專利名稱：包含功能性以及非功能性剪接供體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種載體。
具體地說，本發(fā)明涉及一種用于包裝并表達(dá)反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中的遺傳物質(zhì)的新型系統(tǒng)。
更具體地講，本發(fā)明涉及能夠表達(dá)反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的新型系統(tǒng)，它能夠?qū)⒛康暮塑账嵝蛄?下文縮寫為“NOI”)-甚至多個(gè)NOI-傳遞至一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)。
另外，本發(fā)明特別涉及可用于基因治療的新型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
基因治療可以包括以下的任何一種或多種形式例如在一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)諸如靶細(xì)胞中對(duì)一種或多種核苷酸序列進(jìn)行添加、取代、缺失、補(bǔ)充、操作等。如果所述靶位點(diǎn)為靶細(xì)胞，則所述細(xì)胞可以為組織或器官的組成部分。關(guān)于基因治療的的一般認(rèn)識(shí)可參見MolecularBiology(編輯Robert Meyers，Pub VCH，例如第556-558頁(yè))。
作為再一實(shí)例，基因治療也可以提供用于以下任何一種或多種目的的方法可以應(yīng)用諸如基因的核苷酸序列取代或補(bǔ)充缺陷基因；可以消除諸如基因的致病核苷酸序列或其表達(dá)產(chǎn)物；可以添加或?qū)牒塑账嵝蛄欣缁蚧蚱浔磉_(dá)產(chǎn)物，以便例如產(chǎn)生更合適的表型；可以添加或?qū)牒塑账嵝蛄欣缁蚧蚱浔磉_(dá)產(chǎn)物，例如用于選擇目的(即相對(duì)于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞等)；可以在分子水平上操作細(xì)胞，以治療、治愈或預(yù)防疾病病癥-諸如癌癥(Schmidt-Wolf和Schmidt-Wolf，1994，Annals ofHematology 69，273-279)或其它疾病病癥，諸如免疫疾病、心血管疾病、神經(jīng)病、炎癥性疾病或傳染?。豢梢圆僮骱?或?qū)肟乖约ぐl(fā)免疫應(yīng)答，諸如基因疫苗接種。
近年來(lái)，已經(jīng)提出將反轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療。本質(zhì)上反轉(zhuǎn)錄病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。在該方面，反轉(zhuǎn)錄病毒是通過DNA中間體復(fù)制的感染體。當(dāng)反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞時(shí)，其基因組由反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA形式。以所述DNA拷貝作模板產(chǎn)生新的RNA基因組和裝配感染性病毒顆粒所必需的病毒編碼蛋白。
有許多反轉(zhuǎn)錄病毒，實(shí)例包括鼠白血病病毒(MIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FRB MSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝爾遜鼠類白血病病毒(A-MLV)、鳥類髓細(xì)胞瘤病病毒-29(MC29)和鳥類成紅細(xì)胞增生病毒(AEV)。
在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758-763頁(yè))的著作中，可以找到詳細(xì)的反轉(zhuǎn)錄病毒一覽表。
在本領(lǐng)域中可以找到關(guān)于某些反轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)的詳細(xì)介紹。例如可以從NCBI Genbank中找到關(guān)于HIV的詳細(xì)介紹(即基因組登記號(hào)AF033819)。
所有野生型反轉(zhuǎn)錄病毒基本上均含有三種主要的編碼域-gag、pol、env，它們編碼必需的病毒體蛋白。然而，反轉(zhuǎn)錄病毒可以大致分為兩類即“簡(jiǎn)單型”和“復(fù)雜型”。這兩類的區(qū)別在于其基因組結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)單型反轉(zhuǎn)錄病毒通常僅攜帶基本信息。相比之下，復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒還編碼多重剪接信息產(chǎn)生的其它調(diào)節(jié)蛋白。
反轉(zhuǎn)錄病毒甚至可以進(jìn)一步分為7組。其中5組為具有致癌潛力的反轉(zhuǎn)錄病毒。其余2組是慢病毒和泡沫病毒。關(guān)于這些反轉(zhuǎn)錄病毒的綜述參見“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編輯JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第1-25頁(yè))。
除人T細(xì)胞白血病病毒-牛白血病病毒群(HTLV-BLV)外的所有致癌成員均為簡(jiǎn)單型反轉(zhuǎn)錄病毒。HTLV、BLV和慢病毒以及泡沫病毒是復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒。研究得最清楚的一些致癌反轉(zhuǎn)錄病毒是勞斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠類白血病病毒(MLV)和人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)。
慢病毒群甚至可再分為“靈長(zhǎng)類”和“非靈長(zhǎng)類”慢病毒。靈長(zhǎng)類慢病毒的實(shí)例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長(zhǎng)類慢病毒群包括原型“慢病毒”維斯那/梅迪病毒(VMV)以及相關(guān)的山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和新近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒。
慢病毒科支轉(zhuǎn)錄病毒和其它類型反轉(zhuǎn)錄病毒之間的不同之處在于慢病毒具有感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞的能力(Lewis等1992EMBO.J113053-3058；Lewis和Emerman 1994 J.Virol.68510-516)。相反，諸如MLV的其它反轉(zhuǎn)錄病毒不能感染非分裂細(xì)胞，諸如構(gòu)成例如肌肉、腦、肺和肝臟組織的細(xì)胞。
在感染過程中，反轉(zhuǎn)錄病毒最初附著于特定的細(xì)胞表面受體。在進(jìn)入易感宿主細(xì)胞時(shí)，反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組則由親代病毒內(nèi)攜帶的病毒編碼的反轉(zhuǎn)錄酶拷貝為DNA。該DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞核，隨后在核內(nèi)整合入宿主基因組。在此階段，它通常被稱為原病毒。在細(xì)胞分裂期間，原病毒穩(wěn)定地存在于宿主染色體上，并同其它細(xì)胞蛋白一樣被轉(zhuǎn)錄。原病毒編碼制備更多病毒所需的蛋白和包裝器，病毒可以通過有時(shí)稱為“芽生”的過程離開細(xì)胞。
已經(jīng)表明，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒基因組均包含稱為gag、pol和env的基因，它們編碼病毒體蛋白和酶。在原病毒中，這些基因兩端的側(cè)翼為稱為長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的區(qū)域。LTR負(fù)責(zé)原病毒的整合和轉(zhuǎn)錄。它們也起著增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列的作用。換句話說，LTR可以控制病毒基因的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄病毒RNA的包衣殼借助于位于病毒基因組5’端的psi序列。
LTR本身是相同的序列，它們可以分為三種元件，這些元件稱為U3、R和U5。U3產(chǎn)生自所述RNA 3’端特有的序列。R產(chǎn)生自所述RNA兩端重復(fù)的序列，而U5產(chǎn)生自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反轉(zhuǎn)錄病毒中，這三種元件的大小可能顯著不同。
為了易于理解，圖29圖示RNA形式和DNA形式的所述反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的一般簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)(未按比例制圖)，其中顯示了LTR的基本特征和gag、pol和env的相對(duì)位置。
如圖29所示，傳染性反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組的基本分子結(jié)構(gòu)是(5’)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3’)。在缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組中，gag、pol和env可能缺乏或沒有功能。該RNA兩端的R區(qū)是重復(fù)序列。U5和U3分別代表RNA基因組5’和3’端特有的序列。
病毒體RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中，涉及反轉(zhuǎn)錄酶從模板分子的5’末端至3’末端的兩次跳躍。兩次跳躍的結(jié)果是復(fù)制位于病毒體RNA 5’和3’端的序列。然后這些序列在病毒DNA兩端串聯(lián)融合，形成包含R U5和U3區(qū)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)。反轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，病毒DNA易位到細(xì)胞核中，在此稱為整合前復(fù)合物(PIC)的線性拷貝的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組，借助病毒體整合酶隨機(jī)插入染色體DNA中，形成穩(wěn)定的原病毒。整合入宿主細(xì)胞基因組中的可能位點(diǎn)數(shù)目非常多并且分布非常廣。
原病毒轉(zhuǎn)錄的控制主要?dú)w于病毒LTR的非編碼序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于左手邊LTR(如圖29所示)的U3和R之間的邊界，poly(A)添加(終止)位點(diǎn)位于右手邊LTR(如上圖所示)中R和U5之間的邊界。U3含有所述原病毒的大多數(shù)轉(zhuǎn)錄控制元件，包括對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活蛋白和在某些情況下對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白應(yīng)答的啟動(dòng)子和多個(gè)增強(qiáng)子序列。某些反轉(zhuǎn)錄病毒具有以下基因中的任何一種或多種基因諸如tat、rev、tax和rex，它們編碼參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白。
原病毒DNA的轉(zhuǎn)錄再產(chǎn)生全長(zhǎng)病毒RNA基因組大小的RNA分子和通過RNA加工產(chǎn)生的亞基因組大小的RNA分子。通常，所有的RNA產(chǎn)物均用作產(chǎn)生病毒蛋白的模板。通過RNA轉(zhuǎn)錄物剪接和翻譯期間核糖體移碼的聯(lián)合實(shí)現(xiàn)RNA產(chǎn)物的表達(dá)。
RNA剪接是去除間插或“內(nèi)含子”RNA序列且將其余的“外顯子”序列連接以提供用于翻譯的連續(xù)閱讀框的過程。反轉(zhuǎn)錄病毒DNA的最初轉(zhuǎn)錄物以幾種方式修飾，而且它們非常類似于細(xì)胞mRNA。然而，與其中所有內(nèi)含子被有效剪接的大多數(shù)細(xì)胞mRNA不同，新合成的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA必須轉(zhuǎn)變?yōu)閮深悺Ｒ活惐３植患艚?，以用作基因組RNA，而另一類進(jìn)行剪接，以提供亞基因組RNA。
全長(zhǎng)未剪接的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA轉(zhuǎn)錄物有兩個(gè)功能(i)它們編碼gag和pol基因產(chǎn)物，和(ii)它們作為基因組RNA包裝入子代病毒體顆粒中。亞基因組大小的RNA分子為其余的病毒基因產(chǎn)物提供mRNA。所有剪接的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)錄物均帶有第一外顯子，它跨越5’LTR的U5區(qū)。最后一個(gè)外顯子總是保留3’LTR編碼的U3區(qū)和R區(qū)，盡管其大小不同。其余RNA結(jié)構(gòu)的組成取決于剪接次數(shù)和可變剪接位點(diǎn)的選擇。
在簡(jiǎn)單型反轉(zhuǎn)錄病毒中，一類新合成的反轉(zhuǎn)錄病毒RNA保持未剪接，以用作基因組RNA以及用作gag和pol的mRNA。另一類進(jìn)行剪接，將基因組RNA的5’部分融合至下游基因，最常見為env。用位于gag上游的剪接供體和pol3’末端附近的剪接受體完成剪接。在剪接供體和剪接受體之間、通過剪接去除的內(nèi)含子含有g(shù)ag和pol基因。這一剪接過程產(chǎn)生包膜(Env)蛋白的mRNA。所述剪接供體通常位于gag上游，但在諸如ASLV的某些病毒中，剪接供體位于gag基因中的少數(shù)密碼子，產(chǎn)生第一Env翻譯產(chǎn)物，包括與Gag共有的少數(shù)氨基末端氨基酸殘基。Env蛋白在膜結(jié)合的多核糖體上合成，并通過細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜，在此它裝入病毒顆粒中。
復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒既產(chǎn)生單剪接轉(zhuǎn)錄物，又產(chǎn)生多剪接轉(zhuǎn)錄物，它們不僅編碼env基因產(chǎn)物，而且編碼數(shù)組這些病毒特有的調(diào)節(jié)蛋白和輔助蛋白。復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒，尤其是HIV，提供了在反轉(zhuǎn)錄病毒感染期間可能發(fā)生的可變剪接復(fù)雜性的突出實(shí)例。例如，目前已知HIV-1能夠通過亞適剪接，由最初的基因組轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生30種以上的不同mRNA。由于破壞競(jìng)爭(zhēng)性剪接受體的突變可以引起剪接模式的變化，并且可以影響病毒的感染性，因此看來(lái)這種選擇過程受到調(diào)節(jié)(Purcell和Martin 1993 J Vriol 676365-6378)。
在感染細(xì)胞中，全長(zhǎng)RNA和亞基因組大小RNA的相對(duì)比例是變化的，在反轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)期間，對(duì)這些轉(zhuǎn)錄物水平的調(diào)節(jié)是潛在的控制步驟。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒基因的表達(dá)，未剪接RNA和剪接的RNA均必須轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)，并且必須維持適當(dāng)?shù)募艚拥暮臀醇艚拥腞NA比例，以有效地進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒的基因表達(dá)。不同類別的反轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)演變出對(duì)該問題的不同解決方法。僅使用全長(zhǎng)和單剪接RNA的簡(jiǎn)單型反轉(zhuǎn)錄病毒，或者利用可變有效剪接位點(diǎn)，或者通過在其基因組中加入幾種僅部分定義的順式作用元件，來(lái)調(diào)節(jié)剪接與非剪接類型RNA的胞質(zhì)比率。既控制單剪接RNA的合成又控制多剪接RNA合成的復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒，通過RNA上的序列與輔助基因之一(諸如HIV-1的rev和HTLV-1的rex)的蛋白產(chǎn)物相互作用，來(lái)調(diào)節(jié)不同基因組和亞基因組大小的RNA類型的轉(zhuǎn)運(yùn)和可能的剪接。
關(guān)于結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env本身以及略微更詳細(xì)的介紹，gag編碼病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白。gag被蛋白酶水解加工為成熟蛋白MA(基質(zhì))、CA(衣殼)和NC(核衣殼)。pol基因編碼反轉(zhuǎn)錄酶(RT)，RT既含有DNA聚合酶又具有相關(guān)的RNA酶H活性以及整合酶(IN)，逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)基因組的復(fù)制。env基因編碼病毒體的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它們形成與細(xì)胞受體蛋白特異性相互作用的復(fù)合物。這種相互作用最終使病毒膜與細(xì)胞膜融合。
Env蛋白是包被病毒顆粒并在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)起主要作用的病毒蛋白。反轉(zhuǎn)錄病毒的包膜糖蛋白復(fù)合物包括兩種多肽一種外部的糖基化親水多肽(SU)和一種跨膜蛋白(TM)。這些蛋白一起形成病毒體表面上的寡聚“隆起(knob)”或“隆起的刺突”。兩種多肽均由env基因編碼，并以多肽前體形式合成，多肽前體在其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面期間被蛋白水解切割。盡管未切割的Env蛋白能夠結(jié)合于所述受體，但切割本身對(duì)激活該蛋白的融合潛力是必需的，這對(duì)于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是必需的。通常，SU和TM蛋白均于多個(gè)位點(diǎn)糖基化。然而，在某些病毒中，例如MLV，TM不被糖基化。
盡管SU和TM蛋白本身不一定總是包膜病毒體顆粒裝配所需的，但它們?cè)诓《具M(jìn)入過程中起重要作用。在該方面，SU域結(jié)合于靶細(xì)胞上的受體分子，通常是特定的受體分子。據(jù)信這一結(jié)合過程激活TM蛋白的誘導(dǎo)膜融合潛力，然后病毒膜和細(xì)胞膜融合。在某些病毒中，特別是MLV，人們認(rèn)為導(dǎo)致去除TM胞質(zhì)尾的短部分的切割過程在暴露該蛋白完整融合活性中起關(guān)鍵作用(Brody等1994 J Virol684620-4627；Rein等1994 J Virol 681773-1781)。TM跨膜區(qū)段遠(yuǎn)側(cè)的該胞質(zhì)“尾”仍留在病毒膜內(nèi)側(cè)上，在不同的反轉(zhuǎn)錄病毒中其長(zhǎng)度顯著不同。
因此，SU/受體相互作用的特異性可以限定反轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍和組織嗜性。在某些情況下，這種特異性可能限制重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)潛力。這里，轉(zhuǎn)導(dǎo)包括用病毒載體將非病毒基因傳遞至靶細(xì)胞的過程。因此，許多基因治療試驗(yàn)使用MLV。具有稱為4070A的包膜蛋白的特定MLV被稱為兼嗜性病毒，它也可以感染人細(xì)胞，因?yàn)槠浒さ鞍着c人和小鼠之間保守的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白“對(duì)接”。這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是普遍存在的，因此這些病毒能夠感染許多細(xì)胞類型。然而，在某些情況下，尤其從安全的角度來(lái)看，它可能對(duì)特異性靶向限定的細(xì)胞有益。為此，幾個(gè)研究小組工程改造了一種與其兼嗜性不同的相對(duì)正常地僅感染小鼠細(xì)胞的小鼠親嗜性反轉(zhuǎn)錄病毒，使其特異性感染特定的人細(xì)胞。用紅細(xì)胞生成素區(qū)段取代Env蛋白的片段，產(chǎn)生重組反轉(zhuǎn)錄病毒，該反轉(zhuǎn)錄病毒則特異性地結(jié)合至在其表面表達(dá)紅細(xì)胞生成素受體的人細(xì)胞，諸如紅細(xì)胞前體(Maulik和Patel 1997“MolecularBiotechnologyTherapeutic Applications and Strateges”1997 Wiley-LissInc.，第45頁(yè))。
除gag、pol和env外，復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒還含有“輔助”基因，它們編碼輔助蛋白。輔助蛋白定義為由通常的復(fù)制基因或結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env編碼的蛋白以外的、由輔助基因編碼的蛋白。這些輔助蛋白不同于參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)的蛋白，如由tat、rev、tax和rex編碼的蛋白。輔助基因的實(shí)例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一個(gè)或多個(gè)。這些輔助基因可以見于例如HIV中(參見例如Coffin等編輯的“Retroviruses”，Pub.CSHL 1997的第802和803頁(yè))。非必需輔助蛋白可以在特化的細(xì)胞類型中起作用，提供與由細(xì)胞蛋白提供的功能至少部分重復(fù)的功能。通常，輔助基因位于pol和env之間，恰好在env下游，包括LTR的U3區(qū)或env和每種其它基因的重疊部分。
復(fù)雜型反轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)進(jìn)化出調(diào)節(jié)機(jī)制，所述調(diào)節(jié)機(jī)制利用病毒編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白以及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。這些反式作用的病毒蛋白用作由LTR指導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)錄的激活蛋白。慢病毒的轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白由病毒tat基因編碼。Tat結(jié)合于穩(wěn)定的稱為TAR的莖-環(huán)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，其一種功能是使Tat明顯最佳定位，以反式激活轉(zhuǎn)錄。
如前所述，已經(jīng)提議將反轉(zhuǎn)錄病毒作為傳遞系統(tǒng)(否則作為傳遞載體進(jìn)行表達(dá))，特別是將NOI或多個(gè)NOI傳遞至一個(gè)或多個(gè)目的位點(diǎn)。這種轉(zhuǎn)移可以在體外、活體外或體內(nèi)或混合情況下進(jìn)行。當(dāng)以該方式使用時(shí)，反轉(zhuǎn)錄病毒通常稱為反轉(zhuǎn)錄病毒載體或重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體。甚至應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體研究反轉(zhuǎn)錄病毒生活周期的各個(gè)方面，包括受體利用、反轉(zhuǎn)錄和RNA包裝(由Miller綜述，1992 Curr TopMicrobiol Immunol1581-24)。
在用于基因治療的典型重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，可以從病毒除去一個(gè)或多個(gè)gag、pol和env蛋白編碼區(qū)中的至少一部分。這使得反轉(zhuǎn)錄病毒載體為復(fù)制缺陷型。除去的部分甚至可以用一種NOI取代，以便產(chǎn)生能夠?qū)⑵浠蚪M整合入宿主基因組的病毒，但其中修飾的病毒基因組由于缺乏結(jié)構(gòu)蛋白而不能自我繁殖。當(dāng)整合入宿主基因組中時(shí)，所述NOI表達(dá)產(chǎn)生例如治療和/或診斷效應(yīng)。因此，通常如下將所述NOI轉(zhuǎn)移至目的位點(diǎn)將NOI整合入重組病毒載體中；將修飾的病毒載體包裝入病毒體外殼中；使其轉(zhuǎn)導(dǎo)目的位點(diǎn)，諸如靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群。
可以繁殖并分離大量的反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如制備適當(dāng)?shù)味鹊姆崔D(zhuǎn)錄病毒載體)，然后例如通過聯(lián)合采用包裝細(xì)胞系或輔助細(xì)胞系和重組載體而轉(zhuǎn)導(dǎo)目的位點(diǎn)。
在某些情況下，繁殖和分離可能需要分離反轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol和env基因，并將其分別導(dǎo)入宿主細(xì)胞中獲得“包裝細(xì)胞系”。所述包裝細(xì)胞系產(chǎn)生包裝反轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的蛋白，但由于缺乏psi區(qū)而不能包衣殼。然而，當(dāng)將攜帶NOI和psi區(qū)的重組載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞系時(shí)，所述輔助蛋白可以包裝psi陽(yáng)性重組載體，產(chǎn)生重組病毒原種。這可以用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，以將所述NOI導(dǎo)入細(xì)胞基因組中。其基因組缺乏產(chǎn)生病毒蛋白所需的所有基因的重組病毒，只能轉(zhuǎn)導(dǎo)一次并且不能繁殖。已知這些僅能轉(zhuǎn)導(dǎo)一輪靶細(xì)胞的病毒載體為復(fù)制缺陷型載體。因此，將所述NOI導(dǎo)入宿主/靶細(xì)胞基因組，而不產(chǎn)生潛在有害的反轉(zhuǎn)錄病毒。“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress，編輯JM Coffm，SM Hughes，HE Varmus第449頁(yè))中概述了可用的包裝細(xì)胞系。
反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的設(shè)計(jì)已發(fā)展到解決特別是早先設(shè)計(jì)常遇到的自發(fā)產(chǎn)生輔助病毒的問題。因?yàn)橥葱苑浅Ｓ兄谥亟M，所以降低或消除該載體基因組和輔助病毒基因組之間的同源性減少了產(chǎn)生輔助病毒的問題。新近，已經(jīng)研制出包裝細(xì)胞，其中在獨(dú)立轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系的分離的表達(dá)質(zhì)粒中攜帶gag、pol和env病毒編碼區(qū)，使得野生型病毒的產(chǎn)生需要重組三次。這降低了產(chǎn)生可復(fù)制病毒的可能性。該策略有時(shí)稱為三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23628-633)。
當(dāng)研制載體時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染也可以用來(lái)測(cè)量載體的產(chǎn)生。在該方面，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染避免了產(chǎn)生穩(wěn)定的載體產(chǎn)生細(xì)胞系所需的較長(zhǎng)時(shí)間，如果該載體或反轉(zhuǎn)錄病毒包裝組分對(duì)細(xì)胞有毒性，則使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。通常用來(lái)產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的組分包括編碼Gag/pol蛋白的質(zhì)粒、編碼Env蛋白的質(zhì)粒和含有NOI的質(zhì)粒。載體的產(chǎn)生包括將這些組分中的一種或多種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入含其它所需組分的細(xì)胞中。如果該載體編碼有毒基因或編碼干擾宿主細(xì)胞復(fù)制的基因，諸如細(xì)胞周期抑制劑或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，則可能難以產(chǎn)生穩(wěn)定的載體產(chǎn)生細(xì)胞系，但瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以用來(lái)在細(xì)胞死亡之前產(chǎn)生所述載體。此外，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，已經(jīng)開發(fā)出其產(chǎn)生的載體滴度水平與得自穩(wěn)定的載體產(chǎn)生細(xì)胞系的水平相當(dāng)?shù)募?xì)胞系(Pear等1993，Proc Natl Acad Sci 908392-8396)。
某些HIV蛋白的毒性可能使得難以產(chǎn)生穩(wěn)定的基于HIV的包裝細(xì)胞，由于這種毒性，通常通過載體和輔助病毒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染制備HIV載體。某些工作者甚至用水泡性口膜炎病毒(VSV)的Env蛋白取代HIV的Env蛋白。VSVEnv蛋白的插入促進(jìn)載體的濃縮，因?yàn)橥ㄟ^瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，已經(jīng)產(chǎn)生滴度為5×105(濃縮后為108)的HIV/VSV-G載體(Naldini等1996 Science 272263-267)。因此，HIV載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以提供有用的策略，以產(chǎn)生高滴度的載體(Yee等1994 PNAS.919564-9568)。
關(guān)于載體的滴度，反轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)際使用主要受以下因素的限制在體外培養(yǎng)中能夠獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒滴度(通常不超過108顆粒/ml)和許多包膜病毒對(duì)濃縮和純化病毒的常規(guī)生化和物化技術(shù)的敏感性。
例如開發(fā)了幾種濃縮反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，包括使用離心(Fekete和Cepko 1993 MolCell Biol132604-2613)、中空纖維過濾(Paul等1993 Hum Gene Ther 4609-615)和切向流過濾(Kotani等1994 HunGene Ther 519-28)。盡管可以使病毒滴度提高20倍，但反轉(zhuǎn)錄病毒的Env蛋白的相對(duì)脆性限制了濃縮反轉(zhuǎn)錄病毒載體的能力，且濃縮該病毒通常導(dǎo)致感染性病毒體的回收差。盡管如上所述，通過用更穩(wěn)定的VSV-G蛋白取代反轉(zhuǎn)錄病毒的EnV蛋白可以克服該問題，使得可以更高產(chǎn)率更有效地濃縮載體，但其缺點(diǎn)是VSV-G蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性相當(dāng)大。
盡管用目前可利用的載體可獲得107cfu/ml的無(wú)輔助病毒的載體滴度，但通?？梢杂玫味鹊偷枚嗟妮d體貯液進(jìn)行試驗(yàn)。然而，由于實(shí)用原因，高滴度的病毒最好，尤其是當(dāng)必須感染大量的細(xì)胞時(shí)。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)高百分率的某些細(xì)胞類型需要高滴度。例如，人造血祖細(xì)胞感染率主要取決于載體的滴度，只有用滴度非常高的貯液才能獲得有效感染率(Hock和Miller 1986 Nature 320275-277；Hogge和Humphries 1987Blood 69611-617)。在這些情況下，僅僅將所述細(xì)胞暴露于更大量的病毒以補(bǔ)償?shù)筒《镜味仁遣粔虻摹Ｏ喾?，在某些情況下，感染性載體病毒體的濃度對(duì)于促進(jìn)有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是關(guān)鍵的。
研究人員正在嘗試產(chǎn)生高滴度的載體以用于基因傳遞。例如已證明不同載體設(shè)計(jì)的比較，可用來(lái)幫助確定產(chǎn)生高滴度病毒所需的必需元件。關(guān)于不同反轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)的早期工作表明，幾乎所有的MLV內(nèi)部蛋白編碼區(qū)均可以缺失，而不消除該載體的感染性(Miller等1983 Proc Natl Acad Sci 804709-4713)。這些早期載體僅保留env編碼區(qū)3’端的小部分。后續(xù)工作表明，所有的env基因編碼序列均可以去除，而不會(huì)進(jìn)一步降低載體的滴度(Miller和Rosman 1989Biotechnique 7980-990；Morgenstern和Land 1990 Nucleic Acids Res 183587-3596)。僅病毒LTR和連接所述LTR、包括正鏈和負(fù)鏈DNA引發(fā)所需區(qū)段和將病毒RNA選擇性包裝入病毒體所需區(qū)域(psi位點(diǎn)；Mann等1983 Cell 33153-159)在內(nèi)的短區(qū)域，被認(rèn)為是載體傳遞必需的。盡管如此，用這些早期載體獲得的病毒滴度仍比親代輔助病毒滴度低約10倍。
其它試驗(yàn)表明，gag基因5’端序列的保留顯著提高病毒載體的滴度，這是因?yàn)閷⒉《綬NA包裝入病毒體中的包裝效率的提高(Armentano等1987 J Virol 611647-1650；Bender等1987 J Virol611639-1646；Adam和Miller1988 J Virol 623802-3806)。這種效應(yīng)不是因?yàn)橛稍撦d體的gag區(qū)合成病毒蛋白，而是因?yàn)間ag讀框破壞或gag的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子已經(jīng)對(duì)載體的滴度無(wú)影響(Bender等1987出處同上)。這些試驗(yàn)證明，將基因組RNA有效包裝入MLV所需的序列比以前通過缺失分析限定的psi信號(hào)大(Mann等1983出處同上)。為了獲得高滴度(106至＞107)，證明反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括這種稱為psi+(psi plus)的較大的信號(hào)是重要的?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，該信號(hào)從所述剪接供體上游跨越至gag起始密碼子下游(Bender等1987，出處同上)。因?yàn)樵撔盘?hào)的位置而使得在剪接的env表達(dá)轉(zhuǎn)錄物時(shí)缺失該信號(hào)。這確保只有含病毒生活周期的所有三種必需基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物被包裝。
一些研制用于基因傳遞的高滴度載體的替代方法包括使用(i)缺陷型病毒載體，諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒和痘病毒和(ii)修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)。
腺病毒是一種雙鏈線性DNA病毒，它不經(jīng)過RNA中間體。根據(jù)基因序列的同源性，將超過50種的不同人血清型腺病毒分為6個(gè)亞群。腺病毒的天然靶是呼吸道上皮和胃腸道上皮，一般僅產(chǎn)生輕度癥狀。血清型2和5(具有95％序列同源性)最常用于腺病毒載體系統(tǒng)中，通常與年輕人的上呼吸道感染有關(guān)。
腺病毒是無(wú)包膜的規(guī)則二十面體。典型的腺病毒包括140nm殼內(nèi)DNA病毒。二十面體對(duì)稱的該病毒由152個(gè)殼粒組成240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體。腺病毒顆粒核心含有36 kb線性雙鏈體DNA，它于5’端與用作DNA復(fù)制引物的末端蛋白(TP)共價(jià)連接。所述DNA具有反向末端重復(fù)序列(ITR)，且其長(zhǎng)度隨血清型而變化。
腺病毒進(jìn)入細(xì)胞涉及一系列不同的過程。病毒通過病毒纖絲(37nm)和細(xì)胞上的纖絲受體的相互作用而附著于細(xì)胞。Ad2/5血清型的該受體最近已經(jīng)鑒定出，命名為CAR(Coxsackie和Adeno受體，Tomko等(1997 Proc Natl Acad Sci 943352-3358)。所述病毒通過細(xì)胞αvβ3和avβ5整聯(lián)蛋白內(nèi)化入內(nèi)體，是由五鄰體-基衣殼蛋白(base capsid protein)中的病毒RGD序列介導(dǎo)的(Wickham等，1993 Cell 73309-319)。內(nèi)化后，內(nèi)體通過稱為內(nèi)體裂解(endosomolysis)的過程破裂，據(jù)信這是由細(xì)胞αvβ5整聯(lián)蛋白優(yōu)先促進(jìn)的過程(Wickham等1994 J Cell Biol 127257-264)。另外，最近有證據(jù)表明，Ad5的纖絲隆起以高親和性結(jié)合于某些細(xì)胞類型表面上的1類MHCα2結(jié)構(gòu)域，所述細(xì)胞類型包括人上皮細(xì)胞和B原淋巴細(xì)胞(Hong等1997 EMBO 162294-2306)。
隨后，病毒易位至細(xì)胞核，在此激活早期區(qū)，并且不久后DNA進(jìn)行復(fù)制和激活晚期區(qū)。腺病毒DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝需要宿主和病毒兩者的功能性蛋白器。
病毒基因的表達(dá)可以分為早期(E)和晚期(L)。晚期定義為開始病毒DNA復(fù)制。腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白一般在晚期合成。在腺病毒感染后，在大多數(shù)血清型病毒感染的細(xì)胞中，宿主細(xì)胞mRNA和蛋白的合成被抑制。腺病毒2和腺病毒5的腺病毒裂解循環(huán)非常有效，每個(gè)感染細(xì)胞產(chǎn)生約10,000病毒體，并且合成過量的病毒蛋白和不摻入病毒體的DNA。腺病毒早期轉(zhuǎn)錄是一連串復(fù)雜的相關(guān)互連的生化過程，但它主要需要在DNA復(fù)制開始之前合成病毒RNA。
圖30是腺病毒基因組的示意圖，顯示早期和晚期基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)方向和位置。
腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)在所有腺病毒群中是相似的，特定的功能一般位于所研究的每種血清型的相同位置。早期胞質(zhì)信使RNA與病毒DNA上的四個(gè)明確的非連續(xù)區(qū)互補(bǔ)。這些區(qū)命名為E1-E4。早期轉(zhuǎn)錄物已經(jīng)分類為一系列的立即早期區(qū)(E1a)、延遲早期區(qū)(E1b、E2a、E2b、E3和E4)以及中間區(qū)(intermediate region)。
早期基因在感染后約6-8小時(shí)表達(dá)，由基因區(qū)段E1-4中的7個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
E1a區(qū)參與病毒基因和細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄反式激活以及其它序列的轉(zhuǎn)錄阻抑。E1a基因?qū)λ衅渌缙谙俨《拘攀筊NA發(fā)揮重要的控制作用。在正常組織中，為了有效地轉(zhuǎn)錄E1b、E2a、E2b、E3或E4區(qū)，需要活性E1a產(chǎn)物。然而，可以繞過E1a功能?？梢圆僮骷?xì)胞產(chǎn)生E1a樣功能，或可以天然具有這類功能。也可以操作病毒以繞過E1a功能。病毒包裝信號(hào)與E1a增強(qiáng)子(194-358 nt)重疊。
E1b區(qū)影響病毒和細(xì)胞的代謝以及宿主蛋白的關(guān)閉。它還包括編碼pIX蛋白的基因(3525-4088 nt)，包裝全長(zhǎng)病毒DNA需要此蛋白，它對(duì)于病毒的熱穩(wěn)定性是重要的。感染晚期病毒過程的正常進(jìn)程需要病毒E1b區(qū)。E1b產(chǎn)物在宿主細(xì)胞核中起作用。E1b序列產(chǎn)生突變的突變體的晚期病毒mRNA積累減少以及對(duì)腺病毒感染晚期正常觀察到的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制削弱。改變宿主細(xì)胞功能需要E1b，以使得加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的改變有利于病毒晚期基因產(chǎn)物。這些產(chǎn)物則導(dǎo)致病毒包裝并釋放病毒體。E1b產(chǎn)生防止細(xì)胞凋亡的19 kD蛋白。E1b也產(chǎn)生結(jié)合于p53的55 kD蛋白。關(guān)于腺病毒及其復(fù)制的綜述參見WO96/17053。
E2區(qū)是必需的，因?yàn)樗幋a72 kDa DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶和55 kDa末端蛋白(TP)的80 kDa前體，TP是蛋白激發(fā)始動(dòng)DNA合成所需的。
19kDa蛋白(gp 19K)在E3區(qū)中編碼，它與調(diào)節(jié)宿主對(duì)病毒的免疫應(yīng)答有關(guān)。感染的第一階段在TNFα作用下上調(diào)該蛋白的表達(dá)，該蛋白然后結(jié)合I類MHC抗原并防止該抗原遷移至上皮細(xì)胞表面，由此減弱細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞對(duì)腺病毒感染細(xì)胞的識(shí)別。在體外研究中E3區(qū)是不必要的，并且可以通過缺失1.9 kb XbaI片段而被去除。
E4區(qū)與減少宿主蛋白的合成有關(guān)并增加病毒的DNA復(fù)制。
有5個(gè)家族的晚期基因，所有這些晚期基因均從主要晚期啟動(dòng)子起動(dòng)。晚期基因的表達(dá)包括涉及RNA剪接的非常復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后控制機(jī)制。纖絲蛋白在L5區(qū)中編碼。腺病毒基因組鄰接反向末端重復(fù)序列，所述序列在Ad5中為103 bp，并且是DNA復(fù)制所必需的。感染后30-40小時(shí)，完成病毒的產(chǎn)生。
通過缺失對(duì)E2、E3和E4啟動(dòng)子的誘導(dǎo)重要的E1基因，可以轉(zhuǎn)變腺病毒，以用作基因轉(zhuǎn)移的載體。E1復(fù)制缺陷型病毒可以在反式提供E1多肽的細(xì)胞系中繁殖，所述細(xì)胞系諸如人胚腎細(xì)胞系293?？梢酝ㄟ^重組，插入一種或多種治療基因來(lái)取代E1基因。由或者E1啟動(dòng)子或者異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該基因的表達(dá)。
通過缺失某些或所有E4可讀框(ORF)，已經(jīng)研制出毒性甚至更小的腺病毒載體。然而，某些第二代載體看來(lái)不產(chǎn)生長(zhǎng)期的基因表達(dá)，即使似乎保留所述DNA。因此，看來(lái)一種或多種E4 ORF的功能可以增強(qiáng)病毒攜帶的至少某些病毒啟動(dòng)子的基因表達(dá)。
制備缺陷更多的病毒的替代方法是將所述病毒完全“去內(nèi)臟”，僅保留病毒復(fù)制所需的末端重復(fù)序列?？梢杂玫谝淮o助病毒，在293細(xì)胞系中使“去內(nèi)臟的”或“無(wú)內(nèi)臟的”病毒生長(zhǎng)至高滴度，但難以分離“去內(nèi)臟的”載體與輔助病毒。
有復(fù)制能力的腺病毒也可以用于基因治療。例如，可以將E1A基因插入第一代病毒中，使其處于腫瘤特異性啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下。理論上，在將病毒注射入腫瘤后，病毒可以在腫瘤中特異性地復(fù)制，而在周圍正常細(xì)胞中不復(fù)制。該類型的載體可以或者用來(lái)通過裂解直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或者用來(lái)傳遞“自殺基因”，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV tk)，它可以在用丙氧鳥苷處理后殺傷受感染細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞?；蛘撸瑑HE1b缺陷的腺病毒已經(jīng)特別在1期臨床試驗(yàn)中用于抗腫瘤治療。由E1b編碼的多肽能夠阻斷p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞在病毒感染時(shí)自殺。因此，在正常的非腫瘤細(xì)胞中，在缺乏E1b時(shí)，病毒不能阻斷細(xì)胞凋亡，并因此不能產(chǎn)生感染性病毒并傳播。在p53缺陷型腫瘤細(xì)胞中，E1b缺陷型病毒可以生長(zhǎng)并傳播至相鄰的p53缺陷型腫瘤細(xì)胞，而不傳播至正常的細(xì)胞。再者，該類型的載體也可以用來(lái)傳遞諸如HSV tk的治療基因。
作為用于基因傳遞的載體，腺病毒優(yōu)于其它基因治療載體系統(tǒng)，其原因如下它是雙鏈DNA無(wú)包膜病毒，能夠在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)導(dǎo)范圍廣泛的人類和非人類來(lái)源的細(xì)胞類型。包括呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、初級(jí)乳房上皮細(xì)胞和有絲分裂后終末分化的細(xì)胞，諸如神經(jīng)元(也許重要的例外為某些淋巴樣細(xì)胞，包括單核細(xì)胞)。
腺病毒載體也能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。對(duì)于其中肺上皮中的受累細(xì)胞更新率慢的諸如囊性纖維化的疾病而言，這是非常重要的。事實(shí)上，正在進(jìn)行的幾個(gè)試驗(yàn)利用腺病毒介導(dǎo)將囊性纖維化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CFTR)轉(zhuǎn)移入罹患囊性纖維化成年患者的肺臟中。
腺病毒已經(jīng)用作基因治療的載體，并用于表達(dá)異源基因。大(36千堿基)基因組可以容納高達(dá)8kb的外源插入DNA，并且能夠在互補(bǔ)細(xì)胞系中有效復(fù)制，產(chǎn)生高達(dá)1012的非常高的滴度。因此，腺病毒是研究基因在初級(jí)非復(fù)制型細(xì)胞中表達(dá)的最佳系統(tǒng)之一。
表達(dá)腺病毒基因組的病毒基因或外源基因不需要復(fù)制型細(xì)胞。腺病毒載體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦在細(xì)胞內(nèi)，腺病毒載體極少整合入宿主染色體中，而是在染色體外(獨(dú)立于宿主基因組)作為線性基因組在宿主細(xì)胞核中發(fā)揮作用。因此，使用重組腺病毒緩解了與隨機(jī)整合入宿主基因組有關(guān)的問題。
人類惡性腫瘤與腺病毒感染無(wú)關(guān)。已經(jīng)研制出減毒的腺病毒株，并已經(jīng)作為活疫苗用于人類。
然而，目前的腺病毒載體在體內(nèi)治療應(yīng)用方面存在某些重要的限制。這些限制包括(i)瞬時(shí)基因表達(dá)-腺病毒載體一般保持為附加體并且不復(fù)制，使得它不能傳遞到以后的子代，(ii)因?yàn)樗荒軓?fù)制，所以靶細(xì)胞增殖能稀釋該載體，(iii)產(chǎn)生針對(duì)腺病毒蛋白的免疫應(yīng)答，使得甚至低水平表達(dá)腺病毒蛋白的細(xì)胞被破壞，以及(iv)不能得到有效的治療指數(shù)，因?yàn)轶w內(nèi)的傳遞導(dǎo)致僅一部分靶細(xì)胞攝入該載體以及表達(dá)所傳遞的基因。
如果將腺病毒的特征與反轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒的遺傳穩(wěn)定性結(jié)合，則所述腺病毒基本上可以用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，以成為可以穩(wěn)定感染相鄰細(xì)胞的瞬時(shí)反轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生細(xì)胞。
除在提高載體滴度方面操作所述反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體外，還對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行操作使其自我失活。
例如通過缺失所述轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或3’LTR的U3區(qū)中的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和啟動(dòng)子構(gòu)建第一個(gè)自我失活的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在病毒復(fù)制一輪后，這些變化拷貝到5’LTRS和3’LTRS，產(chǎn)生失活原病毒(Yu等1986Proc Natl Acad Sci 833194-3198；Dougherty和Temin 1987 Proc NatlAcad Sci 841197-1201；Hawley等1987 Proc Natl Acad Sci 842406-2410；Yee等1987 Proc Natl Acad Sci 919564-9568)。但是，這類載體中的LTR內(nèi)部的任何啟動(dòng)子仍然具有活性。已經(jīng)利用這種策略消除病毒LTR中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子對(duì)位于內(nèi)部的基因的轉(zhuǎn)錄的作用。這類作用包括增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄(Jolley等1983 Nucleic Acids Res 111855-1872)或抑制轉(zhuǎn)錄(Emerman和Temin 1984 Cell 39499-467)。還可應(yīng)用這種策略消除3’LTR向下游轉(zhuǎn)錄為基因組DNA(Herman和Coffin 1987 Science 236845-848)。這種作用特別涉及人類基因治療，其中特別重要的是防止偶發(fā)性激活內(nèi)源性癌基因。這種策略的缺點(diǎn)包括與具有完整LTR的載體相比，自我失活載體的滴度低(至少低10倍)以及推測(cè)現(xiàn)存載體自我重組或與用于產(chǎn)生載體貯液的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞中的病毒序列重組而傾向于重排產(chǎn)生具有完整LTR的病毒。
除在提高載體滴度方面操作所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體外，還設(shè)計(jì)了反轉(zhuǎn)錄病毒載體，以在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生特定的NOI(通常為標(biāo)記蛋白)。如前所述，最常用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)包括用一種或多種NOI取代反轉(zhuǎn)錄病毒序列，以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型載體。最簡(jiǎn)單型方法是使用所述反轉(zhuǎn)錄病毒5’LTR中的啟動(dòng)子，來(lái)控制編碼NOI的cDNA的表達(dá)，或改變所述LTR的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，以提供組織特異性表達(dá)或誘導(dǎo)性?；蛘撸ㄟ^用在啟動(dòng)子選擇中提供更大靈活性的內(nèi)部啟動(dòng)子表達(dá)單一的編碼區(qū)。
當(dāng)所述NOI為選擇標(biāo)記時(shí)，如在次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)的情況下，最容易實(shí)現(xiàn)表達(dá)目的基因的這些策略(Miller等1983Proc Natl Acad Sci 804709-4713)，這有助于載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的選擇。如果該載體含有不是選擇標(biāo)記的NOI，則可以通過與存在于獨(dú)立質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記共轉(zhuǎn)染，將該載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞。該策略對(duì)于基因治療的突出優(yōu)點(diǎn)是在最終的靶細(xì)胞中表達(dá)單一的蛋白，并且避免選擇標(biāo)記的可能毒性和抗原性。然而，當(dāng)所插入的基因不可選擇時(shí)，該方法的缺點(diǎn)是更難以產(chǎn)生產(chǎn)生高滴度載體貯液的細(xì)胞。另外，通常更難以測(cè)定該載體的滴度。
目前用來(lái)設(shè)計(jì)表達(dá)兩種或兩種以上蛋白的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，依賴于三種通用的策略。這三種策略包括(i)由一種啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的可變剪接的mRNA表達(dá)不同的蛋白；(ii)使用5’LTR中的啟動(dòng)子和內(nèi)部啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)不同cDNA的轉(zhuǎn)錄，和(iii)使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件，以允許由或者單一mRNA或者由可以從一個(gè)可讀框表達(dá)的融合蛋白翻譯多個(gè)編碼區(qū)。
含內(nèi)部啟動(dòng)子的載體已經(jīng)廣泛用來(lái)表達(dá)多個(gè)基因。一個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子使得可利用非病毒LTR的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合來(lái)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。多個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子可以包括在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，且已經(jīng)證明可以分別由其自身的啟動(dòng)子表達(dá)至少三種不同的cDNA(Overell等1988 Mol CellBiol81803-1808)。
盡管現(xiàn)在有許多這類修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用于在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NOI，但其中大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的簡(jiǎn)單型反轉(zhuǎn)錄病毒，諸如鼠類致癌反轉(zhuǎn)錄病毒。
例如廣泛使用的利用可變剪接表達(dá)病毒LTR SV(X)的基因(Cepko等1984 Cell 371053-1062)的載體，含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為選擇標(biāo)記。這類類型載體的代表是親代病毒MO-MLV，在該病毒中Gag和Gag-Pol蛋白由全長(zhǎng)病毒mRNA翻譯，而Env蛋白由剪接的mRNA產(chǎn)生。由該載體編碼的其中一種蛋白由全長(zhǎng)RNA翻譯，而將5’LTR附近的剪接供體連接于恰好在第二基因上游的剪接受體的剪接作用產(chǎn)生一種RNA，由該RNA可以翻譯第二基因產(chǎn)物。該策略的一個(gè)缺點(diǎn)是將外源序列插入剪接基因的內(nèi)含子中。這可以影響剪接RNA與未剪接RNA之比，或提供干擾編碼第二基因產(chǎn)物的剪接RNA產(chǎn)生的可變剪接受體(Korman等1987 Proc Natl Acad Sci 842150-2154)。因?yàn)檫@些效應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的，所以它們可能影響所述編碼基因的產(chǎn)生。
其它修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以根據(jù)剪接能力分為兩類。
第一類修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體在剪接供體內(nèi)含有抑制病毒轉(zhuǎn)錄物剪接的突變(GT至GC)，其典型代表為pBABE載體(Morgenstem等1990 Nucleic Acid Reseasrch 183587-3596)。這種剪接抑制是有益的，原因有兩個(gè)首先，它確保所有的病毒轉(zhuǎn)錄物均含有包裝信號(hào)，并因此所有的病毒轉(zhuǎn)錄物均可以包裝入所述產(chǎn)生細(xì)胞。其次，它防止病毒剪接供體和所插入基因的可能的隱蔽剪接受體之間的潛在的異常剪接。
第二類修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體含有功能性內(nèi)含子，其典型代表為N2(Miller等1989 Biotechniques 7980-990)和新近的MFG(Dranoff等1993 Proc Natl Acad Sci193979-3986)。這兩種載體均利用存在于包裝信號(hào)內(nèi)的正常剪接供體。然而，它們各自的剪接受體(SA)不同。對(duì)于N2，SA存在于“延伸的”包裝信號(hào)內(nèi)(Bender等1987，出處同上)。對(duì)于MFG，使用天然的SA(存在于pol內(nèi)，參見

圖1)。對(duì)于這兩種載體，已經(jīng)證實(shí)剪接大大增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的基因表達(dá)(Miller等1989，出處同上；Krall等1996 Gene Therapy 337-48)。這類觀測(cè)結(jié)果支持以前的發(fā)現(xiàn)一般而言，剪接可以增強(qiáng)mRNA的翻譯(Lee等1981 Nature 294228-232；Lewis等1986 Mol Cell Biol 61998-2010；Chapman等1991Nucleic Acids Res 193979-3986)。對(duì)此，一個(gè)可能的原因是參與轉(zhuǎn)錄物剪接的相同細(xì)胞器可能也有助于將轉(zhuǎn)錄物輸出細(xì)胞核。
與上述修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒載體不同，對(duì)能夠感染非分裂細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒慢病毒系統(tǒng)中可變剪接的研究工作非常少(Naldini等1996Science 272263-267)。迄今為止，僅有的公開的慢病毒載體為衍生自HIV-1(Kim等1997 J Virol 72811-816)和FIV(Poeschla等1998 NatMed 4354-357)的慢病毒載體。這些載體仍含有病毒來(lái)源的剪接供體和剪接受體序列(Naldini等1996，出處同上)。
本發(fā)明設(shè)法提供一種新型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
具體地說，本發(fā)明設(shè)法提供能夠在一個(gè)或多個(gè)所需靶位點(diǎn)有效表達(dá)一種NOI、乃至多種NOI的新型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明還設(shè)法提供一種用于制備高滴度載體病毒體的新型系統(tǒng)，所述系統(tǒng)增加了體內(nèi)使用的安全特征，并能夠于一個(gè)或多個(gè)所需靶位點(diǎn)有效表達(dá)一種NOI、乃至多種NOI。
按照本發(fā)明的第一方面，提供包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一個(gè)目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中第一NS位于第二NS下游，而第三NS和第四NS位于第二NS上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在所需的靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后，能夠剪接所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
按照本發(fā)明的第二方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)；并且其中第二NS位于所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)下游，使得可于主要靶位點(diǎn)阻止剪接。
按照本發(fā)明的第三方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中第二NS置于第一NOI下游，使得第一NOI能夠在主要靶位點(diǎn)表達(dá)。
按照本發(fā)明的第四方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中第二NS置于多克隆位點(diǎn)上游，使得可以插入一種或多種其它NOI。
按照本發(fā)明的第五方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中第二NS為編碼免疫分子或其部分的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的第六方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述免疫分子為免疫球蛋白。
按照本發(fā)明的第七方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中第二NS為編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
按照本發(fā)明的第八方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體還包含一種功能性內(nèi)含子。
按照本發(fā)明的第九方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述功能性內(nèi)含子的定位使得它能夠?qū)⒅辽僖环N所述NOI的表達(dá)限于所需靶位點(diǎn)。
按照本發(fā)明的第十方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述靶位點(diǎn)為一種細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第十一方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體或原載體可衍生自致癌反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒。
按照本發(fā)明的第十二方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體可衍生自MMLV、MSV、MMTV、HIV-1或EIAV。
按照本發(fā)明的第十三方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體為整合的原病毒。
按照本發(fā)明的第十四方面，提供一種可得自反轉(zhuǎn)錄病毒載體的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。
按照本發(fā)明的第十五方面，提供一種用反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第十六方面，提供一種用于醫(yī)學(xué)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或病毒顆粒或細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第十七方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體或病毒顆?；蚣?xì)胞，以用于產(chǎn)生將一種或多種NOI傳遞至其需要靶位點(diǎn)的藥用組合物。
按照本發(fā)明的第十八方面，提供包括用反轉(zhuǎn)錄病毒載體或病毒顆粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或使用細(xì)胞的方法。
按照本發(fā)明的第十九方面，提供反轉(zhuǎn)錄病毒載體或病毒顆粒或細(xì)胞的傳遞系統(tǒng)，其中所述傳遞系統(tǒng)包含一種或多種非反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒或質(zhì)?；蛩鼈兊慕M合，以將一種NOI或多種NOI傳遞至第一靶細(xì)胞，所述傳遞系統(tǒng)還包含一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，以將一種或多種NOI傳遞至第二靶細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第二十方面，提供一種反轉(zhuǎn)錄病毒原載體。
按照本發(fā)明的第二十一方面，提供一種功能性內(nèi)含子的用法，以將一種或多種NOI的表達(dá)限于所需靶細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第二十二方面，提供應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶將第一NS從反轉(zhuǎn)錄病毒原載體的3’端傳遞至反轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’端，使得轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生功能性內(nèi)含子。
按照本發(fā)明的第二十三方面，提供用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，第一病毒載體能夠感染第一靶細(xì)胞并在其中表達(dá)第二病毒載體，第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞。
按照本發(fā)明的第二十四方面，提供一種雜種病毒載體系統(tǒng)，其中第一病毒載體可得自或基于腺病毒載體和/或第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
按照本發(fā)明的第二十五方面，提供一種雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
按照本發(fā)明的第二十六方面，提供一種慢病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
按照本發(fā)明的第二十七方面，提供一種腺病毒載體系統(tǒng)，其中所述腺病毒載體包含或能夠傳遞斷裂內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
按照本發(fā)明的第二十八方面，提供基于或得自以下任何一種或多種實(shí)體的載體或質(zhì)粒pE1sp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rab。
按照本發(fā)明的第二十九方面，提供能夠在靶細(xì)胞中差異表達(dá)NOI的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明的另一方面包括用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并在其中表達(dá)第二病毒載體，第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞，其中第一載體可得自或基于腺病毒載體，而第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
本發(fā)明的另一方面包括用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并在其中表達(dá)第二病毒載體，第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞，其中第一載體可得自或基于腺病毒載體，而第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，最好是慢病毒載體；其中所述病毒載體系統(tǒng)包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一個(gè)目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中第一NS位于第二NS下游，而第三NS和第四NS位于第二NS的上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在所需的靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后，能夠剪接所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明的另一方面包括自我失活(SIN)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一個(gè)目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中第一NS位于第二NS下游，而第三NS和第四NS位于第二NS的上游；使得反轉(zhuǎn)錄病毒載體因?yàn)樗龇崔D(zhuǎn)錄病毒原載體在其所需的靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄而不能夠被包裝。
所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體最好還包含第二NOI；其中第二NOI位于所述功能性剪接受體位點(diǎn)下游。
所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體最好包含第二NOI；其中第二NOI位于第二NS下游。
第二NOI或其表達(dá)產(chǎn)物最好是治療劑或診斷劑，或包含治療劑或診斷劑。
第一NOI或其表達(dá)產(chǎn)物最好是或包含任何一種或多種賦予可選擇性的因子(例如標(biāo)記元件)、病毒必需元件或其部分或其組合。
第一NS最好位于反轉(zhuǎn)錄病毒原載體3’端或其附近；最好是其中所述3’端包含一個(gè)U3區(qū)和一個(gè)R區(qū)；并且最好其中第一NS位于所述U3區(qū)和所述R區(qū)之間。
所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體的U3區(qū)和/或第一NS最好包含為第三NOI的NS；其中所述NOI為任何一種或多種轉(zhuǎn)錄控制元件、編碼序列或其部分。
第一NS最好可得自病毒。
第一NS最好為內(nèi)含子或其部分。
所述內(nèi)含子最好可得自SV40病毒的小t-內(nèi)含子。
所述載體組分最好受調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，所述載體組分由低氧調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，所述載體組分由四環(huán)素開/關(guān)系統(tǒng)調(diào)節(jié)。
因此，本發(fā)明提供利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的傳遞系統(tǒng)。
本發(fā)明傳遞系統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)，它們鄰接第一NOI。所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體因反轉(zhuǎn)錄病毒原載體的反轉(zhuǎn)錄而形成，該反轉(zhuǎn)錄病毒原載體可以包含多個(gè)NOI。
當(dāng)所述FSDS位于所述FSAS上游時(shí)，任何間插序列均能被剪接。通常，剪接去除間插或“內(nèi)含子”RNA序列，連接其余的“外顯子”序列獲得連續(xù)的翻譯序列。
剪接過程圖示于圖31。
在該圖示中，Y代表剪接去除的間插序列。
間插序列(或內(nèi)含子)的位置最好使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)在靶位點(diǎn)缺失。
反轉(zhuǎn)錄病毒載體的天然剪接結(jié)構(gòu)示于圖27a。已知載體的剪接結(jié)構(gòu)示于圖27b。按照本發(fā)明的剪接結(jié)構(gòu)示于圖27c。
所述間插序列的位置最好使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)在所需的靶位點(diǎn)缺失而且所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體自我失活。
按照本發(fā)明，如果所述FSDS位于所述FSAS下游，則不能進(jìn)行剪接。
同樣，如果所述FSDS為非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)和/或所述FSAS為非功能性受體受體位點(diǎn)(NFSAS)時(shí)，則不能進(jìn)行剪接。
第四NS最好能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)。
第四NS最好能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性隱蔽剪接供體位點(diǎn)。
第四NS最好能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接受體位點(diǎn)。
第四NS最好能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性隱蔽剪接受體位點(diǎn)。
第四NS最好位于所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)中。
NFSDS的一個(gè)實(shí)例是突變的FSDS，使得所述FSDS不能夠再被剪接機(jī)制識(shí)別。
術(shù)語(yǔ)“剪接供體位點(diǎn)”包括鑒定和未鑒定的天然以及人工衍生或可衍生的剪接供體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“隱蔽的”剪接供體位點(diǎn)包括位于包裝信號(hào)中的剪接供體位點(diǎn)，它甚至可包括以前未鑒定的剪接供體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“剪接受體位點(diǎn)”包括鑒定和未鑒定的天然以及人工衍生或可衍生的剪接受體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“隱蔽的”剪接受體位點(diǎn)包括位于包裝信號(hào)中的剪接受體位點(diǎn)，它甚至可包括以前未鑒定的剪接受體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“剪接位點(diǎn)”包括鑒定和未鑒定的天然以及人工衍生或可衍生的剪接供體和/或剪接受體位點(diǎn)，包括隱蔽的剪接供體位點(diǎn)和隱蔽的剪接受體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“隱蔽的”剪接位點(diǎn)包括隱蔽的剪接供體位點(diǎn)和/或位于包裝信號(hào)中的隱蔽剪接受體位點(diǎn)，它甚至可以包括以前未鑒定的剪接供體或剪接受體位點(diǎn)。
按照本發(fā)明，每種NS均可以是任何合適的核苷酸序列。例如，每種序列可以是獨(dú)立的DNA或RNA-它們可以合成制得或可以用重組DNA技術(shù)制得，或可以從天然來(lái)源分離獲得，或可以是它們的組合。所述序列可以是有義序列或反義序列?？梢杂卸喾N可以直接或間接地相互連接的序列或其組合。
按照本發(fā)明，每種NOI均可以是任何合適的核苷酸序列。例如，每種序列可以是獨(dú)立的DNA或RNA-它們可以合成制得或可以用重組DNA技術(shù)制得，或可以從天然來(lái)源分離獲得，或可以是它們的組合。所述序列可以是有義序列或反義序列。可以有多種可以直接或間接地相互連接的序列或其組合。
第一NOI可以包括任但不限于任何一種或多種以下選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記已經(jīng)成功地用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體細(xì)菌新霉素和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，它們分別賦予G418抗性和潮霉素抗性(Palmer等1987Proc Natl Acad Sci 841055-1059；Yang等1987 Mol Cell Biol 73923-3928)；突變的小鼠二氫葉酸還原酶基因(dhfr)，它賦予對(duì)氨甲蝶呤抗性(Miller等1985 Mol Cell Biol 5431-437)；細(xì)菌gpt基因，它允許細(xì)胞在含霉酚酸、黃嘌呤和氨基蝶呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Mann等1983 Cell33153-159)；細(xì)菌hisD基因，它允許細(xì)胞在無(wú)組氨酸但含組氨醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Danos和Mulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 856460-6464)；多藥抗性基因(mdr)，賦予對(duì)多種藥物的抗性(Guild等1988 ProcNatl Acad Sci 851595-1599；Pastan等1988 Proc Natl Acad Sci 854486-4490)和賦予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的細(xì)菌基因(Morgensten和Land 1990 Nucleic Acid Res 183587-3596)。
所有這些標(biāo)記均為顯性選擇標(biāo)記，并允許化學(xué)選擇表達(dá)這些基因的大多數(shù)細(xì)胞。β-半乳糖苷酶也可以認(rèn)為是顯性標(biāo)記；表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞可以通過采用熒光激活細(xì)胞分類器而被選擇。事實(shí)上，任何細(xì)胞表面蛋白均可以為已經(jīng)不產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞提供選擇標(biāo)記。通過采用抗所述蛋白的熒光抗體和細(xì)胞分類器，可以選擇表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞。載體包含的其它選擇標(biāo)記包括hprt和HSV胸苷激酶，后者允許細(xì)胞在含次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
第一NOI可以含有非編碼序列，例如反轉(zhuǎn)錄病毒包裝位點(diǎn)或使得第二NOI在所述原載體中成為無(wú)功能性的無(wú)義序列，但當(dāng)它們通過剪接所述載體而被去除時(shí)，第二NOI顯示功能表達(dá)。
第一NOI也可以編碼病毒必需元件，諸如編碼Env蛋白的env，這可以降低產(chǎn)生系統(tǒng)的復(fù)雜度。例如在腺病毒載體中，這允許所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組和包膜以單一腺病毒載體組合，處于同一啟動(dòng)子控制之下，由此提供更簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，并在所述腺病毒載體中留下更多容納額外序列的容量。一方面，那些額外的序列可以是gag-pol盒本身。因此，在一個(gè)腺病毒載體中，人們可以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。以前的研究(Feng等1997 Nature Biotechnology 15866)需要使用多個(gè)腺病毒載體。
如果所述反轉(zhuǎn)錄病毒組分包括一個(gè)env核苷酸序列，則全部或部分該序列可以任選地用另一env的全部或部分核苷酸序列取代，所述另一env核苷酸序列的實(shí)例諸如命名為4070A的兼嗜性Env蛋白或流感病毒血細(xì)胞凝集素(HA)或水泡性口腔炎病毒G(VSV-G)蛋白。用異源env基因取代所述env基因，是稱為假型化的技術(shù)或策略的一個(gè)實(shí)例。假型化不是一種新現(xiàn)象，實(shí)例可參見WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400、WO-A-91/00047和Mebatsion等1997 Cell90，841-847。
在一個(gè)優(yōu)選方面，已將本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體假型化。在該方面，假型化可以賦予一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，用所述慢病毒載體，基于HIV的載體的env基因產(chǎn)物將限制這些載體，使其僅感染表達(dá)稱為CD4的蛋白的細(xì)胞。但是如果這些載體中的所述env基因被其它RNA病毒的env序列取代，則它們的感染范圍可更廣(Verma和Somia 1997Nature 389239-242)。例如研究人員已經(jīng)用VSV的糖蛋白將基于HIV的載體假型化(Verma和Somia 1997，出處同上)。
在另一替代方法中，所述Env蛋白可以是修飾的Env蛋白，諸如突變或工程改造的Env蛋白。可以制備或選擇修飾，以導(dǎo)入尋靶能力或降低毒性或用于另一目的(Valsesia-Wittman等1996 J Virol 702056-64；Nilson等1996 Gene Therapy 3280-6；Fielding等1998 Blood91802和其中引用的參考文獻(xiàn))。
合適的第二NOI編碼序列包括治療和/或診斷用途的序列，諸如但不限于編碼以下組分的序列細(xì)胞因子、趨化因子、激素、抗體、工程改造的免疫球蛋白樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、靶蛋白的反式顯性陰性突變體(transdominant negative mutant)、毒素、條件毒素、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長(zhǎng)因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶以及它們的衍生物(諸如具有結(jié)合的報(bào)道基團(tuán))。但包括這類編碼序列時(shí)，這類編碼序列通常可以操作性地連接于合適的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可以是驅(qū)動(dòng)核酶表達(dá)的啟動(dòng)子、或是一種不同的啟動(dòng)子或多種啟動(dòng)子。
第二NOI編碼序列可以編碼融合蛋白或編碼序列的區(qū)段。
本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)將諸如前體藥物活化酶的第二NOI傳遞至腫瘤部位，以治療癌癥。在各種情況下，使用合適的前體藥物聯(lián)合合適的前體藥物活化酶治療所述個(gè)體(諸如患者)。合適的前體藥物結(jié)合所述載體給予。前體藥物的實(shí)例包括磷酸鬼臼亞乙苷(與堿性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc Natl Acad Sci 854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶一起使用，Mullen等1994 CancerRes.541503-1506)；阿霉素-N-對(duì)羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol Immunother 31202-206)；對(duì)-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(與羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸頭孢菌素氮芥(與β-內(nèi)酰胺酶一起使用)；SR4233(與P450還原酶一起使用)；丙氧鳥苷(與HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 ProcNatl Acad Sci 857572-7576)；與硝基還原酶一起使用的芥子前體藥物(Friedlos等1997 J Med Chem 401270-1275)和環(huán)磷酰胺(與P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 561331-1340)。
本發(fā)明的載體可以通過病毒或非病毒載體傳遞至靶位點(diǎn)。
本領(lǐng)域眾所周知的是，載體是允許或促進(jìn)一種實(shí)體從一種環(huán)境轉(zhuǎn)移至另一種環(huán)境的工具。例如用于重組DNA技術(shù)的某些載體允許諸如DNA區(qū)段(諸如異源DNA區(qū)段，諸如異源cDNA區(qū)段)的實(shí)體轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞?？扇芜x的是，一旦處于靶細(xì)胞中，所述載體則可以用來(lái)將異源DNA維持在所述細(xì)胞中，或可以用作DNA復(fù)制單位。用于重組DNA技術(shù)的載體實(shí)例包括質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。
非病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染法。在此，轉(zhuǎn)染包括使用非病毒載體將基因傳遞至目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的過程。
典型的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、DNA生物發(fā)射(biolistics)、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、緊密(compacted)DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂轉(zhuǎn)染試劑、陽(yáng)離子試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子表面兩親物(CFA)(NatureBiotechnology 1996 14；556)和它們的組合物。
病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體或痘病毒載體。其它的載體實(shí)例包括活體外傳遞系統(tǒng)，包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染法，諸如電穿孔、DNA生物發(fā)射、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、緊密DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明的載體傳遞系統(tǒng)可以包括在體外制備的第一載體，它編碼在體內(nèi)產(chǎn)生第二載體所必需的基因。
一種或多種第一病毒載體可以是多種不同的病毒載體，諸如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒載體，或在多個(gè)第一病毒載體的情況下，它們可以是不同病毒來(lái)源的載體的混合物。無(wú)論在何種情況下，第一病毒載體均最好是缺陷型，因?yàn)槿毕菪洼d體不能獨(dú)立地復(fù)制。因此，它們能夠進(jìn)入靶細(xì)胞并傳遞第二載體序列，但并不能復(fù)制以繼續(xù)進(jìn)一步感染靶細(xì)胞。
在所述雜種病毒載體系統(tǒng)包含一種以上第一載體以編碼第二載體的情況下，兩種或所有三種第一載體將用來(lái)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)第一靶細(xì)胞群，通常是同時(shí)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
最好有編碼第二病毒載體所有組分的單一的第一病毒載體。
優(yōu)選的單一或多個(gè)第一病毒載體是腺病毒載體。
用于本發(fā)明的腺病毒載體可以衍生自人腺病毒或通常不感染人類的腺病毒。所述載體最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鳥類腺病毒，諸如CELO病毒(Cotton等1993 JVirol 673777-3785)。所述載體可以是具有復(fù)制能力的腺病毒載體，但更優(yōu)選是缺陷型腺病毒載體。可以通過缺失病毒復(fù)制必需的一種或多種組分，使腺病毒載體為缺陷型。通常，每個(gè)腺病毒載體含有至少一個(gè)E1區(qū)的缺失。為了產(chǎn)生感染性腺病毒載體顆粒，通過使病毒在諸如人293細(xì)胞系的人胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系中傳代，可以互補(bǔ)這一缺失，其中293細(xì)胞系含有完整拷貝的Ad5的左邊部分，包括E1基因。異源DNA插入這類載體的容量至多可以為約7kb。因此，這類載體可以用來(lái)構(gòu)建按照本發(fā)明的包含三個(gè)獨(dú)立重組載體的系統(tǒng)，每種載體含有其中一個(gè)必需的轉(zhuǎn)錄單位以構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體。
替代的腺病毒載體是本領(lǐng)域已知的，它們?cè)谄渌俨《净蛑羞€存在缺失，這些載體也適用于本發(fā)明。其中數(shù)種第二代腺病毒載體的免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 J Virol 704173-4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J Virol70559-565)。延長(zhǎng)缺失用來(lái)提供額外的克隆容量以將多個(gè)基因?qū)胨鲚d體。例如描述了25 kb的缺失(Lieber等1996 J Virol 708944-8960)，還報(bào)道了缺失所有病毒基因的克隆載體(Fisher等1996 Virology 21711-22)，所述載體允許導(dǎo)入35 kb以上的異源DNA。這類載體可以用來(lái)產(chǎn)生按照本發(fā)明的腺病毒第一載體，第一載體編碼用于構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的兩個(gè)或三個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。
第二病毒載體最好是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過在第一靶細(xì)胞中表達(dá)缺陷型病毒載體顆粒裝配和包裝的必需基因，產(chǎn)生第二載體。因?yàn)樵撦d體不能獨(dú)立復(fù)制，因而為缺陷型。因此，一旦第二反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)了第二靶細(xì)胞，則它不能通過復(fù)制而傳播至任何其它靶細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄病毒載體”通常包括能夠感染但本身不能復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄病毒核酸。因此，它是復(fù)制缺陷型。反轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包含一種或多種NOI，最好是非反轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的NOI，以將其傳遞至靶細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄病毒載體也可以包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)；一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)和一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)，使得當(dāng)所述FSDS位于所述FSAS上游時(shí)，任何間插序列均能夠被剪接。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以在U3區(qū)包含其它非反轉(zhuǎn)錄病毒序列，諸如非反轉(zhuǎn)錄病毒控制序列，一旦所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為原病毒整合入靶細(xì)胞中時(shí)，所述序列可以影響NOI的表達(dá)。所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體不需要只含有單一反轉(zhuǎn)錄病毒的元件。因此，按照本發(fā)明，可以具有可得自兩種或兩種以上不同反轉(zhuǎn)錄病毒或其它來(lái)源的元件。
術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄病毒原載體”通常包括上述的反轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組，但它包含能夠產(chǎn)生一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)和一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)；其中第一NS位于第二NS的下游；其中第三和第四NS位于第二NS的上游，使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后，能夠剪接所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?！笔侵赴b的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，它最好能夠結(jié)合于靶細(xì)胞并進(jìn)入靶細(xì)胞。如上討論的所述載體顆粒的組分可以相對(duì)于野生型反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行修飾。例如，可以將所述顆粒的蛋白性外殼中的Env蛋白進(jìn)行遺傳修飾，以便改變其靶向特異性或完成某些其它所需功能。
本發(fā)明該方面的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以衍生自鼠類致癌反轉(zhuǎn)錄病毒，諸如MMLV、MSV或MMTV；或可以衍生自慢病毒，諸如HIV-1、EIAV；或可以衍生自另一反轉(zhuǎn)錄病毒。
可以將本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體修飾，以產(chǎn)生所述反轉(zhuǎn)錄病毒無(wú)功能性剪接供體位點(diǎn)。
可以將本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體修飾，以產(chǎn)生所述反轉(zhuǎn)錄病毒無(wú)功能性剪接受體位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“修飾”包括但不限于使所述剪接供體位點(diǎn)或剪接受體位點(diǎn)沉默、失活、突變或去除。
具有突變天然剪接供體位點(diǎn)載體諸如基于MLV的載體，是本領(lǐng)域已知的。這種載體的一個(gè)實(shí)例是pBABE(Morgenstem等1990，出處同上)。
可以由第一載體中DNA編碼的產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體必需基因的表達(dá)，產(chǎn)生第二載體。這類基因可以包括反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因、包膜病毒的env基因和含一種或多種治療或診斷NOI的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體一般含有使得能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的序列、至少一部分5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)、至少一部分3’LTR和包裝信號(hào)。
如果期望使第二載體為復(fù)制缺陷型，則第二載體可以由多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼，所述轉(zhuǎn)錄單位可以位于單一或位于兩種或兩種以上的腺病毒載體或其它第一載體中。因此，可有編碼第二載體基因組的轉(zhuǎn)錄單位、編碼gag-pol的轉(zhuǎn)錄單位和編碼env的轉(zhuǎn)錄單位?；蛘撸梢越M合其中兩種或兩種以上轉(zhuǎn)錄單位。例如，編碼gag-pol和env或env和基因組的核酸序列，可以組合為單一轉(zhuǎn)錄單位。完成該組合的方法是本領(lǐng)域已知的。
本文所述的轉(zhuǎn)錄單位為含編碼序列和完成這些編碼序列表達(dá)的信號(hào)的核酸區(qū)，其獨(dú)立于任何其它編碼序列。因此，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位通常包含至少一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)增強(qiáng)子和一個(gè)多腺苷酸化信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”以本領(lǐng)域的常規(guī)含義使用，例如Jacob-Monod基因表達(dá)理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。
術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”包括結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的其它蛋白組分并由此促進(jìn)由其相關(guān)啟動(dòng)子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列。
編碼第二載體的轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子最好在產(chǎn)生第二病毒載體的條件下，在第一靶細(xì)胞中有強(qiáng)活性，或能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以是組成型有效的，或其活性可以受組織限制或受時(shí)間限制。合適的組織限制啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例是在腫瘤細(xì)胞中呈高活性的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，諸如MUCl基因、CEA基因或5T4抗原基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。時(shí)間限制的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例是對(duì)局部缺血和/或低氧應(yīng)答的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，諸如低氧效應(yīng)元件或grp78或grp94基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。一個(gè)優(yōu)選的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。
其它優(yōu)選的額外組分包括使得能夠有效表達(dá)NOI或多個(gè)NOI的實(shí)體。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，存在低氧或局部缺血調(diào)節(jié)性表達(dá)的第二載體組分。在該方面，低氧是在范圍廣泛的不同細(xì)胞類型中基因表達(dá)的有效的調(diào)節(jié)物，并通過誘導(dǎo)諸如低氧誘導(dǎo)型因子-1(HIF-1；Wang和Semenza 1993 Proc Natl Acad Sci90430)的低氧誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子的活性而起作用，低氧誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于同類的DNA識(shí)別位點(diǎn)，即各種基因啟動(dòng)子上的低氧效應(yīng)元件(HRE)。Dachs等(1997 Nature Med 5515)已經(jīng)使用了多體形式的小鼠磷酸甘油激酶-1(PGK-1)基因的HRE(Firth等1994 Proc Natl Acad Sci916496-6500)，在體外控制對(duì)低氧應(yīng)答的人纖維肉瘤細(xì)胞的標(biāo)記基因和治療基因的表達(dá)，以及在體內(nèi)控制實(shí)體瘤中的標(biāo)記基因和治療基因的表達(dá)(Dachs等，出處同上)?；蛘撸@著的葡萄糖缺乏也存在于腫瘤的局部缺血區(qū)的事實(shí)，能被用來(lái)在腫瘤中特異性地激活異源基因的表達(dá)。已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動(dòng)子的截短的632個(gè)堿基對(duì)的序列，也顯示能夠在鼠類體內(nèi)腫瘤中驅(qū)動(dòng)高水平的報(bào)道基因的表達(dá)(Gazit等1995 Cancer Res.551660)。
調(diào)節(jié)這類組分表達(dá)的一個(gè)替代方法是如Yorshida等所述的使用Gossen和Bujard描述的四環(huán)素開/關(guān)系統(tǒng)(1992 Proc Natl Acad Sci 895547)來(lái)產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的gal、pol和VSV-G蛋白(1997 BiochemBiophys Res Comm 230426)。不尋常的是，該調(diào)節(jié)系統(tǒng)也用于本發(fā)明來(lái)控制產(chǎn)生所述原載體基因組。這確保在缺乏四環(huán)素時(shí)沒有載體組分從所述腺病毒載體表達(dá)。
以下描述可以加入到所述雜種病毒載體系統(tǒng)的安全特征?？梢源嬖谝环N或多種這類特征。
第二載體對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用也是有利的，因?yàn)槠渲幸胂亟M產(chǎn)生能夠獨(dú)立復(fù)制的感染性病毒的可能性的一種或多種特征。以前公開的研究中不包括這類特征(Feng等1997，出處同上)。特別是，F(xiàn)eng等(出處同上)沒有描述由下述三種組分構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
首先，通過缺失同源區(qū)，可以避免編碼第二載體組分的序列之間的序列同源性。同源區(qū)允許發(fā)生基因重組。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用三種轉(zhuǎn)錄單位構(gòu)建第二反轉(zhuǎn)錄病毒載體。第一轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因。第二轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的env基因。第三轉(zhuǎn)錄單位包含在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。在天然的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中，包裝信號(hào)的位置使得正確起作用需要部分gag序列。通常，當(dāng)由其構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)時(shí)，包括部分gag基因在內(nèi)的包裝信號(hào)仍在所述載體基因組中。然而，在本發(fā)明的情況下，所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有基本包裝信號(hào)，它不包含與第一轉(zhuǎn)錄單位中的gag序列同源的序列。同樣，在反轉(zhuǎn)錄病毒中，例如在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，在pol編碼序列3’端和env編碼序列5’端之間有一個(gè)重疊小區(qū)。通過改變或者pol編碼序列3’端或者env編碼序列5’端的序列，以改變密碼子使用，而不改變所編碼蛋白的氨基酸序列，可以去除第一和第二轉(zhuǎn)錄單位之間的相應(yīng)的同源性區(qū)域。
其次，通過用另一反轉(zhuǎn)錄病毒或另一包膜病毒的Env蛋白將一種反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組假型化，這樣可避免env組分和gag-pol組分之間的同源區(qū)，從而可以避免第二病毒載體有復(fù)制能力的可能性。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由以下三種組分構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體第一轉(zhuǎn)錄單位含有非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因。第二轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的替代的包膜病毒的env基因。第三轉(zhuǎn)錄單位包含在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有基本包裝信號(hào)，它不含有與第一轉(zhuǎn)錄單位中的gag序列同源的序列。
第三，通過采用以特定方式構(gòu)建的兩種轉(zhuǎn)錄單位，可以消除反轉(zhuǎn)錄病毒有復(fù)制能力的可能性。第一轉(zhuǎn)錄單位含有在第一靶細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子(諸如hCMV啟動(dòng)子-增強(qiáng)子或組織限制性啟動(dòng)子-增強(qiáng)子)控制下的gag-pol編碼區(qū)。第二轉(zhuǎn)錄單位編碼能夠被包裝入反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA。第二轉(zhuǎn)錄單位含有包裝、整合和反轉(zhuǎn)錄所必需的反轉(zhuǎn)錄病毒序列，也含包膜病毒的env蛋白編碼序列和一種或多種治療基因的編碼序列。
在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)所述env和NOI編碼序列的轉(zhuǎn)錄，使得所述Env蛋白優(yōu)先在第一靶細(xì)胞中產(chǎn)生，而所述NOI的表達(dá)產(chǎn)物優(yōu)先在第二靶細(xì)胞中產(chǎn)生。
一種合適的內(nèi)含子剪接布置在后面實(shí)施例5中進(jìn)行了描述，并圖示于圖17和圖27c。這里，在由第一載體傳遞至第一靶細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組序列中，剪接供體位點(diǎn)位于剪接受體位點(diǎn)下游。因此在第一靶細(xì)胞中不存在剪接，或很少發(fā)生剪接，所以所述Env蛋白將優(yōu)先表達(dá)。然而，一旦所述載體基因組完成了反轉(zhuǎn)錄過程并整合入第二靶細(xì)胞，則功能性剪接供體序列將位于5’LTR中，位于功能性剪接受體序列上游。發(fā)生剪接，將所述env序列剪接去除，產(chǎn)生所述NOI的轉(zhuǎn)錄物。
在該實(shí)施例的第二布置中，所述NOI的表達(dá)限于第二靶細(xì)胞，并防止在第一靶細(xì)胞中表達(dá)，如下所述該布置在后面的實(shí)施例6中描述，并圖示于圖18。在此，將啟動(dòng)子-增強(qiáng)子和含所述編碼序列5’端的NOI第一片段和天然或人工衍生或可衍生的剪接供體序列，插入所述反轉(zhuǎn)錄病毒基因組構(gòu)建物3’端R區(qū)的上游。將含有完成所述編碼區(qū)所需的所有序列的所述NOI的第二片段，置于所述反轉(zhuǎn)錄病毒基因組構(gòu)建物中包裝信號(hào)下游的天然或人工衍生或可衍生剪接受體序列的下游。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組在第二靶細(xì)胞中反轉(zhuǎn)錄并整合時(shí)，所述NOI的啟動(dòng)子’5片段和所述功能性剪接供體序列位于所述功能性剪接受體和所述NOI3’端上游。然后所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄和剪接，允許在第二靶細(xì)胞中翻譯所述NOI。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的雜種病毒載體系統(tǒng)包含編碼反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的單個(gè)或多個(gè)腺病毒第一載體。
描述的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案解決與腺病毒載體和其它病毒載體有關(guān)的主要問題之一，即這類載體的基因表達(dá)是瞬時(shí)的。由第一靶細(xì)胞產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒顆?？梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞，在第二靶細(xì)胞中的基因表達(dá)穩(wěn)定地保持，因?yàn)樗龇崔D(zhuǎn)錄病毒載體基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中。第二靶細(xì)胞不表達(dá)大量的病毒蛋白抗原，因此免疫原性低于用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
用反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為第二載體是有利的，因?yàn)樗缤ㄟ^允許導(dǎo)向快速分裂細(xì)胞，而允許一定程度的細(xì)胞辨別。此外，反轉(zhuǎn)錄病毒的整合允許在靶組織中穩(wěn)定表達(dá)治療基因，包括在增殖性靶細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。
應(yīng)用本發(fā)明的新型反轉(zhuǎn)錄病毒載體設(shè)計(jì)也是有利的，因?yàn)榛虮磉_(dá)可以限于第一靶位點(diǎn)或第二靶位點(diǎn)。因此，單個(gè)或多個(gè)NOI可以優(yōu)先于第二靶位點(diǎn)表達(dá)，而在第一靶位點(diǎn)幾乎不表達(dá)或不以生物學(xué)意義水平表達(dá)。因而可以避免NOI的可能毒性或抗原性。
優(yōu)選的是，第一病毒載體優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)某種或某些細(xì)胞類型。
第一載體更優(yōu)選為定向載體，也就是說它與天然病毒相比組織嗜性改變，使得所述載體導(dǎo)向特定的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“定向載體”不一定與術(shù)語(yǔ)“靶位點(diǎn)’或“靶細(xì)胞”有關(guān)。
“靶位點(diǎn)”是指天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的位點(diǎn)。
“第一靶位點(diǎn)”是指天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一位點(diǎn)。
“第二靶位點(diǎn)”是指天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二位點(diǎn)。
“靶細(xì)胞”就是指是天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
“第一靶細(xì)胞”是指天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一細(xì)胞。
“第二靶細(xì)胞”是指天然或定向載體能夠轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二細(xì)胞。
按照本發(fā)明的優(yōu)選的腺病毒第一載體也最好是定向載體，其中所述載體的組織嗜性因改變而不同于野生型腺病毒?？梢孕揎椣俨《据d體，產(chǎn)生例如以下文獻(xiàn)描述的定向腺病毒載體Krasnykh等1996 J.Virol706839-6846；Wickham等1996 J.Virol 706831-6838；Stevenson等1997 J.Virol 714782-4790；Wickham等1995 Gene Therapy 2750-756；Douglas等1997 Neuromuscul.Disord 7284-298；Wickham等1996Nature Biotechnology 141570-1573。
用于按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)的第一靶細(xì)胞包括造血細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞或這些細(xì)胞中的任何一種的祖細(xì)胞)；內(nèi)皮細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞；基質(zhì)細(xì)胞；星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
因此，能夠產(chǎn)生第二病毒載體的按照本發(fā)明的第一靶細(xì)胞可以是上述細(xì)胞類型中的任何一種。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的第一靶細(xì)胞是用一種缺陷型腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，所述缺陷型腺病毒載體含有反轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol的第一轉(zhuǎn)錄單位和能夠產(chǎn)生可包裝的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第二轉(zhuǎn)錄單位。在這種情況下，至少第二轉(zhuǎn)錄單位最好處于在機(jī)體內(nèi)患病位置中優(yōu)先有活性的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的控制之下，其中所述患病位置諸如局部缺血部位或?qū)嶓w瘤的微環(huán)境。
在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建第二轉(zhuǎn)錄單位，使得將所述基因組插入第二靶細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)含子，它用來(lái)降低病毒必需元件(諸如病毒env基因)的表達(dá)，并允許有效地表達(dá)一種或多種治療和/或診斷NOI。
所述包裝細(xì)胞可以是待治療個(gè)體機(jī)體內(nèi)的體內(nèi)包裝細(xì)胞，或它可以是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞，諸如組織培養(yǎng)細(xì)胞系。合適的細(xì)胞系包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如鼠類成纖維細(xì)胞衍生的細(xì)胞系或人細(xì)胞系。所述包裝細(xì)胞系最好是人細(xì)胞系，諸如HEK293、293-T、TE671、HT1080。
或者，所述包裝細(xì)胞可以是得自待治療個(gè)體的細(xì)胞，諸如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。所述細(xì)胞可以從個(gè)體分離，活體外給予所述包裝組分和載體組分，然后再給予自身包裝細(xì)胞?；蛘?，可以將所述包裝組分和載體組分給予體內(nèi)包裝細(xì)胞。將反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝組分和載體組分導(dǎo)入個(gè)體細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，一種方法是通過瞬時(shí)三重轉(zhuǎn)染(Landau和Littman 1992 J.Virol.66，5110；Soneoka等1995 Nucleic Acids Res 23628-633)，將產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒所需的不同的DNA序列(例如env編碼序列、gag-pol編碼序列和缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組)同時(shí)導(dǎo)入所述細(xì)胞。
第二病毒載體也可以是定向載體。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以通過修飾所述Env蛋白達(dá)到此目的。所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的Env蛋白需要是無(wú)毒的包膜或可以以無(wú)毒量在第一靶細(xì)胞中產(chǎn)生的包膜，諸如MMLV兼嗜性包膜或修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，所述安全特征最好是缺失反轉(zhuǎn)錄病毒組分之間同源的區(qū)域或序列。
所述包膜最好是允許轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞的包膜。合適的env基因的實(shí)例包括但不限于VSV-G、MLV兼嗜性env諸如4070A env、RD114貓白血病病毒env或流感病毒的血細(xì)胞凝集素(HA)。所述Env蛋白可以是能夠與有限數(shù)量人類細(xì)胞類型上的受體結(jié)合的Env蛋白，可以是含有導(dǎo)向部分的工程包膜。由在所選擇的包裝細(xì)胞系中有活性的啟動(dòng)子和任選增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄所述env和gag-pol編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄單位中止于一個(gè)多腺苷酸化信號(hào)。例如，如果所述包裝細(xì)胞是人類細(xì)胞，則合適的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒主要立即早期(hCMV-MIE)基因的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子，并可以使用SV40病毒的多腺苷酸化信號(hào)。其它合適的啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)是本領(lǐng)域已知的。
第二靶細(xì)胞群可以與第一靶細(xì)胞群相同。例如，將本發(fā)明的第一載體傳遞至腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致可復(fù)制和產(chǎn)生能轉(zhuǎn)導(dǎo)其它腫瘤細(xì)胞的其它載體顆粒。
或者，第二靶細(xì)胞群可以不同于第一靶細(xì)胞群。在這種情況下，第一靶細(xì)胞用作治療個(gè)體機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源工廠，產(chǎn)生可以轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞群的另外的載體顆粒。例如，第一靶細(xì)胞群可以是用第一載體體內(nèi)或活體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞。然后，將第一靶細(xì)胞傳遞至或遷移至機(jī)體內(nèi)諸如腫瘤的位點(diǎn)，并產(chǎn)生能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)例如實(shí)體瘤中具有有絲分裂活性的腫瘤細(xì)胞的第二載體顆粒。
按照本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒也將能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)緩慢分裂以及諸如MLV的非慢病毒不能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。緩慢分裂的細(xì)胞約每3-4天內(nèi)分裂一次，包括某些腫瘤細(xì)胞。盡管腫瘤含有快速分裂的細(xì)胞，但某些腫瘤細(xì)胞尤其是腫瘤中心的某些細(xì)胞很少分裂?；蛘撸霭屑?xì)胞可以是能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂的生長(zhǎng)停滯的細(xì)胞，諸如腫瘤塊中心部分的細(xì)胞或干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞或CD34陽(yáng)性細(xì)胞。作為再一替代細(xì)胞，所述靶細(xì)胞可以是分化細(xì)胞的前體，諸如單核細(xì)胞前體、CD33陽(yáng)性細(xì)胞或骨髓前體細(xì)胞。作為再一替代細(xì)胞，所述靶細(xì)胞可以是分化細(xì)胞，諸如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞或精子?？梢曰蛘咴趶娜祟悅€(gè)體分離后在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，或者在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。
本發(fā)明允許在隨后有效轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞所需的一種或多種治療蛋白的作用位點(diǎn)或其附近，體內(nèi)定位產(chǎn)生高滴度的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。這比或者采用缺陷型腺病毒載體或者采用單獨(dú)的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體更加有效。
本發(fā)明也允許體內(nèi)在非分裂細(xì)胞或緩慢分裂的細(xì)胞中產(chǎn)生諸如基于MMLV的載體的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。僅在諸如體外增殖的適用于組織培養(yǎng)的細(xì)胞的快速分裂的細(xì)胞中，或在體內(nèi)的快速分裂的腫瘤細(xì)胞中，產(chǎn)生基于MMLV的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，這在以前已經(jīng)是可能的。對(duì)于將基因傳遞至實(shí)體瘤的細(xì)胞(大多數(shù)實(shí)體瘤細(xì)胞分裂緩慢)而言，以及對(duì)于應(yīng)用非分裂細(xì)胞(諸如內(nèi)皮細(xì)胞)和各種造血譜系細(xì)胞作為產(chǎn)生治療蛋白產(chǎn)物的內(nèi)源工廠而言，擴(kuò)展能夠產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞類型的范圍是有利的。
按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)傳遞一種或多種治療基因的方法可以單獨(dú)采用或聯(lián)合其它療法或所述治療組分使用。
例如，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)傳遞可用于治療WO-A-98/05635中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)提供該表的部分內(nèi)容癌癥、炎癥或炎性疾病、皮膚病、發(fā)熱、心血管效應(yīng)、出血、血凝固和急性期反應(yīng)、惡病質(zhì)、厭食、急性感染、HIV感染、休克狀態(tài)、移植物抗宿主反應(yīng)、自身免疫病、再灌注損傷、腦膜炎、偏頭痛和阿斯匹林依賴性抗血栓形成；腫瘤生長(zhǎng)、侵入和擴(kuò)散、血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移、惡性腹水和惡性胸膜滲漏；腦局部缺血、局部缺血性心臟病、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、哮喘、多發(fā)性硬化、神經(jīng)變性、早老性癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、結(jié)節(jié)性脈管炎、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎、齒齦炎；牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、慢性潰瘍、大皰性表皮松解；角膜潰瘍、視網(wǎng)膜病和手術(shù)傷口愈合；鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、濕疹、過敏反應(yīng)；再狹窄、充血性心力衰竭、子宮內(nèi)膜異位、動(dòng)脈粥樣硬化或endosclerosis。
另外，或在替代方法中，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)傳遞可用于治療WO-A-98/07859中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)提供該表的部分內(nèi)容細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治療免疫缺陷，包括人免疫缺陷病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)；治療癌癥和多種自身免疫病，以及預(yù)防移植排斥或誘導(dǎo)腫瘤免疫)；調(diào)節(jié)造血，例如治療骨髓疾病或淋巴疾??；促進(jìn)骨、軟骨、腱、韌帶和神經(jīng)組織的生長(zhǎng)，例如用于使傷口愈合、治療燒傷、潰瘍和牙周病及神經(jīng)變性；抑制或激活促卵泡激素(調(diào)節(jié)生育力)；趨化性/化學(xué)激活活性(例如使特定的細(xì)胞類型移動(dòng)至損傷部位或感染部位)；止血和溶解血栓活性(例如用于治療血友病和中風(fēng))；抗炎活性(用于治療例如膿毒性休克或節(jié)段性回腸炎)；用作抗微生物藥；例如代謝或行為的調(diào)節(jié)劑；用作鎮(zhèn)痛藥；治療特定的缺陷疾病；用于治療例如牛皮癬，用于人類或獸醫(yī)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
另外，或在替代方法中，本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來(lái)傳遞可用于治療WO-A-98/09985中所列疾病的一種或多種NOI。為了易于參考，現(xiàn)提供該表部分內(nèi)容巨噬細(xì)胞抑制活性和/或T細(xì)胞抑制活性和由此的抗炎活性；抗免疫活性，即對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答的抑制效應(yīng)，包括與炎癥不相關(guān)的應(yīng)答；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞附著于細(xì)胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白的能力，以及向上調(diào)節(jié)T細(xì)胞的fas受體表達(dá)；抑制不需要的免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，與過敏性相關(guān)的炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膠原疾病和其它自身免疫病、與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、再灌注損傷、心搏停止、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫綜合征或其它心肺疾病、與消化性潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎和其它胃腸道疾病相關(guān)的炎癥、肝纖維變性、肝硬變或其它肝病、甲狀腺炎或其它腺病、腎小球性腎炎或其它腎病和泌尿?qū)W疾病、耳炎或其它耳鼻咽疾病、皮炎或其它皮膚病、牙周病或其它牙病、睪丸炎或附睪炎(epididimo-orchitis)、不育癥、睪丸創(chuàng)傷或其它與免疫相關(guān)的睪丸疾病、胎盤功能障礙、胎盤機(jī)能不全、習(xí)慣性流產(chǎn)、子癇、先兆子癇和其它與免疫和/或炎癥相關(guān)的婦科疾病、后色素層炎、中色素層炎、前色素層炎、結(jié)膜炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、眼色素層視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、視神經(jīng)炎、眼內(nèi)炎癥例如視網(wǎng)膜炎或囊性斑狀水腫(cystoid macular oedema)、交感性眼炎、鞏膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎、退行性fondus病的免疫和炎性部分、眼外傷的炎性部分、由感染引起的眼部炎癥、增生性玻璃體-視網(wǎng)膜病(vitreo-retinopathies)、急性局部缺血性視神經(jīng)病、例如在青光眼過濾手術(shù)后的過度瘢痕形成、針對(duì)眼植入物的免疫和/或炎性反應(yīng)以及其它與免疫和炎癥相關(guān)的眼病、與自身免疫病或病癥或障礙相關(guān)的炎癥，在此情況下對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官的免疫和/或炎癥抑制是有益的、Parkinson病、由治療Parkinson病引起的并發(fā)癥和/或副作用、與AIDS相關(guān)的癡呆綜合征、HIV相關(guān)的腦病、Devic病、Sydenham舞蹈病、早老性癡呆和CNS的其它退行性疾病、病癥或障礙、中風(fēng)的炎性部分、小兒麻痹后綜合征、精神障礙的免疫和炎性部分、脊髓炎、腦炎、亞急性硬化性全腦炎、腦脊髓炎、急性神經(jīng)病、亞急性神經(jīng)病、慢性神經(jīng)病、Guillaim-Barre綜合征、Sydenham舞蹈病、重癥肌無(wú)力、腦假腫瘤、Down綜合征、Huntington病、肌萎縮性側(cè)索硬化、CNS壓迫或CNS外傷或CNS感染的炎性部分、肌肉萎縮和營(yíng)養(yǎng)不良的炎性部分、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的與免疫和炎癥相關(guān)的疾病、病癥或障礙、外傷后炎癥、膿毒性休克、傳染病、手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或副作用、骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用、例如由于感染病毒載體引起的基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用、或與AIDS相關(guān)的炎癥、為了抑制或阻止體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答、為了通過減少單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量來(lái)治療或緩解單核細(xì)胞或白細(xì)胞增生性疾病例如白血病、在移植天然或人工細(xì)胞、組織或器官(諸如角膜、骨髓、器官、晶狀體、起搏器、天然或人造皮膚組織)的情況下用于預(yù)防和/或治療移植排斥。
按照本發(fā)明還提供控制一種或多種治療NOI產(chǎn)生的方法，使得所述治療NOI優(yōu)先在第二靶細(xì)胞群中表達(dá)，而在第一靶細(xì)胞中幾乎不表達(dá)或不以生物學(xué)意義水平表達(dá)。
本發(fā)明還提供用于通過基因療法治療個(gè)體的藥用組合物，其中所述組合物包含治療有效量的本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體包含一種或多種可傳遞的治療和/或診斷NOI或由所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生或可得自所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體的病毒顆粒。所述藥用組合物可以用于人類或動(dòng)物。通常，醫(yī)師會(huì)確定最適于治療個(gè)體的實(shí)際劑量，所述劑量將隨具體個(gè)體的年齡、體重和治療反應(yīng)而變化。
所述組合物可以任選地包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔助劑。藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據(jù)預(yù)定的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥物實(shí)踐來(lái)進(jìn)行。所述藥用組合物可以包含作為載體、賦形劑或稀釋劑的或除此之外的任何合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑和可以輔助或促進(jìn)病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的其它載體劑(諸如脂質(zhì)傳遞系統(tǒng))。
在適當(dāng)?shù)那闆r下，所述藥用組合物可以通過以下任何一種或多種方式給予吸入；栓劑或陰道栓劑形式；通常為洗劑、溶液劑、乳膏、軟膏或撒布粉劑(dusting powder)形式；通過使用皮膚貼劑；口服，為含賦形劑(諸如淀粉或乳糖)的片劑形式、或單獨(dú)的或與賦形劑混合的膠囊或原卵(ovule)形式、或含調(diào)味劑或著色劑的酏劑、溶液劑或懸浮劑形式；或它們可以胃腸外注射，例如經(jīng)陰莖海綿體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。對(duì)于胃腸外給藥，所述組合物最好以無(wú)菌水溶液形式使用，所述水溶液可以含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖，使得溶液與血液等滲。對(duì)于頰或舌下給藥，所述組合物可以用常規(guī)方法配制的片劑或錠劑形式給予。
在本發(fā)明的再一方面，提供一般意義(即不必限于以上限定的本發(fā)明的上述第一方面)的用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，第一載體能感染第一靶細(xì)胞并在其中表達(dá)第二病毒載體，第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞。
關(guān)于該具體實(shí)施方案，本發(fā)明的基因載體則為用于基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，它能夠從靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生缺陷型感染性顆粒。因此，本發(fā)明的基因載體包括一種體外制備的第一載體，第一載體編碼體內(nèi)產(chǎn)生第二載體所必需的基因。使用時(shí)，第二載體攜帶一種或多種用于插入第二靶細(xì)胞的選定基因。所述選定基因可以是一種或多種標(biāo)記基因和/或治療基因。標(biāo)記基因編碼可選擇和/或可檢測(cè)蛋白。
以下是涉及本發(fā)明該特定方面的更多方面，所述內(nèi)容也可應(yīng)用于本發(fā)明的上述方面。
另一方面，本發(fā)明提供用一種或多種第一病毒載體感染并能夠產(chǎn)生感染性的第二病毒載體顆粒的靶細(xì)胞。
再一方面，本發(fā)明提供治療人類和非人類哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給予本文所述的雜種病毒載體系統(tǒng)或用一種或多種第一病毒載體感染的靶細(xì)胞。
一種或多種第一病毒載體可以是各種不同的病毒載體，諸如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒載體，或在多個(gè)第一病毒載體的情況下，它們可以是不同病毒來(lái)源的載體的混合物。無(wú)論在何種情況下，第一病毒載體均最好是缺陷型的，因?yàn)槿毕菪洼d體不能獨(dú)立地復(fù)制。因此，它們能夠進(jìn)入靶細(xì)胞并傳遞第二載體序列，但并不能復(fù)制以繼續(xù)感染其它靶細(xì)胞。
在所述雜種病毒載體系統(tǒng)包含一種以上編碼第二載體的第一載體的情況下，兩種或所有三種第一載體將用來(lái)感染第一靶細(xì)胞群，通常是同時(shí)感染。最好為編碼第二病毒載體所有組分的單一的第一病毒載體。
優(yōu)選的單一或多種第一病毒載體是腺病毒載體。在可以從體外培養(yǎng)物獲得的滴度方面，腺病毒載體明顯優(yōu)于其它病毒載體。與包膜病毒相比，所述腺病毒顆粒也比較穩(wěn)定，因此更容易純化和貯存。然而，目前的腺病毒載體用于體內(nèi)治療應(yīng)用的主要限制，是由于缺陷型腺病毒載體的基因表達(dá)僅為瞬時(shí)表達(dá)。因?yàn)樗鲚d體基因組不復(fù)制，所述靶細(xì)胞的增殖導(dǎo)致稀釋所述載體。此外，針對(duì)腺病毒蛋白產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，破壞甚至低水平表達(dá)所述腺病毒蛋白的細(xì)胞。
第二病毒載體最好是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過在第一靶細(xì)胞中表達(dá)缺陷型病毒載體顆粒裝配和包裝的必需基因，產(chǎn)生第二載體。因?yàn)樵撦d體不能獨(dú)立復(fù)制，因而為缺陷型的。因此，一旦第二反轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了第二靶細(xì)胞，則它不能通過復(fù)制而傳播至任何其它靶細(xì)胞。可以由第一載體中DNA編碼的反轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生所必需的基因的表達(dá)，產(chǎn)生第二載體。這類基因可以包括反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因、包膜病毒的包膜基因和含一種或多種治療基因的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組一般含有使得能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的序列、5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分和包裝信號(hào)。
重要的是，第二載體對(duì)于體內(nèi)使用也是安全的，因?yàn)樗尤肓讼亟M產(chǎn)生能獨(dú)立復(fù)制的感染性病毒的可能性的一種或多種安全特征。
為了確保第二載體為復(fù)制缺陷型的，可以用多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼第二載體，所述轉(zhuǎn)錄單位可以位于單一的或位于兩種或兩種以上腺病毒或其它第一載體中。因此，可以有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼第二載體基因組、一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼gag-pol，而一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼env?；蛘撸梢越M合兩種或多種這些轉(zhuǎn)錄單位。例如，編碼gag-pol和env、或env和所述基因組的核酸序列可以組合在一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄單位中。實(shí)現(xiàn)這一目的的方法是本領(lǐng)域已知的。
本文所述的轉(zhuǎn)錄單位為含編碼序列和完成那些編碼序列表達(dá)的信號(hào)的核酸區(qū)，其獨(dú)立于任何其它編碼序列。因此，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位一般包含至少一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)增強(qiáng)子和一個(gè)多腺苷酸化信號(hào)。編碼第二載體的轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子最好在產(chǎn)生第二病毒載體的條件下，在第一靶細(xì)胞中是高活性的，或能夠被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。所述啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以是組成型有效的，或其活性可以受組織限制或受時(shí)間限制。合適的組織限制啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例是在腫瘤細(xì)胞中有高活性的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，諸如MUCl基因、CEA基因或5T4抗原基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。時(shí)間限制的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的實(shí)例是對(duì)局部缺血和/或低氧應(yīng)答的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，諸如低氧效應(yīng)元件或grp78或grp94基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。一個(gè)優(yōu)選的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒(hCMV)主要立即早期(MIE)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。
在某些條件下，低氧或局部缺血可調(diào)節(jié)的第二載體組分的表達(dá)可能特別有用。低氧是各種不同細(xì)胞類型中基因表達(dá)的有效調(diào)節(jié)物，并通過誘導(dǎo)諸如低氧誘導(dǎo)型因子-1(HIF-1；Wang和Semenza(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90430)的低氧誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子的活性而起作用，低氧誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于同類的DNA識(shí)別位點(diǎn)，即各種基因啟動(dòng)子上的低氧效應(yīng)元件(HRE)。Dach等(1997 Nature Med.5515)已經(jīng)使用了多體形式的小鼠磷酸甘油激酶-1(PGK-1)基因的HRE(Firth等(1994).Proc.Natl Acad.Sci USA 916496-6500)，來(lái)在體外控制對(duì)低氧應(yīng)答的人纖維肉瘤細(xì)胞的標(biāo)記基因和治療基因的表達(dá)，以及在體內(nèi)控制在實(shí)體瘤中的標(biāo)記基因和治療基因的表達(dá)(Dachs等，出處同上)。或者，顯著的葡萄糖缺乏也存在于腫瘤的局部缺血區(qū)的事實(shí)，能被用來(lái)在腫瘤中特異性地激活異源基因的表達(dá)。還證實(shí)已知被葡萄糖缺乏特異性激活的grp78基因啟動(dòng)子的截短的632個(gè)堿基對(duì)序列，能夠在體內(nèi)在鼠類腫瘤中驅(qū)動(dòng)高水平表達(dá)報(bào)道基因(Gazit等(1995)Cancer Res.551660)。
以下描述可以加入到所述雜種病毒載體系統(tǒng)的安全特征。可以存在一種或多種這類特征。
首先，通過缺失同源區(qū)，可以避免編碼第二載體組分的序列之間的序列同源性。同源區(qū)允許發(fā)生基因重組。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用三種轉(zhuǎn)錄單位構(gòu)建第二反轉(zhuǎn)錄病毒載體。第一轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因。第二轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的env基因。第三轉(zhuǎn)錄單位包含在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。在天然的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組中，包裝信號(hào)的位置使得正確起作用需要部分gag序列。因此，通常當(dāng)構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)時(shí)，包括部分gag基因在內(nèi)的包裝信號(hào)仍在所述載體基因組中。然而，在本發(fā)明的情況下，所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有基本包裝信號(hào)，它不含與第一轉(zhuǎn)錄單位中的gag序列同源的序列。此外，在反轉(zhuǎn)錄病毒中，例如在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，在pol編碼序列3’端和env 5’端之間有重疊小區(qū)。通過改變或者pol編碼序列3’端的序列或者env 5’端的序列，以改變密碼子使用，而不改變所編碼蛋白的氨基酸序列，可以去除第一轉(zhuǎn)錄單位和第二轉(zhuǎn)錄單位之間的相應(yīng)的同源性區(qū)域。
其次，通過用另一反轉(zhuǎn)錄病毒或另一包膜病毒的包膜蛋白將一種反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組假型化，使得避免env組分和gag-pol組分之間的同源區(qū)，可以避免第二病毒載體有復(fù)制能力的可能性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，由以下三種組分構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體。第一轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的反轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol基因。第二轉(zhuǎn)錄單位含有在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的替代包膜病毒的env基因。第三轉(zhuǎn)錄單位包含在非反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制下的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組。所述缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有基本包裝信號(hào)，它不含有與第一轉(zhuǎn)錄單位中的gag序列同源的序列。
假型化可能涉及例如基于慢病毒(諸如HIV或馬傳染性貧血病毒(EIAV))的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組，所述包膜蛋白可以例如是命名為4070A的兼嗜性包膜蛋白?；蛘?，所述反轉(zhuǎn)錄病毒基因組可以基于MMLV，所述包膜蛋白可以是在第一靶細(xì)胞中以無(wú)毒量產(chǎn)生的另一病毒的蛋白，諸如流感血細(xì)胞凝集素或水泡性口腔炎病毒G蛋白。在另一替代方法中，所述包膜蛋白可以是修飾的包膜蛋白，諸如突變的或工程改造的包膜蛋白?？梢灾苽湫揎椈蜻x擇修飾，以導(dǎo)入尋靶能力或降低毒性或用于另一目的。
第三，通過采用以特定方式構(gòu)建的兩種轉(zhuǎn)錄單位，可以消除產(chǎn)生有復(fù)制能力的反轉(zhuǎn)錄病毒的可能性。第一轉(zhuǎn)錄單位含有在第一靶細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子(諸如hCMV啟動(dòng)子-增強(qiáng)子或組織限制性啟動(dòng)子-增強(qiáng)子)控制下的gag-pol編碼區(qū)。第二轉(zhuǎn)錄單位編碼能夠包裝入反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA。第二轉(zhuǎn)錄單位含有包裝、整合和反轉(zhuǎn)錄所必需的反轉(zhuǎn)錄病毒序列，也含有包膜病毒的env蛋白編碼序列和一種或多種治療基因的編碼序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的雜種病毒載體系統(tǒng)包含單一或多種編碼反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的腺病毒第一載體。用于本發(fā)明的腺病毒載體可以衍生自人腺病毒或通常不感染人類的腺病毒。所述載體最好衍生自2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)、或小鼠腺病毒或鳥類腺病毒，諸如CELO病毒(Cotton等1993 J.Virol 673777-3785)。所述載體可以是具有復(fù)制能力的腺病毒載體，但更優(yōu)選缺陷型腺病毒載體?？梢酝ㄟ^缺失病毒復(fù)制必需的一種或多種組分，使腺病毒載體為缺陷型。通常，每個(gè)腺病毒載體含有至少一個(gè)E1區(qū)的缺失。為了產(chǎn)生感染性腺病毒載體顆粒，通過使病毒在諸如人293細(xì)胞系的人胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞系中傳代，可以互補(bǔ)這一缺失，其中人胚胎成纖維細(xì)胞系含有整合拷貝的Ad5的左邊部分，包括E1基因。異源DNA插入到這類載體的容量可以至多為約7kb。因此，這類載體可以用來(lái)構(gòu)建按照本發(fā)明的包含三種獨(dú)立重組載體的系統(tǒng)，每種載體含有其中一個(gè)必需的轉(zhuǎn)錄單位以構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體。
替代的腺病毒載體是本領(lǐng)域已知的，它們?cè)谄渌俨《净蛑泻羞M(jìn)一步的缺失，這些載體也適用于本發(fā)明。其中數(shù)種第二代腺病毒載體的免疫原性降低(例如E1+E2缺失Gorziglia等1996 J.Virol.704173-4178；E1+E4缺失Yeh等1996 J.Virol.70559-565)。延長(zhǎng)缺失用來(lái)提供額外的克隆容量以將多個(gè)基因?qū)胨鲚d體。例如已經(jīng)描述了25kb的缺失(Lieber等1996 J.Virol.708944-8960)，也報(bào)道了缺失所有病毒基因的克隆載體(Fisher等1996 Virology 21711-22)，所述載體允許導(dǎo)入35kb以上的異源DNA。這類載體可以用來(lái)產(chǎn)生按照本發(fā)明的腺病毒第一載體，第一載體編碼用于構(gòu)建所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的兩種或三種轉(zhuǎn)錄單位。
所述本發(fā)明的實(shí)施方案解決了與腺病毒載體和其它病毒載體有關(guān)的一個(gè)主要問題，即這類載體的基因表達(dá)是瞬時(shí)的。由第一靶細(xì)胞產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可以感染第二靶細(xì)胞，在第二靶細(xì)胞中的基因表達(dá)穩(wěn)定地保持，因?yàn)樗龇崔D(zhuǎn)錄病毒載體基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中。第二靶細(xì)胞不表達(dá)大量的病毒蛋白抗原，因此其免疫原性低于用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
用反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為第二載體也是有利的，因?yàn)樗缤ㄟ^允許導(dǎo)向快速分裂細(xì)胞，而允許一定程度的細(xì)胞辨別。此外，反轉(zhuǎn)錄病毒的整合允許在靶組織中穩(wěn)定地表達(dá)治療基因，包括在增殖性靶細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。
第一病毒載體最好優(yōu)先感染某種或某些細(xì)胞類型。第一載體更優(yōu)選為定向載體，也就是說它與天然病毒相比組織嗜性改變，使得所述載體導(dǎo)向特定的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“定向載體”不一定與術(shù)語(yǔ)“靶細(xì)胞”有關(guān)。
因此，能夠產(chǎn)生第二病毒載體的按照本發(fā)明的第一靶細(xì)胞可以是上述細(xì)胞類型中的任何一種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的第一靶細(xì)胞是用一種缺陷型腺病毒載體感染的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，所述缺陷型腺病毒載體含有用于反轉(zhuǎn)錄病毒gag-pol的第一轉(zhuǎn)錄單位和能夠產(chǎn)生可包裝缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的第二轉(zhuǎn)錄單位。在這種情況下，至少第二轉(zhuǎn)錄單位最好處于在機(jī)體內(nèi)患病位置中優(yōu)先有活性的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的控制之下，其中所述患病位置諸如局部缺血位點(diǎn)或?qū)嶓w瘤的微環(huán)境。在本發(fā)明該方面的一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建第二轉(zhuǎn)錄單位，使得將所述基因組插入第二靶細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)內(nèi)含子，以用來(lái)減少病毒env基因的表達(dá)，并允許有效地表達(dá)治療基因。
第二病毒載體也可以是定向載體。對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以通過修飾所述包膜蛋白達(dá)到此目的。所述反轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的包膜蛋白需要是無(wú)毒的包膜或可以以無(wú)毒量在第一靶細(xì)胞中產(chǎn)生的包膜，諸如MMLV兼嗜性包膜或修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，所述安全特征最好是缺失反轉(zhuǎn)錄病毒組分之間同源的區(qū)域或序列。
第二靶細(xì)胞群可以與第一靶細(xì)胞群相同。例如，將本發(fā)明的第一載體傳遞至腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致復(fù)制和產(chǎn)生可以轉(zhuǎn)導(dǎo)其它腫瘤細(xì)胞的其它載體顆粒。或者，第二靶細(xì)胞群可以不同于第一靶細(xì)胞群。在這種情況下，第一靶細(xì)胞用作治療個(gè)體機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源工廠，產(chǎn)生可以感染第二靶細(xì)胞群的另外的載體顆粒。例如，第一靶細(xì)胞群可以是用第一載體體內(nèi)或活體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血細(xì)胞。然后，將第一靶細(xì)胞傳遞至或遷移至機(jī)體內(nèi)諸如腫瘤的位點(diǎn)，并產(chǎn)生能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)例如實(shí)體瘤中腫瘤細(xì)胞的第二載體顆粒。
本發(fā)明允許在隨后有效轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞所需的一種或多種治療蛋白的作用位點(diǎn)或其附近，體內(nèi)定位產(chǎn)生高滴度的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。這比或者采用缺陷型腺病毒載體或者采用單獨(dú)的缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體更加有效。
本發(fā)明還允許體內(nèi)在非分裂細(xì)胞或緩慢分裂的細(xì)胞中產(chǎn)生諸如基于MMLV的載體的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。以前已經(jīng)可以僅在諸如體外增殖的適應(yīng)于組織培養(yǎng)的細(xì)胞的快速分裂的細(xì)胞中，或在體內(nèi)的快速分裂的腫瘤細(xì)胞中，產(chǎn)生基于MMLV的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。對(duì)于將基因傳遞至實(shí)體瘤的細(xì)胞(許多實(shí)體瘤細(xì)胞分裂緩慢)而言，以及對(duì)于應(yīng)用非分裂細(xì)胞(諸如內(nèi)皮細(xì)胞)和各種造血譜系的細(xì)胞作為產(chǎn)生治療蛋白產(chǎn)物的內(nèi)源工廠而言，擴(kuò)展能夠產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞類型的范圍是有利的。
用按照本發(fā)明的載體系統(tǒng)傳遞一種或多種治療基因的方法可以單獨(dú)采用或聯(lián)合使用其它療法或所述治療部分?？梢灾委煹募膊“ǖ幌抻诎┌Y、神經(jīng)病、遺傳病、心臟病、中風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、病毒感染和免疫系統(tǒng)疾病。合適的治療基因包括編碼以下物質(zhì)的基因腫瘤抑制蛋白、酶、前體藥物活化酶、免疫調(diào)節(jié)分子、抗體、工程改造的免疫球蛋白樣分子、融合蛋白、激素、膜蛋白、血管活性蛋白或肽、細(xì)胞因子、趨化因子、抗病毒蛋白、反義RNA和核酶。
在按照本發(fā)明的治療方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用本發(fā)明的載體系統(tǒng)將編碼前體藥物活化酶的基因傳遞至腫瘤，然后用合適的前體藥物治療所述個(gè)體。前體藥物的實(shí)例包括磷酸鬼臼亞乙苷(與堿性磷酸酶一起使用，Senter等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶一起使用，Mullen等1994 Cancer Res.541503-1506)；阿霉素-N-對(duì)羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V酰胺酶一起使用，Kerr等1990 Cancer Immunol.Immunother.31202-206)；對(duì)-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(與羧肽酶G2一起使用)；氨基甲酸頭孢菌素氮芥(與b-內(nèi)酰胺酶一起使用)；SR4233(與P450還原酶一起使用)；丙氧鳥苷(與HSV胸苷激酶一起使用，Borrelli等1988 Proc.Natl.Acad.Sci.857572-7576)；與硝基還原酶一起使用的芥子前體藥物(Friedlos等1997 J Med Chem 401270-1275)和環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺(與細(xì)胞色素P450一起使用，Chen等1996 Cancer Res 561331-1340)。
按照本發(fā)明還提供一些方法，用于控制治療基因的產(chǎn)生，使得所述治療基因優(yōu)先在第二靶細(xì)胞群中表達(dá)，而在第一靶細(xì)胞中幾乎不表達(dá)或不以生物學(xué)意義水平表達(dá)。
按照本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)水平內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。這類技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面描述。參見例如Sambrook等(1989)Molecular Cloninga laboratory manual；Hames和Glover(1985-1997)DNA Cloninga practical approach，第I-IV卷(第二版)；在McCafferty等(1996)“Antibody EngineeringA Practical Approach”中介紹了工程改造免疫球蛋白基因的方法。
總之，本發(fā)明涉及適用于將一種或多種NOI導(dǎo)入靶細(xì)胞的新型傳遞系統(tǒng)。
在一個(gè)廣義方面，本發(fā)明涉及包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS的上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；能夠產(chǎn)生非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中第一NS位于第二NS下游而其中第三NS和第四NS位于第二NS的上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體的剪接因所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在其所需靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。
在再一廣義方面，本發(fā)明提供用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并能在其中表達(dá)第二病毒載體，第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞。
最好是，第一載體可得自或基于腺病毒載體和/或第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體，最好是慢病毒載體。
現(xiàn)在參考以下附圖，通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明圖1顯示反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒基因組的結(jié)構(gòu)；圖2顯示小T剪接供體pLTR的加入；圖3顯示pL-SA-N的圖解說明；圖4顯示缺失一個(gè)剪接供體的pL-SA-N的圖解說明；圖5顯示MLVpICUT的序列；圖6顯示于EIAVLTR質(zhì)粒的CMV/R連接處插入一個(gè)剪接供體；圖7顯示將一個(gè)剪接受體插入pEGASUS-1；圖8顯示從EIAV載體去除一個(gè)野生型剪接供體；圖9顯示pCMVLTR+SD與pEGASUS+SA(noSD)組合，產(chǎn)生pEICUT-1；圖10顯示pEICUT-LacZ的構(gòu)建；圖11顯示pEICUT-LacZ序列；圖12顯示在轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中所述載體的結(jié)構(gòu)；圖13顯示基因表達(dá)限于或者包裝細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞；圖14顯示MLVpICUT Neo-p450載體的構(gòu)建，所述載體將潮霉素的表達(dá)限于產(chǎn)生細(xì)胞，而將2B6(一種p450同種型)的表達(dá)限于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞；圖15顯示突變的env(m4070A)與pol基因3’端的野生型MMLV序列的序列比較；圖16顯示修飾的env基因m4070A的完整序列；圖17顯示限制性基因表達(dá)構(gòu)建物；4070A包膜限于第一細(xì)胞；p450限于第二細(xì)胞；圖18顯示使用內(nèi)含子將NOI(在本實(shí)施例中為p450)的表達(dá)限于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞；圖19顯示轉(zhuǎn)移載體pE1sp1A的圖解說明；圖20顯示pE1sp1A構(gòu)建物的圖解說明；圖21顯示pE1RevE構(gòu)建物的圖解說明；
圖22顯示pE1HORSE3.1-gagpol構(gòu)建物的圖解說明；圖23顯示pE1PEGASUS4-基因組構(gòu)建物的圖解說明；圖24顯示pCI-Neo構(gòu)建物的圖解說明；圖25顯示pCI-Rab構(gòu)建物的圖解說明；圖26顯示pE1Rab構(gòu)建物的圖解說明；圖27a圖解說明反轉(zhuǎn)錄病毒載體中的天然剪接結(jié)構(gòu)；圖27b圖解說明已知的反轉(zhuǎn)錄病毒載體中的剪接結(jié)構(gòu)；圖27c圖解說明按照本發(fā)明的剪接結(jié)構(gòu)；圖28圖解說明按照本發(fā)明的雙雜種病毒載體系統(tǒng)；圖29為RNA和DNA形式的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的示意圖；圖30為腺病毒的示意圖，顯示早期和晚期基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)方向和位置；圖31為剪接機(jī)制的示意圖；圖32顯示pTRONIN構(gòu)建物的圖解說明；圖33顯示pTRONIN序列；圖34圖解說明用來(lái)擴(kuò)增小T剪接供體上游至剪接受體下游的區(qū)段的PCR反應(yīng)；圖35圖解說明pTRONIN-1構(gòu)建物；以及圖36顯示pTRONIN-1序列。
以下是略為更詳細(xì)的介紹圖1顯示反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒基因組的結(jié)構(gòu)。在該方面，諸如鼠類致癌反轉(zhuǎn)錄病毒的最簡(jiǎn)單的反轉(zhuǎn)錄病毒具有三個(gè)可讀框gag、pol和env。在gag翻譯期間的移碼導(dǎo)致pol翻譯。通過所示的剪接供體(SD)和剪接受體(SA)之間的剪接，完成Env的表達(dá)和翻譯。包裝信號(hào)以psi表示，且僅包含于全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物中-而不包含于表達(dá)env的亞基因組轉(zhuǎn)錄物中，其中該信號(hào)在所述剪接過程期間被去除。
圖2圖示將小T剪接供體加入pLTR。在此，將所述小t剪接供體序列插入LTR載體的轉(zhuǎn)錄起始下游，但位于R序列上游，使得反轉(zhuǎn)錄時(shí)(在最終的構(gòu)建物中)，所述U3-剪接供體-R盒“遺傳”至所述原病毒載體的5’端，并且所表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物在其5’末端附近含有一個(gè)剪接供體序列。
圖3顯示pL-SA-N的示意圖。共有剪接受體(T/C)nNC/TAG-G(Mount 1982 Nucleic Acids Res 10459-472)和分支點(diǎn)用下劃線和粗體顯示。箭頭顯示內(nèi)含子/外顯子接點(diǎn)。在此，將所述共有剪接受體序列插入到pLXSN的Stu1/BamH1位點(diǎn)。因此通過這種定位，該受體將與任何上游的剪接供體(在最終的RNA轉(zhuǎn)錄物中)相互作用。
圖4顯示構(gòu)建缺失一個(gè)剪接供體的pL-SA-N的示意圖。通過用以下顯示的兩種寡核苷酸對(duì)pL-SA-N載體進(jìn)行PCR反應(yīng)，將gT變?yōu)間C。然后，將所得的產(chǎn)物以Spel-Ascl片段克隆入pL-SA-N中，因而用gC取代野生型剪接供體gT。Spe1和Asc1位點(diǎn)均以粗體顯示，Spe1寡核苷酸中的突變以大寫粗體顯示。
圖5顯示MLVpICUT的序列。
圖6顯示于EIAVLTR質(zhì)粒的CMV/R接點(diǎn)處插入一個(gè)剪接供體的示意圖。用以下概述的兩種寡核苷酸進(jìn)行PCR，將所得的PCR產(chǎn)物以Sac1-BamH1片段克隆入CMVLTR中，并去除相當(dāng)?shù)钠巍Ｔ赟ac1寡核苷酸中，所示箭頭指示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，新的插入片段以大寫顯示，并且剪接供體序列以下劃線顯示。R的起始位點(diǎn)以斜體顯示。
圖7顯示將一個(gè)剪接受體插入pEGASUS-1的示意圖。在此，將下述的雙鏈寡核苷酸插入Xho1-Bpul102消化的pEGASUS-1中，產(chǎn)生質(zhì)粒pEGASUS+SA。共有剪接受體(T/C)nNC/TAG-G(Mount 1982，出處同上)和分支點(diǎn)均以下劃線和粗體顯示。箭頭指示內(nèi)含子/外顯子接點(diǎn)。
圖8顯示從EIAV載體去除野生型剪接供體的示意圖。用下述的寡核苷酸和模板pEGASUS+SA，通過重疊PCR，去除剪接供體序列。用寡聚物1+2和寡聚物3+4進(jìn)行第一輪單獨(dú)的PCR反應(yīng)。然后洗脫出所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其混合用于第三輪PCR反應(yīng)。該第三輪反應(yīng)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)后，加入寡聚物2和寡聚物4。然后將所得的產(chǎn)物以Sac1-Sal1片段克隆入pEGASUS+SA中，產(chǎn)生質(zhì)粒pEGASUS+SA(noSD)。顯示了所述剪接供體(SD)的位置。在寡聚物1和互補(bǔ)的寡聚物3中，將野生型剪接供體從GT變?yōu)镚C的點(diǎn)突變均以粗體顯示。
圖9顯示pCMVLTR+SD與pEGASUS+SA(noSD)組合產(chǎn)生pEICUT-1的示意圖。在此，我們將pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1片段插入pCMV-LTR唯一的Mlu1位點(diǎn)。
圖10顯示構(gòu)建pEICUT-LacZ的示意圖。這通過如下概述的將pEGASUS-1的Xhol-Bpu1102 LacZ片段插入pEICUT-1的Xhol-Bpu1102位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。
圖11顯示pEICUT-LacZ序列。
圖12顯示在轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中所述載體結(jié)構(gòu)的示意圖。在此，起始pICUT載體在剪接受體(在該實(shí)例中，所述共有剪接受體衍生自IgSA)上游不含剪接供體，因此所得的RNA轉(zhuǎn)錄物將不被剪接。因此，所有轉(zhuǎn)錄物將為含包裝信號(hào)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物(A)。然而轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，所述剪接供體(在該實(shí)例中為小T剪接的供體)“遺傳”至所述原病毒載體的5’端，使得現(xiàn)在產(chǎn)生的所有RNA轉(zhuǎn)錄物于剪接受體(即內(nèi)含子)上游均含有剪接供體，并因此達(dá)到最大程度剪接(B)。
圖13顯示基因表達(dá)限于或者包裝細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的示意圖。通過將新霉素ORF上游的潮霉素ORF置于MLV pEICUT中，完成在該實(shí)例中基因表達(dá)的限制(a)。用該克隆策略，所得的載體現(xiàn)在表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物，僅在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)潮霉素，因?yàn)楹颂求w5’帽依賴性翻譯只有效閱讀上游ORF。然而，轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，潮霉素現(xiàn)在包含于功能性內(nèi)含子內(nèi)，并因此從成熟的轉(zhuǎn)錄物中缺失(b)，因此新霉素ORF現(xiàn)在以5’帽依賴性方式翻譯。
圖14顯示MLVpICUT Neo-p450載體構(gòu)建的示意圖，所述載體將潮霉素的表達(dá)限于產(chǎn)生細(xì)胞，而將2B6(一種p450同種型)的表達(dá)限于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。用于該構(gòu)建的起始載體為圖13的p1CUT載體，它含有hygo和neo兩者。neo基因用完整的p450 2B6 cDNA如下取代通過用以下引物對(duì)人肝RNA(Clontech)進(jìn)行RT-PCR，獲得完整的2B6 cDNA5’ttcgatgatcaccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcac3’5’ttcgagccggctcatcagcggggcaggaagcggatctggtatgttg3’這產(chǎn)生完整的2B6cDNA，它具有鄰接僅有的BclI和NgoM1位點(diǎn)的最適化kosak序列。然后將該cDNA克隆入pICUT-Hyg-Neo的Bcl1-NgoM1位點(diǎn)，因此用p450取代Neo(參見以下(A))。以下也顯示了在轉(zhuǎn)染(B)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)(C)的細(xì)胞中的所述原病毒DNA構(gòu)建物。
圖15是突變的env(m4070A)與pol基因3’端的野生型MMLV序列的序列比較。
圖16是改變的4070A的完整序列。
圖17顯示基因限制性表達(dá)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，采用該載體，在所述起始載體中表達(dá)第一NOI(4070A包膜ORF)，而僅在載體復(fù)制后表達(dá)第二NOI(在該實(shí)例中為p450)。在復(fù)制后，4070A基因位于功能性內(nèi)含子內(nèi)，因此在RNA剪接期間被去除。
圖18顯示一種反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，使用該載體，在復(fù)制后p450基因的5’端(補(bǔ)平至(flush to)剪接供體)僅見于p450基因的3’端(補(bǔ)平至SA)上游，因而僅在復(fù)制后為表達(dá)的功能性p450基因(剪接的mRNA)。
實(shí)施例實(shí)施例1斷裂-內(nèi)含子MLV載體的構(gòu)建。(i)小T剪接供體的加入用于該構(gòu)建物的起始質(zhì)粒為pLXSN(Miller等1989，出處同上)；首先，用Nhe1消化該構(gòu)建物，將主鏈再連接，產(chǎn)生一個(gè)LTR(U3-R-U5)質(zhì)粒。然后，將含有所述剪接供體序列的寡核苷酸插入該質(zhì)粒的Kpn1-Bbe1位點(diǎn)之間。MLVR序列直至Kpn1也包含于該寡核苷酸內(nèi)，位于所述剪接供體下游。所得的質(zhì)粒命名為3’LTR-SD(參見圖2)。(ii)剪接受體的加入用于該構(gòu)建物的剪接受體序列(包括分支點(diǎn)-參與內(nèi)含子套索形成(Aebi等1987 Trends in Genetics 3102-107)的剪接受體上游20堿基和40堿基之間的一個(gè)A殘基)衍生自免疫球蛋白重鏈可變區(qū)mRNA(Bothwell等1981 Cell 24625-637)，但具有共有/最適化受體位點(diǎn)。這種序列信號(hào)也存在于pCI(Promega)中。首先將該受體序列作為雙鏈寡核苷酸插入pLXSN的BamH1-Stu1位點(diǎn)，產(chǎn)生載體pL-SA-N(注意在克隆期間SV40啟動(dòng)子從pLXSN中喪失)。關(guān)于克隆策略的概述請(qǐng)參見圖3。(iii)從pL-SA-N中去除原始剪接供體。
通過基于PCR的定點(diǎn)誘變，去除pL-SA-N的gag序列中包含的剪接供體。使用兩種寡核苷酸，以PCR擴(kuò)增跨越pL-SA-N的Asc1和Spe1特有位點(diǎn)的區(qū)域。在所述跨越Spe1的寡核苷酸中，也加入agGTaag至agGCaag的改變，該改變也見于剪接陰性pBABE載體(Morgenstem等1990，出處同上)。關(guān)于克隆策略的概述請(qǐng)參見圖4。(iv)將pL(noSD)-SA-N與3’LTR-SD組合。
pL(noSD)SA-N質(zhì)粒含有一個(gè)正常MLV衍生的3’LTR。通過從pL(noSD)SA-N取出Nhe1插入片段，并將其加入Nhe1消化的3’LTR-SD載體中，用3’LTR-SD序列取代所述3’LTR。名為pICUT(IntronCreated Upon Transduction)的所得質(zhì)粒含有這種新一代反轉(zhuǎn)錄病毒載體的所有特征(關(guān)于序列信息請(qǐng)參見圖5)。實(shí)施例2斷裂-內(nèi)含子慢病毒載體的構(gòu)建。起始EIAV慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(也參見專利申請(qǐng)WO 99/32646)。
為了構(gòu)建斷裂功能的慢病毒載體，起始點(diǎn)為名為pEGASUS-1的載體(參見WO 99/32646)。該載體衍生自感染性原病毒EIAV克隆pSPEIAV19(登記號(hào)U01866；Payne等1994)。其構(gòu)建概述如下首先，將通過PCR擴(kuò)增的EIAVLTR克隆入pBluescriptIIKS+(Stratagene)中。然后插入pSEIAV19的MluI/MluI(216/8124)片段，產(chǎn)生pBluescriptIIKS+中的野生型原病毒克隆(pONY2)(圖1)。然后通過去除HindIII/Hind III片段使env區(qū)缺失，產(chǎn)生pONY2-H。另外，缺失pol中的BglII/NcoI片段(1901/4949)，并將由HCMVIE增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的β-半乳糖苷酶基因插入其位置。該質(zhì)粒命名為pONY2.10nlsLacZ。為了將EIAV序列減至759個(gè)堿基對(duì)并將第一轉(zhuǎn)錄物與CMV啟動(dòng)子分離首先，采用以下引物，從pONY2.10LacZ PCR擴(kuò)增包含EIAV多嘌呤序列段(polypurine tract)(PPT)和3’LTR的序列PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG，和3’NEGSpeI(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG然后將PCR產(chǎn)物克隆入pBSIIKS+的Spe1位點(diǎn)；其取向使得U5鄰近pBluescriptIIKS+中的Not1。
其次，對(duì)于報(bào)道基因盒，通過Pst1消化取出pONY 2.10nlsLacZ的CMV啟動(dòng)子/LacZ，并將其克隆入pBS.3’LTR的Pst1位點(diǎn)，其取向使得LacZ基因鄰近所述3’LTR，該載體命名為pBS CMVLacZ.3’LTR。
用表達(dá)載體pCIEneo構(gòu)建所述EIAV載體的5’區(qū)，pCIEneo為pCIneo(Promega)的衍生物，由于包含得自以前定義的全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子5’端的約400個(gè)堿基對(duì)而被修飾。采用以下引物，用pHIT60(Soneoka等1995 Nucleic Aicds Res 23628-633)作為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得該400個(gè)堿基對(duì)的片段VSAT1(GGGCTATATGAGATCTrGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)和該產(chǎn)物用BglII和SpeI消化，并克隆入pCIE-Neo的BglII/SpeI位點(diǎn)。
用以下引物，從pSEIAV擴(kuò)增ELAV基因組中從R區(qū)至gag編碼區(qū)的nt150的EIAV基因組片段(nt268-675)CMV5’EIAV2(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG(下劃線序列退火于EIAVR區(qū))和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)所得的PCR產(chǎn)物鄰近Xba1和Sac1位點(diǎn)。然后，將該產(chǎn)物酶切，并克隆入pCIE-Neo的Xba1/Sac1位點(diǎn)。稱為pCIEneo5’EIAV的所得質(zhì)?，F(xiàn)在于CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)含有EIAVR區(qū)的起始段。然后，通過從pBS.CMVLacZ.3LTR中取出Apa1至Not1的片段，并將其克隆入Sal1-Not1消化的pCIEneo5’ELAV中(在載體和插入片段分別以Not1消化之前，將所述Sal1和Apa1位點(diǎn)用T4“磨光”產(chǎn)生平端)，將CMVLacZ/3LTR盒插入pCIEneo5’EIAV質(zhì)粒中。所得的質(zhì)粒命名為pEGASUS-1。
為了用作基因傳遞載體，pEGASUS-1需要由包裝細(xì)胞以反式提供的gag/pol和env的表達(dá)。關(guān)于gag/pol來(lái)源，通過將pONY2-H的MluI/MluI片段插入哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo(Promega)中，制備EIAVgagpol表達(dá)質(zhì)粒(pONY3)，使得gag-pol基因由hCMV-MIE啟動(dòng)子-增強(qiáng)子表達(dá)，并不含LTR序列。對(duì)于env來(lái)源；常規(guī)使用pRV583 VSV-G表達(dá)質(zhì)粒。這三種載體用于關(guān)于基于MLV的載體所述的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中(Soneoka等1995 Nucl.Acids Res.23628-633)。在D17成纖維細(xì)胞上通常產(chǎn)生的病毒滴度為104-105lacZ形成單位/ml。構(gòu)建pICUT的ELAV慢病毒形式載體，命名為pEICUT為了構(gòu)建pEICUT，首先從pEGASUS-1中去除pEGASUS-1的Xma1-SexA1片段，用T4聚合酶將末端“平端化”，將質(zhì)粒再連接，產(chǎn)生僅含pEGASUS-1 CMV-R-U5部分的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在主鏈中保留SV40-Neo盒。該質(zhì)粒命名為CMVLTR。為了于CMV-R邊界插入一個(gè)剪接供體，用以下在圖6顯示和在圖6說明中概述的兩種寡核苷酸進(jìn)行PCR。所得的質(zhì)粒命名為pCMVLTR+SD。以EIAV形式使用與MLVpICUT(參見上文)相同的基于免疫球蛋白的共有剪接受體。用圖7所述的寡核苷酸，將該共有剪接受體插入pEGASUS-1的XhoI-Bpu1102位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pEGASUS+SA。通過采用圖8描述的寡核苷酸和方法，用pEGASUS+SA作為模板進(jìn)行重疊PCR，去除EIAV的野生型剪接供體，產(chǎn)生質(zhì)粒pEGASUS+SA(noSD)。然后為了產(chǎn)生pEICUT-1，則將pEGASUS+SA(noSD)的Mlu1-Mlu1片段插入pCMVLTR+SD的僅有的Mlu1位點(diǎn)，產(chǎn)生pEICUT-1(參見圖9)。然后，通過Xho1-Bpul102消化和插入，可以將LacZ從pEGASUS-1轉(zhuǎn)移入pEICUT-1，產(chǎn)生pEICUT-Z(參見圖10；對(duì)于序列信息參見圖11)。
MLV和EIAV的pICUT載體均含有所述剪接供體上游的強(qiáng)剪接受體，因此不含功能性內(nèi)含子(內(nèi)含子需要位于剪接受體5’的剪接供體)。為此，當(dāng)將所述載體轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生細(xì)胞中時(shí)，產(chǎn)生的所得轉(zhuǎn)錄物將不被剪接。因此，將不喪失包裝信號(hào)，結(jié)果是可完成最大的包裝(參見圖12)。
然而，由于反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的特有方式，因此，在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，由整合的pICUT載體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物將不同于上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物。這是因?yàn)樵趶?fù)制期間，3’U3啟動(dòng)子(直至R的5’起始)拷貝，并用作轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的5’啟動(dòng)子。為此，由整合的pICUT產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物現(xiàn)在將含有強(qiáng)剪接受體5’端的強(qiáng)剪接供體，這兩者均位于neoORF上游。這類轉(zhuǎn)錄物將因此在5’UTR中(非翻譯區(qū))含有一個(gè)功能性內(nèi)含子，并因此進(jìn)行最大剪接和翻譯。
上述這類載體的另一優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)樗鰞?nèi)含子僅在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生，因而可將基因表達(dá)限于或者包裝細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。如何實(shí)現(xiàn)這一目的的一個(gè)實(shí)例概述于圖13。該策略需要克隆所述剪接受體上游的第二基因(在該實(shí)施例中為潮霉素)。通過取出SeletaVector Hygro(Ingenius；Oxfordshire，UK)的SalI片段上的潮霉素cDNA，并將其克隆入pICUT的Xho1位點(diǎn)(位于所述剪接受體上游)，而完成這一步。該載體在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選擇性地表達(dá)潮霉素，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中選擇性地表達(dá)新霉素。其原因是，在任何一種mRNA轉(zhuǎn)錄物中，在無(wú)內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)的輔助下，僅第一基因由核糖體翻譯。在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，該基因則為潮霉素。然而，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中，因?yàn)槌泵顾乜勺x框(ORF)包含于一種功能性內(nèi)含子內(nèi)，所以該基因現(xiàn)在將從成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物中去除，因此允許neoORF翻譯。
具有這類細(xì)胞特異性基因表達(dá)的載體因種種原因可能具有臨床用途；作為實(shí)例，可以將抗性標(biāo)記的表達(dá)局限于需要它們的產(chǎn)生細(xì)胞中，而不在它們可能具有免疫原性的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)。作為另一實(shí)例，諸如蓖麻毒蛋白的毒性基因的表達(dá)和顯性負(fù)信號(hào)蛋白的表達(dá)，可以被局限于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，在此可能需要它們來(lái)任選地使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或殺傷細(xì)胞，但在這類特征阻止高滴度病毒產(chǎn)生的產(chǎn)生細(xì)胞中不表達(dá)。圖14顯示Neo-p450 MLV pICUT構(gòu)建物，使得僅Neo在產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)，而前體藥物p4502B6同種型在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)。
轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生內(nèi)含子的另一個(gè)益處是，載體功能所需的任何必需元件現(xiàn)在均可以置于功能性內(nèi)含子內(nèi)，該內(nèi)含子在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生，并從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物中去除。作為實(shí)例，對(duì)于MLV和慢病毒載體(lentivector)的pICUT載體，所述病毒轉(zhuǎn)錄物在一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)含有功能性Psi包裝信號(hào)(關(guān)于Psi在MLV中的位置，參見Bender等1987；關(guān)于Psi在EIAV中的位置，參見專利申請(qǐng)GB 9727135.7)，所述內(nèi)含子在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生，而從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物中去除。
這種布置的益處包括(i)增強(qiáng)所得轉(zhuǎn)錄物的翻譯，因?yàn)樵诖嬖赑si二級(jí)結(jié)構(gòu)(如果存在)的情況下，核糖體可能“一陣一陣地動(dòng)(stutter)”(Krall等1996，出處同上和其中引用的參考文獻(xiàn))。
(ii)在缺乏包裝信號(hào)的情況下，所述載體失活并阻止由內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物包裝。
(iii)當(dāng)諸如gag(和其它潛在的ATG翻譯起始位點(diǎn))的病毒基本元件從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物中去除時(shí)，不需要的成熟前翻譯啟動(dòng)受到阻止。當(dāng)EIAV和MLV pICUT載體一樣，當(dāng)包裝信號(hào)延伸到gag中時(shí)，這特別有益。
(iv)可以將啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制基因置于轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的內(nèi)含子內(nèi)，因此模仿其它轉(zhuǎn)錄物布置，如由CMV產(chǎn)生的在內(nèi)含子中含有這類實(shí)體的布置(Chapman等1991，出處同上)。
總之，本發(fā)明描述的新型pICUT載體系統(tǒng)促進(jìn)以下布置(i)在產(chǎn)生細(xì)胞中進(jìn)行最大包裝和減少轉(zhuǎn)錄物的翻譯。
(ii)在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中進(jìn)行最大剪接，且因此進(jìn)行內(nèi)含子增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄物翻譯。
(iii)將基因和/或病毒基本元件的表達(dá)局限于或者產(chǎn)生細(xì)胞或者轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
(iii)當(dāng)所述載體失活時(shí)提高安全特性。實(shí)施例3構(gòu)建與pol基因和gag-pol轉(zhuǎn)錄盒具有最小同源性的MMLV兼嗜性env基因在莫洛尼鼠類白血病病毒(MMLV)中，env編碼序列的前約60bp與pol基因的3’端序列重疊。去除這兩個(gè)基因之間的同源區(qū)，以在表達(dá)這兩種基因的細(xì)胞中防止它們之間進(jìn)行重組的可能性。
如下改變env編碼序列的前60bp的DNA序列，而保留所編碼蛋白的氨基酸序列。構(gòu)建合成的寡核苷酸，以改變env5’端的密碼子使用(參見圖15)，并將其如下插入env的其余部分中。
用于再構(gòu)建4070A基因5’端的起始質(zhì)粒是pCI質(zhì)粒(Promega)，其中以前已經(jīng)克隆入了含pHIT456(Soneoka等1995，出處同上)的4070A基因的Xba1-Xba1片段，以形成pCI-4070A。用引物A和B(圖15)，對(duì)pCI-4070A進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生600個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。然后將該產(chǎn)物克隆到pCI-4070A的Nhe1和Xbo1位點(diǎn)之間。對(duì)所得構(gòu)建物的Nhe1/Xho1區(qū)進(jìn)行測(cè)序。盡管所得基因的氨基酸序列與原始4070A的序列相同，但去除了與pol基因的同源區(qū)。
圖16給出了修飾的env基因m4070A的完整序列。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將該序列插入表達(dá)載體pCI(Promega)中。由pHIT60(Soneoka等1995，出處同上)獲得CMV gag-pol轉(zhuǎn)錄單位。實(shí)施例4從反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)缺失gag序列采用以下寡核苷酸引物，經(jīng)PCR反應(yīng)，由反轉(zhuǎn)錄病毒載體MFG(Bandara等1993 Proc Natl Acad Sci9010764-10768)或MMLV原病毒DNA獲得含LTR和基本功能包裝信號(hào)的DNA片段HindIIIR GCATTAAAGCTTTGCTCTL523GCCTCGAGCAAAAATTCAGACGGA該P(yáng)CR片段含有MMLV核苷酸+1至+523，因此不含起始于+621的gag編碼序列(根據(jù)MMLV的核苷酸序列編號(hào)，Shinnick等1981 Nature293543-548)。
通過用HindIII和XhoI限制性酶消化，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行亞克隆，用所述PCR片段可構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒基因組載體。這類載體與gag編碼序列無(wú)同源性。實(shí)施例5缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的構(gòu)建能夠產(chǎn)生缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的轉(zhuǎn)錄單位示于圖17。它含有以下元件低氧調(diào)節(jié)啟動(dòng)子增強(qiáng)子，包含3個(gè)拷貝的PGK基因HRE以及缺失pGL3(Promega)72bp重復(fù)增強(qiáng)子的SV40啟動(dòng)子；一個(gè)含R、U5和包裝信號(hào)的MMLV序列；m4070A的編碼序列(實(shí)施例3)；一個(gè)剪接受體；一個(gè)用于插入治療蛋白編碼序列的克隆位點(diǎn)；MMLV的多嘧啶序列段；第二拷貝的含HRE啟動(dòng)子-增強(qiáng)子；一個(gè)剪接供體位點(diǎn)；和第二拷貝的R、U5。
在所述載體反轉(zhuǎn)錄并整合入第二靶細(xì)胞后，所述剪接供體立即被導(dǎo)入env基因的上游，從而導(dǎo)致將其從mRNA中剪接去除，因此僅允許治療基因在第二靶細(xì)胞中有效地表達(dá)(參見圖17)。實(shí)施例6構(gòu)建用于細(xì)胞色素P450的條件表達(dá)載體圖18顯示了一分為二的細(xì)胞色素P450基因的反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體cDNA編碼序列的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使得僅轉(zhuǎn)導(dǎo)后完成了正確的剪接，才允許P450表達(dá)。因此這將表達(dá)局限于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
1)用于構(gòu)建該載體的起始質(zhì)粒為pLNSX(Miller和Rosman 1989BioTechniques 7980-990)。通過用ALTERED SITES II誘變?cè)噭┖?Promega)和以下序列的合成寡核苷酸，經(jīng)PCR誘變使包含于pLNSX的包裝信號(hào)內(nèi)的天然剪接供體(…agGTaag...)(781/782位)突變5’-caaccaccgggagGCaagctggccagcaactta-3′2)用以下兩種寡核苷酸，經(jīng)PCR分離pCI表達(dá)載體(Promega)的CMV啟動(dòng)子引物15′-atcggctagcagatcttcaatattggccattagccatat-3′引物25′-atcgagatctgcggccgcttacctgcccagtgcctcacgaccaa-3′這產(chǎn)生含CMV啟動(dòng)子與5’Nhe1位點(diǎn)(引物1)和3’Not1和Xba1位點(diǎn)(引物2)的片段。用Nhe1和Xba1將其酶切，并將其克隆入已經(jīng)去除Nhe1-Nhe1片段的pLNSX中。
3)用以下引物，經(jīng)RT-PCR從人肝RNA(Clontech)中分離細(xì)胞色素P450 cDNA編碼序列的5’端引物35′-atcggcggccgcccaccatggaactcagcgtcctcctcttccttgcaccctagg-3′引物45′-atcggcggccgcacttacCtgtgtgccccaggaaagtattcaagaagccag-3′這擴(kuò)增了p450從ATG至殘基693的5’端(從翻譯起始位點(diǎn)編號(hào)Yamano等1989 Biochem 287340-7348)。在該片段的5’端(衍生自引物3)中也含有一個(gè)Not1位點(diǎn)和一個(gè)最佳化的“Kozak”翻譯起始信號(hào)。在該序列的3’端(衍生自引物4)含有另一個(gè)Not1位點(diǎn)和一個(gè)GT剪接供體對(duì)的共有剪接供體序列(也見于pCI中，最初衍生自人β珠蛋白基因)，GT剪接供體對(duì)直接對(duì)著P450的殘基704的位置(在引物4中互補(bǔ)殘基以大寫顯示)。該片段用Not1消化，并克隆入用Not1消化的步驟2中產(chǎn)生的質(zhì)粒中。
4)然后將步驟2克隆期間取出的Nhe1-Nhe1片段再導(dǎo)入步驟3的質(zhì)粒中。這產(chǎn)生圖17所述的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，但缺失P4503’端。
5)用以下引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，從人肝RNA(Clontech)中分離P450編碼序列的3’端引物5actgtgatcataggcacctattggtcttactgacatcactttctctccacagGcaagtttacaaaacctgcaggaaatcaatgcttacatt-3′引物6actgatcgatttccctcagccccttcagcggggcaggaagc-3′這產(chǎn)生PCR擴(kuò)增的從殘基705(在引物5中以大寫顯示)并延伸通過翻譯終止密碼子的P4503’端。在該產(chǎn)物5’端內(nèi)包含一個(gè)由引物5產(chǎn)生的Bcl1限制性位點(diǎn)和一個(gè)位于殘基705的上游的共有剪接受體以及分支點(diǎn)(也見于pCI中，最初得自免疫球蛋白基因)。于終止密碼子下游的該產(chǎn)物的3’端包含一個(gè)由引物6產(chǎn)生的Cla1位點(diǎn)。然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Bcl1和Cla1消化，并克隆入除去Bcl1-Cla1片段的步驟3的載體中，產(chǎn)生圖18所示的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
以下實(shí)施例描述一種腺慢病毒(adenolentiviral)系統(tǒng)的構(gòu)建，所述系統(tǒng)可用來(lái)在體外或體內(nèi)瞬時(shí)產(chǎn)生慢病毒。第一代重組腺病毒第一代腺病毒載體缺失所述病毒的E1和E3區(qū)，允許插入外源DNA，通常插入該病毒左臂，鄰近左反向末端重復(fù)序列(ITR)。病毒包裝信號(hào)(194-358 nt)與Ela增強(qiáng)子重疊，因此存在于大多數(shù)E1缺失載體中。該序列可以易位至病毒基因組的右端(Hearing和Shenk，1983 Cell3359-74)。因此，在E1缺失載體中，可以缺失3.2 kb(358-3525 nt)。
腺病毒能夠包裝105％長(zhǎng)度的基因組，因此允許加入額外的2.1kb。因此，在E1/E3缺失病毒載體中，其克隆容量變?yōu)?-8 kb(2.1 kb+1.9 kb(除去E3)+3.2 kb(除去E1))。因?yàn)樗鲋亟M腺病毒缺乏必需的E1早期基因，所以它不能在非E1互補(bǔ)細(xì)胞系中復(fù)制。293細(xì)胞系由Graham等研制(1977 J Gen Virol 3659-74)，含有Ad5基因組左端的約4 kb，包括ITR、包裝信號(hào)、E1a、E1b和pIX。所述細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)E1a和E1b基因產(chǎn)物，但即使pIX序列在E1b內(nèi)，也不表達(dá)晚期蛋白IX。在非互補(bǔ)細(xì)胞中，E1缺失病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞，并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，但沒有E1缺失基因組的表達(dá)。第一代腺病毒產(chǎn)生系統(tǒng)Microbix Biosystems-nbl Gene Science圖19中的圖解顯示采用microbix系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒所用的一般策略。
一般策略涉及將外源DNA克隆入E1穿梭載體，其中402-3328 bp的E1區(qū)被所述外源DNA盒取代。然后，將所述重組質(zhì)粒與pJM17質(zhì)粒一起共同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。pJM17缺失E3區(qū)而于3.7圖譜單位的E1區(qū)中插入原核pBRX載體(包括氨芐青霉素抗性序列和細(xì)菌ori序列)。因此，該40 kb質(zhì)粒太大而不能包裝入腺核殼中，但可以在細(xì)菌中增殖。在293細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)重組，導(dǎo)致外源DNA插入片段取代ampr和ori序列。實(shí)施例7構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用于產(chǎn)生含EIAV組分的腺病毒為了產(chǎn)生慢病毒載體，需要制備四種腺病毒基因組、gagpol、包膜(狂犬病G)和Rev。由異源啟動(dòng)子表達(dá)慢病毒組分，它們含有內(nèi)含子(需要時(shí)(用于高表達(dá)gagpol、Rev和狂犬病病毒包膜))以及多腺苷酸化信號(hào)。當(dāng)將這四種病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入E1a-細(xì)胞中時(shí)，所述腺病毒組分將不表達(dá)，但異源啟動(dòng)子將允許表達(dá)慢病毒組分。以下(例1)概述一個(gè)構(gòu)建EIAV腺病毒系統(tǒng)的實(shí)例(申請(qǐng)?zhí)?727135.7)。所述EIAV基于缺乏任何非必需EIAV編碼蛋白(S2、Tat或包膜)的基本系統(tǒng)。用來(lái)使所述EIAV假型化的包膜是狂犬病病毒包膜(G蛋白)。已經(jīng)表明這很好地使EIAV假型化(申請(qǐng)?zhí)?811152.9)。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒以下描述含EIAV組分的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建。所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為pE1sp1A(圖20)。
所述重組轉(zhuǎn)移質(zhì)?？梢杂脕?lái)通過在293細(xì)胞中的同源重組，制備重組腺病毒。
附上以下質(zhì)粒的圖解說明。A) pE1RevE-Rev構(gòu)建物用Apa LI和Cla I切割質(zhì)粒pCI-Rev。用Klenow聚合酶將編碼EIAV Rev的2.3 kb帶平端化，并將其插入pE1sp1A的Eco RV位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pE1RevE(圖21)。B) pE1HORSE3.1-gagpol構(gòu)建物用Sna BI和Not I切割pHORSE3.1。將編碼EIAV gagpol的6.1 kb帶插入用Sna BI和Not I切割的pE1RevE(純化7.5 kb帶)。這產(chǎn)生質(zhì)粒pE1HORSE3.1(圖22)。C) pE1PEGASUS-基因組構(gòu)建物用BglII和Not I切割pEGASUS4。將含有EIAV載體基因組的6.8kb帶插入用BglII和NotI切割的pE1RevE(純化6.7 kb帶)。這產(chǎn)生質(zhì)粒pE1PEGASUS(圖23)。D) pCI-Rab-狂犬病病毒構(gòu)建物為了制備pE1Rab，通過用NsiI和AhdI切割質(zhì)粒pSA91RbG，將狂犬病病毒可讀框插入pCI-Neo(圖24)中。用T4 DNA聚合酶將1.25 kb帶平端化，并將其插入用Sma I切割的pCI-Neo中。這產(chǎn)生質(zhì)粒pCI-Rab(圖25)。F) pE1Rab-狂犬病病毒構(gòu)建物用Sna BI和Not I切割pCI-Rab。將編碼狂犬病病毒包膜的1.9 kb帶插入用Sna BI和Not I切割的pE1RevE(純化7.5 kb帶)。這產(chǎn)生質(zhì)粒pE1Rab(圖26)。實(shí)施例8構(gòu)建pTRONIN除了根據(jù)pICUT需要滴定新霉素抗性之外，決定還包括LacZ報(bào)道基因。將其克隆入pICUT中，使得LacZ基因由LTR表達(dá)而新霉素基因由內(nèi)部SV40啟動(dòng)子表達(dá)。如下制備此構(gòu)建物首先，用RsrII消化pHIT111(Soneoka等1995，出處同上)，然后用BamH1部分消化。取出4144 bp片段(包含LacZ-SV40 Neo序列)，將其克隆入Bc11-RsrII消化的pICUT，獲得pICUT-ZN。其次，用pHIT111的5’CMV LTR取代該質(zhì)粒的上游LTR(Soneka等1995，出處同上)。通過取出包含5’CMV LTR的Scal-BsteII片段，取代用Scal-BstEII類似消化的pICUT-ZN的5’LTR，達(dá)到此目的。獲得的質(zhì)粒命名為pTRONIN(參見圖31以及序列圖32)。
為了研究pTRONIN中的剪接過程，對(duì)pTRONIN轉(zhuǎn)導(dǎo)的HT1080細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR(參見Jones等1975 Cell 6245-252)。如下達(dá)到此目的首先，按照生產(chǎn)商介紹用Trizol(Gibco)從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞提取RNA。然后，采用隨機(jī)引物以及按照生產(chǎn)商介紹使用‘Universal Riboclone cDNA合成系統(tǒng)’(Promega)，由該RNA合成第一鏈cDNA。
最后，對(duì)于PCR反應(yīng)，使用兩種引物。設(shè)計(jì)第一引物(引物A1)以退火至轉(zhuǎn)錄U3起始部位的下游而在小TSD序列的上游(5’-gttaacactagtaagcttg-3’)。設(shè)計(jì)第二引物(引物A2)以退火至反向剪接受體的下游(5’-gattaagttgggtaacgccaggg-3’)。因此，在小T剪接供體上游至剪接受體下游的區(qū)之間擴(kuò)增這些引物。所以該P(yáng)CR反應(yīng)將獲得全長(zhǎng)信息和剪接信息(參見圖34)。
完成后，在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR反應(yīng)物。分析顯示，存在pTRONIN轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的兩種產(chǎn)物。兩者均較全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物小，說明發(fā)生了剪接。兩種片段的凝膠提取、克隆以及測(cè)序顯示，一種產(chǎn)物為小T剪接供體(在反轉(zhuǎn)錄期間拷貝至5’LTR)和剪接受體之間的剪接反應(yīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物。而另一個(gè)較大的產(chǎn)物在剪接受體和以前未鑒定的包含于包裝信號(hào)中的隱蔽剪接供體(作圖于野生型MLV的位置810-811；前后序列為cagGTtaag(以粗體表示GT剪接供體)之間存在剪接。
為了進(jìn)一步研究該隱蔽剪接供體，以pTRONIN用以下方法使其突變首先合成兩種寡聚物。第一寡聚物跨越隱蔽剪接供體的特有BsteII位點(diǎn)和GT。這種寡聚物的剪接供體點(diǎn)(以粗體表示)由GT變?yōu)镚C。以大寫表示BsteII位點(diǎn)。其序列如下5′-cgttgGGTTACCttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccagGCtaagatcaaggtc-3′第二種寡聚物為反向取向并跨越獨(dú)特的Pmel位點(diǎn)(下劃線)5′-gcccagtgtttaaacactcgag-3′.
在應(yīng)用pTRONIN作模板的PCR反應(yīng)中使用這兩種寡聚物。然后用BstE11和Pmel切割PCR產(chǎn)物，再后克隆入用BstE11和Pmel類似消化的pTRONIN中，因此用突變GC序列取代隱蔽剪接供體GT。該載體稱為pTRONIN-1(參見圖35和序列圖36)。
然后比較pTRONIN-1載體和pTRONINRT-PCR分析顯示，pTRONIN-1現(xiàn)在僅在轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生一種主要轉(zhuǎn)錄物，與pTRONIN的2種轉(zhuǎn)錄物不同。測(cè)序證實(shí)，如果它衍生自小TSD和剪接受體之間的剪接反應(yīng)，則該產(chǎn)物為預(yù)期的序列。因此，隱蔽剪接供體由GT突變?yōu)镚C使其功能喪失。
比較滴度時(shí)，通常pTRONIN-1滴度比pTRONIN高5-10倍。這與轉(zhuǎn)導(dǎo)之前沒有剪接受體上游的剪接供體，因此病毒產(chǎn)生期間沒有剪接的事實(shí)一致。隱蔽剪接供體突變提高滴度的事實(shí)提示，缺失后在產(chǎn)生細(xì)胞中隱蔽剪接供體和剪接受體之間的剪接(然后缺失包裝信號(hào))才提高滴度。
另一個(gè)論證是，轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)pTRONIN-1載體的一定程度的剪接將使其滴度與一輪轉(zhuǎn)導(dǎo)后的對(duì)照相當(dāng)(pHIT111 Soneka等，出處同上)。為此，用所述兩種載體通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法(見Soneoka等，出處同上)制備所述病毒制劑，然后用以轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系FLYRD18(Cosset等J.Virol.697430-6)。2天后，收集該包裝細(xì)胞系的相應(yīng)上清液，過濾(0.45)后測(cè)定滴度。關(guān)于pHIT111對(duì)照，瞬時(shí)產(chǎn)生的滴度以及隨后的FLYRD18滴度分別為1×106/ml和5×106/ml。關(guān)于pTRONIN-l，瞬時(shí)產(chǎn)生的滴度同樣為1×106/ml.但是FLYRD18細(xì)胞(一輪轉(zhuǎn)導(dǎo)后)的滴度降至50/ml以下。因此相對(duì)于pHIT111對(duì)照，其滴度降低了100,000倍以上。證實(shí)剪接過程是有效的，而且?guī)缀跛修D(zhuǎn)錄物均被剪接，因此而不被包裝。小結(jié)本發(fā)明涉及適用于將一種或多種NOI導(dǎo)入靶細(xì)胞的新型傳遞系統(tǒng)。
在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明包括包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中第一NS位于第二NS下游而且其中第三NS和第四NS位于第二NS的上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體因所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在其需要靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄而發(fā)生剪接。
換句話說，該方面包括一種新型傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種鄰接一個(gè)功能性SD位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的NOI，條件是該系統(tǒng)由原載體產(chǎn)生，在原載體中，所述SD和SA的順序反轉(zhuǎn)，使得剪接無(wú)效。
本發(fā)明的該方面可稱為“斷裂-內(nèi)含子”方面。圖27c中提供了顯示本發(fā)明該方面的示意圖。相比之下，圖27a和圖27b顯示已知反轉(zhuǎn)錄病毒載體中的剪接結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的另一廣義方面包括一種新型傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含能夠包裝一種或多種慢病毒載體組分的一種或多種腺病毒載體組分，其中所述慢病毒載體任選地包含一個(gè)斷裂內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
一般而言，本發(fā)明的該方面可以稱為雜種病毒載體系統(tǒng)。在該特定情況下，腺病毒組分和慢病毒組分的組合可以稱為雙雜種病毒載體系統(tǒng)。
圖28提供了顯示本發(fā)明該方面的示意圖。
本文討論了本發(fā)明的這些方面和其它廣義方面。
以上說明書中提及的所有出版物均通過引用結(jié)合到本文中。在不偏離本發(fā)明范圍和精神的情況下對(duì)本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)進(jìn)行的各種改進(jìn)和改變，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)該知道，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過度限于這類具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對(duì)分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的對(duì)實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種修改，均屬于以下權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1.一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接一個(gè)第一目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NESDS)的第三NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游而且其中所述第三NS和第四NS位于所述第二NS的上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在需要靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠被剪接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述NFSS為NFSDS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述NFSS為非功能性剪接受體位點(diǎn)(NFSAS)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體還包含一個(gè)第二NOI；其中所述第二NOI位于所述FSAS的下游。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含所述第二NOI；其中所述第二NOI位于所述第二NS下游。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NOI或其表達(dá)產(chǎn)物為治療劑或診斷劑或者包含治療劑或診斷劑。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第一NOI或其表達(dá)產(chǎn)物是或者包含任何一種或多種賦予選擇性的因子(例如標(biāo)記元件)、病毒必需元件或其部分或它們的組合。
8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第一NS位于反轉(zhuǎn)錄病毒原載體3’端或其附近；最好是其中所述3’端包含一個(gè)U3區(qū)和一個(gè)R區(qū)；并且最好其中所述第一NS位于所述U3區(qū)和所述R區(qū)之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體的所述U3區(qū)和/或所述第一NS包含為第三NOI的NS；其中所述NOI為轉(zhuǎn)錄控制元件、編碼序列或其部分的任何一種或多種。
10.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第一NS可得自病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第一NS為一種內(nèi)含子或其部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述內(nèi)含子可得自SV40病毒的小t-內(nèi)含子。
13.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)；并且其中所述第二NS位于所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)下游，使得可防止于第一靶位點(diǎn)進(jìn)行剪接。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)包含為NFSDS的第四NS。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)包含為NFSAS的第四NS。
16.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NS位于所述第一NOI下游，使得所述第一NOI能夠于第一靶位點(diǎn)表達(dá)。
17.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NS置于所述第一NOI的下游，使得所述第一NOI能夠在第一靶位點(diǎn)表達(dá)而且提高所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體滴度。
18.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NS置于一個(gè)多克隆位點(diǎn)的上游，使得可插入一個(gè)或多個(gè)額外NOI。
19.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫分子或其部分的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述免疫分子為免疫球蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述第二NS為編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
22.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體還包含一種功能性內(nèi)含子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述功能性內(nèi)含子的定位使得在需要的靶位點(diǎn)缺失所述包裝信號(hào)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體為自我失活(SIN)載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述功能性內(nèi)含子的定位使得能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)NOI的表達(dá)限定于需要的靶位點(diǎn)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述靶位點(diǎn)為細(xì)胞。
27.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體或原載體可衍生自鼠類致癌反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體可衍生自MMLV、MSV、MMTV、HIV-1或EIAV。
29.一種任一前述權(quán)利要求定義的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體為整合的原病毒。
30.一種反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，它可得自任一前述權(quán)利要求的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
31.一種用權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求30的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
32.用于醫(yī)藥領(lǐng)域的權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求30的病毒顆?；驒?quán)利要求31的細(xì)胞。
33.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求30的病毒顆?；驒?quán)利要求31的細(xì)胞用于生產(chǎn)將一種或多種NOI傳遞至其需要的靶位點(diǎn)的藥用組合物的用途。
34.一種方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求30的病毒顆粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或利用根據(jù)權(quán)利要求31的細(xì)胞。
35.一種用于根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或根據(jù)權(quán)利要求30的病毒顆?；蚋鶕?jù)權(quán)利要求31的細(xì)胞的傳遞系統(tǒng)，其中所述傳遞系統(tǒng)包含一種或多種非反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、腺病毒或質(zhì)?；蛩鼈兊慕M合，以將一種NOI或多種NOI傳遞至第一靶細(xì)胞，所述系統(tǒng)還包含一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，以將一種或多種NOI傳遞至第二靶細(xì)胞。
36.一種任一前述權(quán)利要求定義的反轉(zhuǎn)錄病毒原載體。
37.功能性內(nèi)含子將一種或多種NOI的表達(dá)限于所需靶細(xì)胞的用途。
38.一種反轉(zhuǎn)錄酶的用途，它為所述反轉(zhuǎn)錄酶用于將第一NS從反轉(zhuǎn)錄病毒原載體的3’端傳遞至反轉(zhuǎn)錄病毒載體的5’端，從而使得轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生功能性內(nèi)含子的用途。
39.一種用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含一種或多種編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并在其中表達(dá)所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體和/或所述第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體、最好是慢病毒載體。
41.根據(jù)權(quán)利要求39和權(quán)利要求40的雜種病毒載體系統(tǒng)的用途，其中所述慢病毒載體具有斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
42.一種雜種病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)或能夠傳遞斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
43.一種慢病毒載體系統(tǒng)，其中所述慢病毒載體包含斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)或能夠傳遞斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
44.一種腺病毒載體系統(tǒng)，其中所述腺病毒載體包含斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)或能夠傳遞斷裂-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
45.基于或得自以下任何一種或多種實(shí)體的載體或質(zhì)粒pE1sp1A、pCI-Neo、pE1RevE、pE1HORSE3.1、pE1PEGASUS4、pCI-Rab、pE1Rab。
46.一種用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并能在其中表達(dá)所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體、最好是慢病毒載體。
47.一種用于體內(nèi)基因傳遞的雜種病毒載體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含編碼第二病毒載體的第一病毒載體，所述第一載體能夠感染第一靶細(xì)胞并能在其中表達(dá)所述第二病毒載體，所述第二載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)第二靶細(xì)胞，其中所述第一載體可得自或基于腺病毒載體，而所述第二病毒載體可得自或基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體、最好是慢病毒載體；其中所述病毒載體系統(tǒng)包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接一個(gè)第一目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)能夠產(chǎn)生所述FSDS的第一核苷酸序列(NS)；一個(gè)能夠產(chǎn)生所述FSAS的第二NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游；而且其中所述第三NS和第四NS位于所述第二NS的上游；使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在需要靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠被剪接。
48.一種自我失活(SIN)的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)；其中所述FSDS和所述FSAS鄰接第一目的核苷酸序列(NOI)；其中所述FSDS位于所述FSAS上游；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體；其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)；一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS；一個(gè)能夠產(chǎn)生一個(gè)非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS；其中所述第一NS位于所述第二NS下游而且其中所述第三NS和第四NS位于所述第二NS的上游；使得不能因?yàn)樗龇崔D(zhuǎn)錄病毒原載體在靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄而包裝反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
49.一種能夠基本如本文所述在靶細(xì)胞中差異表達(dá)NOI的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
全文摘要
一種反轉(zhuǎn)錄病毒載體包含一個(gè)功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)和一個(gè)功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS);其中所述FSDS和FSAS鄰接第一目的核苷酸序列(NOI);其中所述FSDS位于所述FSAS上游;其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒原載體;其中所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體包含一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接供體位點(diǎn)(FSDS)的第一核苷酸序列(NS);一個(gè)能夠產(chǎn)生所述功能性剪接受體位點(diǎn)(FSAS)的第二NS;一個(gè)能夠產(chǎn)生非功能性剪接供體位點(diǎn)(NFSDS)的第三NS;一個(gè)能夠產(chǎn)生非功能性剪接位點(diǎn)(NFSS)的第四NS;其中所述第一NS位于所述第二NS下游而且其中所述第三NS和第四NS位于所述第二NS的上游;使得所述反轉(zhuǎn)錄病毒原載體在其需要靶位點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄后所述反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠被剪接。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1344326SQ0080518
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2000年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月22日
發(fā)明者M·烏登, K·米特羅法諾斯 申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國(guó))有限公司