組織)制備的提取物，有機或無機分子、合成的活性劑、半合成活性劑、結(jié)構或功能模擬物、肽、肽模擬物、衍生的活性劑、從全蛋白上斷裂下來的肽或通過合成方法(如作為實例，利用肽合成器或通過重組技術或其組合)合成的肽、重組活性劑、抗體、天然或非天然活性劑、融合蛋白或其等同物和突變體、其衍生物或組合物。
本文所使用的術語“活性劑”可以是單一的物質(zhì)或者它可以是活性劑的組合物。
在某些應用中，如果所述活性劑是有機化合物-例如，如果所述活性劑是I:PDE-那么通常所述有機化合物可以包含兩個或多個連接的烴基。在某些應用中，優(yōu)選地，所述活性劑包含至少兩個環(huán)狀基團-其中一個環(huán)狀基團可以是稠合環(huán)結(jié)構。在某些應用中，優(yōu)選地，至少一個環(huán)狀基團是雜環(huán)基。在某些應用中，優(yōu)選地，所述雜環(huán)基在環(huán)中至少包含一個N。在本文的實施例章節(jié)介紹這些化合物的實例。
在某些應用中，如果所述活性劑是有機化合物-例如，如果所述活性劑是I:NEP-那么通常所述有機化合物可以包含酰胺基(即-N(H)-C(O)-或者-C(O)-N(H)-)和一個或多個烴基。術語“烴基”是指至少包含C和H并且可任選包含一個或多個其他適宜的取代基的基團。所述取代基的實例可以包括鹵素-、烷氧基-、硝基-、烷基-、環(huán)狀基團等。除了所述取代基可能是環(huán)狀基團外，取代基的組合可形成環(huán)狀基團。如果烴基包含一個以上C，那么那些碳不必彼此連接。例如，至少兩個碳可通過適宜的元素或基團連接。因此，所述烴基可包含雜原子。適宜的雜原子是本領域技術人員熟知的并且包括，例如硫、氮和氧。在某些應用中，優(yōu)選地，所述活性劑至少包含一個環(huán)狀基團。在某些應用中，優(yōu)選地，所述活性劑至少包含一個通過酰胺鍵連接到另一個烴基上的環(huán)狀基團。在本文的實施例章節(jié)介紹這些化合物的實例。
在某些應用中，如果所述活性劑是有機化合物-例如，如果所述活性劑是I:NPY-那么通常所述有機化合物可以包含兩個或多個連接的烴基。在某些應用中，優(yōu)選地，所述活性劑至少包含兩個環(huán)狀基團-其中一個環(huán)狀基團可以是稠合環(huán)的環(huán)狀結(jié)構。在某些應用中，優(yōu)選地，至少一個環(huán)狀基團是雜環(huán)基。在某些應用中，優(yōu)選地，所述雜環(huán)基在環(huán)中至少包含一個N。在本文的實施例章節(jié)介紹這些化合物的實例。
所述活性劑可包含鹵素基團?！胞u素”是指氟、氯、溴或碘。
所述活性劑可包含一個或多個烷基、烷氧基、鏈烯基、亞烷基、亞鏈烯基-它們可以是支鏈或直鏈的基團。
所述活性劑可以以可藥用鹽的形式存在-如酸加成鹽或堿鹽-或其溶劑化物包括其水合物的形式存在。有關適宜的鹽的綜述參見Berge等人，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19。
適宜的酸加成鹽是由形成無毒鹽的酸形成的，其實例為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、蔗糖鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(pamoate)。
適宜的堿鹽是由形成無毒鹽的堿形成的，其實例是鈉、鉀、鋁、鈣、鎂、鋅和二乙醇胺鹽。
如果需要，通過將本發(fā)明活性劑的溶液與適宜的酸或堿混合可以很容易地制備本發(fā)明活性劑的可藥用鹽。所述鹽可從溶液中沉淀出來并且可通過過濾收集或可將溶劑蒸發(fā)回收。
所述活性劑可以以多晶型形式存在。
所述活性劑可包含一個或多個不對稱碳原子并因此以兩種或多種立體異構體形式存在。如果所述活性劑包含鏈烯基或亞鏈烯基，也可能存在順式(E)和反式(Z)異構現(xiàn)象。本發(fā)明包括所述活性劑的各種立體異構體，并且如果需要，還可包括其各種互變異構體形式及其混合物。
非對映異構體或順式和反式異構體的分離可通過常規(guī)技術來完成，例如通過本發(fā)明活性劑立體異構體混合物或其適宜的鹽或其衍生物的分級結(jié)品、色譜層析或H.P.L.C.來進行分離。合適時，活性劑的各種對映異構體也可以由相應的旋光中間體通過拆分(如使用合適的手性載體來使相應的消旋體進行高效液相層析)或者通過由相應的外消旋體與合適的旋光酸或堿反應形成的非對映異構體進行分級結(jié)晶來制備。
本發(fā)明也包括活性劑或其可藥用鹽的所有同位素變體。本發(fā)明活性劑或其可藥用鹽的同位素變體被定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子量不同于自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子量的原子所替代?？山Y(jié)合到活性劑及其可藥用鹽中的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素如分別為2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。在藥物和/或底物組織分布研究中可以使用活性劑及其可藥用鹽的某些同位素變體，例如其中結(jié)合有放射性同位素如3H或14C的那些同位素變體。從其易于制備和檢測來說，特別優(yōu)選的是氚(即3H)和碳-14(即14C)同位素。另外，用同位素如氘(即2H)取代可因更好的代謝穩(wěn)定性而產(chǎn)生某些治療方面的優(yōu)點，例如，增加體內(nèi)半衰期或減少所需劑量并因此而在某些環(huán)境中是優(yōu)選的?；钚詣┘捌淇伤幱名}的同位素變體一般可通過常規(guī)方法使用合適試劑的合適同位素變體來制備。
本領域技術人員會意識到活性劑可由前體藥物來衍生。前體藥物的例子包括具有某些保護基團并且不具有所述藥理活性但可通過某些方式給藥(如口服或非胃腸道方式)并且在體內(nèi)代謝后形成具有藥理活性的所述活性劑的那些物質(zhì)。
也會意識到可以將稱作“前體部分”的某些部分(例如在H.Bundgaard,ElSevier,1985“Design of Prodrug”中所描述的，其所公開的內(nèi)容引入本文供參考)引入活性劑的合適的官能團上。這些前體藥物也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
PcAMP可以發(fā)揮下列任何一種或多種作用直接或間接增加cAMP的功效、直接或間接增加cAMP的水平、直接或間接增加cAMP的活性、直接或間接降低cAMP降解的水平、直接或間接降低cAMP抑制的水平。
優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑可直接或間接增加患有FSAD的女性生殖器中的cAMP的水平。
更優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑可直接或間接地選擇性地增加患有FSAD的女性生殖器中的cAMP的水平。
更優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑可直接或間接地選擇性地增加cAMP的水平，其中所述cAMP是性喚醒誘導的cAMP。
在高度優(yōu)選的方面，本發(fā)明活性劑可增加性喚醒誘導的cAMP的相對量。
在某些應用中，本發(fā)明活性劑可選擇性地治療FSAD。
一方面，活性劑可抑制或拮抗合適的靶向物并因此而增加女性生殖器中的cAMP水平。下文中，我們使用術語抑制劑來指抑制劑和/或拮抗劑。
另一方面，活性劑可以激活或激動合適的靶向物并因此而增加女性生殖器中的cAMP水平。下文中，我們使用術語激活劑和上調(diào)劑來指激活劑和/或上調(diào)劑和/或激動劑。
因此，活性劑可以激活、拮抗、上調(diào)或抑制合適的靶向物。
本發(fā)明活性劑可以是能夠顯示兩種或多種這些特性的單一實體。另外，本發(fā)明活性劑可以是能夠顯示一種或多種這些特性的活性劑的組合物。
優(yōu)選地，活性劑可選擇性地激活、選擇性地拮抗、選擇性地上調(diào)或選擇性地抑制合適的靶向物。
優(yōu)選地，活性劑可選擇性地激活、選擇性地拮抗、選擇性地上調(diào)或選擇性地抑制選擇性的合適靶向物。
活性劑也能夠顯示一種或多種其他有利的功能特性。例如，本發(fā)明活性劑可以增強cAMP的作用也可以增強cGMP的作用。
在某些應用(如局部應用)中，活性劑也可以顯示ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制作用。在本文的實驗部分描述了ACE的測定。在某些應用(如特定類型的病人)中，該活性劑(即，也顯示ACE抑制作用的活性劑)可能不適于口服給藥。
在某些應用中，活性劑也可以顯示ECE(內(nèi)皮轉(zhuǎn)化酶)抑制作用。在本領域中，ECE的測定是公知的。藥物的組合本發(fā)明的活性劑可以與一種或多種其他藥物活性劑聯(lián)合使用，其他藥物活性劑如PcGMP(磷酸二酯酶5型抑制劑，如Sildenafil，或一氧化氮供體或一氧化氮前體如L-精氨酸或精氨酸酶抑制劑)和/或中樞作用的藥物(如，多巴胺受體激動劑如阿樸嗎啡或選擇性多巴胺D2受體激動劑如PNU-95666或黑皮素(melanocortin)受體激動劑，如melanotanⅡ)。在美國專利5945117中可發(fā)現(xiàn)利用阿樸嗎啡作為藥物的教導。在該文獻中，阿樸嗎啡經(jīng)舌下給藥。另外，活性劑可以與一種或多種下列藥物聯(lián)合使用PDE5抑制劑(如，Sildenafil、Vardenafil(Bayer BA38-9456)和IC351(Cialis,Icos Lilly))、一種或多種一氧化氮供體(如，NMI-921)、一種或多種多巴胺受體激動劑(如，阿樸嗎啡、Uprima、Ixsene)、一種或多種雜環(huán)胺如在WO00/40226中綜述和具體描述的，特別是實施例7、8和9所述的雜環(huán)胺、一種或多種黑皮素受體激動劑(如melanotanⅡ或PT14)、一種或多種鉀通道開通劑(如，KATP通道開通劑(如，米諾地爾、尼可地爾))和/或鈣激活的鉀通道開通劑(如，BMS-204352)、一種或多種α1-腎上腺素受體拮抗劑(如，酚妥拉明、Vasofem、Vasomax)、一種或多種VIP受體激動劑或VIP類似物(如，Ro-125-1553)或VIP片段、一種或多種α-腎上腺素受體拮抗劑與VIP的組合物(如，Invicorp、Aviptadil)、一種或多種α2-腎上腺素受體拮抗劑(如，育亨賓)、一種或多種雌激素、雌激素和甲羥孕酮或甲羥孕酮乙酸鹽(MPA)或雌激素和甲基睪酮激素替代治療劑(如，HRT，特別是Premarin、Cenestin、Oestrofeminal、Equin、Estrace、Estrofem、Elleste Solo、Estring、Eastraderm、EastradermTTS、EastradermMatrix、Dermestril、Premphase、Prempro、Prempak、Premique、Estratest、Estratest HS、Tibolone)、一種或多種睪酮替代劑(包括DHEA(脫氫雄烯酮)、睪酮(Tostrelle)或睪酮植入劑(Organon))、一種或多種睪酮/雌二醇、一種或多種雌激素激動劑如Lasofoxifene、一種或多種5-羥色胺受體激動劑或拮抗劑(如5HTlA、5HT2C、5HT2A和5HT3受體激動劑和拮抗劑；如WO2000/28993中所述的)、一種或多種前列腺素受體激動劑(如，Muse、前列地爾、米索前列醇)、一種或多種purinergic受體激動劑(特別是P2Y2和P2Y4)、一種或多種抗抑郁劑(如，安非他酮(Wellbutrin)、mirrtazapine、奈法唑酮)。
IC351的結(jié)構是 如果聯(lián)合給予活性劑，那么可以同時、分別或順序給藥。VIP的組合使用在本發(fā)明中，活性劑不是VIP(或者優(yōu)選不是其類似物或其片段)。然而，在某些實施方案中，本發(fā)明的活性劑可與VIP或其類似物或其片段聯(lián)合給藥。
在高度優(yōu)選的方面，不給予VIP或其類似物或其片段。這是因為已經(jīng)有報道VIP輸注導致顯著的心血管副作用如增加心率和降低動脈舒張壓(Ottesen1983,1987,1995)。
另外，盡管Ottesen和同事們證明VIP誘導健康受試者陰道血流和潤滑的增加，但不清楚VIP產(chǎn)生其作用的機制。在文獻中，有VIP通過不同的第二信使系統(tǒng)傳遞信號的各種例子，如cGMP/鳥苷酸環(huán)化酶(Ashur-Fabian,1999)；一氧化碳(CO)/血紅素加氧酶(Fan等人，1998)和cAMP/腺苷酸環(huán)化酶(Foda,1995；Schoeffter,1985；Gu,1992)。通過近來的一份報告來舉例說明，其中描述可通過釋放一氧化氮來解釋VIP在子宮動脈中如何起血管松馳作用(Jovanovic,1998)。而且，也有證據(jù)表明VIP調(diào)節(jié)在男性泌尿生殖器功能中的一氧化氮(NO)/cGMP(Kim,1994)。
而且，在文獻中已經(jīng)報告在陰道平滑肌細胞培養(yǎng)中VIP對cAMP水平?jīng)]有影響(參見Traish,A.,Moreland,R.B.,Huang,Y.，等人(1999)人和兔陰道平滑肌細胞培養(yǎng)的發(fā)展血管活性劑對胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的影響，2,131-127)。
再者，在進一步的研究中，Ottesen和同事們(參見，Palle,Bredkjaer,Ottesen和Fahrenkrug1990,Clinical and Experimental Pharmacology andPhysiology第17卷，61-68)報道了，無論給藥途徑如何，VIP對陰道血流的影響是全身性血管松馳作用而不是局部反應。此外，他們報道了與VIP相關的許多血管副作用-即潮紅、低血壓和心動過速。K1值在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其它活性劑一起)的K1值低于大約100nM，優(yōu)選低于大約75nM，優(yōu)選低于大約50nM，優(yōu)選低于大約25nM，優(yōu)選低于大約20nM，優(yōu)選低于大約15nM，優(yōu)選低于大約10nM，優(yōu)選低于大約5nM。Kb值在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起)的Kb值低于大約100nM，優(yōu)選低于大約75nM，優(yōu)選低于大約50nM，優(yōu)選低于大約25nM，優(yōu)選低于大約20nM，優(yōu)選低于大約15nM，優(yōu)選低于大約10nM，優(yōu)選低于大約5nM。Ka值在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起)的Ka值低于大約100nM，優(yōu)選低于大約75nM，優(yōu)選低于大約50nM，優(yōu)選低于大約25nM，優(yōu)選低于大約20nM，優(yōu)選低于大約15nM，優(yōu)選低于大約10nM，優(yōu)選低于大約5nM。藥物動力學在本發(fā)明某些實施方案中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起-例如I:NEP)具有-2-+4，更優(yōu)選-1-+2的logD值。可通過本領域已知的標準方法如J.Pharm.Pharmacol.1990,42:144中所描述的方法測定所述logD值。
此外，在某些實施方案中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起-例如I:NEP)具有大于2×10-6cms-1，更優(yōu)選大于5×10-6cms-1的caco-2流出值?？赏ㄟ^本領域已知的標準方法如J.Pharm.Sci79,7,p595-600(1990)，和Pharm.Res.vol14,no.6(1997)中所描述的方法測定所述caco流出值。選擇性在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起)對所要求的靶向物具有至少大約100倍的選擇性，優(yōu)選至少大約150倍，優(yōu)選至少大約200倍，優(yōu)選至少大約250倍，優(yōu)選至少大約300倍，優(yōu)選至少大約350倍。
在某些應用中，優(yōu)選地，本發(fā)明活性劑(任選與任意的其他活性劑的一起)對所要求的靶向物具有至少大約400倍的選擇性，優(yōu)選至少大約500倍，優(yōu)選至少大約600倍，優(yōu)選至少大約700倍，優(yōu)選至少大約800倍，優(yōu)選至少大約900倍，優(yōu)選至少大約1000倍?；瘜W合成方法典型地，通過化學合成技術來制備所述活性劑。
活性劑或靶向物或其變體、同源物、衍生物、片段或模擬物可使用全合成或半合成活性劑的化學方法來制備。例如，肽可通過固相技術來合成、從樹脂上分開并通過制備性高效液相色譜來純化(如，Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles,WH Freeman和Co.New York NY)。合成肽的組成可通過氨基酸分析或測序來確證(如，Edman降解方法；Creighton，同上)。
可使用各種固相技術來直接合成活性劑或其變體、同源物、衍生物、片段或模擬物(Roberge JY等人(1995)Science269:202-204)并可使用例如ABI43 1A肽合成儀(Perkin Elmer)按照制造商提供的說明完成自動合成。另外，可在直接合成期間改變包含活性劑或其任意部分的氨基酸序列和/或使用化學方法將所述氨基酸序列與其他亞單位或其任意部分的序列組合來產(chǎn)生改變的活性劑或靶向物，例如改變的PDE。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可使用本領域公知的化學合成方法來全合成或半合成活性劑或靶向物或其變體、同源物、衍生物、片段或模擬物的編碼序列(參見Caruthers MH等人(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23,HornT等人(1980)Nuc Acids Res Symp Ser225-232)。模擬物本文所使用的術語“模擬物”涉及任何對靶向物具有與參照活性劑相同的定性活性或作用的化學物質(zhì)，包括但不限于肽、多肽、抗體或其他有機化學物質(zhì)。化學衍生物本文所使用的術語“衍生物”或“衍生化”包括活性劑的化學改性。這類化學改性的例子是用鹵素基團、烷基、酰基或氨基置換氫?；瘜W改性在本發(fā)明的一個實施方案中，活性劑可以是化學改性的活性劑。
活性劑的化學改性可以增強或降低活性劑和靶向物之間的氫鍵作用、電荷作用、疏水作用、范德瓦耳斯作用或偶極作用。
一方面，鑒定的活性劑可作為開發(fā)其他化合物的樣本(如，模板)。重組方法在本發(fā)明測定中使用的靶向物通?？赏ㄟ^重組DNA技術制備。加強cGMP作用本文所使用的關于cGMP的術語“加強作用”包括下列任何一種或多種作用增強cGMP的效力、增加cGMP的水平、增強cGMP的活性、減少cGMP降解的水平、減少cGMP抑制的水平。
所述加強作用可以是一種直接作用?；蛘咚梢允且环N繼發(fā)作用和/或下游作用。
優(yōu)選地，可加強cGMP作用的活性劑對IcGMP和/或AMcGMP(其中cGMP的調(diào)節(jié)劑對cGMP有不利的影響)起作用，使得活性劑降低和/或消除和/或掩蓋和/或轉(zhuǎn)移IcGMP和/或AMcGMP對cGMP的不利影響。
因此，本發(fā)明包括一種或多種I:IcAMP和一種或多種I:IcGMP的組合物。一方面，I:IcGMP是I:PDEcGMP。IcAMP和/或AMcAMP我們發(fā)現(xiàn)cAMP介導生殖器(如，陰道或陰蒂)血流并通過增強cAMP傳遞信號可在動物模型中增強生殖器(如，陰道或陰蒂)血流。因此，可上調(diào)/增強cAMP介導的血管松馳的活性劑在FSAD治療中將是有效的。為了便于參考，我們將這些物質(zhì)稱作IcAMP和/或AMcAMP。這里，IcAMP和AMcAMP對cAMP水平或活性具有不利影響。
因此，活性劑可以是I:IcAMP和/或I:AMcAMP中的任何一種或多種。
活性劑可以是能夠顯示兩種或多種這些特性的單一實體。另外，活性劑可以是能夠顯示一種或多種這些特性的活性劑的組合物。
IcAMP和AMcAMP的例子包括一種或多種PDE和任選的其他靶向物如NPY和NEP或與其相關的任何成分。例如，相關成分可以是受體和/或輔因子。
因此，活性劑I:PDEcAMP可任選地與I:NPY(有時寫作NPYi)、I:NPYYn(有時寫作NPY Yni)和I:NEP中的一種或多種聯(lián)合使用。
同樣，活性劑可以是能夠顯示兩種或多種這些特性的單一實體。另外，活性劑可以是能夠顯示一種或多種這些特性的活性劑的組合物。I:IcAMP和/或I:AMcAMP根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)通過使用可降低和/或消除和/或掩蓋和/或轉(zhuǎn)移和/或防止IcAMP和/或AMcAMP對cAMP的不利影響的活性劑來治療和/或預防FSAD是可能的。甚至活性劑可恢復由IcAMP和/或AMcAMP降低的cAMP水平。方便起見，我們稱這些物質(zhì)為I:IcAMP和/或I:AMcAMP這里，I:IcAMP和I:AMcAMP可防止或降低對cAMP水平或活性的不利影響。
因此，在一個優(yōu)選方面，活性劑是I:IcAMP和/或I:AMcAMP，其中AMcAMP對cAMP有不利影響。AcAMP根據(jù)本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)FSAD的一個重要原因是在女性生殖器中cAMP水平低或活性低。
因此，活性劑可以是U:AcAMP。
因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的活性劑也能夠作為A:AC、A:VIPr、A:VIPn、I:I:VIPr或I:I:VIPn中的任何一種或多種起作用，和/或可與其聯(lián)合使用。
活性劑可以是能夠顯示兩種或多種這些特性的單一實體。另外，活性劑可以是能夠顯示一種或多種這些特性的活性劑的組合物。U:AcAMP另一方面，其他的靶向物可以是能增加cAMP水平的成分。因此，活性劑也可以作為U:AC起作用。
因此，例如本發(fā)明活性劑也能夠作為U:AcAMP、A:AC、A:VIPr、A:VIPn、I:I:VIPr或I:I:VIPn中的任何一種或多種起作用，和/或可與其聯(lián)合使用。
例如，靶向物可以是cAMP本身或AC或VIP(或其組合物)。I:IcAMP’和/或I:AMcAMP和/或U:AcAMP的聯(lián)合使用另一方面，本發(fā)明的活性劑可與cAMP增效劑聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的活性劑可與一種或多種下列物質(zhì)聯(lián)合使用I:PDEcAMPI:PDEncAMPI:NPYI:NPY YnI:NEPU:AcAMPA:ACA:VIPrA:VIPnI:I:VIPrI:I:VIPncAMP模擬物抑制劑從本發(fā)明活性劑方面考慮，本文所使用的術語“抑制劑”意指可降低和/或消除和/或掩蓋和/或防止IcAMP和/或AMcAMP對cAMP的不利影響的活性劑。所述抑制劑可作為拮抗劑起作用。如果用作其它活性劑，拮抗劑的實例是I:NPY。激活劑從本發(fā)明活性劑方面考慮，本文所使用的術語“激活劑”意指可增加和/或產(chǎn)生和/或暴露和/或升高和/或確保cAMP和/或AcAMP作用的活性劑。激活劑可以起激動劑的作用。其他活性成分另一方面，本發(fā)明活性劑甚至可以與一種或多種其他活性成分-如一種或多種能夠增強cGMP作用的活性劑聯(lián)合使用。氨基酸序列本文所使用的術語“氨基酸序列”是術語“多肽”和/或術語“蛋白質(zhì)”的同義詞。在某些例子中，術語“氨基酸序列”是術語“肽”的同義詞。在某些例子中，術語“氨基酸”序列與術語“蛋白質(zhì)”同義。
氨基酸序列可由合適的原料制備分離，或者可合成制備或通過使用重組DNA技術來制備。
一方面，本發(fā)明提供能夠在測定中起靶向物作用的氨基酸序列，所述測定用于鑒定能夠影響氨基酸序列以便增強cAMP作用來治療FSAD的一種或多種活性劑和/或其衍生物。核苷酸序列本文使用的術語“核苷酸序列”與術語“多核苷酸”同義。
核苷酸序列可以是來源于基因組的或合成的或重組的DNA或RNA。不管代表有義股還是代表反義股或其組合股，核苷酸序列可以是雙股的或單股的。
在某些應用中，優(yōu)選地，核苷酸是DNA。
在某些應用中，優(yōu)選地，核苷酸序列使用重組DNA技術來制備(如，重組DNA)。
在某些應用中，優(yōu)選地，核苷酸序列是cDNA。
在某些應用中，優(yōu)選地，核苷酸序列在這方面可與天然產(chǎn)生的形式相同。
一方面，本發(fā)明提供編碼能夠在測定(如酵母雙雜交測定)中起靶向物作用物質(zhì)的核苷酸序列，所述測定用于鑒定能夠影響所述物質(zhì)以便增強cAMP作用來治療FSAD的一種或多種活性劑和/或其衍生物。
技術人員會理解各種不同的核苷酸序列可因遺傳密碼的簡并性而編碼靶向物。另外會理解，技術人員可使用常規(guī)技術進行核苷酸置換，它基本上不影響由本發(fā)明核苷酸序列編碼的活性，反映了任何特定的表達靶向物的宿主生物體密碼子的使用情況。因此，與在附錄序列表中所述的核苷酸序列相關的術語“變體”、“同系物”或“衍生物”包括任何取代的、改變的、修飾的、置換的、缺失的或插入的一種(多種)由序列得到的核酸，條件是所得核苷酸序列編碼本發(fā)明的功能性靶向物(或者本發(fā)明的活性劑，只要所述活性劑包含核苷酸序列或氨基酸序列)。
如上所述，就序列的同源性而言，與本文序列表所述的序列相比，優(yōu)選地至少有75％的同源性，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％。更優(yōu)選地有至少95％的同源性，更優(yōu)選至少98％?？砂凑丈衔乃龇椒▉磉M行核苷酸同源性的比較。優(yōu)選地序列比較程序是上文所述的GCG Wisconsin Bestfit程序。系統(tǒng)設置的評分標準是各相同核苷酸為10分匹配值和各個錯配為-9分值。系統(tǒng)設置的缺口產(chǎn)生罰分是-50并且系統(tǒng)設置的缺口延伸罰分是每個核苷酸-3。
本發(fā)明也包括能夠與本文所述序列選擇性雜交的核苷酸序列，或其任何變體、片段或衍生物，或它們的互補序列。核苷酸序列長度優(yōu)選至少15個核苷酸，更優(yōu)選長度至少為20、30、40或50個核苷酸。這些序列可用作探針，如在診斷藥盒中。變體/同源物/衍生物除了本文所述的具體氨基酸序列和核苷酸序列外，本發(fā)明也包括使用其變體、同源物和衍生物。這里，術語“同源性”可等同于“同一性”。
本文中，同源序列被認為包括至少75、85或90％相同的氨基酸序列，優(yōu)選至少95或98％相同。具體來說，同源性通常應當考慮已知對活性來說必不可少的序列的區(qū)域。盡管同源性也可被認為是類似性(即，具有相似化學特性/功能的氨基酸殘基)，但本文中優(yōu)選表示序列一致方面的同源性。
同源性比較可通過眼來進行，或者常常借助容易得到的序列比較程序來進行。這些可商購的計算機程序可計算兩個或多個序列的同源性百分數(shù)。
可對毗連序列計算同源性百分數(shù)，即，將一個序列同其他序列一起對比并且將一個序列中的每個氨基酸與另一序列中的相應氨基酸比較，每次一個殘基。這被稱為“無缺口”對比。一般來說，這種無缺口對比僅僅在較少數(shù)目的殘基中進行。
盡管這是一種非常簡單和一致的方法，但其中沒有考慮到，例如，在原本幾乎相同的一對序列中，因一個插入或缺失將使隨后的氨基酸殘基不能對比，因此，在進行完整對比時可能導致同源性百分數(shù)的大大降低。
因此，大多數(shù)序列比較方法被設計為進行最適對比，其中考慮了可能的插入和缺失而不過多地罰扣總體同源性的得分。這通過在序列對比中插入“缺口”以盡可能地使局部的同源性最高化而達到。
然而，這些較復雜的方法將“缺口罰分”分配到對比中所存在的每個缺口中，這樣，對于有相同數(shù)目的相同氨基酸來說，有盡可能少缺口的序列的對比-反映兩個比較序列間的較高相關性-將獲得比有許多缺口的序列高的分數(shù)?！坝H族缺口耗費”通常用來使缺口的存在罰去相對較高的得分，并且缺口中每個隨后的殘基罰去較少的罰分。這是最常用的缺口評分系統(tǒng)。當然，高缺口罰分會產(chǎn)生有較少缺口的最適對比。大多數(shù)對比程序可改變?nèi)笨诹P分。然而，使用這種序列比較軟件時，優(yōu)選使用系統(tǒng)設置值。例如，使用GCG WisconsinBestifit包(見下文)時，氨基酸序列的系統(tǒng)設置缺口罰分對缺口是-12分而對每個延伸是-4分。
所以，最大同源性百分數(shù)的計算首先要求進行最適對比，考慮缺口罰分。進行這種對比的合適的計算機程序是GCG Wisconsin Bestifit包(Universityof Wisconsin,U.S.A.；Devereux等人，1984,Nucleic Acids Research12:387)。其他可進行序列比較的軟件的例子包括但不限于BLAST包(見Ausubel等人，1999ibid-Chapter18)、FASTA(Atschul等人，1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS成套比較工具。BLAST和FASTA在不聯(lián)機和在線檢索時均可使用(見Ausubel等人，1999ibid,7-58到7-60頁)。然而，優(yōu)選使用GCG Bestifit程序。一種新的工具，稱作BLAST2序列也可用來比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett1999 174(2):247-50；FEMSMicrobiol Lett1999 177(1):187-8和tatina@ncbi.nlm.nih.gov)。
盡管最終同源性百分數(shù)可按一致性來測定，但對比方法本身通常不基于全部配對或全不配對的比較。而是通常使用按類似性評分的標準，根據(jù)化學類似性或發(fā)展的距離來將分數(shù)分配給每對比較。這種常用的評分標準的例子是BLOSUM62標準-BLAST成套程序的缺失標準。如果提供的話，GCG WisconsinBestifit程序通常使用公共缺失值或慣用符號比較表(見進一步詳細描述的使用者手冊)。GCG包優(yōu)選使用公共缺失值，或在其他軟件的情況下使用如BLOSUM62的缺失標準。
一旦軟件產(chǎn)生最適對比，即使計算同源性百分數(shù)，優(yōu)選序列一致性百分數(shù)成為可能。軟件通常分段進行序列比較并產(chǎn)生數(shù)值結(jié)果。
序列中也可以有缺失、插入或取代的氨基酸殘基，這些殘基產(chǎn)生沉默改變并產(chǎn)生功能性等同物。氨基酸取代可根據(jù)殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性的類似性來進行，只要保留物質(zhì)的二級結(jié)合活性即可。例如，帶負電荷的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電極性的具有類似親水性端基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可制備保守取代物，例如，按下表所示方法。在第二欄相同區(qū)域的氨基酸、優(yōu)選在第三欄同一行中的氨基酸可相互取代
本發(fā)明也包括可發(fā)生的同源取代(本文所使用的取代和置換均指存在的氨基酸殘基與其他殘基的交換)，即相似取代，如用堿性的取代堿性的、用酸性的取代酸性的、用極性的取代極性的氨基酸殘基等。也可以發(fā)生非同源取代，即，從一類殘基取代為另一類，或另外包括非天然氨基酸如鳥氨酸(下文稱作Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱作B)、正亮氨酸鳥氨酸(下文稱作O)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基鳥氨酸、萘基鳥氨酸和苯基甘氨酸。
置換也可通過非天然氨基酸來進行，這些非天然氨基酸包括α*和α-二取代的*氨基酸，N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵代衍生物如三氟酪氨酸*、對氯苯丙氨酸*、對溴苯丙氨酸*、對碘苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基異丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-蛋氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、對硝基-L-苯丙氨酸、L-羥基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyl(甲基)*、L-Phe(4-異丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苯甲基)*。為了上文的討論(涉及同源或非同源取代)，標志*被用來表示衍生物的疏水特性而A#用來表示衍生物的親水特性，#*表示兩親特性。
改變的氨基酸序列可包括合適的間隔基團，所述基團可插入序列中的任何兩個氨基酸殘基之間，除氨基酸間隔基團如甘氨酸或β-丙氨酸殘基外，還包括烷基如甲基、乙基或丙基基團。本領域技術人員會很好地理解，變體的其它形式包括存在一個或多個類肽形式的氨基酸殘基。為了避免有疑問，所使用的“類肽形式”指改變的氨基酸殘基，其中α-碳取代基在殘基的氮原子上而不是α-碳上。制備類肽形式的肽的方法在本領域中是已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。雜交本發(fā)明也包括可與本文所述靶向序列雜交的序列的應用-如活性劑是反義序列時。
本文所使用的術語“雜交”包括“一股核苷酸通過堿基對與互補股結(jié)合的過程”以及在聚合酶鏈反應(PCR)技術中進行的擴增過程。
能與本文所述核苷酸序列或其互補序列選擇性雜交的本發(fā)明核苷酸序列通常與本文所述的相應互補核苷酸序列在至少20個，優(yōu)選至少25或30，例如至少40、60或100或更多鄰近的核苷酸區(qū)域有至少75％、優(yōu)選至少85或90％并且更優(yōu)選至少95％或98％的同源性。本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列將包括與本發(fā)明序列表SEQ ID No2中所述核苷酸序列優(yōu)選有至少80或90％同源性、更優(yōu)選與本發(fā)明序列表SEQ ID No2中所述核苷酸序列有至少95％的同源性的區(qū)域。
術語“可選擇性雜交的”意指當核苷酸序列用作探針時，發(fā)現(xiàn)靶核苷酸序列在顯著超過本底的水平下與探針雜交。本底雜交可發(fā)生，這是因為例如在被篩選的cDNA或基因組DNA文庫中存在其他核苷酸序列。這樣，本底暗示由探針和非特異DNA文庫成員之間的相互作用所產(chǎn)生信號水平的強度比用靶向DNA所觀察的特異性相互作用低10倍，優(yōu)選低100倍。例如，通過用32P放射標記探針可測量相互作用的強度。
按Berger和Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Press,San Diego CA)的說法，雜交條件基于核苷酸結(jié)合復合物的熔化溫度(Tm)，并授予如下文所描述的定義“嚴格性”。
最大的嚴格性通常在約Tm-5℃(低于探針Tm5℃)發(fā)生；高度嚴格性在低于Tm約5℃到10℃；中等嚴格性在低于Tm約10℃到20℃；并且低嚴格性在低于Tm約20℃到25℃發(fā)生。本領域技術人員會理解，最大嚴格性雜交可用來確定或檢測相同的核苷酸序列而中等(或低等)嚴格性雜交可用來確定或檢測類似的或相關的多核苷酸序列。
在優(yōu)選方面，本發(fā)明包括可在嚴格性條件下(如，65℃和0.1×SSC{1×SSC=0.15M NaCl,0.015M Na3檸檬酸pH7.0})與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明核苷酸序列是雙鏈時，分開或組合的雙螺旋的雙鏈均包含在本發(fā)明中。核苷酸序列是單鏈時，可以理解該核苷酸序列的互補序列也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可通過各種方法來獲得與本發(fā)明序列非100％同源性的但在本發(fā)明范圍的核苷酸序列。可獲得本文所述序列的其他變體，例如通過探測由一定范圍的原料制備的DNA文庫。另外，可以獲得其他病毒/細菌，或同系細胞特別是在哺乳動物細胞(如大鼠、小鼠、牛和靈長類動物細胞)中發(fā)現(xiàn)的同系細胞并且這些同源體及其片段通常能夠與本文序列表中所示的序列進行選擇性地雜交。這些序列可通過探測由其他動物種制備的cDNA庫或基因組DNA庫，并且用包含全部或部分本文所述核苷酸序列的探針在中等到高嚴格性條件下探測這些庫來獲得。采用類似的方法獲得本發(fā)明的物種同源物種和氨基酸和/或核苷酸序列的等位變體。
使用簡并PCR也可獲得變體和同源菌株/種，其中使用設計的引物，它靶向于編碼本發(fā)明序列之中的保守氨基酸序列的變體和同源體范圍之內(nèi)的序列?？梢灶A測保守序列，例如通過對比來自某些變體/同源體的氨基酸序列。序列對比可使用本領域已知的計算機軟件來進行。例如廣泛使用的GCG WisconsinPileUp程序。在簡并PCR中使用的引物將包含一個或多個簡并部位并且將在低于用針對已知序列的單個序列引物來克隆序列所使用的嚴格性條件下使用。
另外，這些核苷酸序列可通過特征序列如本發(fā)明序列表SEQ ID No2中所述的核苷酸序列定點誘變來獲得。例如，要求序列中沉默密碼子改變而使密碼子適于特定的表達核苷酸序列的宿主細胞時，這是有用的。其他序列改變可能是需要的，以便引入限制酶鑒定部位，或者改變核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的活性。
可使用本發(fā)明的核苷酸序列來產(chǎn)生引物如PCR引物、選擇性擴增反應的引物，探針如用揭示標記通過常規(guī)方法使用放射性或非放射性標記物標記的，或者可以將核苷酸序列克隆到載體中。這些引物、探針和其他片段的長度將至少有15個，優(yōu)選至少20個，例如至少25、30或40個核苷酸，并且也包括在本文所使用的本發(fā)明術語核苷酸序列中。
可通過重組、合成方法或通過本領域技術人員可用的任何方法來制備本發(fā)明的核苷酸序列如DNA多核苷酸和探針。它們也可通過常規(guī)技術來克隆。
總而言之，引物將通過合成方法來制備，包括分步制備所需核苷酸序列，一次一個核苷酸。使用自動技術完成制備在本領域是容易的。
較長的核苷酸序列通常使用重組方法來制備，例如使用PCR(聚合酶鏈反應)克隆技術。這包括使一對引物(如約15到30個核苷酸的)置于需要克隆的靶向序列的側(cè)翼區(qū)，使引物與從動物或人細胞獲得的mRNA或cDNA接觸，在使所需區(qū)域擴增的條件下進行聚合酶鏈反應(PCR)，分離擴增的片段(如，通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)并且回收擴增的DNA。可以設計包含合適的限制酶鑒定位點的引物，以便將擴增的DNA克隆到合適的克隆載體中。
由于遺傳密碼的固有簡并性，編碼基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列可用于克隆和表達靶序列。本領域普通技術人員應該理解，對于某些表達系統(tǒng)，產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的靶序列是有益的?？蛇x擇特定原核生物或真核生物的宿主首選的密碼子(Murray E et al(1989)Nuc Acids Res17:477-508)，以便例如提高靶向物表達率或者產(chǎn)生具有所需特性的(如比天然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物有更長半衰期的重組RNA轉(zhuǎn)錄物)。表達載體用作靶向物或者表達靶向物的核苷酸序列可摻入到重組的可復制載體中。載體可用于在相容性宿主細胞中復制和表達核苷酸序列。可使用包括啟動子/增強子和其它表達調(diào)節(jié)信號的控制序列來控制表達。可使用原核生物的啟動子和在真核生物細胞中有功能的啟動子?？梢允褂媒M織特異性或刺激特異性啟動子。也可使用包括來源于兩種或多種上述的不同啟動子的序列成分的嵌合啟動子。
根據(jù)使用的序列和/或載體，通過宿主重組細胞表達核苷酸序列產(chǎn)生的蛋白可被分泌出來或包含于細胞內(nèi)?？捎眯盘栃蛄性O計編碼序列，信號序列引導編碼序列物質(zhì)通過特定的原核生物或真核生物的細胞膜分泌。融合蛋白靶氨基酸序列可以融合蛋白形式生產(chǎn)，例如借助萃取和純化。融合蛋白配合物的實例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配合物和所需的蛋白序列之間包括蛋白分解位點以除去融合蛋白序列也是很方便的。優(yōu)選融合蛋白不影響靶向物的活性。
融合蛋白可包含與本發(fā)明的物質(zhì)融合的抗原或抗原決定簇。在本發(fā)明的實施方案中，融合蛋白可以是包含用作佐劑的物質(zhì)的非天然存在的融合蛋白，所述佐劑可對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一般性刺激作用?？乖蚩乖瓫Q定簇可連接到所述物質(zhì)的氨基或羧基端。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，氨基酸序列可連接到異源序列上以編碼融合蛋白。例如，為篩選肽文庫中能夠影響所述物質(zhì)活性的活性劑，編碼表達可被市售抗體鑒定的異源表位的嵌合物質(zhì)是有用的?？贵w在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的活性劑可以是抗體。此外，或者在供替代的選擇中，靶向物可以是抗體。此外在供替代的選擇中，檢測靶向物的手段可以是抗體。
抗體可通過標準技術，例如用本發(fā)明的物質(zhì)免疫或用噬菌體展示文庫進行生產(chǎn)。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，除非另有說明，術語“抗體”包括但不限于多克隆的、單克隆的、嵌合的、單鏈的、Fab片斷、由Fab表達文庫產(chǎn)生的片斷以及其模擬物。這類片斷包括保持其與靶物質(zhì)的結(jié)合活性的整個抗體的片斷、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片斷以及單鏈抗體(scFv)、包含抗體的抗原結(jié)合位點的融合蛋白和其它合成蛋白。再者，抗體及其片斷可以是人源化抗體。中和抗體，即可抑制所述物質(zhì)多肽生物活性的那些抗體尤其優(yōu)選用于診斷和治療。
如果需要多克隆抗體，將所選擇的哺乳動物(如小鼠、兔、山羊、馬等)用帶有表位的免疫原性多肽免疫，所述表位可由本發(fā)明確定的活性劑和/或物質(zhì)獲得。根據(jù)宿主的種類，可使用各種佐劑增強免疫反應。這類佐劑包括，但不限于弗氏佐劑；礦物凝膠，如氫氧化鋁；和表面活性劑，如溶血卵磷脂、多聚醇類、聚陰離子、肽、油性乳液、匙孔血藍蛋白和二硝基苯酚。BCG(BacilliCalmette-Guerin，結(jié)核菌)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)可能是有用的人佐劑，如果為了激發(fā)防御系統(tǒng)而將純化的多肽物質(zhì)施用于期望免疫的個體，就可以使用這類人佐劑。
收集被免疫動物的血清并按照已知方法處理。如果包含針對可由本發(fā)明確定的活性劑和/或物質(zhì)獲得的表位的多克隆抗體的血清還含有針對其它抗原的抗體，可通過免疫親和色譜純化多克隆抗體。生產(chǎn)和加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為制備這類抗體，本發(fā)明還提供用作人或動物的免疫原的本發(fā)明的多肽或其半抗原化為另一種多肽的片斷。
針對可由本發(fā)明確定的活性劑和/或物質(zhì)獲得的表位的單克隆抗體也可由本領域普通技術人員方便地生產(chǎn)。通過雜交瘤制備單克隆的通用方法是熟知的。產(chǎn)生抗體的無限增殖細胞系可通過細胞融合產(chǎn)生；也可通過其它技術，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞或者用EB(Epstein-Barr)病毒轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生?？筛鶕?jù)各種性質(zhì)，即同種型和表位親和性篩選針對orbit表位產(chǎn)生的單克隆抗體。
針對本發(fā)明物質(zhì)和/或鑒定的活性劑的單克隆抗體可用任何通過培養(yǎng)的傳代細胞系生產(chǎn)抗體分子的技術來制備。這些技術包括，但不限于最初由Koehler和Milstein描述的雜交瘤技術(1975Nature 256:495-497)、人B細胞雜交瘤技術(Kosbor et al(1983)Immunol Today 4:72；Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci80:2026-2030)和EBV-雜交瘤技術(Cole et al(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,pp77-96)。此外，也可使用為生產(chǎn)“嵌合抗體”開發(fā)的技術，將小鼠抗體基因剪接到人抗體基因上以獲得具有適合抗原特異性和生物活性的分子(Morrison etal(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855)；Neuberger et al(1984)Nature312:604-608；Takeda et al(1985)Nature314:452-454)?；蛘?，用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(US Patent No.4946779)也適用于生產(chǎn)所述物質(zhì)特異性的單鏈抗體。
抗體，無論是單克隆抗體還是多克隆抗體，它們都針對可由本發(fā)明確定的活性劑和/或物質(zhì)獲得的表位，并且是中和抗體的那些抗體在被動免疫治療中具有作用。單克隆抗體尤其可用于產(chǎn)生抗獨特型抗體?？躬毺匦涂贵w是帶有需要對抗的所述物質(zhì)和/或活性劑的“內(nèi)影像”的免疫球蛋白。產(chǎn)生抗獨特型抗體的技術是本領域公知的。這些抗獨特型抗體在治療中也有用。
也可通過在體內(nèi)在淋巴細胞群中誘導產(chǎn)生抗體或者通過篩選重組的免疫球蛋白文庫或分布板中的高度特異結(jié)合的試劑來產(chǎn)生抗體(如Orlandi等人于1989年在Proc Natl Acad Sci86:3833-3837以及Winter G和Milstein C于1991年在Nature349:293-299中公開的)。
也可生產(chǎn)含有該物質(zhì)的特異結(jié)合位點的抗體片斷。例如，這類片斷包括，但不限于可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2和可通過還原F(ab’)2片斷的二硫鍵生成的Fab片斷?；蛘?，可構建Fab表達文庫以快速和容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片斷(Huse WD et al(1989)Science 256:1275-1281)。報道基因種類眾多的報道基因可用于本發(fā)明的分析方法(以及篩選)中，優(yōu)選的報道基因提供可方便地檢測的信號(如通過光譜學檢測)。例如，報道基因可編碼催化改變光吸收性的反應的酶。
報道基因分子的實例包括，但不限于β-半乳糖苷酶、綠熒光蛋白(greenfluorescent protein)、熒光素酶、氯霉素、乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶?；蛘?，可將放射性標記的或熒光標記的核苷酸摻入剛生成的轉(zhuǎn)錄物中，之后當所述轉(zhuǎn)錄物與寡核苷酸探針結(jié)合時可被鑒定。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過報道基因產(chǎn)物，例如β-半乳糖苷酶的酶活性測定報道基因分子的產(chǎn)生。
檢測和測定靶向物表達的各種方法，例如通過使用對蛋白具有特異性的多克隆或單克隆抗體是本領域已知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分類術(FACS)。優(yōu)選的是使用與多肽的兩個非干擾性表位有反應性的單克隆抗體的基于單克隆的雙位點免疫測定法，但也可使用競爭性結(jié)合測定法。記載這些及其它測定方法的文獻有Hampton R etal,(1990)Serological Methods,A Laboratory Manual,APS Press,St PaulMN和Maddox DE et al(1983),J Exp Med 15 8:1211)。
各種標記物和綴合技術是本領域普通技術人員已知的，它們可用于各種核酸和氨基酸測定中。產(chǎn)生用于檢測多核苷酸序列靶向物的標記雜交或PCR探針的方法包括微量標記、切口平移、末端標記或使用標記核苷酸的PCR擴增?；蛘?，可將編碼序列或其任何部分克隆到用于產(chǎn)生mRNA探針的載體中。這類載體是本領域已知的并有市售，它們可通過加入適合的RNA聚合酶，例如T7、T3或SP6和標記的核苷酸用于體外合成RNA探針。
有許多公司，例如Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ),Promega(Madison,WI)和US Biochemical Corp(Cleveland,OH)提供用于這些方法的商品試劑盒和方案。適合的報道基因分子或標記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑或生色劑以及底物、輔因子、抑制劑和磁粉等。教導了這些標記物使用的專利包括US-A-3817837；US-A-3850752；US-A-3939350；US-A-3996345；US-A-4277437；US-A-4275149和US-A-4366241。也可如US-A-4816567中所示生產(chǎn)重組免疫球蛋白。
定量特定分子表達的其它方法包括放射性標記(Melby PC et al 1993 JImmunol Methods159:235-44)或生物素?；?Duplaa C et al1993 AnalBiochem229-36)核苷酸、共擴增對照核酸和將實驗結(jié)果繪制到標準曲線上。通過以ELISA格式運行分析可加速多種樣品的定量，其中目標低聚物以各種稀釋度存在并通過分光光度分析或測熱反應進行快速定量。
盡管標記基因的表達與否暗示了目的基因的存在與否，其存在性和表達應被證實。例如，如果將核苷酸序列插入到標記基因序列中，含有該核苷酸序列的重組細胞可通過標記基因功能的缺乏來鑒定?；蛘?，可將靶編碼序列與標記基因串聯(lián)排列處于單一啟動子的控制下。應答誘導或選擇的標記基因表達一般也象征靶向物的表達。
或者，包含編碼靶向物的序列和表達靶向物編碼區(qū)域的宿主細胞可通過本領域普通技術人員已知的各種方法來鑒定。這些方法包括，但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白生物測定或免疫測定技術，所示技術包括基于膜、基于溶液或基于芯片的核酸或蛋白測定和/或定量分析技術。cAMP活性/水平的一般性分析試驗物質(zhì)增強cAMP的能力可通過測量靶向物水平的相關增加或減少來測定。另外，或者供替代的選擇是，試驗物質(zhì)增強cAMP的能力可通過測量cAMP水平的有關增加來測定。例如，可采納Smith等人于1993年的教導(Appl.Biochem.Biotechnol.41:189-218)。另外有市售的用于測定cAMP的免疫測定試劑盒(如Amersham International,Arlington Heights,IL andDuPout,Boston,MA)。在試驗部分給出了適宜的cAMP測定的具體方法。篩選在任何一種藥物篩選技術中，任何一種或多種適合的靶向物-例如氨基酸和/或核苷酸序列都可用于鑒定PcAMP。用于該試驗的靶向物可以游離于溶液中、固定在固體載體上、固定于細胞表面或定位于細胞內(nèi)。該靶向物甚至可以存在于動物模型中，其中所述靶向物可以是內(nèi)源性靶向物或引入的靶向物。動物模型是非人動物模型?？梢詼y量靶向物活性的消失或者靶向物與試驗活性劑之間形成的結(jié)合復合物的形成。
可采用1984年9月13日出版的Geysen的歐洲專利中請84/03564中描述的藥物篩選方法。概括地說，在一種固體底物，例如塑料大頭針或一些其它表面上合成大量不同的小分子肽試驗化合物。將肽試驗化合物與適合的靶向物或其片斷反應并洗滌。然后檢測結(jié)合的實體-例如通過適當采用本領域熟知的方法。也可將純化的靶向物也可直接包被到培養(yǎng)板上用于藥物篩選技術?；蛘撸墒褂梅侵泻涂贵w捕獲肽并使其固定到固體支持物上。
本發(fā)明還包括使用競爭性藥物篩選分析，其中能特異性地與靶向物結(jié)合的中和抗體與試驗化合物競爭結(jié)合靶向物。
另一種高產(chǎn)量篩選(HTS)與所述物質(zhì)具有適宜結(jié)合親和性的活性劑的篩選技術是WO 94/03564中具體描述的方法。
預期本發(fā)明的分析方法適于小規(guī)模和大規(guī)模篩選試驗化合物以及定量分析。
因此，本發(fā)明還涉及一種鑒定可增強cAMP作用的活性劑的方法，該方法包括將適合的靶向物與所述活性劑接觸，然后測定cAMP的活性和/或水平。
本發(fā)明還涉及一種鑒定可在雌性生殖器中選擇性增強cAMP作用的活性劑的方法，該方法包括將來源于雌性生殖器的適合靶向物與所述活性劑接觸，然后測定cAMP的活性和/或水平。
本發(fā)明還涉及一種鑒定可增強cAMP作用的活性劑的方法，該方法包括將適合的靶向物與所述活性劑接觸，然后測定靶向物的活性和/或水平。
本發(fā)明還涉及一種鑒定可在雌性生殖器中選擇性增強cAMP作用的活性劑的方法，該方法包括將來源于雌性生殖器的適合靶向物與所述活性劑接觸，然后測定靶向物的活性和/或水平。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的篩選至少包括下列步驟(這些步驟的順序不一定與此相同)(a)進行體外篩選以確定候選活性劑是否具有相關活性(例如，PDEⅡ的調(diào)節(jié)作用)；(b)進行一種或多種選擇性篩選以確定所述候選活性劑的選擇性(例如，看所述活性劑是否也是ACE抑制劑-如使用本文描述的測定方法)；和(c)對所述候選活性劑進行體內(nèi)篩選(例如，使用功能性動物模型)。一般來說，如果所述候選活性劑通過了(a)篩選和(b)篩選，才進行(c)篩選。診斷本發(fā)明還提供用于檢測FSAD易患體質(zhì)的診斷組合物或試劑盒。在此，所述組合物或試劑盒應包括能夠表明一種或多種靶向物存在或者不存在于試驗樣品中的物質(zhì)。試驗樣品優(yōu)選由雌性生殖器或者其分泌物或其中含有的分泌物獲得。
例如，診斷組合物可包含任何一種本文提及的核苷酸序列或其變體、同源物、片斷或衍生物，或者能與任一種所述核苷酸序列的整體或部分雜交的序列。
為提供診斷疾病的基礎，應建立靶向物的正常或標準值。這可以如下完成通過在本領域熟知的適于復合物形成的條件下，將取自正常者(動物或人)的體液或細胞提取物與靶向物的抗體結(jié)合。通過將形成的標準復合物與系列稀釋的陽性對照進行比較來確定其量，在陽性對照中是將已知量的抗體與已知濃度的純化靶向物混合在一起的。然后，可將由正常樣品獲得的標準值與由取自有可能患FSAD的被診斷對象的樣品獲得值進行比較。標準值與診斷值之間的偏差確定了病癥的存在。
靶向物本身或其任何部分可構成診斷和/或治療化合物的基礎。用于診斷目的時，靶向物多核苷酸序列可用于檢測和定量與FSAD有關的癥狀、病癥或疾病中的基因表達。
編碼多核苷酸序列的靶向物可用于診斷由靶向物表達導致的FSAD。例如，編碼靶向物的多核苷酸序列可用于活檢或尸檢組織或者生物體液的雜交或PCR測定以檢測靶向物表達的異常性。這類定性或定量方法的形式可包括DNA(Southern)或RNA(northern)測定、斑點印跡或其它基于膜的技術；PCR技術；檢測尺(dip stick)、大頭針或芯片技術；以及ELISA或其它多種常規(guī)技術。所有這些技術都是本領域公知的，并且實際上也是許多市售診斷試劑盒的基礎。
在臨床試驗或監(jiān)測個體患者的治療中，這類測定可用于評價特定治療方案的效果并可用于動物研究。為提供診斷疾病的基礎，應建立靶向物表達的正?；驑藴是€。這可如下完成通過在適于雜交或擴增的條件下，將取自正常者(動物或人)的體液或細胞提取物與靶向物或其部分混合。通過將由正常者得到的值與系列稀釋的陽性對照進行比較來定量標準雜交，陽性對照與該實驗相同，其中使用已知量的純化的靶向物?？蓪⒂烧悠帆@得的標準值與由取自可能患與靶向物編碼序列的表達有關的病癥或疾病的被診斷對象的樣品獲得值進行比較。標準值與診斷值之間的偏差確定了病癥的存在。如果疾病確診，施用現(xiàn)有的治療劑，可形成治療曲線或數(shù)據(jù)。最終，按常規(guī)重復該測定以評價治療數(shù)據(jù)是否趨向或恢復至正?；驑藴?。可采用連續(xù)治療曲線來表明經(jīng)過數(shù)天或數(shù)月治療后的治療效果。
一方面，本發(fā)明涉及靶向物多肽或其變體、同源物、片斷或衍生物用于生產(chǎn)抗靶向物的抗體的用途，所述抗體可例如用于診斷性地檢測和定量FSAD狀態(tài)中的靶向物水平。
本發(fā)明還提供用于測定細胞和組織中的靶向物的診斷分析方法和試劑盒，所述方法和試劑盒包括可用作陽性對照的純化的靶向物和抗靶向物的抗體。這些抗體可用于基于溶液、膜或組織的技術以測定與靶蛋白的表達或者其缺失表達或變體、同源物、片斷或衍生物的表達有關的任何疾病或病癥。分析方法診斷組合物和/或方法和/或試劑盒可用于下列技術，包括但不限于競爭性和非競爭性分析、放射免疫測定、生物發(fā)光和化學發(fā)光測定、熒光分析、三明治分析、免疫放射分析、斑點印跡、包括ELISA的酶聯(lián)測定、微滴板、用于快速檢測尿或血液的抗體包被的條帶或浸漬棒(dipstick)、免疫組織化學和免疫細胞化學。
例如，免疫組織化學試劑盒也可用于探測生殖器組織中的NEP活性。免疫組織化學試劑盒可同時使用光學和電子顯微鏡探測組織切片和培養(yǎng)細胞中的NEP，所述顯微鏡是既可用于研究和也可用于臨床目的的。這類信息可用于診斷并且還可能用于治療目的，以檢測和/或預防和/或治療FSD，例如FSAD。對于每一種試劑盒，建立測定的范圍、靈敏度、準確性、可靠性、特異性和再現(xiàn)性。分析內(nèi)和分析間差異建立于頂替分析和活性分析的標準曲線上的20％、50％和80％的點處。探針本發(fā)明的另一方面是提供核酸雜交或PCR探針，它們可測定(尤其是能夠選擇性選擇)多核苷酸序列，包括基因組序列、編碼靶編碼區(qū)域或密切相關的分子，例如等位基因。探針的特異性，即它是否由高度保守的、保守的或非保守的區(qū)域或結(jié)構域衍生，以及雜交或擴增的嚴格性(高度、中等或低度)將決定探針是否僅鑒定天然存在的靶編碼序列或相關的序列。用于測定相關核酸序列的探針選自靶向物家族成員的保守的或高度保守的核苷酸區(qū)域，這類探針可用于簡并探針庫中。為檢測相同的核酸序列，或者需要最高特異性，則核酸探針應選自靶向物多核苷酸的非保守性核苷酸區(qū)域或獨特區(qū)域。本文采用的術語“非保守性核苷酸區(qū)域”是指本文公開的靶向物編碼序列比較獨特，而不存在于相關家族的成員中的核苷酸區(qū)域。
如US-A-4683195、US-A-4800195和US-A-4965188中所述的PCR提供了基于靶序列的寡核苷酸的其它用途。這些低聚物通常是化學合成的，但它們也可通過酶促生成或由重組的原料制備。在鑒定特定基因或病癥的最佳條件下使用的低聚物一般包含兩個核苷酸序列，一個是有義取向的(5’→3’)，另一個是反義取向的(3’←5’)。相同的兩種低聚物、嵌套低聚物的集合或甚至簡并低聚物庫可在不太嚴格的條件下用于測定和/或定量密切相關的DNA或RNA序列。
用于編碼靶向物的核酸序列也可用于產(chǎn)生先前所述的雜交探針，用于測繪內(nèi)源性基因組序列圖?？刹捎霉募夹g將所述序列定位到特定的染色體或染色體的特定區(qū)域中。這些包括原位雜交到染色體擴展圖上(Verma et al(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,NewYork City)、流式分選的染色體制品、或人工構建的染色體，例如YAC、人工細菌染色體(BAC)、細菌PI構成物或單一染色體cDNA文庫。
原位雜交的染色體制品和物理定位技術，例如使用已建立的染色體標記物的連鎖分析在擴展基因圖中沒有價值?；驁D的實例可參見Science(1995；270:410f和1994；265；1981f)。將一個基因放置到另一種哺乳動物的染色體中通常可揭示相關標記物，即使特定人染色體的數(shù)量或臂是未知的。可通過物理定位將新的序列定位到染色體臂或其局部上。這給用定位克隆或其它基因發(fā)現(xiàn)技術研究疾病基因的觀察者提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖到特定的基因組區(qū)域上粗略地定位了疾病或綜合癥，定位到所述區(qū)域的任何序列可代表相關或調(diào)節(jié)基因供進一步研究。本發(fā)明的核苷酸序列還可用于測定正常者、攜帶者或感染者之間的因易位、翻轉(zhuǎn)等的染色體定位差異。宿主細胞與本發(fā)明有關的術語“宿主細胞”包括可包含活性劑靶向物的任何細胞。
本發(fā)明的另一個實施方案提供用本身是靶向物或表達靶向物的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。所述多核苷酸優(yōu)選載于用于復制和表達多核苷酸的載體中，所述多核苷酸是靶向物或用來表達靶向物。宿主細胞應選擇與所述載體相容的，例如可以是原核生物(如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。
革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.Coli)被廣泛用作異源基因表達的宿主。然而，大量異源蛋白質(zhì)趨于在細胞內(nèi)累積。隨后從大腸桿菌的胞內(nèi)蛋白質(zhì)中純化所需蛋白質(zhì)，該純化有時存在困難。
與大腸桿菌相對照，芽孢桿菌屬細菌也非常適于作為異源宿主，因為它們能使蛋白質(zhì)分泌進入培養(yǎng)基中。其它適于作為宿主的細菌是鏈霉菌屬和假單胞菌屬的細菌。
根據(jù)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的性質(zhì)，和/或進一步處理所表達的蛋白質(zhì)的可取性，真核生物宿主，例如酵母或其它真菌是優(yōu)選的。一般來說，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，因為它們更易于操作。但是，某些蛋白質(zhì)很難從酵母細胞中分泌出來，或者在某些情況下，無法進行適當?shù)奶幚?如，酵母中的過度葡糖基化)。在這些情況下，應選擇不同的真菌宿主生物。
本發(fā)明范圍內(nèi)適宜的表達宿主的實例是真菌，例如曲霉屬真菌(如EP-A-0184438和EP-A-0284603中描述的那些)和木霉屬真菌；細菌，例如芽孢桿菌屬細菌(如EP-A-0134048和EP-A-0253455中描述的那些)、鏈霉菌屬和假單胞菌屬的細菌；以及酵母，例如克魯維氏酵母(如EP-A-0096430和EP-A-0301670中描述的那些)和酵母屬酵母。例如，典型的表達宿主可選自黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉變種(Aspergillus niger var.tubigenis)、黑曲霉泡盛變種(Aspergillus niger var.awamori)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatis)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillusorvzae)、Trichoderma reesei、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、乳克魯維氏酵母(kluyveromyces lactis)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
使用適合的宿主細胞-例如酵母、真菌和植物宿主細胞可進行翻譯后修飾(如肉豆蔻?；?、糖基化、平截、lapdation以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，按需賦予本發(fā)明的重組表達產(chǎn)物以最佳生物活性。生物與本發(fā)明有關的術語“生物”包括可包含由其獲得的靶向物和/或產(chǎn)物的任何生物。生物的實例可包括真菌、酵母或植物。
與本發(fā)明有關的術語“轉(zhuǎn)基因生物”包括包含所得靶向物和/或產(chǎn)物的任何生物。宿主細胞/宿主生物的轉(zhuǎn)化如前面所示，宿主生物可以是原核生物或真核生物。適宜的原核生物宿主的例子包括大腸桿菌(E.Coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。有關原核生物宿主轉(zhuǎn)化的教導在本領域文獻中有許多記載，例如參見Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，1989年，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等人(分子生物學現(xiàn)行方法(Current Protocols in Molecular Biology),1995,JohnWiley&Sons,Inc.)。
如果使用原核生物宿主，轉(zhuǎn)化前需要對核苷酸序列加以適當修飾，例如除去內(nèi)含子。
在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。這種情況下，酵母也被廣泛地用作異源基因表達的載體。啤酒糖酵母具有悠久的工業(yè)應用歷史，包括其用于異源基因表達。有關啤酒糖酵母中的異源基因的表達參見Goodey等人的綜述(1987,Yeast Biotechnology,D R Berry et al,eds,pp401-429)和King等人的綜述(1989,Molecular and Cell Biology of Yeasts,E F Waltonand G T Yarronton,eds,pp107-133,Blackie,Glasgow)。
啤酒糖酵母十分適于異源基因表達的原因有數(shù)種。首先，它對人是非病原性的，它不會產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。第二，經(jīng)過幾個世紀的各種目的的商業(yè)探索，它具有使用安全的悠久歷史。這使大眾廣為接受。第三，廣泛的商業(yè)應用和致力于該微生物的研究使人們掌握了大量關于啤酒糖酵母的遺傳學和生理學以及大規(guī)模發(fā)酵特性的知識。
E Hinchcliffe E Kenny撰寫了啤酒糖酵母中異源基因表達原理的綜述(1993，“作為表達異源基因載體的酵母”，Yeasts,Vol5,Anthony H Rose andJ Stuart Harrison,eds,2nd edition,Academic Press Ltd.)。
可利用幾種類型的酵母載體，包括整合載體和自主復制質(zhì)粒載體，所述整合載體需要與宿主基因組重組來保持。
為制備轉(zhuǎn)基因酵母屬酵母，可通過將本發(fā)明的核苷酸序列插入設計用于在酵母中表達的構建物中而制備表達構建物。已開發(fā)了數(shù)種類型的用于異源蛋白表達的構建物。構建物中含有與本發(fā)明核苷酸序列融合的在酵母中有活性的啟動子，通常使用酵母來源的啟動子，例如GAL1啟動子。通常使用酵母來源的信號序列，例如編碼SUC2信號肽的序列。表達系統(tǒng)以酵母中有活性的終止子終止。
為轉(zhuǎn)化酵母，已開發(fā)了數(shù)種轉(zhuǎn)化方案。例如本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母屬酵母可通過下列教導制備Hinnen等人(1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA75,1929)；Beggs,J D(1978,Nature,London,275,104)；和Ito,H等人(1983,J Bacteriology153,163-168)。
用各種選擇性標記物選擇轉(zhuǎn)化的酵母細胞。在用于轉(zhuǎn)化的標記物中有許多營養(yǎng)缺陷型標記物，例如LEU2、HIS4和TRP1，以及顯性抗生素抗性標記物，例如氨基糖甙類抗生素標記物，如G418。
另一種宿主生物是植物。構建基因修飾的植物的基本原理是將遺傳信息插入植物基因組中以使插入后的遺傳物質(zhì)保持穩(wěn)定。已有數(shù)種用于插入遺傳信息的技術，兩種主要的原理是直接引入遺傳信息和通過使用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。通用技術的綜述參見Potrykus的文章(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol42:205-225)和Christou的文章(Agro-Food-Industry Hi-TechMarch/April1994 17-27)。有關植物轉(zhuǎn)化的其它技術可參見EP-A-0449375。
因此，本發(fā)明還提供一種用核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法，所述核苷酸序列本身是靶向物或用于表述靶向物。可在適于表達和適于從細胞培養(yǎng)物中回收所述編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。根據(jù)所用的序列和/或載體，通過重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可被分泌出來或被包含在細胞內(nèi)。本領域普通技術人員應該理解，可用信號序列設計包含編碼序列的表達載體，該信號序列可指導編碼序列通過原核生物或真核生物的細胞膜分泌。其它重組構建物可將編碼序列連接到編碼有助于可溶性蛋白純化的多肽區(qū)域的核苷酸序列上(Kroll DJ等人(1993)DNA Cell Biol12:441-53)。藥物組合物本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它含有治療有效量的本發(fā)明活性劑和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括它們的各種組合)。
藥物組合物可以以人或獸用藥形式用于人或動物，它們一般含有一種或多種可藥用稀釋劑、載體或賦形劑。用于治療用途的可接受載體或稀釋劑是藥物領域公知的，并且記載于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇應考慮計劃的給藥途徑和標準的藥物實踐。藥物組合物除含有載體、賦形劑或稀釋劑外，還可含有一種或多種任何適宜的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑。
防腐劑、穩(wěn)定劑、顏料和甚至芳香劑也可加到藥物組合物中。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。也可使用抗氧劑和懸浮劑。
根據(jù)不同的給藥系統(tǒng)，可以有不同的組成/配方。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以配制為使用微型泵或通過粘膜途徑給藥的，例如呈鼻噴霧劑或吸入氣霧劑或可攝取溶液形式，或者通過例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑經(jīng)非胃腸途徑給藥，其中將組合物配制為注射劑形式?；蛘?，制劑可被設計為同時通過兩種途徑給藥的形式。
當活性劑通過胃腸粘膜經(jīng)粘膜給藥時，在通過胃腸道期間活性劑應能保持穩(wěn)定；例如活性劑應能耐受蛋白水解的降解作用，在酸性pH下是穩(wěn)定的并且能耐受膽汁的洗滌作用。
如果合適，藥物組合物可以栓劑或陰道栓形式通過吸入給藥，以洗劑、溶液、霜劑、軟膏或細粉形式局部給藥，通過使用皮膚貼劑給藥，以含有賦形劑如淀粉或乳糖的片劑形式、以僅含活性劑或含有活性劑與賦形劑的膠囊或卵形劑形式或者以含有矯味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液形式口服給藥，或者它們通過非胃腸途徑，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射給藥。對于非胃腸給藥，組合物最好以滅菌水溶液形式給藥，該溶液可含有其它物質(zhì)，例如足以使該溶液與血液等滲的鹽或單糖。對于頰或舌下給藥，組合物可以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式給藥。
對于某些實施方案，活性劑也可與環(huán)糊精結(jié)合使用。環(huán)糊精已知用于與藥物分子形成包合物和非包合物的復合物。形成藥物-環(huán)糊精復合物可改變藥物分子的溶解度、溶解速率、生物利用度和/或穩(wěn)定性。藥物-環(huán)糊精復合物一般用于大多數(shù)劑型和給藥途徑。作為與藥物直接復合的可替代的選擇是，環(huán)糊精可被用作輔助添加劑，例如作為載體、稀釋劑或增溶劑。最常用的是α-、β-和γ-環(huán)糊精，適合的例子記載于WO-A-91/11172、WO-A-94/02518和WO-A-98/55148。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的活性劑系統(tǒng)給藥(例如口服、經(jīng)頰、舌下)，更優(yōu)選口服給藥。
因此，活性劑是適于口服給藥的形式。
對于某些實施方案，使用時活性劑優(yōu)選不作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
對于某些實施方案，使用時活性劑優(yōu)選是經(jīng)外周發(fā)揮作用的。給藥術語“給藥”包括通過病毒或非病毒技術傳遞。病毒傳遞機制包括，但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和桿狀病毒載體。非病毒傳遞機制包括脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、lipofectin、陽離子表面兩親物(CFA)和它們的混合物。
本發(fā)明的活性劑可以僅以其本身給藥，但是通常是以藥物組合物形式給藥-例如該活性劑與適于目的給藥途徑和標準藥學實踐的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合。
例如，活性劑可以以片劑、膠囊、卵形劑、酏劑、溶液或懸浮液形式(如經(jīng)口服或局部)給藥，它們可含有矯味劑或著色劑，用于活性劑的立即釋放、延遲釋放、調(diào)節(jié)釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放或控制釋放。
片劑可含有賦形劑，例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸；崩解劑，例如淀粉(優(yōu)選玉米、土豆或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和某些復合硅酸鹽；和制粒粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。另外，還可包括潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸、二十二烷酸甘油酯和滑石。
類似形式的固體組合物也可用作明膠膠囊的填充劑。與此有關的優(yōu)選賦形劑包括乳糖、淀粉、纖維素、奶糖或高分子量聚乙二醇。對于水性懸浮液和/或酏劑，活性劑可與各種甜味劑或矯味劑、著色物質(zhì)或顏料，與乳化劑和/或懸浮劑以及與稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇和甘油或者它們的混合物混合。
給藥(傳遞)途徑包括，但不限于下列的一種或多種口服(例如以片劑、膠囊或可攝取的溶液形式)、局部、粘膜(如以鼻噴霧劑或吸入氣霧劑形式)、鼻、非胃腸(如通過注射形式)、胃腸道、脊髓內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、子宮內(nèi)、眼內(nèi)、皮內(nèi)、顱內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)、腦室內(nèi)、小腦內(nèi)、皮下、眼用(包括脈絡膜基底內(nèi)或房內(nèi))、透皮、直腸、頰、陰道、硬膜外和舌下。
應該理解，并非所有的活性劑都需通過相同的途徑給藥。同樣，如果組合物含有一種以上的活性成分，則這些活性成分可通過不同的途徑給藥。
如果本發(fā)明的活性劑經(jīng)非胃腸給藥，給藥的實例包括下列的一種或多種靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)或皮下施用活性劑；和/或采用輸液技術施用。
對于非胃腸給藥，活性劑最好以無菌水溶液形式使用，該溶液可含有其它物質(zhì)，例如足以使該溶液與血液等滲的鹽或葡萄糖。如果需要，水溶液應適宜地緩沖(優(yōu)選至pH 3-9)。采用本領域普通技術人員熟知的標準藥學技術，在無菌條件下很容易制備適宜的非胃腸制劑。
如上所示，本發(fā)明的活性劑可經(jīng)鼻內(nèi)或通過吸入給藥，通常以干粉吸入器形式或使用適合的拋射劑由加壓容器、泵或噴霧器將氣霧劑噴霧使用，所述拋射劑是，例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲、二氯四氟乙烷、氫氟烷烴(如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EATM))、二氧化碳或其它適合的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量定位可通過傳遞計量量的閥門來確定。加壓容器、泵或噴霧器可內(nèi)裝活性化合物的溶液或懸浮液(如，用乙醇和拋射劑的混合物作為溶劑)，其中可另外含有潤滑劑，如脫水山梨醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器使用的膠囊或管殼劑(例如由明膠制備)可配制為含有活性劑與適合的粉末基質(zhì)，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
或者，活性劑可以以栓劑或陰道栓形式給藥或者可以以凝膠、水凝膠、洗劑、溶液、霜劑、軟骨或細粉形式局部給藥。活性劑還可例如使用皮膚貼劑經(jīng)皮或透皮給藥。它們還可通過肺或直腸途徑給藥。它們還可通過眼途徑給藥。對于眼科應用，所述化合物可配制成等滲的、pH調(diào)節(jié)的、無菌鹽水的微粒子懸浮液形式，或者優(yōu)選配制為等滲的、pH調(diào)節(jié)的、無菌鹽水的溶液形式，其中可任選地混合有防腐劑，例如氯芐烷銨?；蛘?，它們可被配制成軟膏，例如使用凡士林。
對于皮膚的局部應用，活性劑可配制成適合的軟膏形式，其中含有懸浮或溶解在例如與一種或多種下列物質(zhì)的混合物中的活性成分礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水?；蛘撸钚詣┛蓱腋』蛉芙庠谙铝械囊环N物質(zhì)或多種物質(zhì)的混合物中配制為適合的洗劑或霜劑礦物油、脫水山梨醇一硬脂酸酯、聚乙二醇、液體石蠟、吐溫60、鯨蠟基酯蠟、鯨蠟基硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發(fā)明的組合物可通過直接注射給藥。
對于某些應用，活性劑優(yōu)選通過口服給藥。
對于某些應用，活性劑優(yōu)選經(jīng)局部給藥。劑量水平一般，醫(yī)生將決定最適于個體患者的實際劑量。對任一特定患者的具體劑量水平和給藥頻率可根據(jù)包括下列的多種因素發(fā)生變化使用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間長短、患者的年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時間、排泄速率、聯(lián)合用藥、具體癥狀的嚴重程度和正施行的個體治療。本發(fā)明的活性劑和/或藥物組合物可按照每天1-10次，例如每天1或2次的治療方案給藥。
對于人類患者的口服和非胃腸給藥，活性劑的每日劑量水平可以是單次劑量或分成幾次劑量。
根據(jù)需要，活性劑可以以0.01-30mg/kg體重，例如0.1-10mg/kg，更優(yōu)選以0.1-1mg/kg體重的劑量給藥。自然，本文列舉的劑量是平均情況下的例子。因此，對于具體情況，當然可以接受更高或更低的劑量范圍。制劑活性劑可配制成藥物組合物，例如使用本領域已知的技術將其與一種或多種適合的載體、稀釋劑或賦形劑混合。
下面描述制劑的一些非限制性例子。制劑1用下列成分制備片劑重量/mg活性劑250微晶纖維素400
二氧化硅，霧化的10硬脂酸 5總計 665將各成分混合并壓制成每片重665mg的片劑。制劑2如下制備靜脈內(nèi)制劑活性劑100mg等滲鹽水1,000ml藥用活性劑鹽活性劑可以以可藥用鹽的形式給藥。通常，如果合適，可藥用鹽可容易地用所需的酸或堿來制備。鹽可以從溶液中沉淀出來，經(jīng)過濾收集或者可通過蒸發(fā)溶劑來回收。動物試驗模型可使用體內(nèi)模型來觀察和/或設計治療FSAD的療法或治療劑。可使用模型觀察各種工具/先導化合物對指示性喚起反應的各種參數(shù)的影響。這些試驗動物模型可用于本發(fā)明的分析中。動物試驗模型是非人的動物試驗模型。
現(xiàn)有許多可以使用的血管原性雌性性功能障礙(FSAD)的動物模型。
例如，已有記載侵入性動物模型的文獻(例如，參見Park et al.,1997)。這里，在正常和動脈粥樣硬化的雌性兔中，在骨盆神經(jīng)刺激后可直接記錄陰道和陰蒂的血液動力學反應。在正?；騀SAD動物中都可觀察cAMP增效劑的體內(nèi)效果。
例如，已有記載非侵入性動物模型的文獻(例如，參見Goldstein等人的綜述，1998；Laan等人，1998)。這里，脈沖多普勒超聲波檢查法用作檢測陰道和陰蒂動脈中血流變化的方法。該模型可用于觀察藥理學施用血管擴張劑期間的血管形成效果。
可使用的其它非侵入性技術包括陰道光電容積描記法，該方法提供了定量測量陰道粘膜充血的方法；以及陰道熱清除技術，該技術基于通過測量從保持于恒溫的陰道內(nèi)探針轉(zhuǎn)移走的熱量來記錄陰道血流變化的原理。性喚起動物模型在研究中，我們開發(fā)了一種穩(wěn)定再現(xiàn)的性喚起生理模型。該模型使用麻醉的兔并使用激光多普勒技術監(jiān)測生殖器的血流，同時常規(guī)性地記錄心血管參數(shù)。我們能夠測定由骨盆神經(jīng)刺激或者在有或沒有試驗物質(zhì)存在下輸注VIP引起的陰道(甚至陰蒂)血流的微小變化。
我們相信，我們的動物模型直接反映了臨床數(shù)據(jù)。因此，該模型可通過例如測量陰蒂或陰蒂血流的增加用于研究治療FSAD的候選活性劑。雌性性喚起的生理學測量依據(jù)本發(fā)明，可使用數(shù)種不同的技術測量陰蒂和陰道的血流。例如，可使用陰道光電容積描記法、陰道熱清除技術、陰蒂和陰道對比度反差增強MRI、陰蒂/外陰激光多普勒脈沖成像和陰蒂超聲波檢查法。
陰道潤滑定量還可以通過本領域已知的技術-例如(a)陰道塞在刺激前后的重量，和(b)測量陰道液體的pH值。對于后者，陰道的正常靜息酸性介質(zhì)變得更具有堿性，當在性喚起過程中發(fā)生液體滲出時，接近血壓的pH值。PDE(磷酸二酯酶)按照本發(fā)明，靶向物是PcAMP靶，該PcAMP靶是PDE(磷酸二酯酶)，該PDE是水解cAMP的PDE(并任選地水解cGMP)。
已知環(huán)核苷酸，例如cAMP和cGMP是重要的細胞內(nèi)第二信使。環(huán)核苷酸磷酸二酯酶-另外也稱為PDE-是催化環(huán)核苷酸降解的一類酶，因此它們是調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸濃度的細胞成分之一。
最近幾年，根據(jù)底物親和性和輔因子需求定義了至少七種PDE酶(例如PDEⅠ-PDEⅦ)以及這些酶的許多亞型(Beavo JA and Reifsnyder DH,TrendsPharmacol.Sci.11:150；Beavo J,In環(huán)核苷酸磷酸二酯酶結(jié)構、調(diào)節(jié)作用和藥物作用，Beavo J and Housley MD(Eds.).Wiley:Chihester,pp.3-15)。
PDE的實例包括PDEI，一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性PDE；PDEⅡ，一種cAMP和cGMP興奮的PDE；PDEⅢ，一種cGMP抑制的PDE；PDEⅣ，一種高親和性cAMP特異性PDE；和PDEⅤ，一種cGMP特異性PDE。PDEⅠ等有時也被稱為Ⅰ型PDE等或1型PDE等。
每種PDE可包含兩種或多種同工型(即，它們可以是兩種或多種PDE同功酶)。例如，在大鼠中，與果蠅Dunce基因同源的哺乳動物PDEⅣ(Chen CN etal,Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)83:9313)已知具有四種同工型(Swinnen JV et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)86:5325)。還已知人PDE也以同工型形式存在并具有剪接變體。例如，1990年報道了單核細胞中PDEⅣ的一種人同工型的克隆(Livi GP et al.,Mol.Ce...Bio.,10:2678)。再例如，其它研究者獨立克隆了PDEⅣ的三種剪接變體，它們是新命名的hPDEⅣ-B1、hPDEⅣ-B2和hPDEⅣ-B3。
有關環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的教導參見US-A-5932423和US-A-5932465。
有關其它環(huán)核苷酸磷酸二酯酶-即CN PCDE8的教導可參見WO-A-97/35989。根據(jù)WO-A-97/35989,CN PCDE8具有兩種同功酶，它們是新命名的CN PCDE8A和CN PCDE8B。在本領域中，術語“同功酶”有時也稱作“同工型”。
根據(jù)WO-A-97/35989的記載，已鑒別出多種不同PDE的抑制劑，一些正進行臨床評估。例如PDEⅢ抑制劑被開發(fā)為抗血栓形成劑、抗高血壓劑和用于治療充血性心衰的強心劑?？├仗m，一種PDEⅢ抑制劑，已被用于治療抑郁；其它PDEⅢ抑制劑正進行作為抗炎藥的評估?？├仗m還顯示出抑制脂多糖(LPS)誘導的α-TNF,α-TNF在體外顯示出增強HⅣ-1復制的作用。因此，咯利普蘭可抑制HⅣ-1復制(Angel et al1995 AIDS9:1137-44)。另外，根據(jù)其抑制α-TNF、β-TNF和γ-干擾素產(chǎn)生的能力，咯利普蘭在腦脊髓炎的治療中表現(xiàn)出有效性(多發(fā)性硬化的實驗動物模型(Sommer et al,1995NatMed1:244-248))并可有效治療遲發(fā)性運動障礙(Sasaki et al,1995Eur JPharmacol282:71-76)。
按照WO-A-97/35989，還描述了用于治療支氣管哮喘和其它呼吸疾病的非特異性PDE抑制劑，例如茶堿；以及用于間歇性跛行和糖尿病引發(fā)的其它外周血管疾病的己酮可可堿。據(jù)認為，在呼吸疾病的治療中，茶堿作用于呼吸道平滑肌以及具有抗炎或免疫調(diào)節(jié)能力(Banner et al 1995 Respir J8:996-1000)；并認為其中茶堿通過抑制CN PDE cAMP和cGMP的水解起作用(Banneret al1995 Mondaldi Arch Chest Dis50:286292)。已知阻斷α-TNF產(chǎn)生的己酮可可堿可抑制HⅣ-1復制(Angel et al supra)。Beavo1995 supra中列出了CN PDE抑制劑的名稱。
據(jù)認為，選擇性PDE抑制劑及其同功酶和亞型將產(chǎn)生更有效的治療作用，同時具有更少的副作用。例如，參見Wieshaar RE等人(J.Med.Chem.,28:537)、Giembycz MA(Biochem.Pharm.,43:2041)以及Lowe JA和Cheng JB(Drugs of the Future,17:799-807)的綜述。
因此，對于某些應用需要對一種類型的PDE具有選擇性抑制作用。
VictorA.Mckusich等人在http:∥www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關PDE的背景技術。下列有關PDE2或cGMP刺激的PDE的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“環(huán)核苷酸充當介導各種細胞對胞外信號，例如激素、光和神經(jīng)遞質(zhì)的反應的第二信使。環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)通過調(diào)節(jié)細胞中環(huán)核苷酸的濃度在信號轉(zhuǎn)導中起作用。哺乳動物細胞含有多種PDE，根據(jù)其底物親和性以及對輔因子和抑制藥物的選擇敏感性，它們可分為7個家族。這7個家族是(Ⅰ)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性PDE；(Ⅱ)cGMP興奮的PDE；(Ⅲ)cGMP抑制的PDE；(Ⅳ)cAMP特異性PDE；(Ⅴ)cGMP特異性PDE；(Ⅵ)光受體PDE；和(Ⅶ)高度親和的、cAMP特異性的PDE。從氨基酸序列可清楚地看出，所有這些家族的PDE都包含相關的區(qū)域，這些區(qū)域被認為是催化區(qū)域，在不同家族之間約有30％序列同一性。同家族成員之間關系更密切；在整個編碼區(qū)域，它們有60-80％的序列是相同的。
Michaeli等人(1993)建立了一種用于分離編碼cAMP磷酸二酯酶的cDNA的高度靈敏的功能篩選法，該方法通過補償同時缺乏內(nèi)源性cAMP PDE基因、PDE1和PDE2的Saccharomyces cerevisiae中的缺陷進行。采用該功能篩選法，從人成膠質(zhì)細胞瘤cDNA文庫中分離對應于3種編碼cAMP特異性PDE的人基因的三組cDNA。其中兩種基因與果蠅’dunce’cAMP特異性PDE有密切關系。第三種基因(Michaeli等人(1993)稱為HCP1)編碼一種新的cAMP特異性PDE。HCP1的氨基酸序列與所有環(huán)核苷酸PDE的催化區(qū)域的序列有關。但它是一種不具備cAMP特異性PDE家族的其它性質(zhì)的高親和性cAMP特異性PDE。HCP1的PDE活性對cGMP或者cGMP可抑制性PDE的其它抑制劑不敏感。HCP1的生物化學和藥理學性質(zhì)使Michaeli等人(1993)認為它是從前未發(fā)現(xiàn)的環(huán)核苷酸PDE家族中的一員，它們被命名為第Ⅶ家族。Northern印跡分析表明在人的骨骼肌中存在高水平的HCP1 RNA。
通過Southern印跡分析，Milatovich等人(1994)將HCP1定位于染色體8；通過對包含染色體8的不同區(qū)域的雜交體細胞的研究，他們將該基因進一步定位到8q13-q22。Han等人(1998)通過原位熒光雜交將PDE7A基因定位于8q13。通過種間回交分析，他們將小鼠Pde7A基因定位于染色體3的近端區(qū)。”Jennifer P.Macke等人在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關PDE2的背景技術。下列有關cGMP興奮的PDE2的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“Rosman等人(1997)克隆了相應于PDE2A的cDNA。PDE2A編碼預定分子量為106kD的941個氨基酸的多肽該蛋白質(zhì)序列與牛和大鼠的PDE2A序列有90％相同。Northern印跡分析表明在測試的所有人組織中，PDE2A以不同水平表達為4.2-kb mRNA，在大腦中的表達水平最高。表達研究揭示了PDE2A水解cAMP和cGMP，并被PDE2A特異性的抑制劑EHNA抑制。”文獻描述了PDE的核苷酸序列和氨基酸序列。本文提供的序列表中給出了其中的某些序列。
一方面，PDE靶向物選自下列的一種或多種PDE酶PDEcAMP1、PDEcAMP2、PDEcAMP3、PDEcAMP4、PDEcAMP7和PDEcAMP8。
PDE靶向物優(yōu)選自下列的一種或多種PDE酶PDEcAMP1、PDEcAMP2、PDEcAMP3和PDEcAMP4。
在本發(fā)明中，針對靶向物的PDE至少是PDE2。I:PDE如上面所示，活性劑可以是可用作I:PDE的任何活性劑。
I:PDE的實例公開于EP-A-091133和EP-A-0771799。
I:PDE優(yōu)選是I:PDE2。因此，優(yōu)選的化合物實例是EP-A-0771799中描述的那些。
為方便起見，現(xiàn)重述EP-A-0771799的權利要求1通式(Ⅰ)的嘌呤-6-酮衍生物及其互變異構體和鹽 其中R1表示氫或者包含至多8個碳原子的直鏈或支鏈烷基；R2表示包含至多4個碳原子的直鏈或支鏈?；?，或者包含至多8個碳原子的直鏈或支鏈烷基，所述烷基可任選地被羥基、疊氮基或者式-NR3R4或-OSO2R5的基團取代；其中R3和R4相同或不同，表示包含3-6個碳原子的環(huán)烷基、氫、甲酰基或包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，所述烷基可任選地被分別包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基或者烷氧羰基或者被式-(CO)a-NR6R7的基團取代，其中a是0或1的數(shù)；R6和R7相同或不同，表示氫、甲?；?、羥基、苯基或者包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，所述烷基可任選地被羥基或者包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基取代；或者R3和/或R4表示包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧羰基、羧基或者包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈?；?，所述?；扇芜x地被羥基或者包含至多4個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基取代；或者R3和/或R4表示式-(CO)b-T-NR8R9、-CO-R10、-SO2R11或-SO2NR12R13的殘基，其中b與上述a具有相同的含義并且與a相同或不同；T可表示包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者當b≠0時，它還可表示一個鍵；R8和R9與上述R6和R7具有相同含義并且與R6和R7相同或不同；R10表示包含至多3個選自S、N和/或O的雜原子的飽和的、部分不飽和的或不飽和的5-7元雜環(huán)，所述雜環(huán)在N官能團上可任選地被包含至多4個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烷氧基或烷氧羰基、羧基、芐氧羰基或羥基取代；R11表示包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基、芐基或苯基；R12和R13相同或不同，表示氫、苯基或者包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷基；或者R3和R4與氮原子一起形成5或6元的飽和的、部分飽和的或不飽和的雜環(huán)，該雜環(huán)可包含至多3個選自N、S和/或O的雜原子，或者-NR14殘基，其可任選地被羰基、包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷氧羰基或者包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基取代，所述烷基又可被羥基、羧基或者分別包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈?；?、烷氧基或烷氧羰基取代；其中R14表示氫、羰基或包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基或烷氧羰基；和R5表示苯基或者包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基；A表示分別包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈亞烷基或亞烯基鏈；D和L相同或不同，表示包含6-10個碳原子的芳基或者包含至多3個選自S、N和/或O的雜原子的5-7元芳香的、任選是苯并稠合的雜環(huán)，所述芳基或雜環(huán)可任選地被相同或不同的下列基團取代至多3次鹵素、羥基、硝基、三氟甲基、羧基、分別包含至多6個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烷氧基或烷氧羰基，或者被式-(Ⅴ)c-NR15R16和/或-OR17的基團取代；或者c是0或1的數(shù)；Ⅴ表示式-CO或-SO2的殘基；R15和R16相同或不同，具有上述R3和R4中給出的含義；R17表示氫、包含至多8個碳原子的直鏈或支鏈烯基或者包含至多8個碳原子的直鏈或支鏈烷基，所述烯基或烷基可任選地被相同或不同的下列基團取代至多3次羥基、羰基或包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷氧羰基；和/或可任選被含6-10個碳原子的芳基或者被含至多3個選自S、N和/或O的雜原子的5-7元芳香的、可任選是苯并稠合的雜環(huán)取代的環(huán)，所述芳基或雜環(huán)可任選地被相同或不同的下列基團取代至多兩次鹵素、羥基、硝基、羧基、三氟甲基或者分別包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基、烷氧基或烷氧羰基，或者帶有式(Ⅴ’)d-NR18R19的基團；其中d與上述a具有相同含義并且與a相同或不同；R18和R19與上述R3和R4具有相同含義并且與R3和R4相同或不同；Ⅴ’與上述Ⅴ具有相同含義并且與Ⅴ相同或不同；和/或表示下面D中給出的環(huán)系，該環(huán)系可任選地被包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈?；〈?，任選地被羥基、包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基或者被式-NR20R21基團取代；其中R20和R21相同或不同，與上述R3和R4具有相同含義；或者E表示式-CH2-Y-Z的殘基；其中Y表示一個鍵或者氧或硫原子或者-NH-基；Z表示包含至多5個碳原子的直鏈或支鏈烷基；
D表示下式的殘基 優(yōu)選的I:PDE選自下列結(jié)構式 NEP(中性內(nèi)肽酶)按照本發(fā)明的一方面，其它靶向物是另一種PcAMP靶，例如NEP。
編碼NEP的核苷酸序列和氨基酸序列在文獻中有記載。本文給出的序列表中列出了某些序列。
一方面，NEP是NEP(EC3.4.24.11)(也稱為腦啡肽酶或內(nèi)肽酶-2)。這里，我們發(fā)現(xiàn)了人和兔陰道中的NEP EC3.4.24.11 mRNA和表達蛋白質(zhì)。
這里，我們相信在包括患FSAD的那些女性中，VIP被NEP EC3.4.24.11降解。因此，NEP抑制劑將增強性喚起期間釋放的VIP的內(nèi)源性血管舒張作用。這可對FSAD產(chǎn)生治療作用，例如通過增加陰道充血。我們發(fā)現(xiàn)NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑增強由骨盆神經(jīng)刺激和VIP引起的生殖器的(如陰道的或陰蒂的)血流增加。此外，選擇性NEP抑制劑增強VIP和神經(jīng)介導的離體陰道壁的舒張。
Victor A.Mckusick等在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關NEP的背景技術。下列有關NEP的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“在人急性淋巴細胞性白血病(ALL)的診斷中，普通急性淋巴細胞性白血病抗原是一種重要細胞表面標記。它存在于前B表型的白血病細胞中，代表了85％的ALL狀況。CALLA不限于白血病細胞，發(fā)現(xiàn)它還存在于多種正常組織中。CALLA是一種在腎臟中含量尤其豐富的糖蛋白，它存在于腎臟的近端腎小管的刷狀緣和腎小球上皮中。Letarte等人(1988)克隆了編碼CALLA的cDNA，顯示出由cDNA序列得到的氨基酸序列與人的膜結(jié)合中性內(nèi)肽酶(NEP；EC3.4.24.11)、也被稱為腦啡肽酶相同。NEP在疏水性殘基的氨基一側(cè)分解肽并使數(shù)種肽激素失活，所述激素包括胰高血糖素、腦啡肽、P物質(zhì)、神經(jīng)降壓素、催產(chǎn)素和緩激肽。通過cDNA轉(zhuǎn)染測定，Shipp等人(1989)證實了CALLA是一類功能性中性內(nèi)肽酶，以前它們被稱為腦啡肽酶。Barker等人(1989)證實了編碼100-kD Ⅱ型跨膜糖蛋白的CALLA基因存在于大于45kb的單拷貝中，該大于45kb的單拷貝不在表達細胞表面CALLA的惡性腫瘤中重排。通過研究雜合體細胞使基因定位到人的染色體3上，通過原位雜交將其定位于3q21-q27。Tran-Paterson等人(1989)還通過用人-嚙齒類動物的雜合體細胞的DNA進行Southern印跡測定使基因定位于染色體3上。D’Adamio等人(1989)證實了CALLA基因跨度大于80kb并由24個外顯子組成。”I:NEP
如上所述，額外的試劑可以是任何可作為I:NEP起作用的適宜試劑。另外，或者作為可供替代的選擇，本發(fā)明的試劑也可用作I:NEP。
下面描述了鑒別和/或研究I:NEP的適宜分析系統(tǒng)的具體內(nèi)容。下面的綜述文章中討論了I:NEPPathol.Biol.,46(3),1998,191.Current Pharm.Design,2(5),1996,443.Biochem.Soc.Trans.,21(3),1993,678.Handbook Exp.Pharmacol.,104/1,1993,547.TiPS,11,1990,245.Pharmacol.Rev.,45(1),1993,87.Curr.Opin Inve.Drugs,2(11),1993,1175.Antihypertens.Drugs,(1997),113.Chemtracts,(1997),10(11),804.Zinc Metalloproteases Health Dis.(1996),105.Cardiovasc.Drug Rev.,(1996),14(2),166.Gen.Pharmacol.,(1996),27(4),581.Cardiovasc.Drug Rev.,(1994),12(4),271.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.,(1995),22(1),63.Cardiovasc.Drug Rev.,(1991),9(3),285.Exp.Opin.Ther.Patents(1996),6(11),1147.下列文獻中公開了I:NEP:EP-509442AUS-192435US-4929641EP-599444BUS-884664EP-544620AUS-798684J.Med.Chem.1993,3821.Circulation 1993,88(4),1．EP-136883JP-85136554US-4722810Curr.Pharm.Design,1996,2,443.EP-640594J.Med.Chem.1993,36(1),87.EP-738711-AJP-270957CAS#115406-23-0DE-19510566DE-19638020EP-830863JP-98101565EP-733642WO9614293JP-08245609JP-96245609WO9415908JP05092948WO-9309101WO-9109840EP-519738EP-690070J.Med.Chem.(1993),36,2420.JP-95157459Bioorg.Med.Chem.Letts.,1996,6(1),65.下列文獻中公開了優(yōu)選的I:NEP:EP-A-0274234JP-88165353Biochem.Biophys.Res.Comm.,1989,164,58.EP-629627-AUS-77978Perspect.Med.Chem.(1993),45.EP-358398-B
I:NEP的優(yōu)選實例選自下列結(jié)構式
更優(yōu)選的I:NEP選自下列結(jié)構式
更優(yōu)選的I:NEP選自下列結(jié)構式
按照實驗部分(在下的)所示的教導制備這些化合物。試驗這些化合物的活性，發(fā)現(xiàn)它們在增強cAMP中有用，因此用于治療FSAD。在實驗部分(在下的)給出了有關這些化合物的一些實驗數(shù)據(jù)。NEP分析由犬、大鼠、兔和人腎皮質(zhì)制備可溶性(NEP)中性內(nèi)肽酶制品及其分析。
由腎皮質(zhì)獲得可溶性NEP并通過測量分解NEP底物Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp生成其熒光產(chǎn)物Abz-D-Arg-Arg的速率測定其活性。實驗方法1、材料所有的水均是二次去離子水。1.1組織人腎臟IIAM(Pennsylvania.U.S.A.)大鼠腎臟兔腎臟犬腎臟1.2勻漿介質(zhì)100mM甘露醇和20mM Tris＠pH7.1室溫下，在1升水中稀釋2.42g Tris(Fisher T/P630/60)并在室溫用6M鹽酸將pH調(diào)至7.1。往其中加入18.22g甘露醇(Sigma M-9546)。1.3Tris緩沖液(NEP緩沖液)在950ml水中稀釋50ml 50mM的Tris pH7.4(Sigma T2663)。1.4底物(Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp)購自SNPE，將其以粉末形式貯存于-20℃下。通過將該底物輕輕地(不能進行渦旋或聲波處理)再懸浮于Tris緩沖液中制備2mM儲備液。將該2mM的儲備液分成每份600μl，在-20℃下可貯存長達一個月。(Medeiros,M.A.S.,Franca,M.S.F.et al.,(1997),Brazilian Journal of Medical andBiological Research,30,1157-1162)。1.5總產(chǎn)物將相應于100％底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的樣品加到培養(yǎng)板上以測定底物轉(zhuǎn)化的百分數(shù)。通過將1ml 2mM底物與20μl酶儲備液在37℃下保溫24小時形成總產(chǎn)物。1.6終止溶液用NEP緩沖液制備300μM Phosphoramidon(Sigma R7385)儲備液并將其以每份50μl貯存于-20℃下。1.7二甲基亞砜(DMSO)。1.8氯化鎂-MgCl2.6H2O(Fisher MO600/53)。1.9黑色96孔平底測定板(Costar3915)。1.10 Topseal A(Packard6005185)。1.11離心管2、特殊儀器2.1 Sorvall RC-5B離心機(SS34 GSA轉(zhuǎn)子，預冷卻到4℃)。2.2 Braun微型起動攪拌機。2.3 Beckman CS-6R離心機2.4 Fluostar galaxy.2.5 Wesbart1589振蕩保溫箱。3、方法3.1組織制品3.2采用Booth,A.G.&amp;Kenny,A.J.(1994)Biochem.J.142,575-581中的方法，由腎皮質(zhì)獲得犬、大鼠、兔和人的NEP。3.3在室溫下，使冷凍的腎臟融化并將髓質(zhì)與皮質(zhì)分開。3.4將皮質(zhì)切碎，并用Braun微型起動攪拌機(2.2)在約10倍體積的勻漿緩沖液(1.2)中勻漿。3.5將氯化鎂(1.8)(20.3mg/gm組織)加到該勻漿物中并在冰水浴中攪拌15分鐘。3.6在Becknan離心機(2.3)中，將勻漿物以1,500g(3,820rpm)離心12分鐘后，將上清液移至新的離心管中，棄去沉淀。3.7在Sovall離心機(2.1)中，將上清液以15,000g(12,100rpm)離心12分鐘，棄去上清液。3.8將殘留沉淀頂部的淺粉層取出并再懸浮于含氯化鎂的勻漿緩沖液中(對于1g組織，使用含9mg氯化鎂的5ml緩沖液)。3.9在Becknan離心機(2.3)中，將懸浮液以2,200g(4,630rpm)離心12分鐘后，棄去沉淀。3.10在Sovall離心機(2.1)中，將上清液以15,000g(12,100rpm)離心12分鐘，棄去上清液。3.11將最終的沉淀再懸浮于含氯化鎂的勻漿緩沖液中(對于1g組織，使用含0.9 mg氯化鎂的0.5ml緩沖液)。用Braun微型起動攪拌機(2.2)得到均勻的懸浮液。然后以每份100μl冷凍用以測定NEP活性。4.0 NEP活性測定通過其分解NEP特異性肽底物的能力測定預先等分的NEP的活性。4.1制備4％DMSO/NEP緩沖溶液(96ml NEP緩沖液中含4ml DMSO)。4.2使底物、總產(chǎn)物、酶和Phosphoramidon儲備液在冰上融化。4.3往每個孔中加入50μl 4％DMSO/NEP緩沖溶液。4.4以1∶40的比例稀釋2mM底物儲備液，制成50μM溶液。往每個孔中加入100μl 50μM的底物溶液(終濃度為25μM)。4.5加入50μl的系列酶稀釋液以引發(fā)反應(通常使用1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600和1∶3200的稀釋液)。往空白孔中加入50μl NEP緩沖液。4.6以1∶80的比例稀釋2mM總產(chǎn)物溶液，制成25μM溶液。將200μl 25μM的產(chǎn)物溶液加到一塊新測定板的前四個孔中。4.7將測定板在37℃下在振蕩保溫箱中保溫60分鐘。4.8以1∶100的比例將300μM的Phosphoramidon儲備液稀釋至300nM。通過加入100μl 300nM Phosphoramidon溶液并于37℃下在振蕩保溫箱中保溫20分鐘，使反應終止后，在Fluostar(ex320/em420)上讀取數(shù)據(jù)。5、NEP抑制測定5.1使底物、總產(chǎn)物、酶和Phosphoramidon儲備液在冰上融化。5.2用100％DMSO制備化合物儲備液并以1∶25的比例在NEP緩沖液中稀釋得到4％DMSO溶液。所有進一步的稀釋都在4％DMSO溶液(96ml NEP緩沖液中含4ml DMSO)中進行。5.3將50μl化合物一式兩份地加到96孔培養(yǎng)板中，將50μl 4％DMSO/NEP緩沖液加到對照和空白孔中。5.4以1∶40的比例在NEP緩沖液中稀釋2mM底物儲備液，制成50μM溶液(275<p>表2
文獻已描述了NPY及其受體的核苷酸序列和氨基酸序列。本文提供的序列表中給出了其中的某些序列。
現(xiàn)在，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽Y(NPY)對血管活性腸肽(VIP)介導的血管舒張具有抑制性調(diào)節(jié)影響作用。因此，NPY受體的抑制作用將促進骨盆神經(jīng)和VIP介導的生殖器(如陰道或陰蒂)血流的增加。在臨床上這將增強陰道和/或陰蒂充血，最終通過血漿滲出和提高陰道的順應性而增強潤滑作用。因此，用于治療FSAD的適合靶向物是NPY或其相關受體中的一種。
因此，另一種藥劑優(yōu)選NPY Y1Y2或Y5拮抗劑，優(yōu)選是一種口服的NPY Y1Y2或Y5拮抗劑。該藥劑將通過增加生殖器(如陰道或陰蒂)血流并增強潤滑作用來治療FSAD。
NPY介導的對VIP引發(fā)的血流增加的拮抗作用代表了可通過其影響雌性生殖道血流的一種潛在治療靶。由此產(chǎn)生拮抗作用的機理最可能是通過NPY Y1受體引發(fā)的Gi/o活化。在另一種生理系統(tǒng)中，NPY Y1受體參與介導血管收縮和抑制交感神經(jīng)遞質(zhì)釋放(Lundberg et al.,1996；不能排除NPY Y2的影響)。我們相信在雌性生殖道中NPY通過直接抑制腺苷酸環(huán)化酶抑制血管舒張，所述腺苷酸環(huán)化酶直接抑制VIP釋放或交感神經(jīng)的神經(jīng)傳遞。
如上所示，另一種PcAMP靶是NPY受體中的一種。
神經(jīng)元的NPY釋放調(diào)節(jié)VIP引起的陰道血管床的血管舒張。該調(diào)節(jié)作用最可能是通過涉及與NPY Y1受體有關的突觸前機制產(chǎn)生，雖然也不排除突觸后作用方式。NPY拮抗劑將增強VIP引發(fā)的陰道血管床的血管擴張作用。臨床上，該作用將通過陰道壁充血增強陰道的潤滑作用以及順應性。
我們進行的NPY受體表達研究鑒定出了人陰道中的NPY Y1Y2和Y5受體亞型。
因此，另一種PcAMP靶是NPY Y1Y2和Y5受體亞型中的一種或多種。
Victor A.Mckusick等人在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關NPY及其相關受體的背景技術。下列有關NPY的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“神經(jīng)肽Y(NPY)是一種富含于和廣泛分布在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中的肽。其顯示，與肽YY同源，并且其氨基酸序列和核苷酸序列與胰腺多肽(PNP；167780)同源率超過50％。NPY是一種36氨基酸的肽。Minth等人(1984)從嗜鉻細胞瘤的mRNA開始克隆了NPY基因。Takeuchi等人(1985、1986)分別從嗜鉻細胞瘤和胰腺內(nèi)分泌腫瘤分離出了NPY和PNP基因的cDNA克隆。使用這些cDNA探針分析人-小鼠雜交體細胞染色體排布板的基因組DNA，然后檢測基因是否是同線的。研究顯示不是同線的，在7pter-7q22上帶有NPY，在17p11.1-17qter上帶有PNP。通過用Mus spretus進行回交研究，Bahary等人(1991)將同源NPY基因定位于小鼠染色體6。由于小鼠染色體6與人7q同源，因此人的NPY基因有可能定位于7cen-q22區(qū)域。Meisler等人(1987)排除了囊纖維變性位點(219700)與神經(jīng)肽Y之間存在緊密連鎖關系。Terenghi等人(1987)采用原位雜交技術測定了在外科活檢樣品和死后的大腦中，大腦皮層神經(jīng)元中編碼NPY的mRNA的分布。該研究顯示了在正常成熟皮層神經(jīng)元中NPY基因轉(zhuǎn)錄和表達的定位的一致性。Baker等人(1995)通過熒光原位雜交表明NPY基因定位于7p15.1并以單拷貝形式存在。他們評論說NPY是已知的保守程度最高的肽之一，例如在人和鯊魚之間僅有3個氨基酸的差異。神經(jīng)肽Y是一種與能量平衡控制有關的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，在ob/ob小鼠的下丘腦中被過度生產(chǎn)。為確定NPY在對leptin(164160)缺乏的響應中的作用，Erickson等人(1996)生產(chǎn)了NPY缺乏的ob/ob小鼠。在不存在NPY的情況下，ob/ob小鼠由于減少了食物攝入和增加了能量消耗，不太肥胖，因此不易患糖尿病、不孕和促生長不足。這些結(jié)果可解釋為NPY是leptin缺乏癥的中央效能器。乙醇偏好性選擇性繁殖的大鼠的遺傳連鎖測定鑒定了包括NPY基因的染色體區(qū)域(Carr等人，1998)。與非乙醇偏好性的大鼠相比，乙醇偏好性的大鼠在數(shù)個大腦區(qū)域中的NPY水平較低。Thiele等人(1998)研究了因定向基因破壞而完全缺乏NPY的小鼠的乙醇消耗(Erichson等人，1996)。他們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，NPY缺乏的小鼠消耗含有6％、10％和20％(體積)的乙醇溶液的量較高。它們由乙醇引發(fā)的睡眠更為快速蘇醒，由此可以看出，NPY缺乏的小鼠對乙醇的鎮(zhèn)靜/催眠作用也不太敏感，雖然其血漿乙醇濃度與對照相比也沒有明顯的差異。相反，與對照相比，在通常表達NPY的神經(jīng)元中過度表達標記的NPY基因的轉(zhuǎn)基因小鼠對乙醇的喜愛性較差，同時對乙醇的鎮(zhèn)靜/催眠作用更敏感。這些數(shù)據(jù)給出了乙醇的消耗量和耐受性與大腦中的NPY水平成反比的直接證據(jù)。作為正在進行的肥胖基因基礎研究的一部分，Karvonen等人(1998)鑒別了一種1128T-C多態(tài)性，其中脯氨酸置換前原NPY的信號肽部分第7位殘基上的亮氨酸。該多態(tài)性與肥胖或能量代謝無關，但在正常體重的和肥胖的芬蘭人以及肥胖的荷蘭人中，該多態(tài)性與高血清總膽固醇水平和LDL膽固醇水平明顯有關并與它們具有一致性。Uusitupa等人(1998)發(fā)現(xiàn)14％的芬蘭人具有7位脯氨酸多態(tài)性，但該多態(tài)性在荷蘭人僅占6％。在NPY中7位是脯氨酸的人與不具有該基因變異的人相比，血清總膽固醇水平平均高出0.6-1.4mmol/L。在正常體重的荷蘭人中沒有發(fā)現(xiàn)pro7NPY對血清總膽固醇水平的影響，因此可以設想肥胖的人可能更易受該基因變異的影響。通過計算，在血清總膽固醇水平等于或高于8mmol/L的肥胖者中具有pro7NPY的可能性可能高達50-60％。至少是在芬蘭人中，pro7NPY是影響血清膽固醇水平的最強的遺傳因素之一。還可參見Allen和Bloom(1986)；Dockray(1986)；Maccarrone和Jarrott(1986)；Minth等人(1986)。”Victor A.Mckusick等人在上述網(wǎng)站上發(fā)表了有關NPY及其相關受體的背景技術。下列有關NPYRl的材料節(jié)選于該網(wǎng)站。
“神經(jīng)肽Y(NPY；162640)是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)肽之一，它表現(xiàn)出多種不同的重要生理活性，包括對精神運動活性、食物攝取、中樞內(nèi)分泌物分泌的調(diào)節(jié)作用和對心血管系統(tǒng)的有力血管活性作用。采用藥理學標準，已定義了兩種主要的NPY亞型(Y1和Y2)。NPY Y1受體已在不同的組織中鑒定到，例如腦、脾臟、小腸、腎臟、睪丸、胎盤和主動脈平滑肌中。Y2受體主要發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Herzog等人(1992)報道了編碼人NPY受體的cDNA的克隆，他們證實了人NPY受體是G蛋白偶聯(lián)的受體大家族中的一員。當在中國倉鼠卵巢(CHO)或人胚腎細胞中表達時，該受體表現(xiàn)出特征性配體特異性。在腎細胞系中，該受體與介導對環(huán)AMP累積的抑制作用的百日咳毒素敏感的G蛋白偶聯(lián)。另一方面，在CHO細胞系中，該受體不與腺苷酸環(huán)化酶的抑制偶聯(lián)，而是與細胞內(nèi)鈣的增加偶聯(lián)。因此，根據(jù)不同類型細胞中存在的特異性G蛋白和效能器系統(tǒng)，NPY受體的第二信使偶聯(lián)是細胞類型特異性的。Larhammar等人(1992)獨立地克隆和表征了神經(jīng)肽Y受體。Herzog等人(1993)確定了人NPY Y1受體基因的分子組織和調(diào)控。與大多數(shù)G蛋白偶聯(lián)的受體基因的毗連結(jié)構形成對照，他們發(fā)現(xiàn)NPY Y1受體基因具有3個外顯子。他們在該基因的第一個內(nèi)含子中還鑒定出共同的Pstl多態(tài)性。通過高分辨的熒光原位雜交技術，他們將該基因定位于4q31.3-q32。Herzog等人(1997)發(fā)現(xiàn)NPY1R和NPY5R(602001)基因共同定位于染色體4q31-q32上。這兩種基因以相反方向從共同的啟動子區(qū)域開始轉(zhuǎn)錄。Y1受體基因其它方式剪接的5’外顯子是Y5受體的編碼序列的一部分。Herzog等人(1997)通過這種非常規(guī)排列推測，這兩種基因是通過基因復制事件產(chǎn)生的，它們可協(xié)同表達。通過種間回交，Lutz等人(1997)分別將Npylr和Npy2r基因定位到小鼠染色體8和3的保守連鎖群上，所述連鎖群相應于人染色體4q的遠端區(qū)?！盫ictor A.Mckusick等人在上述網(wǎng)站上發(fā)表了有關NPY及其相關受體的背景技術。下列有關NPYR2的材料節(jié)選于該網(wǎng)站。
“神經(jīng)肽Y(NPY)通過存在于大腦和交感神經(jīng)神經(jīng)元的G蛋白結(jié)合的受體傳送信號。根據(jù)藥理學標準、組織分布和編碼基因的結(jié)構，已明確了至少3類神經(jīng)肽Y受體；參見162641和162643。Rose等人(1995)報道了編碼人2型受體NPY2R的cDNA在COS細胞中的克隆表達。已轉(zhuǎn)染的細胞對NPY(162640)、肽YY(PYY；600781)和包括13-36位氨基酸的NPY片斷顯示出高親和性。預計的381-氨基酸蛋白質(zhì)具有7個跨膜區(qū)，其具有G蛋白偶聯(lián)受體的特性，并且與人Y1受體(NPY1R；162641)僅31％相同。通過對取自不同區(qū)域的神經(jīng)系統(tǒng)的組織樣品進行Northern印跡分析檢測到4-kb mRNA。Gerald等人(1995)使用放射標記的PYY-結(jié)合測定從人海馬cDNA表達文庫克隆了相應于人Y2受體的cDNA。他們在COS-7細胞中表達了Y2基因并進行了激素結(jié)合測定，該測定表明Y2受體結(jié)合(親和性從最高到最低)PYY、NPY和胰腺多肽(PP；167780)激素。Ammar等人(1996)克隆并表征了編碼2型NPY受體的人基因。轉(zhuǎn)錄物跨越9kb基因組序列，并以2個外顯子形式被編碼。同1型NPY受體基因中一樣，NPY2R的5-引物未翻譯區(qū)被4.5-kb間插序列間隔。Ammar等人(1996)通過嚙齒類動物-人雜交細胞的Southern分析及隨后的熒光原位雜交(FISH)證實，NPY2R基因定位在4q31上(包含NPYlR基因的相同區(qū)域)，認為這些亞型雖然結(jié)構不同，但可能是通過基因復制產(chǎn)生的。通過種間回交分析，Lutz等人(1997)分別將Npy1r和Npy2r基因定位到小鼠染色體8和3的保守連鎖群上，所述連鎖群相應于人染色體4q的遠端區(qū)。”
測定有爭議的或?qū)嶋H的活性劑是否能夠與NPY結(jié)合的方法記載于WO-A-98/52890中(參見其96頁第2-28行)。I:NPY如上所示，其它活性劑可以是能用作I:NPY(有時稱為NPY拮抗劑)的任何適宜活性劑。另外，或者可供選擇的替代，本發(fā)明的活性劑也可用作I:NPY。
下列綜述中討論了I:NPY(尤其是NPY拮抗劑)Dunlop J,Rosenzweig-Lipson S肥胖的治療方法，Exp Opin Ther Pat 19998 12 1683-1694Wang S,Ferguson KC,Burris TP,Dhurandhar NV第8屆肥胖和非胰島素依賴性糖尿病國際年會新藥開發(fā)，Exp Opin Invest Drugs 1999 8 7 1117-1125Ling AL神經(jīng)肽Y受體拮抗劑，Exp Opin Ther Pat 1999 9 4 375-384Adham N,Tamm J,Du P,Hou C等人拮抗劑SNAP6608與Y5受體結(jié)合中有關殘基的鑒定，Soc Neurosci Abstr 1998 24 Part2 626.9Shu YZ,Cutrone JQ,Klohr SE,Huang S:BMS-192548，一種從黑曲霉WB2346得到的神經(jīng)肽Y受體的四環(huán)類結(jié)合抑制劑。Ⅱ．物理化學性質(zhì)和結(jié)構鑒別，JAntibiot1995 48 10 1060-1065Rigollier P,Rueger H,Whitebread S,Yamaguchi Y,Chiesi M,SchillingW,Criscione L:CGP 71683A，一種神經(jīng)肽Y Y5受體的有效和選擇性拮抗劑的合成和SAR,Int Symp Med Chem 1998 15th Edinburgh 239Criscione L,Rigollier P,Batzl-Hartmann C,Rueger H,Stricker-Krongrad A等人神經(jīng)肽Y5受體介導的自由禁食和能量被剝奪的瘦型鼠的食物攝取，J Clin Invest1998 102 12 2136-2145Neurogen Corp:NGD95-1 Clin Trials Monitor 1996 5 10 Ab 19244Buttle LA減肥藥物定位大超市銷售，Exp Opin Invest Drugs 1996 5 121583-1587Gehlert DR,Hipskind PA肥胖中的神經(jīng)肽Y受體拮抗劑，Exp Opin InvestDrugs1996 7 9 1827-1838Goldstein DJ,Trautman ME肥胖癥的治療，Emerging Durgs 1997 2-1-27Hipskind P A,Lobb K L,Nixon J A,Britton T C,Bruns RT,Caltlow J,Dieckman Mcginty D K,Gachenheimer S L,Gitter B D,Lyengar S,SchoberD A等人NPY Y-1的有效和選擇性拮抗劑1,2,3-三取代的吲哚，J Med Chem1997 40 3712-3714Zimmerman DM,Cantrall BE,Smith ECR,Nixon JA,Bruns RF,Gitter B,Hipskind PA,Ornstein PL,Zarrinmayeh H,Britton TC,Schober DA,Gehlert DR系列1-取代的-4-甲基苯并咪唑神經(jīng)肽Y-1受體拮抗劑的結(jié)構-活性關系，Bioorganic Med Chem Lett 1998 8 5 473-476Zarrinmayeh H,Nunes A,Ornstein P,Zimmerman D,Arnold MB等人作為選擇性神經(jīng)肽Y Y1受體拮抗劑新的2-[(4-氯苯氧基)甲基]苯并咪唑系列化合物的合成和評價，J Med Chem 1998 41 15 2709-2719Britton TC,Spinazze PG,Hipskind PA,Zimmerman DM,Zarrinmayeh H,Schober DA,Gehlert DR,Bruns RG系列苯并噻吩衍生的NPY-Y1拮抗劑的結(jié)構-活性關系C2側(cè)鏈的最優(yōu)化，Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 3475-480Zarrinmayeh H,Zimmerman DM,Cantrell BE,Schober DA,Bruns RF,Gachenheimer SL,Ornstein PL,Hipskind PA,Britton TC,Gehlert DR作為神經(jīng)肽Y Y1受體拮抗劑的一系列二氨基烷基取代的苯并咪唑的結(jié)構-活性關系，Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 5 647-652Murakami Y,Hara H,Okada T,Hashizume H,Kii M,Ishikawa M,MiharaS-1,Kato G,Hanasaki K,Hagishita S,Fujimoto M作為新的有效的選擇性神經(jīng)肽Y Y1受體拮抗劑的1,3-二取代的苯并吖庚因，J Med Chem 1999 4214 2621-2632Rudolf K,Eberiein W,Engel W,Wieland HA,Willim KD,Entzeroth M,Wienen W,Beck Sickinger AG,Doods HN第一種高效選擇性非肽類神經(jīng)肽YY1受體拮抗劑BIBP3226,Eur J Pharmacol1994 271 2-3 R11-R13Wieland HA,Willim KD,Entzeroth M,Wienen W,Rudolf K,Eberlein W,Engel W,Doods HN非肽類神經(jīng)肽Y1受體拮抗劑BIBP 3226的亞型選擇性和拮抗劑特性，J Pharmacol Exp Ther 1995 275 1 143=149Wright J,Bolton G,Creswell M,Downing D,Georgic L,Heffner T,HodgesJ,MacKenzie R,Wise L:8-氨基-6-(芳基磺?；?-5-硝基喹諾酮類新的非肽類神經(jīng)肽Y1受體拮抗劑，Bioorganic Med Chem Lett 1996 6 15 1809-1814Capurro D,Huidobro-Toro JP神經(jīng)肽Y Yl受體在血壓壓力反射中的關系用BIBP3226和BIB3304進行的研究，Eur J Pharmacol1999 376 3 251-255Dumont Y,Cadieux A,Doods H,Quirion R研究中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)肽Y受體的新工具BIBO-3304(Y1),BIIE-246(Y2)和[125I]-GR-231118(Y1/Y4),Soc Neurosci Abstr 1999 25 Part1 Abs 74.11Hegde SS,Bonhaus DW,Stanley W,Eglen RM,Moy TM,Loeb M等人1229U91，一種高親和性和選擇性的神經(jīng)肽Y(NPY)-Y1受體拮抗劑的藥理學評價，Pharmacol Res1995 31 190Matthews JE,Chance WT,Grizzle MK,Heyer D,Daniels AJ用GI264879A,一種NPY-Y1受體處理的大鼠的食物攝取抑制和體重減輕，Soc Neurosci Abstr1997 23 Pt 2 1346Doods HN,Willim K-D,Smith SJ:BIBP 3226一種選擇性高效NPY-Y1拮抗劑，Proc Br Pharmacol Soc 1994 13-16 Dec.C47Rudolf K,Eberlein W,Engel W,Wieland HA,Willim KD,Entzeroth M,Wienen W,Beck Sickinger AG,Doods HN第一種高效選擇性非肽類神經(jīng)肽YY1受體拮抗劑BIBP3226,Eur J Pharmacol1994 271 2-3 R11-R13Serradelil-Le-Gal C,Valette G,Rouby PE,Pellet A,Villanova G,Foulon L,Lespy L,Neliat G,Chambon JP,Maffrand JP,Le-Fur G:SR120107A和SR 120918A兩種有效的選擇性的口服有效的NPY Y1受體拮抗劑，Soc Neurosci Abstr1994 20 Pt1 907-Abs 376.14Hong Y,Gregor V,Ling AL,Tompkins EV,Porter J,Chou TS Paderes G,Peng Z,Hagaman C.Anderes K,Luthin D,May J作為有效NPY Y2受體拮抗劑的新的脒基脲化合物的合成和生物學評價，Acs1999 217 Anaheim MEDI108下列文獻中公開了I:NPY(尤其是NPY拮抗劑)
WO-98/07420WO-94/00486WO-96/22305WO-97/20821WO-97/20822WO-96/14307JP-07267988WO-96/12489US-5552422WO-98/35957WO-96/14307WO-94/17035EP-0614911WO-98/40356EP-0448765EP-0747356WO-98/35941WO-97/46250EP-0747357I:NPY的優(yōu)選實例選自下列結(jié)構式。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)這些化合物在增強cAMP中有用，由此可用于治療FSAD。在下面的實驗部分給出了有關這些化合物的一些實驗數(shù)據(jù)。
VIP(血管活性腸肽)依據(jù)本發(fā)明，另一種靶向物是PcAMP靶，該PcAMP靶是VIP或其相關受體之一。目前的分類和命名稱它們?yōu)閂PAC1、VPAC2和PACAP。
VIP及其受體的核苷酸序列和氨基酸序列可從文獻查閱到。本文提供的序列表中給出了其中的一些序列。
我們知道VPAC1和VPAC2存在于人和兔的陰道中。PACAP既不存在于兔的陰道中，也不存在于人的陰道中。
VIP是在性喚起期間釋放的一種主要內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，它負責神經(jīng)誘發(fā)的位于陰道壁血管床的陰道血管舒張。腺苷酸環(huán)化酶活化和cAMP的產(chǎn)生介導了這種血管舒張作用。不希望受到理論的局限，這種作用可能是通過VIP受體亞型VPAC1、VPAC2或PACAP(腦垂體腺苷酸環(huán)化酶活化的肽)受體介導的。VPAC2和PACAP受體可最廣泛地在CNS中表達，盡管這兩種受體也在腦垂體中表達，但它們未表現(xiàn)出廣泛的生物學功能。
本發(fā)明的活性劑可增強VIP和/或用作VIP模擬物或類似物。因此所述活性劑將增強和/或模擬性喚起期間釋放的內(nèi)源性VIP的血管舒張作用。所述活性劑對VIP引發(fā)的陰道平滑肌舒張作用還具有加合作用。在臨床上，這可用于FSAD的治療，并且還通過陰道壁充血和順應性增強陰道的潤滑作用。在該實施方案中，無論怎樣，模擬物或類似物都不具有上面討論的VIP的有害性質(zhì)。
Victor A.Mckusick等人在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關VIP及其相關受體的背景技術。下列有關VIP的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“血管活性腸肽(VIP)，一種最初從豬十二指腸分離的28氨基酸肽，它不僅存在于胃腸組織中，還存在于神經(jīng)組織中(可能是一種神經(jīng)遞質(zhì))，并表現(xiàn)出多種不同的生物學作用。由于VIP與胰高血糖素、促胰液素和腸抑胃肽(GIP)表現(xiàn)出相似性，因此認為VIP是胰高血糖素-促胰液素家族中的一員。編碼VIP的mRNA的初級翻譯產(chǎn)物(前VIP原)的分子量為20道爾頓。通過克隆與編碼人VIP的mRNA互補的DNA序列，Itoh等人(1983)發(fā)現(xiàn)VIP前體不僅包含VIP，還包含一種新的27氨基酸肽(被命名為PHM27)，其具有組氨酸氨基端和甲硫氨酸羧基端。PHM27有2個氨基酸與從豬小腸中分離的PHI17不同；正如其命名中所示，PHI27具有異亮氨酸羧基端。Linder等人(1987)分離了編碼VIP和PHM27的人基因并研究了其在大鼠的各種組織中的表達。Heinz-Erian等人(1985)認為使用VIP神經(jīng)肽對囊性纖維化患者的汗腺進行缺陷性革新可能是減少表皮水含量和降低表皮對氯離子和其它離子的相對不滲透性(刻畫了囊性纖維化的特征)的基本機制。為驗證這種假設，Gozes等人(1987)實施了“候選基因”方案。Bonder等人(1985)通過實驗表明VIP和PHM-27通過相鄰的外顯子被編碼。Gozes等人(1987)用PHM-27編碼的基因組片斷來測定VIP基因存在于6q21-qter。因此，他們消除了可能構成囊性纖維化主要原因的缺陷性VIP基因(它由染色體7編碼)。通過原位雜交技術，Gozes等人(1987)將VIP基因定位于6q24。這將VIP放入了MYB(189990)區(qū)域，它被定位于6q22。Gozes等人(1987)研究了神經(jīng)元組織中這2種基因之間的功能關系。他們觀察到3日齡大鼠的海馬中MYB mRNA的尖峰，該峰早于存在于8日齡大鼠海馬中的VIPmRNA峰。Omary和Kagnoff(1987)在人結(jié)腸腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了VIP的核受體。Gotoh等人(1988)將所述基因的分子克隆片斷通過點印跡雜交法定位到分類染色體上，使VIP定位于染色體6上。通過原位雜交可準確定位于6q26-q27?！盫ictor A.Mckusick等人在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關VIP及其相關受體的背景技術。下列有關VIPR1或VPAC1的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“血管活性腸肽(VIP；192320)是一種主要發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和分布于不同組織中的外周肽能神經(jīng)元中的octacosameric神經(jīng)內(nèi)分泌介質(zhì)。在許多具有免疫學功能的神經(jīng)內(nèi)分泌肽中，VIP以其具有直接影響B(tài)細胞和T細胞的能力而著名。神經(jīng)、呼吸道、胃腸道和免疫細胞的不同亞群帶有特異性的高親和性VIP受體，所述受體與能活化腺苷酸環(huán)化酶的鳥嘌呤核苷酸-結(jié)合(G)蛋白結(jié)合。Libert等人(1991)通過選擇性擴增和由甲狀腺cDNA克隆獲得了G蛋白偶聯(lián)受體家族的4種新受體。Sreedharan等人(1991)鑒定出這4種受體之一是VIP受體(稱為RDC1)。Libert等人(1991)通過原位雜交將VIPR基因定位于2q37。后來的報道對定位于2q37的基因是否確實是VIP受體基因產(chǎn)生了質(zhì)疑(Vassart,1992)。Wenger(1993)發(fā)現(xiàn)，Sreendharan等人(1991)命名為GPRN1并定位于2q37的該序列不與VIP結(jié)合。Sreedharan等人(1995)分離出真正的Ⅰ型VIP受體基因并通過熒光原位雜交將其定位于小細胞肺癌有關區(qū)域中的3p22帶。通過種間回交分析，Hashimoto等人(1999)將小鼠Vipr1基因定位于染色體9的遠端區(qū)，該區(qū)與人染色體3p表現(xiàn)出同線同源性。Sreedharan等人(1993)克隆了人小腸VIP受體基因；該推論的氨基酸序列與大鼠肺VIP受體基因84％相同。Couvineau等人(1994)從人空腸上皮細胞cDNA文庫分離了2種VIPR cDNA克隆。一種cDNA編碼由460個氨基酸組成的并具有7個跨膜區(qū)域的VIP受體(與其它G蛋白偶聯(lián)受體一樣)。另一種cDNA編碼495個氨基酸的VIP受體相關蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與功能性VIP受體在C-末端的428個氨基酸具有100％同源性，但它的N-末端包含完全不同的67個氨基酸。當在COS-7細胞中表達時，第二種蛋白質(zhì)不與放射性碘標記的VIP結(jié)合，盡管按照免疫熒光研究，該種蛋白質(zhì)一般存在于質(zhì)膜中。Sreedharan等人(1995)發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型VIP受體(也稱為Ⅱ型PACAP受體(參見另一類PACAP受體的102981))跨度約22kb并且包括13個外顯子(從42-1400bp)和12個內(nèi)含子(從0.3-6.1kb)。Sreedharab等人(1995)還描繪了該基因的啟動子和5-引發(fā)側(cè)旁區(qū)域的性質(zhì)?！盫ictor A.Mckusick等人在上述網(wǎng)站上發(fā)表了有關VIP及其相關受體的背景技術。下列有關VIPR2或VPAC2的信息節(jié)選于該網(wǎng)站。
“血管活性腸肽(VIP；192320)和腦垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽(PACAP；102980)是同源性肽，它們行使神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌激素的功能。雖然VIP和PACAP的受體具有同源性，但它們在其底物特異性和表達模式上存在差別。參見VIPR1(192321)和ADCYAP1R1(102981)。Svoboda等人(1994)使用基于VIP受體中保守序列的引物進行了低嚴格性PCR。他們從淋巴母細胞cDNA文庫克隆了人VIP2受體基因。該基因編碼一種438個氨基酸的多肽，該多肽與大鼠VIP2受體86％相同。他們在中國倉鼠卵巢細胞中表達了人VIP2受體，發(fā)現(xiàn)該受體與PACAP-38、PACAP-27、VIP和helodermin結(jié)合，并且該受體與這些肽中任一項的種結(jié)合都激活腺苷酸環(huán)化酶。還發(fā)現(xiàn)肽結(jié)合被GTP抑制。Adamou等人(1995)從人胎盤cDNA文庫克隆了VIP2受體基因。Northern印跡揭示VIPR2以4.6kb和2.3kb的2種轉(zhuǎn)錄物形式在骨骼肌中被高水平表達，在心臟、大腦、胎盤和胰腺中被低水平表達。Mackay等人(1996)使用熒光原位雜交將VIPR2基因定位于人染色體7q36.3。使用由3型前腦無裂畸形(HPE3；142945)患者得到的細胞系的進一步定位揭示了VIPR2基因位于HPE3的窄小的決定性區(qū)域內(nèi)。Mackay等人(1996)認為盡管VIPR2可能與HPE3表型有關，但它不是唯一起作用的因素?！盇C(腺苷酸環(huán)化酶)根據(jù)本發(fā)明的另一方面，另一種靶向物是PcAMP靶，該PcCAMP靶是AC。
AC的核苷酸序列和氨基酸可從文獻中查閱到。
為證實VIP通過升高胞內(nèi)cAMP水平及隨后活化腺苷酸環(huán)化酶而誘導血管舒張，我們測定了VIP刺激期間陰道cAMP濃度，并使用毛喉素(一種腺苷酸環(huán)化酶活化劑)以模擬活化cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑的效果。
在這些研究中，我們發(fā)現(xiàn)VIP處理和毛喉素處理增高了離體陰道組織中的胞內(nèi)cAMP水平。
我們還發(fā)現(xiàn)在性喚起動物模型中，毛喉素增加了陰道血流。
另外，我們發(fā)現(xiàn)毛喉素引發(fā)了離體陰道的舒張。
Victor A.Mckusick等人在http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上發(fā)表了有關AC的背景技術。下列有關AC的內(nèi)容節(jié)選于該網(wǎng)站。
“腺苷酸環(huán)化酶(EC4.6.1.1)催化ATP向環(huán)AMP的轉(zhuǎn)化。該酶的活性受到數(shù)種激素的調(diào)節(jié)，不同的多肽參與信號從受體向催化部分的轉(zhuǎn)導。興奮性或抑制性受體(Rs和Ri)與表現(xiàn)GTP酶活性的G蛋白(Gs和Gi)相互作用，他們調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的催化亞單位的活性。Parma等人(1991)克隆了相應于人大腦腺苷酸環(huán)化酶的cDNA(以HBAC1符號表示)。通過使用人大腦cDNA探針原位雜交到中期染色體片上，Stengel等人(1992)顯示出該基因位于8q24.2。通過同樣的方法，發(fā)現(xiàn)高度同源性基因ADCY2(103071)定位于5p15.3?！蓖ㄓ弥亟MDNA操作技術盡管本文提及的技術一般都是本領域所熟知的，仍可參考尤其是Sambrook等人的《分子克隆-實驗室手冊》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)(1989)和Ausubel等人的《分析生物學精選方案》(Short Protocols inMolecular Biology)(1999)，第4版，John Wiley&amp;Sons,Inc。PCR記述于US-A-4683195、US-A-4800195和US-A-4965188。
總之，本發(fā)明涉及I:PDE在治療FSD、特別是FSAD中的應用。實施例下面將參照以下附圖對本發(fā)明進行描述，這些描述僅僅是舉例性的

圖1是骨盆神經(jīng)刺激和血流之間的生殖器血流-頻率反應的關系的圖表；圖2是VIP對陰道血流的影響的圖表；圖3是VIP、NEP抑制劑、PDEcAMP抑制劑或骨盆神經(jīng)刺激對麻醉兔平均動脈壓的影響的圖表；圖4是毛喉素(一種cAMP模擬物)增加麻醉兔中的陰道血流，在分離的兔陰道中VIP刺激cAMP產(chǎn)生，毛喉素對分離的兔陰道的松弛作用的圖表；圖5是VIP和毛喉素增加麻醉兔陰蒂血流的圖表；圖6是NEP抑制劑對骨盆刺激的麻醉兔陰道血流改變的影響的圖表；圖7是VIP(6μg/kg,60μg/kg)對在NEP抑制劑存在和不存在的條件下陰道血流的影響的圖表；圖8是PDEcAMP2型抑制劑對骨盆神經(jīng)刺激陰道血流增加的影響的圖表；圖9是PDEcAMP2型抑制劑對VIP誘導的陰道血流增加的影響的圖表；圖10是NPY Y1拮抗劑對骨盆神經(jīng)刺激麻醉兔陰道血流增加的影響的圖表；圖11是提高cAMP信號傳遞增強神經(jīng)介導的兔陰道血流(VBF)的增加的圖表；并且圖12是NEPi對骨盆神經(jīng)刺激的陰蒂血流增加的影響的圖表。
應當理解，本發(fā)明的活性劑是I:PDE。有關I:NEP和I:NPY的教導為專業(yè)人員清楚地指明，本發(fā)明活性劑可以與這兩種類型之一或二者的活性劑聯(lián)合使用以得到本文所提及的有益效果。還包括這些附加的教導以進一步支持我們的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)。
下面更詳細地討論附圖。
圖1骨盆神經(jīng)的電刺激在被麻醉的性喚起兔模型中誘導陰道血流的頻率依賴性增加。刺激頻率的增加導致更大的血流增加。采用激光多普勒技術監(jiān)測血流的變化。
圖2血管活性腸肽(VIP)-在被麻醉的性喚起兔模型中誘導陰道血流增加。圖2a說明了通過輸入VIP(靜脈內(nèi)藥團)陰道血流如何以濃度依賴的方式增加。圖2b證明兩次重復輸注VIP產(chǎn)生了相似的血流增加。注意響應的持續(xù)時間也是相似的。采用激光多普勒技術監(jiān)測血流的變化。
圖3血管活性腸肽(VIP)在被麻醉的性喚起兔模型中使平均動脈血壓降低。該圖說明血管活性劑的典型作用，以及用于評價陰道血流對麻醉兔平均動脈壓的刺激參數(shù)。所發(fā)現(xiàn)的作用是在所有實驗動物中可見的典型趨勢。VIP引起平均動脈壓的顯著下降，而骨盆神經(jīng)刺激、Hepsaline或PDEcAMP抑制劑或NEP對照輸注對血壓沒有影響。值得注意的是，與VIP輸注有關的血壓降低也和心率大大增加有關。
圖4cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑的活化模擬VIP介導的血管舒張和陰道組織平滑肌舒張。圖4a說明了輸注毛喉素(40nmol/kg，靜脈藥團，一種cAMP模擬物)引起陰道血流的明顯增加。注意響應的幅度和持續(xù)時間與由VIP(20.0μg/kg，靜脈藥團)引起的情況相似。有趣的是，對血流的影響比對陰道外壁的作用時間更長。所有變化均采用激光多普勒技術監(jiān)測。圖4b證明VIP(0.1μM)和毛喉素(10μM)使兔陰道的細胞內(nèi)cAMP濃度明顯升高，超過了基礎水平。圖4c表明毛喉素引起預先收縮(用1μM脫羥腎上腺素)的兔陰道條的有效舒張，其IC50值約為300nM。采用體內(nèi)激光多普勒技術、生物化學cAMP酶免疫分析法或通過體外組織舒張監(jiān)測所有變化。
圖5輸注VIP使陰蒂血流增加，并且cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑的活化模擬VIP介導的被麻醉的性喚起兔模型的陰蒂血管舒張。輸注VIP(60-200μg/kg)引起陰蒂血流的濃度依賴性增加。靜脈輸注200μg/kg VIP后觀察到陰蒂血流115％增加。通過輸注cAMP模擬物毛喉素(FSK,40nmol/kg，靜脈藥團)可以模擬VIP對陰蒂血流的影響。靜脈輸注40nmol/kg毛喉素后觀察到陰蒂血流156％增加。所有的增加均明顯高于對照輸注(Hepsaline)。注意響應的幅度與由VIP(200μg/kg，靜脈藥團)引起的情況相似，并且可與圖2和4中對陰道血流觀察的結(jié)果相比。采用體內(nèi)激光多普勒技術監(jiān)測所有變化，并且當與賦形劑輸注(Hepsaline)比較時有明顯增加。
圖6:NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑促進了麻醉的性喚起兔模型中骨盆神經(jīng)刺激(PNS)的陰道血流增加。以15分鐘的間隔反復進行PNS引起陰道血流(白色條棒)可再現(xiàn)的增加。與相同時間的對照刺激或賦形劑對照(陰影條棒)觀察到的增加相比，施用NEP抑制劑(灰色條棒)使次最大刺激頻率(例如4Hz)引起的陰道血流的峰增加加強。觀察到了如下的劑量依賴性加強-0.3mg/kg靜脈注射引起40％增加，1.0mg/kg靜脈注射引起91％增加(3次的平均值)。NEP抑制劑對基礎(未刺激的)陰道血流沒有影響(沒有給出數(shù)據(jù))。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。
圖7:NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑促進了麻醉的性喚起兔模型中VIP引起的陰道血流增加。以30分鐘的間隔反復進行VIP輸注引起陰道血流可再現(xiàn)的增加(見圖2b)。當使用次最大劑量例如6.0μg/kg VIP引起血流增加時，NEP抑制劑對血流加強的幅度和持續(xù)時間的延長均有加強作用。在引起陰道血流量最大增加的VIP劑量(例如60μg/kg)下，NEP抑制劑僅僅使陰道血流增強的持續(xù)時間加強。在NEP抑制劑存在下VIP引起的增加以實心三角表示，而對照VIP的反應以空心三角表示。對照輸注Hepsaline對響應的幅度沒有影響。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。
圖8:2型PDEcAMP的選擇性抑制劑促進了麻醉的性喚起兔模型中骨盆神經(jīng)刺激(PNS)的陰道血流增加。以15分鐘的間隔反復進行PNS引起陰道血流(白色方塊)可再現(xiàn)的增加。與相同時間的對照刺激(空心方塊)觀察到的增加相比，施用2型PDEcAMP抑制劑使次最大刺激頻率(黑色方塊，例如4Hz)引起的陰道血流的峰增加加強。輸注PDE2抑制劑(500μg/kg)引起陰道血流86.8±21.9％的增強(平均值±平均標準偏差，n=2)。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。
圖9:2型PDEcAMP的選擇性抑制劑促進了麻醉的性喚起兔模型中VIP誘導的陰道血流增加。以30分鐘的間隔反復用VIP輸注引起陰道血流可再現(xiàn)的增加(見圖2b)。2型PDEcAMP的選擇性抑制劑(25μg/kg，靜脈藥團)對VIP(60μg/kg，靜脈藥團)引起的陰道血流加強的持續(xù)時間有加強作用。在PDEcAMP抑制劑存在下VIP引起的增加以實心三角表示，而對照VIP的反應以空心三角表示。對照輸注Hepsaline對響應的幅度沒有影響。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。
圖10:NPY Y1受體的選擇性拮抗劑促進了麻醉的性喚起兔模型中骨盆神經(jīng)刺激(PNS)的陰道血流增加。以15分鐘的間隔反復進行PNS引起陰道血流(數(shù)據(jù)未顯示)可再現(xiàn)的增加。與相同時間的對照刺激或賦形劑對照(陰影條棒)觀察到的增加相比，施用NPY Y1拮抗劑(灰色條棒)使次最大刺激頻率(例如4Hz)引起的陰道血流的峰增加加強。觀察到了如下的劑量依賴性加強-0.01mg/kg靜脈注射引起15.8±19.6％增加；0.03mg/kg靜脈注射引起35.1±17.17％增加；0.10mg/kg靜脈注射引起60.1±16.9％增加以及0.30mg/kg靜脈注射引起91.9±27.4％增加(3次的平均值±平均標準偏差)。NPY Y1拮抗劑對基礎(未刺激的)陰道血流沒有影響(沒有給出數(shù)據(jù))。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。
圖11是本文提供的某些數(shù)據(jù)的匯總圖，顯示這些活性劑非常適用于通過加強內(nèi)源cAMP水平而增加陰道血流量。
圖12:NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑促進了麻醉的性喚起兔模型中骨盆神經(jīng)刺激(PNS)的陰蒂血流增加。與相同時間的對照刺激或賦形劑對照(陰影條棒)觀察到的增加相比，施用NEP抑制劑(灰色條棒)使次最大刺激頻率(例如4Hz)引起的陰蒂血流的峰增加加強。觀察到了如下的劑量依賴性加強-1.0mg/kg靜脈注射引起131％增加(3次的平均值)。NEP抑制劑對基礎(未刺激的)陰蒂血流沒有影響。采用激光多普勒技術監(jiān)測所有變化。測量cAMP活性/水平的分析用Biotrak cAMP酶免疫分析(EIA)試劑盒(Amersham Life Sciences RPN225)測量陰道組織樣本中的cAMP。
通過EIA測量陰道組織樣本中的cAMP水平。EIA是以未標記cAMP與固定量的過氧化物酶標記的cAMP競爭有限量的cAMP特異性抗體為基礎的。1．材料除非另外指明，所有材料均由Amersham Life Science cAMP EIA試劑盒(RPN225)提供。1.1微滴板-96孔微滴板用驢抗兔IgG包被。1.2分析緩沖液-一經(jīng)重新配制，即為pH5.8、含0.02％牛血清白蛋白和0.5％防腐劑的0.05M乙酸鈉緩沖液。用3×15毫升蒸餾水洗滌，將瓶中的物質(zhì)轉(zhuǎn)入刻度量筒中。然后將最終體積調(diào)節(jié)至500毫升。1.3cAMP標準物(用于乙酰化方法)。配制成cAMP的濃度為10.24pmol/ml，在0.05M乙酸鹽緩沖液(pH為5.8，含0.02％牛血清白蛋白和0.5％防腐劑)中。標準物在使用前溶于2.5毫升分析緩沖液中。1.4抗血清。抗-cAMP抗體，配制成在0.05M乙酸鹽緩沖液(pH為5.8，含0.02％牛血清白蛋白和0.5％防腐劑)中。在使用前用11毫升分析緩沖液稀釋抗體并輕輕地倒轉(zhuǎn)混合以溶解內(nèi)容物。1.5cAMP綴合物。cAMP辣根過氧化物酶，配制成在0.05M乙酸鹽緩沖液(pH為5.8，含0.02％牛血清白蛋白和0.5％防腐劑)中。在使用前用11毫升分析緩沖液稀釋該溶液并輕輕地倒轉(zhuǎn)混合以溶解內(nèi)容物。1.6洗滌緩沖液。配制成pH7.5、含0.05％(v/v)TweenTM20的0.01M磷酸鹽緩沖液。將瓶中的物質(zhì)用3×15毫升蒸餾水洗滌轉(zhuǎn)入刻度量筒中。然后將最終體積調(diào)節(jié)至500毫升。1.7TMB底物。3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)/過氧化氫，在20％(v/v)二甲基甲酰胺中。備用。1.8乙?；噭?。根據(jù)需要準備2ml乙酸酐、4ml三乙胺。1.9硫酸(1M)。由18M儲液(BDH)制備1M硫酸。向18.8ml蒸餾水中加入1.11ml硫酸。2．具體的設備2.1一次性使用的5ml玻璃試管2.2分光光度平板讀數(shù)器(Spectra max190)2.3微滴板震動器(Luckham R100)3．方法·組織樣品的制備。將組織在5毫升生理鹽溶液的樣品例如興奮劑、cAMP模擬物等中進行預處理。處理后，將樣品在液氮中速凍，然后用錘子打碎。將粉末刮入離心管中，加入1毫升0.5M冰冷卻的高氯酸(PCA)。將樣品渦旋混合，并在冰上放置1小時?！慕M織樣品中提取cAMP。在4℃，將樣品以10000g的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。取出上清液，置于另外的離心管中。將沉淀物于-80℃存放以進行蛋白分析。然后用磷酸三鉀將上清液樣品中和至pH約6。在4℃，以10000g的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。取出上清液并用5倍體積(5毫升)水飽和的乙醚洗滌4次。每次洗滌后傾析出上面的乙醚層。將水層轉(zhuǎn)入短的薄壁玻璃管中，并在60℃和氮氣流下干燥。將干燥的提取物溶于1ml分析緩沖液中并貯存在冰箱中備用(或者可以冷凍)?！湓噭┢胶獾绞覝?，然后制備操作溶液。·在貼有2、4、8、16、32、64、128、256和512fmol標簽的玻璃管中制備cAMP標準物。向除512fmol標準物之外的所有管中加入1毫升分析緩沖液。然后向兩個最高濃度的標準物(256和512fmol)中加入1毫升乙?；瘶藴饰?10.24pmol/ml)。將256fmol標準物渦旋混合，并將其中的1毫升轉(zhuǎn)入128fmol標準物中。依次進行這樣的操作，直至2fmol標準物中1毫升溶液被棄去。零標準物管設定為含1毫升分析緩沖液。·將組織萃取樣品在冰上解凍(如果需要的話)，并在貼標簽的玻璃管中稀釋成1/100(10μl樣品990μl分析緩沖液)?！ねㄟ^在通風櫥中沿著管壁加入100μl乙酰化試劑、并立即渦旋混合，使標準物和樣品中的cAMP乙?；??！⑺械臉藴饰锖蜆悠?0μl加入96孔板的適當孔中，并向非特異性結(jié)合(NSB)的孔中加入150μl分析緩沖液?！は虺瞻?B)和NSB之外的所有孔中加入100μl抗血清，然后于3-5℃進行孵育2小時?！し跤?，向除B之外的所有孔中加入100μl cAMP-過氧化物酶綴合物，再在3-5℃進行孵育1小時。·通過將培養(yǎng)板反轉(zhuǎn)并印跡在吸收紙上清空培養(yǎng)板，然后用400μl洗滌緩沖液洗滌各孔4次。將每一洗滌后的板再印跡一次，以確保已經(jīng)除去了所有殘留的洗滌緩沖液。然后立即向所有孔中加入200μl TMB。·在室溫，將各板置于培養(yǎng)板振搖器中30分鐘，然后向所有孔中加入100μl 1M硫酸。在Spectra max 190中于30分鐘內(nèi)讀出450nm處的光密度。4．標準物對于所有分析準備下列標準物管4.1將標準物摻入分析緩沖液中將已知量的cAMP摻入分析緩沖液中以測定該分析方法的效力。向分析緩沖液中加入70pmol/ml cAMP，這在分析中相當于35fmol/孔，這是劑量響應曲線的中間值。制備1ml標準物68.4μl 521fml/孔標準物931.6μl分析緩沖液4．化合物對培養(yǎng)板的影響設置標準物以確定功能研究中使用的化合物是否對96孔培養(yǎng)板有任何作用或?qū)AMP的結(jié)合有影響。這些標準物包括·僅將化合物摻入分析緩沖液中用于評價該化合物對培養(yǎng)板的直接作用?！⒒衔飺饺牒谢A水平cAMP的血漿中以評價該化合物對cAMP與培養(yǎng)板結(jié)合的影響。
向每一標準物中摻入5nM濃度的化合物，選擇5nM是因為過去最終輸注后的藥物總濃度約為150-300nM。在分析前，將樣品稀釋為1∶100，因此5nM大于任何最終輸注的預期總體藥物濃度。5．計算Spectra max平板讀數(shù)器讀取450nm的光密度(OD)。
在Spectra max上以％B/Bo(y坐標軸)對cAMP fmol/孔(x坐標軸)繪圖產(chǎn)生標準曲線。
如下計算每一樣品和標準物的％B/Bo(％結(jié)合)Bo=零標準物(參見方法3.2) 然后可以從標準曲線上直接讀取每一樣品的fmol/孔體積。然后將這些值轉(zhuǎn)化為pmol/ml，并取每對樣品的平均值。由fmol/孔值轉(zhuǎn)化為Dmol/mlfmol轉(zhuǎn)化為Dmol=1/1000 樣品稀釋至1/100，所以總值 =1×1000/1000×100/50=2所以所有的fmol/孔值乘以2即得pmol/ml值。動物試驗模型加強環(huán)3’,5’-單磷酸腺苷(cAMP)的作用導致麻醉的性喚起兔模型的陰道血流增加1．0目的1．開發(fā)和驗證雌性性喚起動物模型。2．確定麻醉兔生殖器血流調(diào)節(jié)的機理。3．確定增加陰道和陰蒂血流的的有效途徑。4．研究陰道平滑肌舒張的機理，并確定增加陰道舒張的有效途徑。2．0介紹正常的性喚起響應由性興奮過程中觀察到的多種生理反應組成。這些變化例如陰道、陰唇和陰蒂的充血由導致生殖器血流的增加導致。充血因血漿滲出導致陰道的潤滑性增加，使陰道柔順性增加(陰道平滑肌舒張)，并增加了陰道和陰蒂的敏感性。
雌性性喚起疾病(FSAD)是非常普遍的性疾病，受影響的絕經(jīng)前、鄰近絕經(jīng)和絕經(jīng)后(±HRT)婦女高達40％。FSAD的主要后果是生殖器充血減少，表現(xiàn)出陰道缺乏潤滑性以及缺少愉快的生殖器感覺。繼而導致性需求減少、性交過程中疼痛以及難以達到性高潮。FSAD最常見的起因是造成陰道、陰唇和陰蒂充血的生殖器血流減少。(Park,1997；Goldstein,1998；Berman,1999a,Werbin,1999)。
如本文所述，本發(fā)明提供了恢復或加強患FSAD婦女正常性喚起響應的方法，該方法是通過增加生殖器血流實現(xiàn)的。
在研究中，我們采用激光多普勒技術測量生殖器血流的小變化，已經(jīng)確定cAMP(環(huán)3’,5’-單磷酸腺苷)是陰道血管舒張的調(diào)節(jié)劑。利用VIP代謝抑制劑(一種NEP EC3.4.24.11抑制劑)，我們還證實，骨盆神經(jīng)刺激(即性興奮)中觀察到的生殖器血流增加是由VIP介導的。這與性喚起動物模型的開發(fā)有關，并且證明這些數(shù)據(jù)反映出雌性性喚起過程中觀察到的生理變化。該模型還用于確定和驗證生殖器血流增加的機理，例如直接或間接增強cAMP介導的血管舒張。3.0方法3.1麻醉方案經(jīng)肌內(nèi)注射0.5ml/kg美托咪定(Domitor)和肌內(nèi)注射0.25ml/kg氯胺酮(Vetalar)聯(lián)合預處理雌性新西蘭兔(約2.5kg)，同時經(jīng)面罩保持吸氧。用PortexTM無封套的氣管內(nèi)管3ID切開兔的氣管，該管與換氣裝置連接，并保持每分鐘30-40次呼吸的換氣速率，潮氣量(tidal volume)約18-20ml，最大呼吸道壓為10cm水柱高。然后用異氟烷麻醉并繼續(xù)以2升/分鐘的量換氧。用23G或24G導管在右緣耳靜脈插管，并以0.5ml/分鐘的量灌注Lactated Ringer溶液。在侵入性手術過程中保持供給兔3％的異氟烷，并降至2％異氟烷以保持麻醉。3.2脈管套管插入術將兔子左側(cè)腹股溝處的毛剃除，并沿大腿垂直切開約5cm長的切口。股靜脈和股動脈露出，將其分離，然后插入PVC導管(17G)以用于輸入藥物和化合物。對股動脈重復同樣的套管插入術，將導管插入10cm深以確保導管達到腹部主動脈。將動脈導管與Gould系統(tǒng)相連以記錄血壓變化。經(jīng)動脈導管取出用于血氣分析的血樣。測量收縮壓和舒張壓，并用式(舒張壓×2+收縮壓)÷3計算平均動脈壓。用脈搏氧計量器和Po-ne-mah數(shù)據(jù)獲取軟件系統(tǒng)(PonemahPhysiology Platform,Gould instrument Systems Inc)測量心率。3.3骨盆神經(jīng)刺激從腹部中線切開至腹腔。切口長及恥骨上約5cm。簡單地剝離脂肪和肌肉以使延及體腔的腹下神經(jīng)露出。必需保持接近恥骨壁的側(cè)曲線以避免損傷位于恥骨上的股靜脈和股動脈。坐骨和骨盆神經(jīng)位置較深，位于兔子背部一側(cè)進一步解剖后處。一旦找到坐骨神經(jīng)，骨盆神經(jīng)的位置也就容易找到了。術語骨盆神經(jīng)很少使用，在解剖學書中沒有對這一主題進行足夠詳細的定義。無論如何，神經(jīng)刺激引起陰道和陰蒂血流的增加，并且造成骨盆區(qū)的神經(jīng)支配。從組織周圍找出骨盆神經(jīng)，并在神經(jīng)周圍放置Harvard雙極刺激電極。將神經(jīng)略微抬高以使其拉緊，這樣就確保將電極放置在適當?shù)奈恢?。在神?jīng)和電極的周圍放入約1ml輕石蠟油。該輕石蠟油用作神經(jīng)保護潤滑劑并防止血液污染電極。電極與Grass S88刺激器相連。以下列參教刺激骨盆神經(jīng)5V，脈沖寬度0.5ms，刺激時間10秒，刺激頻率2至16Hz。當每15-20分鐘刺激神經(jīng)時，得到可再現(xiàn)的響應。
在每次實驗開始時測定頻率響應曲線，以測定用作次最大響應的最佳頻率，通常為4Hz。使用Harvard 22輸注泵，以連續(xù)15分鐘的刺激循環(huán)，經(jīng)股靜脈輸入試驗化合物。3.4激光多普勒探針的放置在恥骨尾端沿腹部中線切口使恥骨區(qū)露出。除去結(jié)締組織使陰蒂膜露出，以確保其壁不含小血管。除去所有的結(jié)締組織使外陰道壁也同樣露出。將一只激光多普勒流量探針插入陰道內(nèi)3cm，使得探針柄的一半可見。放置第二枚探針，使其剛好位于外陰蒂壁的上面。調(diào)節(jié)這些探針的位置直到獲得信號為止。第二枚探針恰好放置在外陰道壁血管的表面。將兩枚探針在其放置處夾緊。
陰道和陰蒂血流既可以使用Po-ne-mah數(shù)據(jù)獲取軟件(PonemahPhysiology Platform,Gould instrument Systems Inc)直接由流量計讀數(shù)，也可以間接地由Gould圖表記錄器描繪。在試驗開始時進行校準(0-125ml/分鐘/100g組織)。3.5輸注血管活性腸肽(VIP)
VIP(Bachem,H-3775)的靜脈內(nèi)輸注劑量為2.0、6.0、20.0、60.0μg/kg,并且以0.5ml鹽水為載體輸注。VIP用Harvard22泵、以500μl/分鐘的速度經(jīng)3向接口輸入股靜脈。輸注VIP后，用肝素化的鹽水(Hepsaline)沖洗導管，使得VIP不會留在導管內(nèi)。
對于用VIP輸注進行的試驗，需要初始敏化劑量響應曲線(2-60μg/kg)，以得到可再現(xiàn)的響應。最初輸注Hepsaline(50UI/ml)作為陰性對照。3.6輸注抑制劑在鹽水或5％葡萄糖溶液(在1.8ml注射用水中的200μl 50％葡萄糖)中配制NEP(中性內(nèi)肽酶EC3.4.24.11)抑制劑、5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑和NPYY1拮抗劑。將PDEcAMP抑制劑溶于40％乙醇溶液(在1.8ml注射用水/乙醇中的200μl 50％葡萄糖)中。以與VIP同樣的速度輸注抑制劑和對照物。在VIP劑量響應曲線之前保持NEP抑制劑30分鐘，而在骨盆神經(jīng)刺激之前保持NEP抑制劑、NPYY1受體拮抗劑和PDEcAMP抑制劑15分鐘。3.7測量分離的兔陰道中平滑肌的舒張3.7(a)體外制備兔陰道通過頸脫位處死雌性新西蘭白兔(2.0-3.0kg)。打開腹腔并切除陰道。在Krebs碳酸氫鹽緩沖液中，以最初剩余的1.5g張力，將組織條用包線絲縫合(6/0線規(guī))縱向固定在Wesley Co.5ml甲硅烷化器官腔中，該緩沖液保持溫度在37℃，并通入95％O2/5％CO2。將每一組織條上面的縛線連結(jié)在10g容量的壓力換置(force-displacement)傳感器上，測量等長收縮力的變化，并用DART體外數(shù)據(jù)俘獲系統(tǒng)記錄。使組織平衡1.5小時并有規(guī)律地用Krebs洗滌。3.7(b)血管活性腸肽引起的兔陰道舒張用1μM蒸浴濃度(bathconcentration)的脫羥腎上腺素使每一組織收縮。當收縮反應達到穩(wěn)定的平臺(約15分鐘)時，以對數(shù)單位將VIP漸增地加入器官腔中，以形成0.1-100nM的濃度。加入各濃度的VIP后，測量舒張反應5分鐘；此時達到最大舒張。然后向組織中加入試驗活性劑(例如NEP或PDE抑制劑)或DMSO載體(時間匹配對照)。3.7(c)VIP舒張試驗的數(shù)據(jù)分析對于每一VIP濃度舒張-響應曲線，以與脫羥腎上腺素引起的最大收縮的百分數(shù)表示由VIP引起的舒張響應。然后將這些值對VIP濃度的對數(shù)繪圖，得到S形曲線。為了繪制曲線，將最小舒張響應定為0％，而最大舒張響應不固定。測定產(chǎn)生脫羥腎上腺素收縮的50％舒張所需的VIP濃度(EC50PE)。3.7(d)電場刺激的兔陰道舒張如3.7(a)節(jié)所述制備兔陰道組織條。將組織條固定在置于器官腔頂部和底部的兩個鉑電極之間，距離約4cm遠。用1μM蒸浴濃度脫羥腎上腺素使每一組織收縮。當收縮反應達到穩(wěn)定的平臺(約15分鐘)時，對組織進行預處理電場刺激(EFS)以產(chǎn)生舒張曲線。以0.5毫秒的脈沖寬度，連續(xù)10秒釋放2、4、8和16Hz的系列頻率，在40-60伏電壓下進行上述刺激。在每一頻率(5分針)之間使組織恢復到基線預收縮張力，并記錄舒張響應的大小。
在完成預處理EFS響應曲線后，將所有組織洗滌15分鐘，使組織恢復到基線張力。然后向組織中加入試驗活性劑(例如NEP或PDE抑制劑，一氧化氮合成酶[NOS]抑制劑)或DMSO載體(時間匹配對照)。加入化合物或載體后，用脫羥腎上腺素(1μM)使組織再收縮15分鐘，并如上所述測定EFS-引起的舒張響應曲線。
對于EFS試驗，向Krebs中加入阿托品(10μM)和胍乙啶(150μM)以消除陰道的任何膽堿能或腎上腺素能神經(jīng)元神經(jīng)支配。3.8測量分離的兔陰道中cAMP水平用Biotrak cAMP酶免疫分析(EIA)試劑盒(Amersham Life Sciences RPN225)測定陰道組織提取物中的cAMP濃度。用試驗活性劑(例如毛喉素或VIP)處理分離的陰道組織樣品。5分鐘后，用液氮將樣品速凍，打成勻漿并提取cAMP。通過EIA測定cAMP的含量。EIA是以未標記的cAMP與固定量的過氧化物酶標記的cAMP對有限量的cAMP特異性抗體的競爭為基礎的。3.9測量分離的兔陰道中磷酸二酯酶(PDE)活性從ABS Inc.,Delaware獲得人陰道壁胞質(zhì)溶膠提取物(供者的年齡為41-60歲)。通過Mono-Q陰離子交換色譜分離PDE同工酶，并根據(jù)其底物選擇性、對變構調(diào)節(jié)劑和選擇性抑制劑的敏感性確定其特征。用特異性PDE同工酶抗體進行Western分析，以檢測PDE在人陰道中的表達。
所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差記錄。用t-檢驗確定顯著變化。4.0結(jié)果和討論4.1性喚起動物模型在研究中，我們開發(fā)了健康的可再現(xiàn)性喚起生理模型。使用該麻醉的兔模型，我們可以用激光多普勒技術測量到很小的生殖器血流變化。采用刺激骨盆神經(jīng)來刺激性喚起的神經(jīng)元作用。
我們發(fā)現(xiàn)，刺激骨盆神經(jīng)引起陰道和陰蒂血流的頻率依賴性增加(見圖1)。無論是陰道內(nèi)壁或是外壁的記錄，陰道血流的增加都是顯著的。以2Hz的頻率刺激骨盆神經(jīng)使陰道血流量平均最大升高10.3±1.8，以4Hz的頻率刺激為20.0±4.6，以8Hz的頻率刺激為36.3±4.8并且以16Hz的頻率刺激為46.6±4.7ml/分鐘/100g組織(n=4；15-20V,0.5ms,10s)，并且陰蒂血流的增加以2Hz的頻率刺激為14.7±3.6，以4Hz的頻率刺激為29.4±1.4，以8Hz的頻率刺激為69.7±2.1。這些值與前面在人體研究和性喚起動物模型中觀察到的范圍相似。(Berman,1999a；Park,1997)。
我們發(fā)現(xiàn)，對骨盆神經(jīng)的次最大刺激導致生殖器血流的可再現(xiàn)增加(例如每15分鐘以4Hz的頻率刺激使陰道血流量平均增加8.50±0.1ml/分鐘/100g組織(n=8)并使陰蒂血流量平均增加13.65±0.86ml/分鐘/100g組織(n=11))。這種再現(xiàn)性保持高達5小時。我們可以利用這些響應的再現(xiàn)性進行如下研究a)鑒定內(nèi)源性血管活性劑/導致生殖器充血的機理，和b)可以有效增加陰道和/或陰蒂血流的藥物的影響。
我們發(fā)現(xiàn)，在麻醉兔中沒有與骨盆神經(jīng)刺激有關的心血管副作用(見圖3)。
生殖器血流的增加是在性喚起過程中(Berman,1999)通過增加動脈血流供給實現(xiàn)的-陰道動脈、子宮動脈的陰道分支、內(nèi)陰部動脈和中間直腸動脈的中間分支都向陰道和陰蒂供血。源于S2/S4脊柱區(qū)的骨盆神經(jīng)支配雌性生殖器，并且其末端延伸至下陰道、陰蒂和相關的血管中。通過刺激骨盆神經(jīng)，我們可以模擬在性喚起中觀察到的血流的作用，即增加動脈生殖器血流量。有趣的是，靜脈引流使毛細網(wǎng)絡充血并不能使動脈血流量增加。陰道充血通過增加血漿的滲出致使陰道潤滑，這是性刺激過程中觀察到的第一個骨盆反應。目前骨盆神經(jīng)刺激或性喚起過程中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是不確定的。陰道和陰蒂的脈管系統(tǒng)和微脈管系統(tǒng)受含有神經(jīng)肽或其他神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)支配，這些神經(jīng)具有明確的免疫組織化學特征。這些研究表明，與降鈣素基因有關的肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、一氧化氮合成酶(NOS)、P物質(zhì)和血管活性腸肽(VIP)都存在于支配人陰道和陰蒂的神經(jīng)中(Hoyle,1996；Burnett,1997；HauserKronberger.1999)。4.2麻醉的性喚起兔模型的驗證為了將用該模型得到的血流數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成性喚起人模型中觀察到的數(shù)據(jù)，我們將我們的數(shù)據(jù)直接與臨床前研究中得到的陰道血流數(shù)據(jù)和心血管數(shù)據(jù)進行比較。
我們發(fā)現(xiàn)，輸注VIP在性喚起兔模型中具有以下作用·外源VIP(靜脈藥團)引起陰道血流顯著的濃度依賴性增加(見圖2a)。無論是陰道內(nèi)壁或是陰道外壁，所記錄的陰道血流的增加明顯高于上述基礎血流值。靜脈內(nèi)注射VIP(60μg/kg)使陰道血流顯著增加24.7±3.6ml/分鐘/100g組織。輸注后約11分鐘，血流量保持高于基礎水平。劑量越低，增加越小，例如6.0μg/kg VIP使陰道血流量升高7.5±1.3ml/分鐘/100g組織，并使血流量在輸注后7分鐘升高?！ぶ貜洼斪⑼瑯觿┝康腣IP(以30分鐘間隔靜脈內(nèi)輸注)引起陰道血流明顯可再現(xiàn)地增加(見圖2b)。·VIP(靜脈內(nèi)輸注)明顯使心率增加，并使平均動脈血壓降低(見圖3)。靜脈內(nèi)輸注6.0μg/kg VIP使動脈血壓顯著減少13.2±0.7mm Hg，并使每分鐘心率明顯升高16±4次搏動。
該動物模型直接反映出給健康志愿者輸注VIP所觀察到的臨床數(shù)據(jù)，即陰道血流增加、血壓降低和心率升高。因此，該模型可用于研究在性喚起過程中出現(xiàn)的生理變化的機理，此外還可用于確定增強陰道血流、因而治療FSAD的新途徑。4.3通過刺激cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑由VIP-引起的陰道血流變化Ottesen與其合作者證明VIP引起健康志愿者的陰道血流增加和陰道潤滑。然而VIP的作用機理是不清楚的。在該文獻中，有大量的VIP通過不同的第二信使系統(tǒng)包括cGMP/鳥苷酸環(huán)化酶(Ashur-Fabian,1999)、一氧化碳/血紅素氧合酶(Fan,1998)和cAMP/腺苷酸環(huán)化酶(Schoeffter,1985；Gu,1992；Foda,1995)傳輸信號的實例。近期描述用一氧化氮的釋放解釋VIP如何在子宮動脈中起舒張作用的報道就是例證(Jovanovic,1998)。令人關注的還有VIP調(diào)節(jié)雄性泌尿生殖器功能中的NO/cGMP的證據(jù)(Kim,1994)，并且有用VIP(0.5μM)處理人陰道平滑肌細胞培養(yǎng)物不能使cAMP含量升高的直接證據(jù)(Traish,1999，出處同上)。
在該研究中我們證明，通過升高胞內(nèi)cAMP水平，VIP引起血管舒張。通過實施一系列功能試驗，我們測量了血流量和平滑肌舒張，并對胞內(nèi)cAMP的濃度進行了生化測定。我們使用毛喉素，一種腺苷酸環(huán)化酶活化劑或cAMP模擬物，模擬cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑活化的作用。VIP和毛喉素對生理性喚起作用在陰道血流和舒張方面具有同樣的影響。
VIP(20μg/kg)和毛喉素(40nmol/kg)使陰道血流分別明顯增加13.2和12.7ml/分鐘/100mg組織(見圖2a和4a)。由VIP和毛喉素引起的這些變化的幅度并無明顯差異。無論是陰道內(nèi)壁或是陰道外壁，所記錄的這些變化明顯高于基礎血流值。
VIP(0.1μM)和毛喉素(10μM)均使分離的陰道組織中胞內(nèi)cAMP的濃度比基礎水平明顯增高(見圖4b)。
VIP(0.1μM)和毛喉素(10μM)使基礎濃度從276nM分別升高156％和238％。這些百分數(shù)的不同反映出VIP和毛喉素濃度的不同，例如濃度為0.1μM的VIP使預收縮的分離陰道舒張約80％，而10μM濃度的毛喉素足以使該分離的組織完全舒張。
此外，我們證明，VIP和毛喉素使分離的陰道組織舒張，其EC50值分別為18.8±0.6nM和320±20nM(見圖4c)。
這些數(shù)據(jù)表明，VIP通過cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑引起陰道血管舒張，因此該模型可用于研究是否刺激骨盆神經(jīng)、即性喚起會導致VIP釋放/cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑的活化。此外，也可以研究在性喚起過程中增強陰道血流的途徑，例如直接或間接加強cAMP的信號傳輸。4.4cAMP是陰道血管舒張的介質(zhì)在性喚起過程中使陰道血流增加的神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使目前尚未確認。迄今為止，研究人員關注于一氧化氮(NO)/cGMP途徑。根據(jù)本發(fā)明，我們證實了1)cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑介導了VIP引起的陰道血流增加；2)VIP是性喚起過程中釋放的內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)；和3)內(nèi)源釋放的VIP通過使cAMP升高導致其血管舒張作用。
使陰道壁舒張的神經(jīng)遞質(zhì)目前尚未確定。我們已經(jīng)證明VIP是刺激骨盆神經(jīng)時釋放出來的神經(jīng)遞質(zhì)，并且cAMP介導了VIP介導的血管舒張。防止VIP代謝或直接加強cAMP信號傳輸?shù)幕钚詣┛墒构桥枭窠?jīng)刺激引起的陰道血流增加強化，例如分別有NEP抑制劑或PDEcAMP抑制劑(參見下面一節(jié))。
在研究中我們發(fā)現(xiàn)，可以排除NO在VIP引起的陰道舒張中的作用。有效的選擇性5型PDE抑制劑對VIP-引起的分離陰道平滑肌的舒張具有很小的影響(使VIP-引起的舒張增強30％；見表1)。表1:VIP介導的分離兔陰道舒張的增強。該表說明了VIP-引起的預收縮(1μM脫羥腎上腺素)陰道平滑肌舒張的EC50值增加的百分數(shù)。1、2、3和4型PDEcAMP的選擇性抑制劑都會顯著加強VIP-介導的舒張，而5型PDEcGMP的選擇性抑制劑或賦形劑對照對VIP-介導的舒張沒有影響。
我們證明，VIP還是內(nèi)源性NANC(非腎上腺素能，非膽堿能的)神經(jīng)遞質(zhì)，它部分地造成EFS-引起的分離陰道平滑肌的舒張。高劑量的一氧化氮合成酶抑制劑(L-NOARG,300μM)僅僅使EFS-引起的舒張抑制50％。防止NEP-引起的VIP代謝并因此加強VIP信號傳輸?shù)腘EP抑制劑(1μM)增強了由EFS引起的非一氧化氮NANC舒張。我們已經(jīng)證明，NO和VIP都可調(diào)節(jié)陰道壁平滑肌的緊張。因此用增強NO/cGMP和/或VIP/cAMP介導的信號傳輸?shù)幕钚詣┛梢灾委熜缘丶訌婈幍榔交〉氖鎻垺?.5VIP經(jīng)cAMP途徑引起陰蒂舒張在性喚起過程中使陰蒂血流增加的神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使目前尚未確定。與目前對陰道血流的研究一致，研究人員推測并關注于一氧化氮(NO)/cGMP途徑。盡管含有神經(jīng)元的VIP可見地存在于陰蒂組織中，但是目前沒有VIP在干預陰蒂血流/充血方面的報道(Hauser-Kronberger等，1999)。
在該研究中我們證實1．輸注VIP可增加陰蒂血流2．cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑介導了VIP-引起的陰蒂血流增加3．VIP是在性喚起過程中釋放的內(nèi)源性陰蒂神經(jīng)遞質(zhì)1．輸注VIP(60-200μg/kg，靜脈內(nèi)注射藥團)引起陰蒂血流以濃度依賴的方式增加(圖5)。靜脈輸注200μg/kg VIP后觀察到陰蒂血流增加115％。這明顯高于對照輸注(Hepsaline)的結(jié)果。2．通過輸注cAMP模擬物毛喉素(40nmol/kg，靜脈內(nèi)注射藥團，圖5)可以模擬VIP對陰蒂血流的影響。靜脈內(nèi)輸注40nmol/kg毛喉素后觀察到陰蒂血流增加156％。這明顯高于對照輸注(Hepsaline)的結(jié)果。值得注意的是，該響應幅度與VIP(200μg/kg，靜脈內(nèi)注射藥團)引起的響應相似，并且可與圖2和圖4中所示的對陰道血流觀察到的結(jié)果相比。3．臨床相關劑量的NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑明顯加強了骨盆神經(jīng)刺激引起的陰蒂血流增加(見圖12)。與賦形劑對照引起的增加相比，NEP抑制劑使陰蒂血流的峰增加加強多達131％。
這些數(shù)據(jù)確定了VIP能夠增加陰蒂血流/使血管舒張，并且這可以通過活化cAMP/腺苷酸環(huán)化酶途徑模擬。對于NEP EC3.4.24.11(起VIP代謝作用)的抑制劑可加強骨盆神經(jīng)刺激引起的陰蒂血流增加的發(fā)現(xiàn)，證實了VIP是骨盆神經(jīng)刺激/性喚起過程中釋放的神經(jīng)遞質(zhì)。4.6可直接或間接升高cAMP水平的藥物活性劑能使生殖器血流增加FSAD與生殖器血流量有關，并且由生殖器血流減少引起。治療這種疾病的潛在途徑是使生殖器血流增加。已經(jīng)確定，cAMP是生殖器血管舒張的介質(zhì)，而神經(jīng)元釋放的VIP導致cAMP的升高，我們相信，如果cAMP信號傳輸增強，其結(jié)果是生殖器血流增加，因此使生殖器血流恢復到正常水平并治療FSAD。
特別優(yōu)選的是，我們選擇三種靶向物質(zhì)以直接或間接加強cAMP-介導的血管舒張-PDEcAMP抑制劑例如2型PDEcAMP抑制劑、NEP(EC3.4.24.11)抑制劑和神經(jīng)肽Y Y1(NPY Y1)受體拮抗劑。4.6.1中性內(nèi)肽酶(NEP EC3.4.24.11)抑制劑NEP EC3.4.24.11可代謝VIP，因此終止VIP介導的生物活性。NEP抑制劑可加強性喚起過程中釋放的VIP的內(nèi)源性血管舒張作用。這將具有加強生殖器充血的臨床作用。
先前沒有文獻報道NEP EC3.4.24.11存在于陰道組織中或者在陰道組織中發(fā)生功能性作用或在性喚起過程中發(fā)揮作用。
臨床相關劑量的NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流增加明顯加強(見圖6)。
與時間匹配的對照的增加相比，NEP抑制劑使陰道血流的峰增加加強高達53％。次最大刺激頻率(如4Hz)引起的增加是劑量依賴性的，例如靜脈內(nèi)注射0.1mg/kg引起35.0±7.6％的增加；靜脈內(nèi)注射0.3mg/kg引起42.6.0±27.7％的增加，并且靜脈內(nèi)注射1.0mg/kg引起52.8±32.5％的增加。NEP抑制劑對基礎(未刺激的)陰道血流沒有影響。因此，本發(fā)明的活性劑可通過加強cAMP的信號傳輸而加強性喚起，而不是在沒有性需求的情況下引起性喚起，即直接增加cAMP的信號傳輸。
臨床相關劑量的NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰蒂血流增加明顯加強(見圖12)。與賦形劑對照的增加相比，NEP抑制劑使陰蒂血流的峰增加加強高達131％。NEP抑制劑對基礎(未刺激的)陰道血流沒有影響。這還使得我們確信，本發(fā)明的活性劑可通過加強cAMP的信號傳輸而加強性喚起，而不是在沒有性需求的情況下引起性喚起，即直接增加cAMP的信號傳輸。
與時間匹配的對照相比，臨床相關劑量的NEP EC3.4.24.11的選擇性抑制劑使VIP引起的陰道血流增加加強。次最大劑量的VIP(例如6.0μg/kg)使峰增加明顯加強(95±6％)，并使該加強的持續(xù)時間延長(約140％-從7分鐘增加至超過17分鐘，見圖7)。將NEP抑制劑與引起最大血流增加的劑量的VIP聯(lián)合給藥時，將使VIP引起的陰道血流增加的持續(xù)時間明顯延長(在11-20分鐘內(nèi)約增加80％)。
臨床相關劑量的NEP抑制劑使VIP引起的和神經(jīng)介導的分離組織的舒張明顯加強。在選擇性NEP抑制劑(1μM)存在下，VIP的EC50值從18.8±0.6nM顯著減少至2.9±0.3nM。NEP抑制劑的作用是濃度依賴性的。
人和兔陰道中表達NEP EC3.4.24.11 mRNA信使和蛋白，并且已通過Northern和Western分析在鑒定出來了。4.6.2磷酸二酯酶(PDE)抑制劑cAMP由水解cAMP的PDE酶、即PDEcAMP降解。PDEcAMP抑制劑可使性喚起過程中釋放的cAMP的內(nèi)源性血管舒張作用加強。它們應該具有加強陰道充血的臨床作用。
先前沒有文獻報道PDEcAMP存在于陰道組織中或者這些同工酶在陰道組織中發(fā)生功能性作用或在性喚起過程中發(fā)揮作用。人和兔陰道的PDE特性表明存在1、2、3、4、7和8型PDEcAMP同工酶。這些PDEcAMP的抑制劑代表了可加強陰道血流和/或舒張陰道平滑肌的可能的活性劑。
臨床相關劑量的2型PDEcAMP的選擇性抑制劑使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流增加明顯加強(見圖8)。與時間匹配的對照增加(@4Hz)相比，2型PDEcAMP抑制劑(500μg/kg；靜脈內(nèi)注射)使陰道血流的峰增加加強86.8±21.9％。
2型PDEcAMP的選擇性抑制劑使VIP(60μg/kg)-引起的陰道血流的峰增加持續(xù)時間明顯提高了超過100％(以50％的幅度測量；見圖9)。2型PDEcAMP的選擇性抑制劑使VIP刺激引起的陰道血流的峰增加明顯加強(約15±3％[200μg/kg])。
2型PDEcAPM的選擇性抑制劑使VIP引起的陰道血流的峰增加持續(xù)時間明顯提高了超過100％(以50％的幅度測量；見圖8)。2型PDEcAMP的選擇性抑制劑使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流的峰增加明顯加強(約15±3％[200μg/kg],4Hz)。
PDEcAMP抑制劑使VIP-引起的預收縮分離的陰道平滑肌的舒張加強(1μM脫羥腎上腺素；見表1)。1、2、3和4型PDEcAMP的選擇性抑制劑均明顯加強了VIP-介導的舒張(VIP的EC50值增強210％@76nM,130％@8nM,220％@3.4μM和160％@686nM)。這些抑制劑以本身已知的對所關注的具體PDEcAMP具有選擇性的劑量給藥。5型PDEcGMP的選擇性抑制劑或載體對照對VIP介導的舒張沒有明顯影響。4.6.3NPY Y1受體拮抗劑NPY對VIP介導的血管舒張具有抑制作用，因此NPY Y1受體拮抗劑可促進性喚起過程中釋放的內(nèi)源性VIP的血管舒張作用。它們應該具有加強陰道充血的臨床作用。
先前沒有文獻報道NPY受體存在于陰道組織中或者這些受體在陰道組織中發(fā)生功能性作用或在性喚起過程中發(fā)揮作用。
NPY受體表達的研究已經(jīng)得到Northern和Western分析的認同，即在人和兔陰道中存在NPY Y1、Y2和Y5受體亞型。
臨床相關劑量的NPY Y1的選擇性抑制劑可使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流增加明顯加強(見圖10)。與時間匹配的對照增加相比，NPY Y1拮抗劑使陰道血流的峰增加加強高達92％。次最大刺激頻率(例如4HZ)的增加是劑量依賴性的，例如靜脈內(nèi)注射0.01mg/kg引起15.8±19.6％的增加；靜脈內(nèi)注射0.03mg/kg引起35.1±17.17％的增加；靜脈內(nèi)注射0.10mg/kg引起60.1±16.9％的增加并且靜脈內(nèi)注射0.3mg/kg引起91.9±27.4％的增加(平均值±標準偏差，n=3)。NPY Y1拮抗劑對基礎(未刺激的)陰道血流沒有影響。這就支持了我們的觀點，即它們通過加強cAMP的信號傳輸而加強性喚起，而不是在沒有性需求的情況下引起性喚起，即直接增加cAMP的信號傳輸。4.7可加強cAMP作用或增加陰道血流的活性劑對麻醉兔平均動脈血壓的影響在口服治療FSAD的研究中，希望對心血管沒有副作用，例如對血壓或心率沒有副作用。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)輸注VIP可明顯降低平均動脈血壓(見圖3)以及明顯增加心率。因此，特別優(yōu)選的是，該活性劑不是VIP。無論如何，骨盆神經(jīng)刺激以及PDEcAMP和NEP抑制劑對血壓沒有影響。靜脈內(nèi)輸注的6.0μg/kg VIP使平均動脈血壓明顯減少13.2±0.7mm Hg，并使每分鐘的心率顯著增加16±4次搏擊。更高劑量例如60μg/kg VIP(靜脈內(nèi)輸注)使平均動脈血壓明顯減少14.7±1.37mm Hg，并使每分鐘的心率顯著增加111±30次搏擊，此后平均動脈血壓增加8.5±1.4mm Hg。試驗化合物用上述提及的一系列化合物進行本發(fā)明的試驗，并且發(fā)現(xiàn)它們對于本發(fā)明是有效的即它們可以用作治療FSD、特別是FSAD的PcAMP。
這些化合物包括式Ⅰa(“FⅠa”)化合物-即5-[4-(二乙基氨基)芐基]-1-甲基-3-丙基-6,7-二氫-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮。FⅠa可以按照EP-A-0911333(其中的實施例50)的教導制備。
式Ⅱ(“FⅡ”)化合物-即9-(1-乙酰基-4-苯基丁基)-2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮。FⅡ可以按照EP-A-0771799(其中的實施例100)的教導制備。
式Ⅲ(“FⅢ”)化合物-即甲氰吡酮。FⅢ是市售產(chǎn)品。
式Ⅳ(“FⅣ”)化合物-即咯利普蘭。FⅣ是市售產(chǎn)品。
式Ⅴ(“FⅤ”)化合物-即環(huán)己烷甲酸，3-[[[1-(2-羧基-4-戊烯基)環(huán)戊基]羰基]氨基]-,1-乙基酯。FⅤ可以按照EP-A-0274234(其中的實施例300)的教導制備。
式Ⅵ(“FⅥ”)化合物一即環(huán)己烷甲酸，3-[[[1-(2-羧基-4-戊烯基)環(huán)戊基]羰基]氨基]-。FⅤ可以按照EP-A-0274234(其中的實施例379)的教導制備。
特別是，F(xiàn)Ⅰa、FⅡ、FⅢ和FⅣ是PDEcAMP抑制劑。FⅠa是I:PDEⅠ,FⅡ是I:PDEⅡ,FⅢ是I:PDEⅢ并且FⅣ是I:PDEⅣ。
這些化合物的數(shù)據(jù)如上示于前面實施例一節(jié)中-例如見表Ⅰ。
顯然，這些PDEcAMP抑制劑可加強VIP-引起的分離組織的舒張。
臨床相關劑量的FⅡ-選擇性I:PDEⅡ-可加強VIP-引起的陰道血流增加。
臨床相關劑量的FⅡ還使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流增加加強。
FⅤ和FⅥ是NEP Ec3.4.24.11的選擇性抑制劑。
在前面的實施例一節(jié)中如上所示的數(shù)據(jù)是由FⅥ得出的。但是，由FⅤ得到了類似的結(jié)果。
顯然，臨床相關劑量的FⅤ和FⅥ可加強VIP-引起的陰道血流增加。
臨床相關劑量的FⅤ和FⅥ還使骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道血流增加加強。
臨床相關劑量的FⅤ和FⅥ還使VIP-引起的和神經(jīng)介導的分離組織的舒張加強。
其他用于試驗并證明有效的化合物包括2-[(1-{[(1-芐基-6-氧代-1,6-二氫3-吡啶基)氨基]羰基)環(huán)戊基)-甲基]-4-甲氧基丁酸(F57)2-{[1-({[3-(2-氧代-1-吡咯烷基)丙基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸(F58)(+)-2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸(F59)2-[(1-{[(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基)環(huán)戊基)-甲基]-4-苯基丁酸(F60)
順-3-(2-甲氧基乙氧基)-2-[(1-{[(4-{[(苯磺酰基)氨基]羰基}環(huán)己基)氨基]羰基}環(huán)戊基)甲基]丙酸(F61)(+)-2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}戊酸(F62)(+)-2-[(1-{[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]戊酸(F63)2-({1-[(3-芐基苯胺基)羰基]環(huán)戊基}甲基)戊酸(F64)2-[(1-{[(1-芐基-6-氧代-1,6-二氫-3-吡啶基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]戊酸(F65)2-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(氨基羰基)-3-丁基環(huán)己基]氨基}羰基)環(huán)戊基]甲基}戊酸(F66)F57-66中的每一個化合物均是I:NEP。合成化合物F57-66在下面的說明中，制備實施例是中間體的合成；而實施例則是本發(fā)明各化合物的合成。實施例12-[(1-{[(1-芐基-6-氧代-1,6-二氫-3-吡啶基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]-4-甲氧基丁酸(F57) 將制備1(1/62)的芐基酯(850mg,1.64mmol)和5％披鈀木炭(250mg)在40％乙醇水溶液(21ml)中的混合物在30psi和室溫下氫化30分鐘。反應混合物經(jīng)Hyflo過濾，減壓蒸發(fā)濾液。殘余的泡沫經(jīng)硅膠柱色譜純化，用二氯甲烷∶甲醇(97∶3)作洗脫劑，得到白色泡沫狀標題化合物，550mg,79％；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)d:1.24-2.17(m,12H),2.18-2.31(m,1H),3.07(s,3H),3.21(t,2H),5.08(s,2H),6.63(d,1H),7.23-7.41(m,5H),7.72(d,1H),8.24(s,1H)。分析實測值C,67.46；H,7.18；N,6.24。C24H30N2O5的理論值C,67.58；H,7.09；N,6.57％。實施例22-{[1-({[3-(2-氧代-1-吡咯烷基)丙基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸(F58) 將制備3(3/67)的芐基酯(780mg,1.55mol)和10％披鈀木炭(100mg)在乙醇∶水(90∶10體積比)(30ml)中的混合物在室溫和60psi氫氣壓下氫化1.5小時。濾出催化劑，減壓蒸發(fā)濾液得到白色泡沫狀標題化合物，473mg,74％；1HNMR (CDCl3,300MHz)d:1.26-1.77(m,10H),1.78-2.46(m,11H),2.49-2.70(m,2H),2.95-3.36(m,4H),6.92-7.38(m,5H)；分析實測值C,64.05；H,7.73；N,6.22。C24H34N2O4；0.75H2O的理論值C,65.88；H,7.83；N,6.40％。實施例3(+)-2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基)-4-苯基丁酸(F59)
使用AD柱以及用己烷∶異丙醇∶三氟乙酸(70∶30∶0.2)作洗脫劑，通過標準HPLC方法，可以純化2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸(WO 9110644)，得到實施例3的標題化合物，99.5％ee；[α]D=+9.1°(c=1.76，乙醇中)。實施例42-[(1-{[(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]-4-苯基丁酸(F60) 將制備4(4/70)的芐基酯(187mg,0.39mmol)和10％披鈀木炭(80mg)在乙醇(20ml)中的混合物在60psi下氫化18小時。Tlc分析表明仍剩余有原料，因此再加入10％披鈀木炭(100mg)，并繼續(xù)反應5小時。再次進行的Tlc分析表明還剩有原料，所以再加入催化劑(100mg)，并繼續(xù)氫化18小時?；旌衔锝?jīng)Arbocel過濾，減壓濃縮濾液，并與二氯甲烷共沸。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜純化，使用Biotage柱，用二氯甲烷∶甲醇(95∶5)作洗脫劑，得到標題化合物，為澄清的油，80mg,53％；1H NMR(CDCl3,300MHz)d:1.51-1.89(m,9H),2.03(m,1H),2.20(m,1H),2.40(m,2H),2.60(m,5H),7.15-7.30(m,5H)；LRMS:m/z387.8(MH+)。實施例5順-3-(2-甲氧基乙氧基)-2-[(1-{[(4-{[(苯磺?；?氨基]羰基}環(huán)己基)氨基]羰基}環(huán)戊基)甲基]丙酸(F61) 將制備8(8/66)的叔丁基酯(446mg,0.75mmol)在二氯甲烷(5ml)和三氟乙酸(5ml)中的溶液在室溫攪拌18小時。減壓濃縮反應混合物，殘余物與二氯甲烷共沸，然后與甲苯共沸，最后與乙醚共沸，得到標題化合物，為白色泡沫，385mg,95％；1H NMR(CDCl3,400MHz)d:1.48-2.17(m,18H),2.40(s,1H),2.66(s,1H),3.37(s,3H),3.50-3.70(m,6H),3.94(s,1H),6.10(d,1H),6.59(s,1H),7.55(t,2H),7.61(m,1H),8.02(d,2H),9.11(s,1H)；分析實測值C,54.88；H,6.90；N,5.04.C26H38N2O8S；1.7H2O理論值C,57.97；H,7.11；N,5.20％。實施例6(+)-2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}戊酸(F62) 使用AD柱，經(jīng)HPLC進一步純化2-{[1-({[2-(羥甲基)-2,3-二氫-1H-茚-2-基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}戊酸(WO9110644)，用己烷∶異丙醇∶三氟乙酸(90∶10∶0.1)作洗脫劑，得到實施例6的標題化合物，99％ee,[α]D=+10.4°(c=0.067，乙醇)。實施例7(+)-2-[(1-{[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]戊酸(F63) 用AD柱，經(jīng)HPLC將制備18的酸(18/ex4)(824mg)進一步純化，使用己烷∶異丙醇∶三氟乙酸(85∶15∶0.2)作洗脫劑，得到實施例7的標題化合物，為白色泡沫，386mg,99％ee,1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.90(t,3H),1.38(m,6H),1.50-1.79(m,9H),2.19(m,1H),2.30(m,1H),2.44(m,1H),2.60(m,1H),2.98(q,2H),12.10-12.27(bs,1H)；LRMS:m/z338(MH-)；并且[α]D=+3.8°(c=0.1，甲醇)。實施例82-({1-[(3-芐基苯胺基)羰基]環(huán)戊基}甲基)戊酸(F64) 將制備10(10/53)的芐基酯(1.3mg,2.47mmol)和5％披鈀木炭(130mg)在水(10ml)和乙醇(40ml)中的混合物在30psi和室溫下氫化2小時。反應混合物經(jīng)Arbocel過濾，減壓濃縮濾液，殘余物用二氯甲烷研制。殘余的膠用乙醚研制，然后用己烷研制，并在50℃干燥，得到固體狀的標題化合物，0.79g,81％；1H NMR(CDCl3,300MHz)d:0.95(t,3H),1.24-1.51(m,3H),1.58-1.80(m,7H),1.88(dd,1H),2.15(m,2H),2.24(m,1H),2.48(m,1H),4.00(s,2H),6.98(d,1H),7.24(m,6H),7.40(m,3H)；分析實測值C,75.48；H,7.76；N,3.59。C25H31NO3；0.25H2O的理論值C,75.44；H,7.98；N,3.51％。實施例92-[(1-{[(1-芐基-6-氧代-1,6-二氫-3-吡啶基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]戊酸(F65) 按照與制備19(19/ex21)所述相似的方法，由制備13(13/56)的芐基酯得到標題化合物，產(chǎn)率51％，為白色泡沫，不同的是，該產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯作洗脫劑；1HNMR(CDCl3,300MHz)d:0.96(t,3H),1.28-1.80(m,12H),2.01(m,1H),2.30-2.52(m,2H),5.02(dd,2H),6.60(d,1H),7.27(m,5H),7.70(s,1H),8.34(s,1H)；分析實測值C,69.52；H,7.41；N,6.51。C24H30N2O4；0.25H2O的理論值C,69.45；H,7.41；N,6.75。實施例102-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(氨基羰基)-3-丁基環(huán)己基]氨基}羰基)環(huán)戊基]甲基}戊酸(F66)按照與制備14(14/ex1)所述類似的方法，由相應的叔丁基酯制備式ic化合物，即其中r1是丙基的通式i化合物。 制備1(1/62)2-[(1-{[(1-芐基-6-氧代-1,6-二氫-3-吡啶基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]-4-甲氧基丁酸芐基酯 向冰冷卻的1-{2-[(芐氧基)羰基]-4-甲氧基丁基}環(huán)戊烷甲酸(EP274234)(1.0g,3.3mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(2滴)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入草酰氯(0.26ml,3.0mmol)，并在室溫攪拌反應物2小時。減壓濃縮溶液，殘余物與二氯甲烷(3×10ml)共沸。將產(chǎn)物溶于二氯甲烷(20ml)中，然后在冰浴中冷卻。加入制備2(2/28)的胺(600mg,3mmol)和N-甲基嗎啉(0.6ml,5.45mmol)，并在室溫攪拌反應物18小時。減壓濃縮反應混合物，并在水和乙醚之間分配。有機層用鹽酸(2N)、碳酸氫鈉溶液、然后用水洗滌，用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)。殘余的綠色固體經(jīng)中壓硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯∶己烷(90∶10)作洗脫劑，得到標題化合物，880mg,57％；1H NMR(CDCl3,300MKz)d:1.37-2.28(m,12H),2.46-2.64(m,1H),3.20(s,3H),3.31(m,2H),4.97(dd,2H),5.08(dd,2H),6.57(d,1H),7.12(m,1H),7.18-7.48(m,10H),8.08(d,1H)。制備2(2/28)5-氨基-1-芐基-2(1H)-吡啶酮 將1-芐基-5-硝基-1H-吡啶-2-酮(Justus Liebigs Ann.Chem.484；1930；52)(1.0g,4.35mmol)和顆粒錫(3.5g,29.5mmol)在濃鹽酸(14ml)中的混合物在90℃加熱1.5小時。冷卻的溶液用水稀釋，用碳酸鈉溶液中和，并用乙酸乙酯(總量250ml)萃取。將合并的有機提取液過濾，用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)，得到標題化合物，為淡綠色固體(隨時間推移變?yōu)樗{色)，440mg,51％；1HNMR(CDCl3,250MHz)δ:4.12-4.47(bs,2H),5.00(s,2H),6.31(d,1H),6.86(s,1H),7.07(m,1H),7.14-7.42(m,5H)。制備3(3/67)2-{[1-({[3-(2-氧代-1-吡咯烷基)丙基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸芐酯 在室溫，向冷卻的1-{2-[(芐氧基)羰基]-4-苯基丁基}環(huán)戊烷甲酸(EP274234)(1.5g,3.94mmol)在無水二氯甲烷(15ml)中的溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(1.06g,5.53mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(0.60g,4.44mmol)和4-甲基嗎啉(0.56g,5.54mmol)，然后加入N-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮(0.56g,3.94mmol)，并在室溫攪拌反應物18小時。該混合物用水、2N鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)。殘余的黃色油經(jīng)硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯∶戊烷(50∶50)作洗脫劑，得到標題化合物，為澄清的膠，800mg,40％；1H NMR(CDCl3,300MHz)d:1.37-2.20(m,16H),2.34-2.58(m,5H),2.92-3.46(m,6H),5.07(d,1H),5.18(d,1H),6.98-7.47(m,10H)。制備4(4/70)2-[(1-{[(5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基]羰基}環(huán)戊基)-甲基]-4-苯基丁酸芐酯 按照與制備5(5/68)所述類似的方法，由1-{2-[(芐氧基)羰基]-4-苯基丁基}環(huán)戊烷甲酸(EP 274234)和2-氨基-5-甲基-1,3,4-噻二唑得到標題化合物，為澄清的油，產(chǎn)率74％；1H NMR(CDCl3,400MHz)d:1.58-1.76(m,7H),1.83-1.98(m,3H),2.03(m,1H),2.20(m,1H),2.35(m,1H),2.44(m,3H),2.65(s,3H),5.02(dd,2H),7.00(d,2H),7.15(m,1H),7.19(m,2H),7.35(m,5H)；LRMS:m/z478.7(MH+)。制備5(5/68)2-{[1-({[3-(甲氨基)-3-氧代丙基]氨基}羰基)環(huán)戊基]-甲基}-4-苯基丁酸芐酯 在室溫，向冷卻的1-{2-[(芐氧基)羰基]-4-苯基丁基}環(huán)戊烷甲酸(EP274234)(202mg,0.53mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(122mg,0.64mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(86mg,0.64mmol)和4-甲基嗎啉(173μl,1.59mmol)，然后加入制備6(6/23)的胺鹽酸鹽(146mg,1.06mmol)，并在90℃攪拌反應物18小時。將該冷卻的溶液減壓濃縮，殘余物在水(20ml)和乙酸乙酯(100ml)之間分配。分離各層，有機相用水(3×30ml)、鹽水(25ml)洗滌，用硫酸鎂干燥，并減壓蒸發(fā)，得到澄清的油。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用二氯甲烷∶甲醇(98∶2)作洗脫劑，得到標題化合物，為無色油，162mg,67％；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:1.38-1.53(m,2H),1.53-1.96(m,8H),2.02(m,2H),2.27(t,2H),2.46(m,3H),2.76(d,3H),3.44(m,2H),5.13(s,2H),5.79(bs,1H),6.38(m,1H),7.06(d,2H),7.18(m,1H),7.22(m,2H),7.38(m,5H)；LRMS:m/z465.5(MH+)。制備6(6/23)3-氨基-N-甲基丙酰胺鹽酸鹽 在50psi和室溫下，將制備7(7/13)的氨基甲酸芐基酯(7.92g,33.5mmol)和5％披鈀木炭(800mg)在乙醇(300ml)中的混合物氫化4小時。反應混合物經(jīng)Arbocel過濾，用乙醇充分洗滌，并向合并的濾液中加入1N鹽酸(36.9ml,36.9mmol)。將該溶液減壓蒸發(fā)，殘余物與二氯甲烷共沸，得到無色泡沫狀的標題化合物，4.66g,1H NMR(DMSOd6,300MHz)δ:2.46(t,2H),2.60(s,3H),2.95(m,2H),7.98-8.16(m,2H)。制備7(7/13)3-(甲氨基)-3-氧代丙基氨基甲酸芐酯 將N-[(芐氧基)羰基]-β-丙氨酸(10g,44.8mmol)、甲胺鹽酸鹽(3.33g,49.28mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(6.05g,44.8mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(10.3g,53.76mmol)和N-甲基嗎啉(11.33ml,103mmol)在二氯甲烷(200ml)中的混合物在室溫攪拌18小時。濾出所得沉淀，得到所需產(chǎn)物，為無色泡沫，減壓蒸發(fā)濾液。殘余物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯∶己烷(90∶10至100∶0)梯度洗脫，得到另外的產(chǎn)物，7.96g，總計75％；1HNMR(CDCl3,300MHz)δ:2.42(t,2H),2.80(s,3H),3.50(m,2H),5.21(s,2H),5.49(bs,1H),5.63(bs,1H),7.36(m,5H)；分析實測值C,60.68；H,7.00；N,11.95。C12H16N2O3的理論值C,61.00；H,6.83；N,11.86％。制備8(8/66)順-3-(2-甲氧基乙氧基)-2-[(1-{[(4-{[(苯磺酰基)氨基]羰基}環(huán)己基)氨基]羰基}環(huán)戊基)甲基]丙酸叔丁酯 向冰冷卻的制備9(9/63)的酸(400mg,0.878mmol)在二氯甲烷(12ml)和N,N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中的溶液加入N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(199mg,0.97mmol)、4-二甲基氨基吡啶(118mg,0.97mmol)和苯磺酰胺(152mg,0.97mmol)，并在室溫攪拌該反應物20小時。將該混合物減壓濃縮，并將殘余物懸浮在冷的乙酸乙酯中。濾出所得不溶物質(zhì)，濾液用鹽酸(1N)和水洗滌，然后用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用二氯甲烷∶甲醇(95∶5至90∶10)梯度洗脫，得到白色泡沫狀標題化合物，480mg,92％；1H NMR(CDCl3,400MHz)d:1.44(s,9H),1.63(m,13H),1.80(m,2H),1.88(m,1H),1.98(m,2H),2.36(m,1H),2.57(m,1H),3.38(s,3H),3.40(m,1H),3.51(t,2H),3.58(m,3H),3.95(m,1H),5.92(d,1H),7.56(m,2H),7.62(m,1H),8.05(d,2H),8.75(bs,1H)；LRMS:m/z 618(MNa+)。制備9(9/63)4-{[(1-{3-叔丁氧基-2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-3-氧代丙基}環(huán)戊基)羰基]氨基}環(huán)己烷甲酸 在50psi和室溫下，將4-{[(1-{3-叔丁氧基-2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-3-氧代丙基}環(huán)戊基)羰基]氨基}環(huán)己烷甲酸芐基酯(EP274234)和10％披鈀木炭(250mg)在水(10ml)和乙醇(50ml)中的混合物氫化18小時。反應混合物經(jīng)Solkafloc過濾，減壓濃縮濾液，殘余物與甲苯(3×)共沸，然后與二氯甲烷(3×)共沸，得到標題化合物，2.0g,96％；1H NMR(CDCl3,300MHz)d:1.48(s,9H),1.53-1.84(m,14H),1.94-2.10(m,5H),2.60(m,2H),3.40(s,3H),3.41-3.63(m,5H),3.96(m,1H),5.90(bd,1H)。制備10(10/53)按照與制備12(12/52)所述相似的方法，由制備11(11/3)的酰氯與合適的胺制備下列化合物 其中 1=用作柱洗脫劑的二氯甲烷制備11(11/3)2-{[1-(氯羰基)環(huán)戊基]甲基}戊酸芐酯 向冰冷卻的1-{2-[(芐氧基)羰基]戊基}環(huán)戊烷甲酸(EP274234)(2.0g,6.3mmol)在無水二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入草酰氯(1.15ml,13.2mmol)，并在室溫攪拌該溶液2小時。減壓濃縮反應混合物，殘余物與二氯甲烷(3x)共沸，得到金色油狀標題化合物，2.1g；1H NMR(CDCl3,300MHz)d:0.88(t,3H),1.28(m,2H),1.43(m,2H),1.63(m,6H),2.00(m,1H),2.08-2.35(m,3H),2.44(m,1H),5.15(s,2H),7.28(m,5H)。制備12(12/52)2-({1-[(3-吡啶基氨基)羰基]環(huán)戊基}甲基)戊酸芐酯 向制備11(11/3)的酰氯(200mg,0.60mmol)和2-氨基吡啶(61mg,0.65mmol)在二氯甲烷(3ml)中的混合物中加入三乙胺(0.11ml,0.78mmol)，并在室溫攪拌反應物16小時。將該混合物減壓蒸發(fā)，殘余物在碳酸氫鈉溶液(5ml)和乙酸乙酯(20ml)之間分配，分離各層。有機相用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)，得到膠。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯作洗脫劑，得到標題化合物，130mg；1H NMR(CDCl3,400MHz) d:0.82(t,3H),1.21(m,3H),1.40(m,1H),1.43-1.72(m,6H),1.81(d,1H),1.98(m,1H),2.18(m,1H),2.24(m,1H),2.46(m,1H),4.98(m,2H),7.20-7.38(m,6H),7.42(s,1H),8.06(d,1H),8.35(d,1H),8.56(s,1H)。制備13(13/56)按照與制備12(12/52)所述類似的方法，由制備11(11/3)的酰氯和適當?shù)陌分苽湎铝谢衔?其中 2=N-甲基嗎啉用作堿制備14(14/exl)2-({1-[(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基氨基)羰基]環(huán)戊基}甲基)戊酸 向制備15(15/34)的叔丁酯(130mg,0.31mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入三氟乙酸(5ml)，并在室溫攪拌該溶液4小時。減壓濃縮反應混合物，殘余物與甲苯共沸，然后與二氯甲烷共沸，得到澄清油狀的標題化合物，112mg,1H NMR(CDCl3,400MHz)δ0.83(t,3H),1.22-1.40(m,3H),1.50-1.72(m,8H),1.95(m,1H),2.10(m,2H),2.19(m,1H),4.30(m,2H),5.93(s,2H),5.99(bs,1H),6.74(m,3H)；LRMS:m/z 380(MH-)。制備15(15/34)按照與制備17(17/33)所述類似的方法，由制備16(16/1)的酸和適當?shù)陌坊衔镏苽湎铝谢衔?其中 制備16(16/1)1-[2-(叔丁氧羰基)-4-戊基]環(huán)戊烷甲酸 在30psi和室溫下，將1-[2-(叔丁氧羰基)-4-戊烯基]環(huán)戊烷甲酸(EP274234)(23g,81.5mmol)和10％披鈀木炭(2g)在無水乙醇(200ml)中的混合物氫化18小時。反應混合物經(jīng)Arbocel過濾，減壓濃縮濾液，得到黃色油。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用乙酸乙酯∶戊烷(40∶60)作洗脫劑，得到所需產(chǎn)物，為澄清的油，21g,91％；1H NMR(CDCl3,0.86(t,3H),1.22-1.58(m,15H),1.64(m,4H),1.78(dd,1H),2.00-2.18(m,3H),2.24(m,1H)；LRMS:m/z 283(M-H)-。制備17(17/33)2-{[1-({[1-(羥甲基)環(huán)戊基]氨基}羰基)環(huán)戊基]甲基}戊酸叔丁酯 向制備16(16/1)的酸(150mg,0.53mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(4lmg,0.21mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(27mg,0.2mmol)、N-甲基嗎啉(35μl,0.31mmol)和1-氨基-1-環(huán)戊烷甲醇(25mg,0.22mmol)，并在90℃攪拌反應物18小時。冷卻的溶液用乙酸乙酯(90ml)稀釋，用水(3×25ml)和鹽水(25ml)洗滌，然后用硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠色譜純化，用乙酸乙酯∶戊烷(30∶70)作洗脫劑，得到標題化合物，38mg,57％；1H NMR(CDCl3,400MHz)d:0.88(t,3H),1.29(m,3H),1.41-1.78(m,26H),1.78-1.98(m,4H),2.04(m,1H),2.26(m,1H),3.59(dd,1H),3.70(dd,1H),4.80(t,1H),5.81(s,1H)；LRMS:m/z 380(MH-)。制備18(18/ex.4)按照與制備14(14/ex.1)所述類似的方法，由相應的叔丁酯制備下式所示的化合物。
3=從乙醚中重結(jié)晶制備19(19/ex.21)2-({1-[(3-芐基苯胺基)羰基]環(huán)戊基}甲基)戊酸 在30psi和室溫下，將制備10(10/53)的芐基酯(1.3mg.2.47mmol)和5％披鈀木炭(130mg)在水(10ml)和乙醇(4ml)中的混合物氫化2小時。反應混合物經(jīng)Arboce1過濾，減壓濃縮濾液，殘余物用二氯甲烷研制。殘余的膠用乙醚研制，然后用己烷研制，并在50℃干燥，得到固體狀的標題化合物，0.79g,81％；1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:0.95(t,3H),1.24-1.51(m,3H),1.58-1.80(m,7H),1.88(dd,1H),2.15(m,2H),2.24(m,1H),2.48(m,1H),4.00(s,2H),6.98(d,1H),7.24(m,6H),7.40(m,3H)；分析實測值C,75.48；H,7.76；N,3.59。C25H31NO3；0.25H2O的理論值C,75.44；H,7.98；N,3.51％。ACE分析由豬和人的腎皮質(zhì)制備可溶性血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)以及分析。
由腎皮質(zhì)得到可溶性ACE活性，并通過測量ACE底物Abz-Gly-對-硝基-Phe-Pro-OH裂解產(chǎn)生其熒光產(chǎn)物Abz-Gly的速度進行分析。1．材料所有的水都是兩次去離子的。1.1人腎IIAM(Pennsylvania.U.S.A.)或UK Human Tissue Bank(UK HTB)1.2豬腎ACE Sigma(A2580)1.3勻漿緩沖液-1100mM甘露糖醇和20mM Tris@pH7.12.42g Tris(Fisher T/P630/60)在1升水中稀釋，并在室溫用6M鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.1。向該溶液中加入18.22g甘露糖醇(Sigma M-9546)。1.4勻漿緩沖液-2100mM甘露糖醇，20mM Tris@pH7.1和10mM MgCl2.6H2O(FisherMO600/53)向500ml勻漿緩沖液1(1.4)中加入1.017g MgCl2。1.5Tris緩沖液(ACE緩沖液)50mM Tris和300mM NaCl@pH7.4將50ml 50mM的Tris pH7.4(Sigma T2663)和17.52g NaCl(FisherS/3160/60)制成1000ml水溶液。1.6底物(Abz-D-Gly-對-硝基-Phe-Pro-OH)(Bachem M-1100)粉末狀的ACE底物貯存于-20℃。將該底物輕輕懸浮于ACE緩沖液中制成2mM儲液，一定不能采用渦旋或聲處理。將400μl等分量的2mM儲液貯存于-20℃最多一個月。1.7最終產(chǎn)物將相應于向產(chǎn)物100％轉(zhuǎn)化的底物樣品置于培養(yǎng)板上以使底物百分之百轉(zhuǎn)化可以被檢測到(見計算結(jié)果)。通過在37℃將1ml 2mM的底物與20μl酶儲液一起孵育24小時產(chǎn)生總體產(chǎn)物。1.8終止溶液用ACE緩沖液將0.5M EDTA(Promega CAS[6081/92/6])稀釋成1∶250，制成2mM溶液。1.9二甲基亞砜(DMSO)1.10氯化鎂-MgCl2.6H2O(Fisher MO600/53)1.11黑色96孔平底培養(yǎng)板(Costar3915或Packard)1.12Topseal A(Packard6005185)1.13離心管2．特殊裝置2.1 Sorvall RC-5B離心機(SS34 GSA轉(zhuǎn)子，預冷卻至4℃)2.2Braun微型(miniprimer)混合器2.3Beckman CS-6R離心機2.4BMG Fluostar Galaxy2.5Wesbart 1589振蕩孵化器3．方法3.1組織制備3.2按照Booth,A.G.&amp;Kenny,A.J.(1974)Biochem.J.142,575-581所述方法，由腎皮質(zhì)制備人ACE。3.3將冷凍的腎在室溫解凍，并將皮質(zhì)與髓質(zhì)剝離。3.4將皮質(zhì)細細地剁碎，并在約10倍體積的勻漿緩沖液1(1.4)中，用Braun微型混合器(2.2)勻漿。3.5向勻漿物質(zhì)中加入氯化鎂(1.11)(20.3mg/gm組織)，并將勻漿物在冰水浴中攪拌15分鐘。3.6在Beckman離心機(2.3)中、以1,500g(3,820rpm)的轉(zhuǎn)速離心勻漿物12分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，并棄去沉淀物。3.7在Sovall離心機(2.1)中、以15,000g(12,100rpm)的轉(zhuǎn)速離心上清液12分鐘，并棄去上清液。3.8取出剩余沉淀物上面一層的淡粉色物質(zhì)，再懸浮于勻漿緩沖液2(1.5)中(每1克組織5ml緩沖液)。3.9在Beckman離心機中、以2,200g(4,630rpm)的轉(zhuǎn)速離心該懸浮液12分鐘，然后棄去沉淀物。3.10在Sovall離心機(2.1)中、以15,000g(12,l00rpm)的轉(zhuǎn)速離心上清液12分鐘，并棄去上清液。3.11將最終的沉淀物再懸浮于勻漿緩沖液2中(每1克組織0.5ml緩沖液)。用Braun微型混合器得到均質(zhì)懸浮液。以100μl的等分量將該懸浮液冷凍，用于進行NEP活性分析。4.0ACE活性測定通過裂解ACE特異性肽底物的能力，對前面等分量的ACE活性進行測定。
將豬ACE(1.2)解凍并以0.004U/μl的量再懸浮于ACE緩沖液(1.6)中，將所得物質(zhì)以50μl的等分量冷凍。4.1制備4％DMSO/ACE緩沖溶液(4ml DMSO在96ml ACE緩沖液中)4.2底物(1.7)、最終產(chǎn)物(1.8)和酶(1.1,1.2,1.3)在冰上解凍4.3向每孔中加入50μl 4％ DMSO/ACE緩沖溶液4.4將2mM底物儲液稀釋1∶100，制成20μM溶液。向每孔中加入100μl 20μM底物(分析用的最終濃度為10μM)4.5加入50μl的系列酶稀釋液使反應開始(通常使用1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600和1∶3200的稀釋液)。向空白孔中加入50μl ACE緩沖液。4.6將2mM的最終產(chǎn)物稀釋1∶200，制成10μM溶液。向一個新板的前4個孔中加入200μl 10μM的產(chǎn)物。4.7在振蕩孵化器中于37℃將培養(yǎng)板孵育60分鐘。4.8通過加入在ACE緩沖液中的100μl 2mM EDTA終止酶反應，并在振蕩孵化器中于37℃孵育20分鐘，然后在BMG Fluostar Galaxy上讀數(shù)(ex320/em420)。5.ACE抑制分析5.1將底物、最終產(chǎn)物和酶儲液在冰上解凍。5.2在100％DMSO中制備化合物儲液，并用ACE緩沖液稀釋1∶25，得到4％DMSO溶液。其他所有的稀釋均用4％ DMSO/ACE緩沖溶液(4ml DMSO在96ml ACE緩沖液中)配制。5.3一式兩份，將50μl化合物加入96孔培養(yǎng)板中，并向?qū)φ蘸涂瞻卓字屑尤?0μl 4％ DMSO/ACE緩沖液。5.4手工或使用Packard多探頭機器人進行步驟5.2和5.3。5.5用ACE緩沖液將2mM底物儲液稀釋1∶100，制成20μM溶液(10μM最終分析濃度)(對于一只板，向10.89ml緩沖液中加入110μl 2mM底物就足夠了)。5.6用ACE緩沖液稀釋酶儲液，如活性檢查所測定的(4.0)。5.7用ACE緩沖液將2mM最終產(chǎn)物儲液稀釋1∶200，制成10μM溶液。向另一板的前4個孔中加入200μl該溶液。5.8將0.5mMEDTA儲液稀釋1∶250，制成2mM儲液(將44μl EDTA加入10.96mlACE緩沖液中)。5.9向96孔板的每一孔中加入下列試劑表1向96孔板中加入下列試劑
5.10一式兩份，向同樣的96孔板中加入50μl最高濃度的每種分析化合物，作為總的結(jié)果(5.7)。加入150μl ACE緩沖液以測定每一化合物的熒光。5.11加入ACE酶使反應開始，然后在振蕩孵化器中于37℃孵育1小時。5.12加入100μ1 2mM EDTA終止反應，并在振蕩孵化器中于37℃孵育20分鐘，然后在BMG Fluostar Galaxy(ex320/em420)上讀數(shù)。6．計算在有或無化合物存在下測定ACE酶的活性，并以百分數(shù)表示。FU=熒光單位(ⅰ)％對照活性(酶的轉(zhuǎn)換值) (ⅱ)有抑制劑的％活性 (ⅲ)以對照的％表示的活性 或 (ⅳ)％抑制=100-％對照(ⅴ)對于熒光化合物，將含有化合物的空白的平均FU(5.10)從化合物的平均FU值中扣除，以計算％活性。
由％活性(對照的％)對化合物濃度繪制S形量效曲線，并用LabStats擬合曲線在Excel中計算IC50值。結(jié)論我們研制了一種動物模型，該模型反映出在雌性性喚起過程中觀察到的生理學喚起反應并直接反映出在人類志愿者中觀察到的臨床數(shù)據(jù)。該模型使用激光多普勒技術，以記錄骨盆神經(jīng)刺激或血管活性神經(jīng)遞質(zhì)引起的陰道和陰蒂血流的微小變化。在性喚起過程中，由骨盆神經(jīng)的神經(jīng)支配增加引起生殖器血流增加。在動物模型中觀察到的骨盆神經(jīng)刺激引起的陰道和陰蒂血流增加代表了在雌性性喚起-即充血過程中觀察到的內(nèi)源性血管作用。因此，該模型首先可用于確定與陰道和陰蒂血流調(diào)節(jié)有關的機理，第二可用于驗證使生殖器血流增加的新的途徑。
該研究已成功地將體內(nèi)、體外和生物化學技術結(jié)合在一起，用于表明VIP介導生殖器血流變化，并確定了cAMP是調(diào)節(jié)生殖器血管舒張(和陰道壁舒張)的介質(zhì)/第二信使。使用該動物模型，我們證實了VIP的輸注可引起陰道和陰蒂血流增加。使用VIP代謝抑制劑(例如NEP EC3.4.24.11抑制劑)，我們還證明了在骨盆神經(jīng)刺激(即性喚起)過程中觀察到的生殖器血流增加是由VIP介導的。我們已經(jīng)表明，VIP-介導的生殖器血流增加是由組織cAMP升高造成的，而先前已經(jīng)表明VIP可使健康志愿者的陰道血流增加，但是其細胞作用機理尚不清楚。此外，我們還證明了，可以用cAMP模擬物直接增加生殖器血流，或者通過用2型PDEcAMP抑制劑或NPY Y1受體拮抗劑升高cAMP的濃度而間接增加生殖器血流。
FSAD的主要起因是生殖器血流減少，這本身可以由陰道、陰唇和陰蒂充血減少得以證明。通過恢復正常的性喚起響應可以治療患FSAD的婦女。這可以通過增加生殖器血流得以實現(xiàn)。我們治療FSAD的途徑將是例如，使用NEP(EC3.4.24.11)抑制劑、水解cAMP的PDE的抑制劑或NPY受體拮抗劑直接或間接加強內(nèi)源性cAMP信號傳輸，以增強生殖器血流，因而加強陰道充血/潤滑以及陰蒂充血/敏感性。這將具有恢復或加強正常性喚起響應的總體效果，而不具有心血管副作用。性喚起/充血將會被加強，而不是簡單地在缺乏性沖動的情況下引起，而在服用某些外源性血管活性劑例如VIP即會出現(xiàn)后面的情況。
總而言之，本發(fā)明尤其涉及以下方面用于(或當使用時)治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物組合物；該藥物組合物含有能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。
活性劑在制備用于治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強。
雌性(例如患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性)的治療方法；該方法包括給所述雌性施用能夠使性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中活性劑的用量為引起雌性性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。
在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明尤其涉及用于(或當使用時)治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物組合物；該藥物組合物含有能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥。
活性劑在制備用于治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥。
雌性(例如患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性)的治療方法；該方法包括給所述雌性施用能夠使性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中活性劑的用量為引起雌性性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥。
在另一特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明尤其涉及用于(或當使用時)治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物組合物；該藥物組合物含有能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
活性劑在制備用于治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強；并且其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
雌性(例如患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性)的治療方法；該方法包括給所述雌性施用能夠使性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中活性劑的用量為引起雌性性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
在又一特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明尤其涉及用于(或當使用時)治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物組合物；該藥物組合物含有能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥以及其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
活性劑在制備用于治療FSD、優(yōu)選FSAD的藥物中的應用；其中所述活性劑能使患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性性生殖器中cAMP作用加強；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥以及其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
雌性(例如患FSD、優(yōu)選FSAD的雌性)的治療方法；該方法包括給所述雌性施用能夠使性生殖器中cAMP作用加強的活性劑；其中活性劑的用量為引起雌性性生殖器中cAMP作用加強的量；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述活性劑經(jīng)口服給藥以及其中所述活性劑可加強內(nèi)源性cAMP作用。
在上面的說明書中所提及的所有出版物均引入本文作為參考。那些不背離本發(fā)明范圍和精神的對本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)進行的各種修飾和改變對于本領域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。盡管已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明進行了描述，但是應該理解，本發(fā)明的權利要求不能不適當?shù)叵抻谶@些具體實施方式
。事實上，那些對生物化學和生物技術領域的專業(yè)人員顯而易見的、對所述實施本發(fā)明的方法進行的各種修飾將包括在下列權利要求的范圍內(nèi)。
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=磷酸二酯酶PDEn=PDE家族(例如PDE1、PDE2等)PDEcAMP=cAMP水解性PDEPDEcGMP=cGMP水解性PDEPDEcAMPi=cAMP水解性PDE的抑制劑PDEcGMPi=cGMP水解性PDE的抑制劑I:PDEcAMP=cAMP水解性PDE的抑制劑I:PDEcAMP=cAMP水解性PDE家族的抑制劑NPY =神經(jīng)肽YNPYr=NPY受體(可以表示為NPYR)NPY Yn=NPY的Yn(例如NPY Y1)受體亞型(例如NPYR1)I:NPY =NPY抑制劑I:NPY Yn=NPY Yn抑制劑kDa =千道爾頓bp =堿基對kb =千堿基對序列表1．NEP(EC3.4.24.11)基因座 HSMRNAEN3181 bp mRNA PRI12-SEP-1993定義人腦啡肽酶mRNA(EC3.4.24.11).登記號 X07166NID g34757譯本X07166.1 GI:34757關鍵詞 腦啡肽酶；金屬蛋白質(zhì)；神經(jīng)內(nèi)肽酶來源人生物體 Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比1(bases 1 to 3181)作者 Malfroy,B.,Kuang,W.J.,Seeburg,P.H.,Mason,A.J.and Schofield,P.R.題目 人腦啡肽酶(神經(jīng)內(nèi)肽酶)的分子克隆和氨基酸序列雜志 FEBS Lett.229(1),206-210(1988)MEDLINE 88152222特征Location/Qualifiers來源1..3181/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″/組織型=″placenta″/克隆文庫=″lambda gt10″/克隆=″lambda H7″CDS 18..2249/note=″腦啡肽酶(AA 1-743)″/密碼起始=1/蛋白質(zhì)號=CAA30157.1″/db_xref=″PID:g34758″/db_xref=″GI:34758″/db_xref=″SWISS-PROT:P08473″/翻譯=″MDITDINTPKPKKKQRWTPLEISLSVLVLLLTIIAVTMIALYATYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW"misc_feature3073..3078/note=″poly A信號″堿基數(shù)1055 a 582 c 657 g 887 t來源1 gcaagtcaga aagtcagatg gatataactg atatcaacac tccaaagcca aagaagaaac61 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Loughney,K.,Martins,T.J.,Harris,E.A.,Sadhu,K.,Hicks,J.B.,Sonnenburg,W.K.,Beavo,J.A.和Ferguson,K.題目 與兩種人體調(diào)節(jié)鈣，鈣調(diào)蛋白，3‘,5‘-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶對應的cDNA的分離和表征雜志 J.Biol.Chem.271(2),796-806(1996)MEDLINE 96132810參比 2(bases 1 to 2008)作者Loughney,K.,Martins,T.J.,Harris,E.A.S.,Sadhu,K.,Hicks,J.B.,Sonnenburg,W.K.,Beavo,J.A.和Ferguson,K.題目 Direct Submission雜志 Submitted(07-NOV-1995)Kate Loughney,ICOS,22021 20th Ave.S.E.,Bothell,WA 98021,USA特征 Location/Qualifiers來源 1..2008/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″基因 85..1692/基因=″PDE1A″CDS 85..1692/基因=″PDE1A″/note=″PDE1A3；Ⅰ型磷酸二酯酶″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″3’,5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶″/蛋白質(zhì)號=″AAC50436.1″/db_xref=″PID:g1151109″/db_xref=″GI:1151109″/翻譯=″MGSSATEIEELENTTFKYLTGEQTEKMWQRLKGILRCLVKQLERGDVNVVDLKKNIEYAASVLEAVYIDETRRLLDTEDELSDIQTDSVPSEVRDWLASTFTRKMGMTKKKPEEKPKFRSIVHAVQAGIFVERMYRKTYHMVGLAYPAAVIVTLKDVDKWSFDVFALNEASGEHSLKFMIYELFTRYDLINRFKIPVSCLITFAEALEVGYSKYKNPYHNLIHAADVTQTVHYIMLHTGIMHWLTELEILAMVFAAAIHDYEHTGTTNNFHIQTRSDVAILYNDRSVLENHHVSAAYRLMQEEEMNILINLSKDDWRDLRNLVIEMVLSTDMSGHFQQIKNIRNSLQQPEGIDRAKTMSLILHAADISHPAKSWKLHYRWTMALMEEFFLQGDKEAELGLPFSPLCDRKSTMVAQSQIGFIDFIVEPTFSLLTDSTEKIVIPLIEEASKAETSSYVASSSTTIVGLHIADALRRSNTKGSMSDGSYSPDYSLAAVDLKSFKNNLVDIIQQNKERWKELAAQEARTSSQKCEFIHQ"堿基數(shù) 627 a 400 c 437 g544 t來源1 gaattctgat gtgcttcagt gcacagaaca gtaacagatg agctgctttt ggggagagct61 tgagtactca gtcggagcat catcatgggg tctagtgcca cagagattga agaattggaa121 aacaccactt ttaagtatct tacaggagaa cagactgaaa aaatgtggca gcgcctgaaa181 ggaatactaa gatgcttggt gaagcagctg gaaagaggtg atgttaacgt cgtcgactta241 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catttgtctt taccgagtgc1981 caataaattt tctttgagca aaaaaaaa3．PDE 2型基因座 HSU677 33 4240 bp mRNA PRI21-MAY-1997定義人cGMP-刺激的3‘,5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶PDE2A3(PDE2A)mRNA,完全的cds登記號 U67733NIDg2108051譯本U6773 3.1 GI:2108051關鍵詞.來源人生物體 Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比1(bases 1 to 4240)作者 Rosman,G.J.,Martins,T.J.,Sonnenburg,W.K.,Beavo,J.A.,Ferguson,K.
and Loughney,K.題目編碼cGMP-刺激的3‘,5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的人cDNA的分離和表征雜志Gene191(1),89-95(1997)MEDLINE 97354299參比2(bases 1 to 4240)作者Rosman,G.J.,Martins,T.J.,Sonnenburg,W.K.,Beavo,J.A.,Ferguson,K.
and Loughney,K.題目Direct Submission雜志Submitted(21-AUG-1996)Icos Corporation,22021 20th Ave.S.E.,Bothell,WA 98021,USA特征Location/Qualifiers來源1..4240/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″基因 162..2987/基因=″PDE2A″CDS 162..2987/基因=″PDE2A″/功能=″cGMP-刺激的3’,5’-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶″/note=″PDE2家族；剪接變體3″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″PDE2A3″/蛋白質(zhì)號=″AAC51320.1″/db_xref=″PID:g2108052″/db_xref=″GI:2108052″/翻譯=″MGQACGHSILCRSQQYPAARPAEPRGQQVFLKPDEPPPPPQPCADSLQDALLSLGSVIDISGLQRAVKEALSAVLPRVETVYTYLLDGESQLVCEDPPHELPQEGKVREAIISQKRLGCNGLGFSDLPGKPLARLVAPLAPDTQVLVMPLADKEAGAVAAVILVHCGQLSDNEEWSLQAVEKHTLVALRRVQVLQQRGPREAPRAVQNPPEGTAEDQKGGAAYTDRDRKILQLCGELYDLDASSLQLKVLQYLQQETRASRCCLLLVSEDNLQLSCKVIGDKVLGEEVSFPLTGCLGQVVEDKKSIQLKDLTSEDVQQLQSMLGCELQAMLCVPVISRATDQVVALACAFNKLEGDLFTDEDEHVIQHCFHYTSTVLTSTLAFQKEQKLKCECQALLQVAKNLFTHLDDVSVLLQEIITEARNLSNAEICSVFLLDQNELVAKVFDGGVVDDESYEIRIPADQGIAGHVATTGQILNIPDAYAHPLFYRGVDDSTGFRTRNILCFPIKNENQEVIGVAELVNKINGPWFSKFDEDLATAFSIYCGISIAHSLLYKKVNEAQYRSHLANEMMMYHMKVSDDEYTKLLHDGIQPVAAIDSNFASFTYTPRSLPEDDTSMAILSMLQDMNFINNYKIDCPTLARFCLMVKKGYRDPPYHNWMHAFSVSHFCYLLYKNLELTNYLEDIEIFALFISCMCHDLDHRGTNNSFQVASKSVLAALYSSEGSVMERHHFAQAIAILNT
HGCNIFDHFSRKDYQRMLDLMRDIILATDLAHHLRIFKDLQKMAEVGYDRNNKQHHRLLLCLLMTSCDLSDQTKGWKTTRKIAELIYKEFFSQGDLEKAMGNRPMEMMDREKAYIPELQISFMEHIAMPIYKLLQDLFPKAAELYERVASNREHWTKVSHKFTIRGLPSNNSLDFLDEEYEVPDLDGTRAPINGCCSLDAE"堿基數(shù)902 a1260 c1202 g876 t來源1 cagcagagct ggattggggt gttgagtcca ggctgagtag ggggcagccc actgctcttg61 gtccctgtgc ctgctggggg tgccctgccc tgaactccag gcagcgggga cagggcgagg121 tgccacctta gtctggctgg ggaggcggac gatgaggagc gatggggcag gcatgcggcc181 actccatcct ctgcaggagc cagcagtacc cggcagcgcg accggctgag ccgcggggcc241 agcaggtctt cctcaagccg gacgagccgc cgccgccgcc gcagccatgc gccgacagcc301 tgcaggacgc cttgctgagt ctgggctctg tcatcgacat ttcaggcctg caacgtgctg361 tcaaggaggc cctgtcagct gtgctccccc gagtggaaac tgtctacacc tacctactgg421 atggtgagtc ccagctggtg tgtgaggacc ccccacatga gctgccccag gaggggaaag481 tccgggaggc tatcatctcc cagaagcggc tgggctgcaa tgggccgggc ttctcagacc541 tgccagggaa gcccttggcc aggctggtgg ctccactggc tcctgatacc caagtgctgg601 tcatgccgct agcggacaag gaggctgggg ccgtggcagc tgtcatcttg gtgcactgtg661 gccagctgag tgataatgag gaatggagcc tgcaggcggt ggagaagcat accctggtcg721 ccctgcggag ggtgcaggtc ctgcagcagc gcgggcccag ggaggctccc cgagccgtcc781 agaacccccc ggaggggacg gcggaagacc agaagggcgg ggcggcgtac accgaccgcg841 accgcaagat cctccaactg tgcggggaac tctacgacct ggatgcctct tccctgcagc901 tcaaagtgct ccaatacctg cagcaggaga cccgggcatc ccgctgctgc ctcctgctgg961 tgtcggagga caatctccag ctttcttgca aggtcatcgg agacaaagtg ctcggggaag1021 aggtcagctt tcccttgaca ggatgcctgg gccaggtggt ggaagacaag aagtccatcc1081 agctgaagga cctcacctcc gaggatgtac aacagctgca gagcatgttg ggctgtgagc1141 tgcaggccat gctctgtgtc cctgtcatca gccgggccac tgaccaggtg gtggccttgg1201 cctgcgcctt caacaagcta gaaggagact tgttcaccga cgaggacgag catgtgatcc1261 agcactgctt ccactacacc agcaccgtgc tcaccagcac cctggccttc cagaaggaac1321 agaaactcaa gtgtgagtgc caggctcttc tccaagtggc aaagaacctc ttcacccacc1381 tggatgacgt ctctgtcctg ctccaggaga tcatcacgga ggccagaaac ctcagcaacg1441 cagagatctg ctctgtgttc ctgctggatc agaatgagct ggtggccaag gtgttcgacg1501 ggggcgtggt ggatgatgag agctatgaga tccgcatccc ggccgatcag ggcatcgcgg1561 gacacgtggc gaccacgggc cagatcctga acatccctga cgcatatgcc catccgcttt1621 tctaccgcgg cgtggacgac agcaccggct tccgcacgcg caacatcctc tgcttcccca1681 tcaagaacga gaaccaggag gtcatcggtg tggccgagct ggtgaacaag atcaatgggc1741 catggttcag caagttcgac gaggacctgg cgacggcctt ctccatctac tgcggcatca1801 gcatcgccca ttctctccta tacaaaaaag tgaatgaggc tcagtatcgc agccacctgg1861 ccaatgagat gatgatgtac cacatgaagg tctccgacga tgagtatacc aaacttctcc1921 atgatgggat ccagcctgtg gctgccattg actccaattt tgcaagtttc acctataccc1981 ctcgttccct gcccgaggat gacacgtcca tggccatcct gagcatgctg caggacatga2041 atttcatcaa caactacaaa attgactgcc cgaccctggc ccggttctgt ttgatggtga2101 agaagggcta ccgggatccc ccctaccaca actggatgca cgccttttct gtctcccact2161 tctgctacct gctctacaag aacctggagc tcaccaacta cctcgaggac atcgagatct2221 ttgccttgtt tatttcctgc atgtgtcatg acctggacca cagaggcaca aacaactctt2281 tccaggtggc ctcgaaatct gtgctggctg cgctctacag ctctgagggc tccgtcatgg2341 agaggcacca ctttgctcag gccatcgcca tcctcaacac ccacggctgc aacatctttg2401 atcatttctc ccggaaggac tatcagcgca tgctggatct gatgcgggac atcatcttgg2461 ccacagacct ggcccaccat ctccgcatct tcaaggacct ccagaagatg gctgaggtgg2521 gctacgaccg aaacaacaag cagcaccaca gacttctcct ctgcctcctc atgacctcct2581 gtgacctctc tgaccagacc aagggctgga agactacgag aaagatcgcg gagctgatct2641 acaaagaatt cttctcccag ggagacctgg agaaggccat gggcaacagg ccgatggaga2701 tgatggaccg ggagaaggcc tatatccctg agctgcaaat cagcttcatg gagcacattg2761 caatgcccat ctacaagctg ttgcaggacc tgttccccaa agcggcagag ctgtacgagc2821 gcgtggcctc caaccgtgag cactggacca aggtgtccca caagttcacc atccgcggcc2881 tcccaagtaa caactcgctg gacttcctgg atgaggagta cgaggtgcct gatctggatg2941 gcactagggc ccccatcaat ggctgctgca gccttgatgc tgagtgatcc cctccaggac3001 acttccctgc ccaggccacc tcccacagcc ctccactggt ctggccagat gcactgggaa3061 cagagccacg ggtcctgggt cctagaccag gacttcctgt gtgaccctgg acaagtacta3121 ccttcctggg cctcagcttt ctcgtctgta taatggaagc aagacttcca acctcacgga3181 gactttgtaa tttgcttctc tgagagcaca ggggtgacca atgagcagtg ggccctactc3241 tgcacctctg accacacctt ggcaagtctt tcccaagcca ttctttgtct gagcagcttg3301 atggtttctc cttgccccat ttctgcccca ccagatcttt gctcctttcc ctttgaggac3361 tcccaccctt tgggtctcca ggatcctcat ggaaggggaa ggtgagacat ctgagtgagc3421 agagtgtggc atcttggaaa cagtccttag ttctgtggga ggactagaaa cagccgcggc3481 gaaggccccc tgaggaccac tactatactg atggtgggat tgggacctgg gggatacagg3541 ggccccagga agaagctggc cagaggggca gctcagtgct ctgcagagag gggccctggg3601 gagaagcagg atgggattga tgggcaggag ggatccccgc actgggagac aggcccaggt3661 atgaatgagc cagccatgct tcctcctgcc tgtgtgacgc tgggcgagtc tcttcccctg3721 tctgggccaa acagggagcg ggtaagacaa tccatgctct aagatccatt ttagatcaat3781 gtctaaaata gctctatggc tctgcggagt cccagcagag gctatggaat gtttctgcaa3841 ccctaaggca cagagagcca accctgagtg tctcagaggc cccctgagtg ttccccttgg3901 cctgagcccc ttacccattc ctgcagccag tgagagacct ggcctcagcc tggcagcgct3961 ctcttcaagg ccatatccac ctgtgccctg gggcttggga gaccccatag gccgggactc4021 ttgggtcagc ccgccactgg cttctctctt tttctccgtt tcattctgtg tgcgttgtgg4081 ggtgggggag ggggtccacc tgccttacct ttctgagttg cctttagaga gatgcgtttt4141 tctaggactc tgtgcaactg tcgtatatgg tcccgtgggc tgaccgcttt gtacatgaga4201 ataaatctat ttctttctac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa4．NPY基因座 HUMNPY551 bp mRNAPRI07-JAN-1995定義 人神經(jīng)肽Y(NPY)mRNA，完全的cds登記號 K01911NIDg189273譯本 K01911.1 GI:189273關鍵詞 神經(jīng)肽Y.來源 Human pheochromocytema,cDNA to mRNA,clone pNPY3-75.生物體 Homo sapiensEukaryota； Metazoa； Chordata； Craniata； Vertebrata；Mammalia；Eutberia；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 551)作者Minth,C.D.,Bloom,S.R.,Polak,J.M.and Dixon,J.E.題目編碼神經(jīng)肽酪氨酸的克隆、表征和DNA序列雜志 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(14),4577-4581(1984)MEDLINE84272678注釋 神經(jīng)肽Y(NPY)是一種哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的肽，其廣泛分布的特點暗示起神經(jīng)傳遞或調(diào)節(jié)作用。NPY在腎上腺髓質(zhì)的某些嗜鉻細胞中也被發(fā)現(xiàn)。特征 Location/Qualifiers來源 1..551/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″/組織型=″嗜鉻細胞瘤″/map=″7pter-q22″mRNA＜1..551/基因=″NPY″/note=″GOO-119-456″基因 1..551/基因=″NPY″信號肽 87..170/基因=″NPY″/note=″GOO-119-456″
CDS 87..380/基因=″NPY″/編碼起始=1/db_xref=″GDB:GOO-119-456″/產(chǎn)物=″神經(jīng)肽Y″/蛋白質(zhì)號=″AAA59944.1″/db_xref=″PID:g189274″/db_xref=″GI:189274″/翻譯=″MLGNKRLGLSGLTLALSLLVCLGALAEAYPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRYGKRSSPETLISDLLMRESTENVPRTRLEDPAMW″成熟肽171..278/基因=″NPY″/note=″GOO-119-456″/產(chǎn)物=″神經(jīng)肽Y″堿基數(shù)131 a171 c129 g120 t來源RsaⅠ位點上游51bp1 accccatccg ctggctctca cccctcggag acgctcgccc gacagcatag tacttgccgc61 ccagccacgc ccgcgcgcca gccaccatgc taggtaacaa gcgactgggg ctgtccggac121 tgaccctcgc cctgtccctg ctcgtgtgcc tgggtgcgct ggccgaggcg tacccctcca181 agccggacaa cccgggcgag gacgcaccag cggaggacat ggccagatac tactcggcgc241 tgcgacacta catcaacctc atcaccaggc agagatatgg aaaacgatcc agcccagaga301 cactgatttc agacctcttg atgagagaaa gcacagaaaa tgttcccaga actcggcttg361 aagaccctgc aatgtggtga tgggaaatga gacttgctct ctggcctttt cctattttca421 gcccatattt catcgtgtaa aacgagaatc cacccatcct accaatgcat gcagccactg481 tgctgaattc tgcaatgttt tcctttgtca tcattgtata tatgtgtgtt taaataaagt541 atcatgcatt c5．NPY Y1受體基因座A264812624 bpmRNA PAT17-OCT-1995定義 人NPY受體Y1基因cDNA.登記號A26481NID g1247452譯本 A26481.1 GI:1247452關鍵詞來源 人生物體 Homo sapiensEukaryota； Metazoa；Chordata；Vertebrata；Mammlia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 2624)作者 ．題目 人神經(jīng)肽Y-Y1受體雜志 專利:WO 9309227-A3 13-MAY-1993；特征 Location/Qualifiers來源 1..2624/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″CDS152..1306/編碼起始=1/產(chǎn)物=″神經(jīng)肽Y Y1受體″/蛋白質(zhì)號=″CAA01819.1″/db_xref=″PID:e205126″/db_xref=″PID:g1247453″/db_xref=″GI:1247453″/db_xref=″SWISS-PROT:P25929″/翻譯=″MNSTLFSQVENHSVHSNFSEKNAQLLAFENDDCHLPLAMIFTLALAYGAVIILGVSGNLALIIIILKQKEMRNVTNILIVNLSFSDLLVAIMCLPFTFVYTLMDHWVFGEAMCKLNPFVQCVSITVSIFSLVLIAVERHQLIINPRGWRPNNRHAYVGIAVIWVLAVASSLPFLIYQVMTDEPFQNVTLDAYKDKYVCFDQFPSDSHRLSYTTLLLVLQYFGPLCFIFICYFKIYIRLKRRNNMMDKMRDNKYRSSETKRINIMLLSIVVAFAVCWLPLTIFNTVFDWNHQIIATCNHNLLFLLCHLTAMISTCVNPIFYGFLNKNFQRDLQFFFNFCDFRSRDDDYETIAMSTMHTDVSKTSLKQASPVAFKKINNNDDNEKI"堿基數(shù)791 a 479 c 473 g 878 t3 others來源1 attgttcagt tcaagggaat gaagaattca gaataatttt ggtaaatgga ttccaatatc61 gggaataaga ataagctgaa cagttgacct gctttgaaga aacatactgt ccatttgtct121 aaaataatct ataacaacca aaccaatcaa aatgaattca acattatttt cccaggttga181 aaatcattca gtccactcta atttctcaga gaagaatgcc cagcttctgg cttttgaaaa241 tgatgattgt catctgccct tggccatgat atttacctta gctcttgctt atggagctgt301 gatcattctt ggtgtctctg gaaacctggc cttgatcata atcatcttga aacaaaagga361 gatgagaaat gttaccaaca tcctgattgt gaacctttcc ttctcagact tgcttgttgc421 catcatgtgt ctccccttta catttgtcta cacattaatg gaccactggg tctttggtga481 ggcgatgtgt aagttgaatc cttttgtgca atgtgtttca atcactgtgt ccattttctc541 tctggttctc attgctgtgg aacgacatca gctgataatc aaccctcgag ggtggagacc601 aaataataga catgcttatg taggtattgc tgtgatttgg gtccttgctg tggcttcttc661 tttgcctttc ctgatctacc aagtaatgac tgatgagccg ttccaaaatg taacacttga721 tgcgtacaaa gacaaatacg tgtgctttga tcaatttcca tcggactctc ataggttgtc781 ttataccact ctcctcttgg tgctgcagta ttttggtcca ctttgtttta tatttatttg841 ctacttcaag atatatatac gcctaaaaag gagaaacaac atgatggaca agatgagaga901 caataagtac aggtccagtg aaaccaaaag aatcaatatc atgctgctct ccattgtggt961 agcatttgca gtctgctggc tccctcttac catctttaac actgtgtttg attggaatca1021 tcagatcatt gctacctgca accacaatct gttattcctg ctctgccacc tcacagcaat1081 gatatccact tgtgtcaacc ccatatttta tgggttcctg aacaaaaact tccagagaga1141 cttgcagttc ttcttcaact tttgtgattt ccggtctcgg gatgatgatt atgaaacaat1201 agccatgtcc acgatgcaca cagatgtttc caaaacttct ttgaagcaag caagcccagt1261 cgcatttaaa aaaatcaaca acaatgatga taatgaaaaa atctgaaact acttatagcc1321 tatggtcccg gatgacatct gtttaaaaac aagcacaacc tgcaacatac tttgattacc1381 tgttctccca aggaatgggg ttgaaatcat ttgaaaatga ctaagatttt cttgtcttgc1441 ttttttactg cttttgttgt agtgtcataa ttacatttgg aacaaaaggt gtgggctttg1501 gggtcttctg gaaatagttt tgaccagaca tctttgaagt gctttttgtg aatttatgca1561 tataatataa agacttttat actgtactta ttggaatgaa atttctttaa agtattacga1621 tnnnctgact tcagaagtac ctgccatcca atacggtcat tagattgggt catcttgatt1681 agattagatt agattagatt gtcaacagat tgggccatcc ttactttatg ataggcatca1741 ttttagtgtg ttacaatagt 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tattaaaatc aagg6．NPY Y2受體基因座HSU362691200 bp mRNA PRI14-NOV-1995定義 人神經(jīng)肽Y/肽YY Y2受體mRNA，完全的cds.登記號U36269NID g1063633譯本 U36269.1 GI:1063633關鍵詞．來源 人生物體 Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 1200)作者 Gerald,C.,Walker,M.W.,Vaysse,P.J.,He,C.,Branchek,T.A.andWeinshank,R.L.題目 人海馬神經(jīng)肽Y/肽YY Y2受體亞型的表達克隆和藥理特性雜志 J.Biol.Chem.270(45),26758-26761(1995)MEDLINE 96070760參t 2(bases 1 to 1200)作者 Gerald,C.A.題目 Direct Submission雜志 Submitted(13-SEP-1995)Christophe A.Gerald,SynapticPharmaceutical Corporation,Molecular Biology,215 College Road,Paramus,NJ 07652,USA特征 Location/Qualifiers來源 1..1200/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″
/克隆=″hhY2″/sex=″male″/組織型=″brain hippocampus″/dev_stage=″adult″5′UTR1..20CDS 21..1166/note=″NPY/PYY Y2 receptor″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″neuropeptide Y/peptide YY Y2 receptor″/蛋白質(zhì)號=″AAC50281.1″/db_xref=″PID:g1063634″/db_xref=″GI:1063634″/翻譯=″MGPIGAEADENQTVEEMKVEQYGPQTTPRGELVPDPEPELIDSTKLIEVQVVLILAYCSIILLGVIGNSLVIHVVIKFKSMRTVTNFFIANLAVADLLVNTLCLPFTLTYTLMGEWKMGPVLCHLVPYAQGLAVQVSTITLTVIALDRHRCIVYHLESKISKRISFLIIGLAWGISALLASPLAIFREYSLIEIIPDFEIVACTEKWPGEEKSIYGTVYSLSSLLILYVLPLGIISFSYTRIWSKLKNHVSPGAANDHYHQRRQKTTKMLVCVVVVFAVSWLPLHAFQLAVDIDSQVLDLKEYKLIFTVFHIIAMCSTFANPLLYGWMNSNYRKAFLSAFRCEQRLDAIHSEVSVTFKAKKNLEVRKNSGPNDSFTEATNV″3′UTR1164..1200堿基數(shù)292 a295 c299 g 314 t來源1 caagtggacc tgtactgaaa atgggtccaa taggtgcaga ggctgatgag aaccagacag61 tggaagaaat gaaggtggaa caatacgggc cacaaacaac tcctagaggt gaactggtcc121 ctgaccctga gccagagctt atagatagta ccaagctgat tgaggtacaa gttgttctca181 tattggccta ctgctccatc atcttgcttg gggtaattgg caactccttg gtgatccatg241 tggtgatcaa attcaagagc atgcgcacag taaccaactt tttcattgcc aatctggctg301 tggcagatct tttggtgaac actctgtgtc taccgttcac tcttacctat accttaatgg361 gggagtggaa aatgggtcct gtcctgtgcc acctggtgcc ctatgcccag ggcctggcag421 tacaagtatc cacaatcacc ttgacagtaa ttgccctgga ccggcacagg tgcatcgtct481 accacctaga gagcaagatc tccaagcgaa tcagcttcct gattattggc ttggcctggg541 gcatcagtgc cctgctggca agtcccctgg ccatcttccg ggagtattcg ctgattgaga601 tcatcccgga ctttgagatt gtggcctgta ctgaaaagtg gcctggcgag gagaagagca661 tctatggcac tgtctatagt ctttcttcct tgttgatctt gtatgttttg cctctgggca721 ttatatcatt ttcctacact cgcatttgga gtaaattgaa gaaccacgtc agtcctggag781 ctgcaaatga ccactaccat cagcgaaggc aaaaaaccac caaaatgctg gtgtgtgtgg841 tggtggtgtt tgcggtcagc tggctgcctc tccatgcctt ccagcttgcc gttgacattg901 acagccaggt cctggacctg aaggagtaca aactcatctt cacagtgttc cacatcatcg961 ccatgtgctc cacttttgcc aatccccttc tctatggctg gatgaacagc aactacagaa1021 aggctttcct ctcggccttc cgctgtgagc agcggttgga tgccattcac tctgaggtgt1081 ccgtgacatt caaggctaaa aagaacctgg aggtcagaaa gaacagtggc cccaatgact1141 ctttcacaga ggctaccaat gtctaaggaa gctgtggtgt gaaaatgtat ggatgaattc7．NPY Y5受體基因座HSU662751370 bpmRNA PRI18-OCT-199 6定義 人神經(jīng)肽Y5受體(NPYR5)mRNA，完全的cds.登記號U66275NID g1620655譯本 U66275.1 GI:1620655關鍵詞.來源 人生物體Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1 (bases 1 to 1370)作者Hu,Y.,Bloomquist,B.T.,Cornfield,L.J.,DeCarr,L.B.,Flores-Riveros,J.R.,Friedman,L.,Jiang,P.,Lewis-Higgins,L.,Sadlowski,Y.,Schaefer,J.,Velazquez,N.and McCaleb,M.L.題目一種新的與進食行為有關的下丘腦神經(jīng)肽Y受體的鑒別雜志J.Biol.Chem.271(42),26315-26319(1996)MEDLINE 96421636參比2(bases 1 to 1370)作者Hu,Y.,Bloomquist,B.T.,Cornfield,L.J.,DeCarr,L.B.,Flores-Riveros,J.R.,Friedman,L.,Jiang,P.,Lewis-Higgins,L.,Sadlowski,Y.,Schaefer,J.,Velazquez,N and McCaleb,M.L.題目Direct Submission雜志Submitted(06-AUG-1996)Metabolic Disorders,Bayer Corporation,400Morgan Lane,West Haven,CT06516,USA特征Location/Qualifiers來源 1..1370/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″基因 18..1355/基因=″NPYR5″CDS18..1355/基因=″NPYR5″/功能=″G蛋白質(zhì)-偶聯(lián)受體″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″神經(jīng)肽Y5受體″/protein_id=″AAC50741.1″/db_xref=″PID:g1620656″/db_xref=″GI:1620656″/翻譯=″MDLELDEYYNKTLATENNTAATRNSDFPVWDDYKSSVDDLQYFLIGLYTFVSLLGFMGNLLILMALMKKRNQKTTVNFLIGNLAFSDILVVLFCSPFTLTSVLLDQWMFGKVMCHIMPFLQCVSVLVSTLILISIAIVRYHMIKHPISNNLTANHGYFLIATVWTLGFAICSPLPVFHSLVELQETFGSALLSSRYLCVESWPSDSYRIAFTISLLLVQYILPLVCLTVSHTSVCRSISCGLSNKENRLEENEMINLTLHPSKKSGPQVKLSGSHKWSYSFIKKHRRRYSKKTACVLPAPERPSQENHSRILPENFGSVRSQLSSSSKFIPGVPTCFEIKPEENSDVHELRVKRSVTRIKKRSRSVFYRLTILILVFAVSWMPLHLFHVVTDFNDNLISNRHFKLVYCICHLLGMMSCCLNPILYGFLNNGIKADLVSLIHCLHM″堿基數(shù)392 a 263 c 257 g 458 t來源1 ccaagcagga ctataatatg gatttagagc tcgacgagta ttataacaag acacttgcca61 cagagaataa tactgctgcc actcggaatt ctgatttccc agtctgggat gactataaaa121 gcagtgtaga tgacttacag tattttctga ttgggctcta tacatttgta agtcttcttg181 gctttatggg gaatctactt attttaatgg ctctcatgaa aaagcgtaat cagaagacta241 cggtaaactt cctcataggc aatctggcct tttctgatat cttggttgtg ctgttttgct301 cacctttcac actgacgtct gtcttgctgg atcagtggat gtttggcaaa gtcatgtgcc361 atattatgcc ttttcttcaa tgtgtgtcag ttttggtttc aactttaatt ttaatatcaa421 ttgccattgt caggtatcat atgataaaac atcccatatc taataattta acagcaaacc481 atggctactt tctgatagct actgtctgga cactaggttt tgccatctgt tctccccttc541 cagtgtttca cagtcttgtg gaacttcaag aaacatttgg ttcagcattg ctgagcagca601 ggtatttatg tgttgagtca tggccatctg attcatacag aattgccttt actatctctt661 tattgctagt tcagtatatt ctgcccttag tttgtcttac tgtaagtcat acaagtgtct721 gcagaagtat aagctgtgga ttgtccaaca aagaaaacag acttgaagaa aatgagatga781 tcaacttaac tcttcatcca tccaaaaaga gtgggcctca ggtgaaactc tctggcagcc841 ataaatggag ttattcattc atcaaaaaac acagaagaag atatagcaag aagacagcat901 gtgtgttacc tgctccagaa agaccttctc aagagaacca ctccagaata cttccagaaa961 actttggctc tgtaagaagt cagctctctt catccagtaa gttcatacca ggggtcccca1021 cttgctttga gataaaacct gaagaaaatt cagatgttca tgaattgaga gtaaaacgtt1081 ctgttacaag aataaaaaag agatctcgaa gtgttttcta cagactgacc atactgatat1141 tagtatttgc tgttagttgg atgccactac accttttcca tgtggtaact gattttaatg1201 acaatcttat ttcaaatagg catttcaagt tggtgtattg catttgtcat ttgttgggca1261 tgatgtcctg ttgtcttaat ccaattctat atgggtttct taataatggg attaaagctg1321 atttagtgtc ccttatacac tgtcttcata tgtaataatt ctcactgttt8．VIP基因座 VIP 1511 bp mRNA PRI19-MAR-1999定義 Homo sapiens 血管活性腸肽(VIP)mRNA.登記號 NM_003381NIDg4507896譯本 NM_003381.1 GI:4507896關鍵詞 .來源 人生物體 Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata； Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 1511)作者 DeLamarter,J.F.,Buell,G.N.,Kawashima,E.,Polak,J.M.andBloom,S.R.題目 血管活性腸肽細菌細胞中激素原的表達雜志 Peptides 6 Suppl 1,95-102 (1985)MEDLINE86016352注釋 REFSEQ由M36634衍生的參比序列。
臨時參比序列這是一種仍未進行人體評價的臨時的參比序列。最終處理的參比序列記錄可與此略有不同。特征 Location/Qualifiers來源 1..1511/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″/map=″6q24-q27″/組織型=″胰腺癌″基因 1..1511/基因=″VIP″/db_xref=″MIM:192320″/db_xref=″LocusID:7432″信號肽 67..129/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″CDS67..579/基因=″VIP″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″/蛋白質(zhì)號=″NP_003372.1″/db_xref=″PID:g4507897″/db_xref=″GI:4507897″/翻譯=″MDTRNKAQLLVLLTLLSVLFSQTSAWPLYRAPSALRLGDRIPFEGANEPDQVSLKEDIDMLQNALAENDTPYYDVSRNARHADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLMGKRVSSNISEDPVPVKRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGKRSSEGESPDFPEELEK"成熟肽 307..387/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″成熟肽 439..522/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″polyA信號1326..1331堿基數(shù) 541 a255 c276 g439 t來源1 ggtcagctcc aaaacaatcc ggaacggcca gctccggggg agcacgactg ggcgagaggc61 acagaaatgg acaccagaaa taaggcccag ctccttgtgc tcctgactct tctcagtgtg121 ctcttctcac agacttcggc atggcctctt tacagggcac cttctgctct caggttgggt181 gacagaatac cctttgaggg agcaaatgaa cctgatcaag tttcattaaa agaagacatt241 gacatgttgc aaaatgcatt agctgaaaat gacacaccct attatgatgt atccagaaat301 gccaggcatg ctgatggagt tttcaccagt gacttcagta aactcttggg tcaactttct361 gccaaaaagt accttgagtc tcttatggga aaacgtgtta gcagtaacat ctcagaagac421 cctgtaccag tcaaacgtca ctcagatgca gtcttcactg acaactatac ccgccttaga481 aaacaaatgg ctgtaaagaa atatttgaac tcaattctga atggaaagag gagcagtgag541 ggagaatctc ccgactttcc agaagagtta gaaaaatgat gaaaaagacc tttggagcaa601 agctgatgac aacttcccag tgaattcttg aaggaaaatg atacgcaaca taattaaatt661 ttagattcta cataagtaat tcaagaaaac aacttcaata tccaaaccaa ataaaaatat721 tgtgttgtga atgttgtgat gtattctagc taatgtaata actgtgaagt ttacattgta781 aatagtattt gagagttcta aattttgtct ttaactcata aaaagcctgc aatttcatat841 gctgtatatc ctttctaaca aaaaaatata ttttaatgat aagtaatgct aggttaatcc901 aattatatga gacgtttttg gaagagtagt aatagagcaa aattgatgtg tttatttata961 gagtgtactt aactattcag gagagtagaa cagataatca gtgtgtctaa atttgaatgt1021 taagcagatg gaatgctgtg ttaaataaac ctcaaaatgt ctaagatagt aacaatgaag1081 ataaaaagac attcttccaa aaagattttc agaaaatatt atgtgtttcc atattttata1141 ggcaaccttt atttttaatg gtgttttaaa aaatctcaaa tttggattgc taatcaccaa1201 aggctctctc ctgatagtct ttcagttaag gagaacgacc cctgcttctg acactgaaac1261 ttccctttct gcttgtgtta agtatgtgta aaatgtgaag tgaatgaaac actcagttgt1321 tcaataataa atatttttgc cataatgact cagaatattg ctttggtcat atgagcttcc1381 ttctgtgaaa tacattttgg agacacaact atttttccaa aataatttta agaaatcaaa1441 gagagaaaat aaagaccttg cttatgattg cagataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1501 aaaaaaaaaa a9．VPAC1受體基因座VIP1511 bp mRNA PRI19-MAR-1999定義 Homo sapiens vasoactive intestinal peptide(VIP)maRNA登記號NM_003381NID g4507896譯本 NM_003381.1 GI:4507896關鍵詞.來源 人生物體Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 1511)作者 DeLamarter,J.F.,Buell,G.N.,Kawashima,E.,Polak,J.M.andBloom,S.R.題目 血管活性腸肽細菌細胞中激素原的表達雜志 Peptides6 Suppl 1,95-102(1985)MEDLINE 86016352注釋 RESEQ由M36634衍生的參比序列。
臨時參比序列這是一種仍未進行人體評價的臨時參比序列。最終處理的參比序列記錄可與此略有不同。特征 Location/Qualifiers來源 1..1511/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″/map=″6q24-q27″
/組織型=″胰腺癌″基因1..1511/基因=″VIP″/db_xref=″MIM:192320″/db_xref=″LocusID:7432″信號肽67..129/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″CDS 67..579/基因=″VIP″/編碼起始=1/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″/蛋白質(zhì)號=″NP_003372.1″/db_xref=″PIO:g4507897″/db_xref=″GI:4507897″/翻譯=″MDTRNKAQLLVLLTLLSVLFSQTSAWPLYRAPSALRLGDRIPFEGANEPDQVSLKEDIDMLQNALAENDTPYYDVSRNAPHADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLMGKRVSSNISEDPVPVKRHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILNGKRSSEGESPDFPEELEK″成熟肽 307..387/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″成熟肽 439..522/產(chǎn)物=″血管活性腸肽″polyA信號 1326..1331堿基數(shù)541 a255 c276 g 439 t來源1 ggtcagctcc aaaacaatcc ggaacggcca gctccggggg agcacgactg ggcgagaggc61 acagaaatgg acaccagaaa taaggcccag ctccttgtgc tcctgactct tctcagtgtg121 ctcttctcac agacttcggc atggcctctt tacagggcac cttctgctct caggttgggt181 gacagaatac cctttgaggg agcaaatgaa cctgatcaag tttcattaaa agaagacatt241 gacatgttgc aaaatgcatt agctgaaaat gacacaccct attatgatgt atccagaaat301 gccaggcatg ctgatggagt tttcaccagt gacttcagta aactcttggg tcaactttct361 gccaaaaagt accttgagtc tcttatggga aaacgtgtta gcagtaacat ctcagaagac421 cctgtaccag tcaaacgtca ctcagatgca gtcttcactg acaactatac ccgccttaga481 aaacaaatgg ctgtaaagaa atatttgaac tcaattctga atggaaagag gagcagtgag541 ggagaatctc ccgactttcc agaagagtta gaaaaatgat gaaaaagacc tttggagcaa601 agctgatgac aacttcccag tgaattcttg aaggaaaatg atacgcaaca taattaaatt661 ttagattcta cataagtaat tcaagaaaac aacttcaata tccaaaccaa ataaaaatat721 tgtgttgtga atgttgtgat gtattctagc taatgtaata actgtgaagt ttacattgta781 aatagtattt gagagttcta aattttgtct ttaactcata aaaagcctgc aatttcatat841 gctgtatatc ctttctaaca aaaaaatata ttttaatgat aagtaatgct aggttaatcc901 aattatatga gacgtttttg gaagagtagt aatagagcaa aattgatgtg tttatttata961 gagtgtactt aactattcag gagagtagaa cagataatca gtgtgtctaa atttgaatgt1021 taagcagatg gaatgctgtg ttaaataaac ctcaaaatgt ctaagatagt aacaatgaag1081 ataaaaagac attcttccaa aaagattttc agaaaatatt atgtgtttcc atattttata1141 ggcaaccttt atttttaatg gtgttttaaa aaatctcaaa tttggattgc taatcaccaa1201 aggctctctc ctgatagtct ttcagttaag gagaacgacc cctgcttctg acactgaaac1261 ttccctttct gcttgtgtta agtatgtgta aaatgtgaag tgaatgaaac actcagttgt1321 tcaataataa atatttttgc cataatgact cagaatattg ctttggtcat atgagcttcc1381 ttctgtgaaa tacattttgg agacacaact atttttccaa aataatttta agaaatcaaa1441 gagagaaaat aaagaccttg cttatgattg cagataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1501 aaaaaaaaaa a10．VPAC2受體基因座 HUMHVRP1640 bp mRNA PRI 16-FEB-1995定義 人helodermin-優(yōu)選VIP受體(VIP2/PACAP受體)mRNA，完全的cds.登記號L36566NID g550477譯本 L36566.1 GI:550477關鍵詞PACAP受體；VIP受體；helodermin-優(yōu)選VIP受體。來源 Homo sapiens cDNA to mRNA.生物體Homo sapiensEukaryota；Metazoa；Chordata；Craniata；Vertebrata；Mammalia；Eutheria；Primates；Catarrhini；Hominidae；Homo.參比 1(bases 1 to 1640)作者 Svoboda,M.,Tastenoy,M.,Van Rampelbergh,J.,Goossens,J.F.,DeNeef,P.,Waelbroeck,M.and Robberecht,P.題目 來自SUP-T1成淋巴細胞的人VIP受體的分子克隆和功能表征雜志 Biochem.Biophys.Res.Commun.205(3),1617-1624(1994)MEDLINE 95110300特征 Location/Qualifiers來源 1..1640/生物體=″Homo sapiens″/db_xref=″taxon:9606″/細胞系=″SUP T1淋巴母細胞″/克隆文庫=″lamda ZAP Ⅱ″信號肽 163..231/note=″推定的″CDS 163..1479/note=″人VIP2受體先前稱為″helodermin優(yōu)選VIP受體″；跨膜結(jié)構域位于下列位置637-696；772-844；880-948；1003-1071；1147-1209；1243-1302；潛在的糖基化位點位于334-236；424-426；436-438″/編碼起始=1/功能=″VIP和PACAP受體″/蛋白質(zhì)號=″AAC37569.1″/db_xref=″PID:g550478″/db_xref=″GI:550478″/翻譯=″MRTLLPPALLTCWLLAPVNSIHPECRFHLEIQEEETKCTELLRSQTEKHKACSGVWDNITCWRPANVGETVTVPCPKVFSNFYSKAGNISKNCTSDGWSETFPDFVDACGYSDPEDESKITFYILVKAIYTLGYSVSLMSLATGSIILCLFRKLHCTRNYIHLNLFLSFILRAISVLVKDDVLYSSSGTLHCPDQPSSWVGCKLSLVFLQYCIMANFFWLLVEGLYLHTLLVAMLPPRRCFLAYLLIGWGLPTVCIGAWTAARLYLEDTGCWDTNDHSVPWWVIRIPILISIIVNFVLFISIIRILLQKLTSPDVGGNDQSQYKRLAKSTLLLIPLFGVHYMVFAVFPISISSKYQILFELCLGSFQGLVVAVLYCFLNSEVQCELKRKWRSRCPTPSASRDYRVCGSSFSHNGSEGALQFHRASRAQSFLQTETSVI″成熟肽232..1476/功能=″VIP和PACAP受體″堿基數(shù) 315 a 512 c 461 g 352 t來源1 cgggacgagg gggcggcccc cgcgctcggg gcgctcggct acagctgcgg ggcccgaggt61 ctccgcgcac tcgctcccgg cccatgctgg aggcggcgga acccggggga cctaggacgg121 aggcggcggg cgctgggcgg cccccggcac gctgagctcg ggatgcggac gctgctgcct181 cccgcgctgc tgacctgctg gctgctcgcc cccgtgaaca gcattcaccc agaatgccga241 tttcatctgg aaatacagga ggaagaaaca aaatgtacag agcttctgag gtctcaaaca301 gaaaaacaca aagcctgcag tggcgtctgg gacaacatca cgtgctggcg gcctgccaat361 gtgggagaga ccgtcacggt gccctgccca aaagtcttca gcaattttta cagcaaagca421 ggaaacataa gcaaaaactg tacgagtgac ggatggtcag agacgttccc agatttcgtc481 gatgcctgtg gctacagcga cccggaggat gagagcaaga tcacgtttta tattctggtg541 aaggccattt ataccctggg ctacagtgtc tctctgatgt ctcttgcaac aggaagcata601 attctgtgcc tcttcaggaa gctgcactgc accaggaatt acatccacct gaacctgttc661 ctgtccttca tcctgagagc catctcagtg ctggtcaagg acgacgttct ctactccagc721 tctggcacgt tgcactgccc tgaccagcca tcctcctggg tgggctgcaa gctgagcctg781 gtcttcctgc agtactgcat catggccaac ttcttctggc tgctggtgga ggggctctac841 ctccacaccc tcctggtggc catgctcccc cctagaaggt gcttcctggc ctacctcctg901 atcggatggg gcctccccac cgtctgcatc ggtgcatgga ctgcggccag gctctactta961 gaagacaccg gttgctggga tacaaacgac cacagtgtgc cctggtgggt catacgaata1021 ccgattttaa tttccatcat cgtcaatttt gtccttttca ttagtattat acgaattttg1081 ctgcagaagt taacatcccc agatgtcggc ggcaacgacc agtctcagta caagaggctg1141 gccaagtcca cgctcctgct tatcccgctg ttcggcgtcc actacatggt gtttgccgtg1201 tttcccatca gcatctcctc caaataccag atactgtttg agctgtgcct cgggtcgttc1261 cagggcctgg tggtggccgt cctctactgt ttcctgaaca gtgaggtgca gtgcgagctg1321 aagcgaaaat ggcgaagccg gtgcccgacc ccgtccgcga gccgggatta cagggtctgc1381 ggttcctcct tctcccacaa cggctcggag ggcgccctgc agttccaccg cgcgtcccga1441 gcccagtcct tcctgcaaac ggagacctcg gtcatctagc cccacccctg cctgtcggac1501 gcggcgggag gcccacggtt cggggcttct gcggggctga gacgccggct tcctccttcc1561 agatgcccga gcaccgtgtc gggcaggtca gcgcggtcct gactccgtca agctggttgt1621 ccactaaacc ccatacctgg
權利要求
1.一種用于(或使用時)治療FSD，優(yōu)選FSAD的藥物組合物；該藥物組合物含有能夠在患有FSD，優(yōu)選FSAD的雌性的性生殖器中增強cAMP作用的活性劑；其中的活性劑任選地可以與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述的活性劑是PDE抑制劑(I:PDE)，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述活性劑是生殖器(如，陰道或陰蒂)血管舒張的介導劑。
3.權利要求1或2的藥物組合物，其中組合物為口服使用的。
4.權利要求1-3任一項的藥物組合物，其中所述cAMP是內(nèi)源性的cAMP。
5.權利要求1-4任一項的藥物組合物，其中組合物在性刺激前或刺激過程中使用。
6.活性劑在制備用于治療FSD，優(yōu)選FSAD的藥物中的用途，其中所述活性劑能夠在患有FSD，優(yōu)選FSAD的雌性的性生殖器中增強cAMP作用；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
7.權利要求6的用途，其中所述活性劑是生殖器(如，陰道或陰蒂)血管舒張的介導劑。
8.權利要求6或7的用途，其中藥物為口服使用的。
9.權利要求6-8任一項的用途，其中所述cAMP是內(nèi)源性的cAMP。
10.權利要求6-9任一項的用途，其中組合物在性刺激前或刺激過程中使用。
11.一種治療雌性(如患有FSD，優(yōu)選FSAD的雌性)疾病的方法，該方法包括給予所述雌性能夠在性生殖器中增強cAMP作用的活性劑；其中所述活性劑的量在雌性性生殖器中對cAMP有增強作用；其中的活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
12.權利要求11的方法，其中所述活性劑是生殖器(如，陰道或陰蒂)血管舒張的介導劑。
13.權利要求11或12的方法，其中活性劑被口服給藥。
14.權利要求11-13任一項的方法，其中所述cAMP是內(nèi)源性的cAMP。
15.權利要求11-14任一項的藥物組合物，其中組合物在性刺激前或刺激過程中使用。
16.一種鑒定可用于治療FSD，特別是FSAD的活性劑的分析方法，該分析方法包括測定活性劑能否直接或間接增強cAMP作用；其中在活性劑的存在下cAMP作用增強表明該活性劑可用于治療FSD，特別是FSAD；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
17.一種方法，包括下列步驟(a)按權利要求16的方法進行測定；(b)鑒定一種或多種可直接或間接增強cAMP作用的活性劑；和(c)制備一定量的一種或多種所鑒定的活性劑；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
18.一種通過用活性劑增強體內(nèi)cAMP作用來治療FSD，優(yōu)選FSAD的方法，其中活性劑能夠在體外分析方法中直接或間接增強cAMP作用；其中體外分析方法是權利要求16所定義的分析方法；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
19.活性劑在制備可用于治療FSD，優(yōu)選FSAD的藥物組合物中的用途，其中活性劑按權利要求16的分析方法體外測定時能夠直接或間接增強cAMP作用；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
20.按權利要求16的分析方法鑒定的活性劑；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
21.權利要求20的用于藥物的活性劑；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
22.權利要求21的用于治療FSD，優(yōu)選FSAD的活性劑；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
23.一種口服給藥治療FSD，優(yōu)選FSAD的藥物，其中藥物含有權利要求20的活性劑；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
24.一種診斷方法，該方法包含從雌性中分離樣品；測定樣品中是不是含有可引起FSD，優(yōu)選FSAD的量的物質(zhì)，或者其量是不是可引起FSD，優(yōu)選FSAD；其中所述物質(zhì)可直接或間接影響雌性性生殖器中cAMP的水平或活性；并且其中所述物質(zhì)可通過使用活性劑來調(diào)節(jié)以產(chǎn)生有利的作用；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
25.一種診斷組合物或藥盒，包含用于檢測分離雌性樣品中的物質(zhì)的裝置；其中所述裝置可用于測定樣品是不是含有可引起FSD，優(yōu)選FSAD的量的物質(zhì)，或者其量是不是可引起FSD，優(yōu)選FSAD；其中所述物質(zhì)可直接或間接影響雌性性生殖器中cAMP的水平或活性；并且其中所述物質(zhì)可通過使用活性劑來調(diào)節(jié)以產(chǎn)生有利的作用；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
26.一種用于鑒定能夠治療FSD，優(yōu)選FSAD的活性劑的動物模型，所述模型包括麻醉的雌性動物，其中包含測定所述動物骨盆神經(jīng)受刺激后，其生殖器(如，陰道或陰蒂)血流改變的裝置；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
27.一種用于鑒定能夠直接或間接加強cAMP作用以便治療FSD，優(yōu)選FSAD的活性劑的測定方法，所述測定方法包括給予權利要求26的動物模型以活性劑；并測定cAMP的任何加強作用和/或所述動物生殖器(陰道或陰蒂)血流的增加；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
28.通過權利要求27的分析方法鑒定的活性劑；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
29.一種用于(或使用時)治療FSD(優(yōu)選FSAD)的藥物組合物；所述藥物組合物含有活性劑；其中活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
30.活性劑在制備用于治療FSD(優(yōu)選FSAD)的藥物(如藥物組合物)中的用途；其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
31.一種治療FSD(優(yōu)選FSAD)雌性患者的方法；該方法包括給予該雌性以活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
32.一種用于增加雌性生殖器(如，陰道或陰蒂)血流的藥物組合物；該藥物組合物包含活性劑；其中所述活性劑可任選地與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
33.活性劑在制備用于增加雌性生殖器(如，陰道或陰蒂)血流的藥物(如藥物組合物)中的用途；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
34.一種治療FSD(優(yōu)選FSAD)或預防FSD(優(yōu)選FSAD)雌性患者的方法；所述方法包含給予該雌性以活性劑；并且其中所述的活性劑是I:PDE，所述PDE是水解cAMP的PDE，并且任選地可水解cGMP。
35.權利要求29-34任一項的發(fā)明，其中所述活性劑可增強cAMP作用。
36.上述權利要求任一項的發(fā)明，其中所述cAMP是內(nèi)源性cAMP(如本文所述)。
37.上述權利要求任一項的發(fā)明，其中所述活性劑是I:PDE1或I:PDE2或I:PDE3或I:PDE4或I:PDE&amp;或I:PDE8。
38.權利要求37的發(fā)明，其中所述的活性劑是I:PDE2。
全文摘要
描述了一種治療FSD,特別是FSAD女性患者的方法。所述方法包括給予該女性能夠增強性生殖器中cAMP作用的活性劑;其中活性劑的量能增強女性性生殖器中cAMP的作用?；钚詣┛膳c可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。所述活性劑是I∶PDE,所述PDE是水解cAMP的PDE,并且任選地可水解cGMP。
文檔編號A61P15/00GK1322526SQ0013767
公開日2001年11月21日 申請日期2000年11月7日 優(yōu)先權日1999年11月8日
發(fā)明者G·N·瑪沃, C·P·威曼 申請人:輝瑞大藥廠