專利名稱：用編碼腺病毒e1蛋白的序列在人體細胞中生產(chǎn)重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的領(lǐng)域，尤其涉及使用人體細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及單克隆抗體生產(chǎn)的領(lǐng)域，尤其用人體細胞生產(chǎn)單克隆抗體。本發(fā)明還涉及病毒蛋白生產(chǎn)的領(lǐng)域。本發(fā)明尤其用于生產(chǎn)疫苗，以助于脊椎動物，尤其哺乳動物特別是人抗病毒病原體的防護作用。
本發(fā)明揭示了生產(chǎn)重組蛋白的方法和組合物。本發(fā)明尤其用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，該蛋白質(zhì)需要翻譯后或翻譯時期(peritranslational)修飾，如糖基化和適當折疊。
人重組蛋白在異源細胞中的表達已充分記錄。許多重組蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)是可用的，如細菌，酵母，和真菌及昆蟲細胞，植物細胞和哺乳動物細胞。然而盡管有這些生產(chǎn)系統(tǒng)，但有些生產(chǎn)系統(tǒng)仍不是最佳的，或只適于生產(chǎn)特殊類別的蛋白質(zhì)。例如，在原核生產(chǎn)系統(tǒng)中不能生產(chǎn)需要翻譯后或翻譯時期修飾如糖基化，γ-羧基化或γ-羥基化的蛋白質(zhì)。原核表達系統(tǒng)的另一熟知問題是在一些情況下經(jīng)常產(chǎn)生錯誤折疊的產(chǎn)物，甚至產(chǎn)生不溶的包涵體。真核系統(tǒng)是生產(chǎn)特別是真核細胞衍生的蛋白質(zhì)的一改良系統(tǒng)，但可用的生產(chǎn)系統(tǒng)仍有許多弊端。例如酵母菌株中的高甘露糖化影響酵母正確表達糖蛋白的能力。高甘露糖化通常甚至導致免疫反應，當這樣制備的治療性蛋白質(zhì)施用于病人時。另外，酵母分泌信號不同于哺乳動物信號，導致哺乳動物蛋白包括人多肽輸送至細胞外更有問題，這又導致持續(xù)生產(chǎn)和/或分離的問題。哺乳動物細胞廣泛用于生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)，因為它們具有進行精確的翻譯后修飾的能力。重組蛋白在哺乳動物細胞中的表達在過去的幾年里已取得明顯進展，在許多情況下成為常規(guī)技術(shù)。尤其中國倉鼠卵巢細胞(CHO)已成為生產(chǎn)生物藥學蛋白質(zhì)和有診斷用處的蛋白質(zhì)的通用及常規(guī)生產(chǎn)系統(tǒng)。有許多特征使CHO非常適用作宿主細胞CHO細胞中可達到的生產(chǎn)水平非常高；此細胞系提供了安全的生產(chǎn)系統(tǒng)，其沒有感染性或類病毒顆粒；CHO細胞已精確定性，盡管其來源的細胞系的歷史是模糊的；CHO細胞用無血清的培養(yǎng)基，可在生物反應器中懸浮生長直至高密度；CHO的dhfr-突變體(DG-44克隆，Urlaub等，1983)已產(chǎn)生，通過導入外源dhfr基因，之后用氨甲碟呤良好控制dhfr基因和轉(zhuǎn)基因的擴增，從而獲得簡易的選擇系統(tǒng)。然而，糖蛋白或包含至少兩個(不同)亞單位的蛋白質(zhì)仍會產(chǎn)生問題。糖基化蛋白質(zhì)的生物活性可由于寡糖組分的精確性質(zhì)而深遠影響。糖基化的類型對糖蛋白的免疫原性，定向及藥物動力學性質(zhì)也有明顯作用。近年來，在確定糖基化的細胞因子領(lǐng)域已取得重大進展，并已克隆了許多糖基轉(zhuǎn)移酶。由此導致研究方向針對于糖基化機制的代謝工程化(Fussenegger等，1999；Lee等，1989；Vonach等，1998；Jenkim等，1998；Zhang等，1998；Muehmore等，1989)。這種策略例如見于以下所述。CHO細胞缺失功能性α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，導致唾液酸通過α-2，3-鍵特有地添加于半乳糖中。已知α-2，6-鍵缺失可增強蛋白質(zhì)從血流中清除。為解決這個問題，CHO細胞通過適當?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染，已遺傳工程化為模擬人聚糖分布。CHO細胞也不能生產(chǎn)Lewis×寡糖，現(xiàn)已產(chǎn)生表達人N-乙酰-D-葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶III的CHO細胞系。相反已知嚙齒動物細胞包括CHO細胞，產(chǎn)生糖基化CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸水解酶(Jenkine等，1996)，這是一種人體沒有的酶。攜帶這種糖基化的蛋白質(zhì)當注射時，可產(chǎn)生強免疫應答(Kawashima等，1993)。對編碼此水解酶的嚙齒動物基因的新近鑒別，很可能促進缺失此活性的CHO細胞的產(chǎn)生，并避免這種嚙齒動物修飾。
本領(lǐng)域因此教導可通過表達人糖基轉(zhuǎn)移酶，而改變哺乳動物宿主細胞的糖基化趨勢。盡管在重組蛋白上CHO衍生的聚糖結(jié)構(gòu)可模擬在其天然人相應蛋白上的結(jié)構(gòu)，但仍發(fā)現(xiàn)它們很不相同。另一潛在問題是不是所有的糖基化酶都已克隆并因此適于代謝工程化。治療性施用不同于其天然人體相應蛋白的蛋白質(zhì)，可導致激活病人的免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生影響治療效果的非所需應答。使用非人細胞的其它問題是在翻譯期間或之后可產(chǎn)生蛋白質(zhì)的錯誤折疊，這可取決于不同陪伴蛋白的存在情況。發(fā)生異常折疊，可導致蛋白質(zhì)生物活性的降低或喪失。另外，非常重要的是同時表達分離的多肽，這些分離的多肽以正確的相對豐度一起形成包含不同亞單位的蛋白質(zhì)，如單克隆抗體。人體細胞能更好地提供正確表達和加工人體蛋白所必需的所有便利條件。
因此，更需要生產(chǎn)人體重組蛋白的方法，其包括一種細胞，其提供一致的人類型加工如翻譯后或翻譯期間修飾，如糖基化，其優(yōu)選還適于大規(guī)模生產(chǎn)。
因此，本發(fā)明提供了一種在細胞中生產(chǎn)至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，所述細胞包括真核細胞，其在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，該細胞不從其基因組或整合入其中的序列編碼結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白；所述方法包括提供編碼重組蛋白質(zhì)物質(zhì)的基因給所述細胞，將此細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，并從所述細胞和/或培養(yǎng)基中收集至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)。蛋白質(zhì)物質(zhì)是一種包含通過肽鍵連接的至少兩個氨基酸的物質(zhì)。此物質(zhì)還可進一步包含與所述氨基酸部分物理連接的一或多個其它分子或不包含這些分子。這些其它分子的非限制性例子包括碳水化合物和/或脂質(zhì)分子。由于許多原因，編碼腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸不應存在。原因之一是在所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)制備物中存在腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白在這種所生產(chǎn)的蛋白的應用中是非常不希望的。從產(chǎn)物中除去這種結(jié)構(gòu)蛋白最好通過避免其在制備中發(fā)生而實現(xiàn)。優(yōu)選地，所述真核細胞是哺乳動物細胞。在一優(yōu)選的實施方案中，從細胞中收獲的蛋白質(zhì)物質(zhì)和細胞自身是衍生自相同物種的。例如，如果將蛋白質(zhì)施用于人，優(yōu)選細胞和收獲自所述細胞的蛋白質(zhì)物質(zhì)均來源于人。人體細胞的一優(yōu)點是商業(yè)上大多數(shù)引人注意的蛋白質(zhì)是人源的。收獲自所述細胞的蛋白質(zhì)物質(zhì)可以是由所述細胞產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)物質(zhì)。在一實施方案中，至少一種收獲的蛋白質(zhì)物質(zhì)是由所述基因編碼的。在另一實施方案中，將基因提供給所述細胞，以增強和/或誘導一或多種內(nèi)源性存在的基因在細胞中表達。例如，提供編碼蛋白質(zhì)的基因給所述細胞，能增強在所述細胞中蛋白質(zhì)物質(zhì)的表達。
基因是指包含一種處于可表達形式如表達盒的感興趣核酸的一種核酸。感興趣的核酸可以從天然啟動子或其衍生物或完全異源啟動子表達，感興趣核酸可包含或不包含內(nèi)含子。相似地，其可以是cDNA或cNDA樣核酸。感興趣核酸可編碼蛋白質(zhì)?；蛘撸信d趣核酸可編碼反義RNA。
本發(fā)明還提供了一種在細胞中生產(chǎn)至少一種人重組蛋白的方法，包括將編碼所述人重組蛋白的核酸提供給一種人體細胞，該細胞在其基因組中具有編碼至少一種無限增殖化腺病毒E1蛋白質(zhì)或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，此細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白；將所述細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從所述細胞和/或培養(yǎng)基中收獲至少一種人重組蛋白。直至本發(fā)明，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)有任何人體細胞適于以任何可再生及大規(guī)模方式生產(chǎn)人重組蛋白。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在其基因組中至少包含無限增殖化腺病毒E1序列的細胞，能相對非依賴于外源生長因子而生長(它們通過E1而無限增殖化)。另外，這些細胞能大量生產(chǎn)重組蛋白，并能正確加工生產(chǎn)的重組蛋白。當然這些細胞也能生產(chǎn)非人體蛋白。已用于大量生產(chǎn)重組蛋白的人體細胞系通常是腫瘤(轉(zhuǎn)化)細胞系。大多數(shù)用于生產(chǎn)重組蛋白的人體細胞是腫瘤衍生的這一事實，增加了使用這些特殊細胞系的危險性，并導致分離重組蛋白的步驟要非常嚴格，以避免在任何蛋白質(zhì)或其制備物中有轉(zhuǎn)化活性或致瘤性物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的方法，所述細胞衍生自原代細胞。為能使其無限生長，原代細胞需以一些方式無限增殖化，在本發(fā)明中已通過導入腺病毒E1而達到。本領(lǐng)域還不清楚轉(zhuǎn)化和無限增殖化的界線。本文中其不同之處是指無限增殖化的細胞無限地生長，而其表型仍存在；轉(zhuǎn)化的細胞也無限生長，但其表型也明顯改變。為通過細胞培養(yǎng)而達到大規(guī)模(持續(xù)性)生產(chǎn)重組蛋白，本領(lǐng)域優(yōu)選使細胞能不需貼壁地生長。本發(fā)明的細胞具有此能力。當細胞在其基因組中包含編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或其片段的序列時，細胞的非依賴于貼壁的生長能力得以改善，其中優(yōu)選所述E2A編碼序列編碼一種溫度敏感性的突變E2A，如ts125。為獲得從中可易于分離所需重組蛋白的純凈及安全的生產(chǎn)系統(tǒng)，優(yōu)選使用本發(fā)明的方法，其中所述人體細胞不包含其它腺病毒序列。本發(fā)明使用的最優(yōu)選的細胞是以ECACC保藏號96022940保藏的PER.C6，或其衍生物。PER.C6比例如轉(zhuǎn)化的人293細胞在運用中表現(xiàn)更佳，其也已經(jīng)通過腺病毒的E1區(qū)而無限增殖化。對PER.C6細胞已經(jīng)定性并已非常深入地研究，它們在大規(guī)模加工，懸浮生長和不依賴于生長因子方面表現(xiàn)更好。特別是PER.C6可在懸浮液中以高度可再生方式生長，這使其非常適于大規(guī)模生產(chǎn)。另外，已證明PER.C6細胞系可在生物反應器中生長至非常高的密度。
本發(fā)明的細胞，尤其PER.C6具有另外的優(yōu)點，其可在無動物或人衍生的血清或動物或人衍生的血清組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因此分離更加容易，而安全性由于培養(yǎng)基中沒有額外的人或動物蛋白而提高，且此系統(tǒng)是非常可靠的(合成培養(yǎng)基是再生性最好的)。另外，腺病毒早期區(qū)域1A(E1A)的存在與缺失此特殊基因的(人)細胞系相比，又有另外的優(yōu)點作為轉(zhuǎn)錄激活劑的E1A已知增強從巨細胞病毒介導的早期基因的增強子/啟動子中轉(zhuǎn)錄(Olive等，1990；Gorman等，1989)。當產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在CMV增強子/啟動子控制下時，所述細胞中表達水平提高，而缺失EIA的細胞中表達水平不提高。本發(fā)明因此還提供了一種在原核細胞中增加重組蛋白質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)量的方法，包括提供編碼所述蛋白質(zhì)物質(zhì)至少一部分的核酸給原核細胞，所述編碼序列在CMV啟動子，E1A啟動子或其功能性同源物，衍生物和/或片段的控制下，并且進一步提供給所述細胞以E1A活性或類E1A活性。與CMV啟動子相似，E1A啟動子在表達一或多種E1A產(chǎn)物的細胞中，比在不表達這種產(chǎn)物的細胞中更有活性。已知實際上E1A表達增強作用是一些其它啟動子的特性。就本發(fā)明而言，這種啟動子是E1A啟動子的功能同源物。E1A的作用可通過轉(zhuǎn)錄激活物引誘E1A啟動子或其同源物，和/或通過除去/避免轉(zhuǎn)錄阻抑物附著啟動子而介導。激活物與阻抑物與啟動子的結(jié)合，以序列依賴方式發(fā)生。E1A啟動子或其同源物的功能衍生物或片段至少包含一種E1A蛋白調(diào)節(jié)的激活物和/或阻抑物的核酸結(jié)合序列。
本發(fā)明的細胞的另一個優(yōu)點是其具有并持續(xù)表達腺病毒E1B基因。腺病毒E1B是熟知的細胞程序死亡的抑制劑。此抑制是通過其55K E1B產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄因子p53結(jié)合，或隨后抑制而發(fā)生的(Yew和Berk，1992)。E1B區(qū)域的其它產(chǎn)物，19K E1B，可通過結(jié)合并從而抑制細胞死亡蛋白Bax和Bak而防止細胞程序死亡，這兩種蛋白均在p53的控制下(White等，1992；Debbas和White，1993；Han等，1996；Farrow等1995)。這些特點特別可用于表達這樣的重組蛋白，即當此重組蛋白過表達時，可通過依賴p53途徑誘導細胞程序死亡。
本發(fā)明還提供了人體細胞在生產(chǎn)人重組蛋白中的應用，所述細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種無限增殖化E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了這種應用，其中所述人體細胞衍生自原代細胞，優(yōu)選所述細胞是PER.C6細胞或其衍生物。本發(fā)明還提供了一種應用，其中所述細胞在其基因組中還包含編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或片段的序列，優(yōu)選其中所述E2A是溫度敏感性的。
本發(fā)明還提供了可根據(jù)本發(fā)明方法或本發(fā)明的應用獲得的人重組蛋白，所述人重組蛋白具有不同于分離的天然人相應蛋白的人糖基化模式。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種人體細胞，其基因組中具有編碼腺病毒的E1或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白，并還具有編碼人重組蛋白的基因，優(yōu)選此人體細胞衍生自ECACC保藏號96022940的PER.C6。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種人體細胞，PER.C6/E2A，其基因組中還包含編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或片段的序列，優(yōu)選所述E2A是溫度敏感性的。
在這些細胞中表達的蛋白質(zhì)和使用本發(fā)明的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些蛋白優(yōu)選是人體蛋白，優(yōu)選經(jīng)過一些天然加工，如分泌，陪伴折疊和/或轉(zhuǎn)運，與其它亞單位共合成，糖基化，磷酸化。典型的治療性或診斷性用途例如包括由一些亞單位組成的單克隆抗體，組織特異性纖溶酶原激活物(tpA)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和人促紅細胞生成素(EPO)。EPO是一種典型的產(chǎn)物，尤其在體內(nèi)，其活性和免疫原性主要依賴于其糖基化模式。因此，相對高水平的EPO可通過使用CHO細胞而達到，當與純化自人尿液的EPO相對比時，其糖基化不同，但增加紅細胞產(chǎn)生的活性相同。然而這種EPO的不同糖基化在受體中產(chǎn)生免疫原性問題，和半衰期改變的問題。
本發(fā)明為此還揭示了一種新的無限增殖化的人細胞系，及其進行生產(chǎn)的應用。PER.C6細胞(WO 97/00326)是通過用含有腺病毒血清型5(Ad5)E1A編碼序列和E1B編碼序列(Ad5的459-3510位核苷酸)的質(zhì)粒，在人磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子的控制下，轉(zhuǎn)染原代人胚胎視網(wǎng)膜細胞而產(chǎn)生的。
以下特點使PER.C6特別適用作生產(chǎn)重組蛋白的宿主1.充分定性的人體細胞系；2，按照GLP產(chǎn)生；3.可作為懸浮培養(yǎng)物在沒有任何人或動物衍生的蛋白質(zhì)的限定的無血清培養(yǎng)基中生長；4.適合在滾瓶，搖瓶，旋動瓶和生物反應器中生長，倍增時間大約35小時；5.存在E1A使在CMV增強子/啟動子的控制下的基因表達被正調(diào)節(jié)；6.存在E1B，防止依賴于p53的細胞程序死亡可能通過重組轉(zhuǎn)基因的過表達而增強。
在一實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述細胞與常規(guī)哺乳動物細胞系相比，能產(chǎn)生2-200倍的更多重組蛋白和/或蛋白質(zhì)物質(zhì)。優(yōu)選地，所述常規(guī)哺乳動物細胞選自CHO，COS，Vero，Hela，BHK和Sp-2細胞系。
在本發(fā)明的一方面，蛋白質(zhì)物質(zhì)或蛋白質(zhì)是單克隆抗體?？贵w或免疫球蛋白(Igs)是在體液免疫應答，結(jié)合抗原并滅活抗原，或觸發(fā)炎癥應答以消除抗原中起主要作用的血清蛋白?？贵w能高度特異性地與多種配體相互作用，包括腫瘤相關(guān)標記，病毒外殼蛋白，和淋巴細胞表面的糖蛋白。因此，它們是診斷和治療人體疾病的潛在的非常有用的制劑。重組單克隆和單鏈抗體技術(shù)展示了開發(fā)新的治療和診斷制劑的新前景。小鼠單克隆抗體在許多臨床試驗中已用作治療劑，以治療感染性疾病和癌癥。用小鼠單克隆抗體治療病人的第一篇報道發(fā)表于1980年(Nadler等，1980)。然而，使用這些制劑所觀測到的效果通常非常令人失望(參見Lowder等，1986；Mellstedt等，1991；Baldwin和Byers，1986)。傳統(tǒng)地，重組單克隆抗體(免疫球蛋白)是在B細胞雜交瘤中生產(chǎn)的。這種雜交瘤是通過將初始通過其特異性選擇的產(chǎn)生免疫球蛋白的B細胞，與小鼠骨髓瘤融合并從而無限增殖B細胞而產(chǎn)生的。無限增殖小鼠B細胞的原始方案產(chǎn)生于1975年(Kohier和Milstein)。然而，在這種雜交瘤中產(chǎn)生的免疫球蛋白有缺陷，即其來源于小鼠，導致低抗體特異性，低抗體親和性和嚴重的宿主抗小鼠抗體應答(HAMA，Shawler等，1985)。此HAMA應答可導致病人出現(xiàn)炎癥，發(fā)熱甚至死亡。小鼠抗體在人體內(nèi)親和性較低且與人抗體相比，原因不明地在人體循環(huán)中半衰期非常短，人抗體半衰期為21天(Frodin等，1990)，小鼠抗體半衰期為19-42小時。結(jié)合HAMA應答的嚴重性，促使開發(fā)另外的產(chǎn)生更多人或完全人化的免疫球蛋白的方案(參見Owens和Young1994，Sandu1992，Vaswani等，1998)。一個這種方案是用人免疫球蛋白的恒定區(qū)置換小鼠的相應部分，產(chǎn)生新的“嵌合”和“人化”抗體。由于HAMA應答主要由于恒定區(qū)所致，因此采取該方案(Oi等，1983；Morrison等，1984)。這種嵌合抗體例如是CAMPATH-1H(Reichmann等，1988)。用于治療非Hodgkin’sB細胞淋巴瘤的CAMPATH-1HAb，抗存在于所有淋巴細胞和單核細胞中，但不在其它類型細胞中的人抗原CAMPATH-1[CDw52]，(Hale等，1988；Isaacs等，1992)。其它例如是抗人CD20的Rituxan[Rituximab](Reff等，1994)，和用于血液凝血顯影中的抗人片段D二聚體產(chǎn)生的嵌合抗體，15C5(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。然而，由于這些新產(chǎn)生的嵌合抗體仍有部分是小鼠的，其在體內(nèi)可誘導免疫應答，盡管此應答沒有抗全部源自小鼠的HAMA應答嚴重。
在另一更復雜的方法中，抗體可變區(qū)中存在的但明顯不是識別抗原所必需的殘基，用更類人的氨基酸序列置換，產(chǎn)生第二代或高嵌合的抗體(Vaswani等，1998)。此方法熟知的例子是Herceptin(Carter等，1992)，其是一種95％是人的抗HER2(一種腫瘤特異性抗原)的抗體，并用于乳腺腫瘤的病人。
一種更優(yōu)選的代替小鼠重組免疫球蛋白的方式是導致人免疫球蛋白產(chǎn)生的方式。重要地，由于用試驗性生物制品免疫接種人體是不合乎規(guī)定的，因此不能繼之選擇特異的B細胞進行如小鼠B細胞所示的無限增殖化(Kohler和Milstein 1975)。盡管用病人的B細胞選擇抗癌抗原的特異抗體，但與小鼠抗體相比技術(shù)上更難于從人體物質(zhì)中制備人免疫球蛋白(Kohler和Milstein，1975)。通過使用表達人源可變區(qū)的噬菌體展示的抗體文庫，一種生產(chǎn)全部人抗體的重組方法成為可能(McCafferty等，1990；Clarkson等，1991；Barbas等，1991；Garrard等，1991；Winter等，1994；Burton和Barbas，1994)。這些可變區(qū)是通過它們對一些抗原的特異親和性選擇的，隨后與人免疫球蛋白的恒定區(qū)連接，產(chǎn)生人重組免疫球蛋白。這一方法例如是單鏈的Fv抗體17-1A(Riethmuller等，1994)，其被轉(zhuǎn)變成稱為UBS-54的完整人IgG1κ免疫球蛋白，抗腫瘤相關(guān)的EpCAM分子(Huls等，1999)。
產(chǎn)生重組免疫球蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)是多種多樣的。首先用于臨床試驗的小鼠免疫球蛋白是在其親代特異性B細胞中大量產(chǎn)生的，并融合于小鼠骨髓瘤細胞以無限增殖化。此系統(tǒng)的缺點是產(chǎn)生的免疫球蛋白全部源自小鼠，且在病人體內(nèi)產(chǎn)生明顯的免疫應答(HAMA應答，如上述)。部分人化的或人抗體缺少可無限增殖的親代B細胞，并因此不得不在其它系統(tǒng)如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或幼倉鼠腎(BHK)細胞中生產(chǎn)。也可使用一般適于免疫球蛋白生產(chǎn)的細胞，如腫瘤衍生的人或小鼠骨髓瘤細胞。然而，當與最初鑒別的無限增殖的B細胞中獲得的抗體產(chǎn)量相比時，在骨髓瘤細胞中獲得的抗體產(chǎn)量通常相對較低(±0.1μg/ml)，前者產(chǎn)生充足的小鼠免疫球蛋白(±10μg/ml，Sandu 1992)。
為解決這些及其它問題，正在開發(fā)不同的系統(tǒng)以生產(chǎn)較高產(chǎn)量的人化或人免疫球蛋白。
例如，近來研究表明可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠品系，其中小鼠IgG基因用人的相應部分置換(Bruggeman等，1991；Lonberg等，1994；Lonberg和Huszan，1995；Jacobovits，1995)。將含有人重鏈和輕(k)鏈免疫球蛋白(Ig)基因座的大片段的酵母人工染色體(YACs)，導入Ig失活的小鼠中，產(chǎn)生人抗體產(chǎn)物，其與在人體中所見的抗體在包括基因重排，裝配和所有組成成分方面十分相似(Mendez等，1997；Green等，1994)。類似地，F(xiàn)ishwild等(1996)已經(jīng)構(gòu)建人Ig轉(zhuǎn)基因，以隨后用常規(guī)的雜交瘤方法獲得人免疫球蛋白。此雜交瘤細胞分泌的人免疫球蛋白的性質(zhì)類似于在野生型小鼠中產(chǎn)生的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性，生長和分泌水平。產(chǎn)生自這種轉(zhuǎn)基因小鼠品系的重組抗體不攜帶非人氨基酸序列。
然而，這樣產(chǎn)生的人免疫球蛋白的缺點是其是在非人細胞中產(chǎn)生的，導致非人翻譯后修飾如糖基化和/或亞單位的折疊。所有抗體均在其恒定區(qū)的保守部位糖基化且碳水化合物的存在對抗原清除功能如補體激活是關(guān)鍵性的。附著的碳水化合物的結(jié)構(gòu)也可影響抗體活性。抗體糖基化可受產(chǎn)生其的細胞，抗體的構(gòu)象和細胞培養(yǎng)條件影響。例如，在小鼠細胞中產(chǎn)生的抗體攜帶含有Gal-α1-3Gal殘基的聚糖，其在人體細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中不存在(Borrebaeck等，1993；Borrebaeck，1999)。人體中存在非常高效價的抗Gal-α1-3Gal抗體(100μg/ml，Galili，1993)，導致在其聚糖中攜帶此殘基的(小鼠)蛋白質(zhì)迅速清除。
很快顯而易見的是為發(fā)揮作用，病人需長期用非常高劑量的重組免疫球蛋白治療。對不是在人體細胞中產(chǎn)生的人或人化的免疫球蛋白的翻譯后修飾，明顯影響這些抗體從血流中清除的速率。
現(xiàn)還不清楚為什么在CHO細胞中產(chǎn)生的免疫球蛋白也需要以非常高的劑量應用，因為Gal-α1-3Gal殘基在衍生自此細胞系的蛋白質(zhì)上的聚糖中并不存在(Rother和Sauinto，1996)。因此，除Gal-α1-3Gal殘基之外的其它翻譯后修飾，可能參與人體抗在這種CHO細胞中產(chǎn)生的完全人或人化的免疫球蛋白的特異免疫應答。
本領(lǐng)域因此教導可產(chǎn)生不具有小鼠衍生的蛋白質(zhì)序列的人化抗體。然而，目前產(chǎn)生的重組免疫球蛋白仍不同于其天然人相應物，如翻譯后修飾如糖基化和折疊。這可導致病人免疫系統(tǒng)激活，并導致可影響治療效果的非所需應答。因此，盡管研制出嵌合抗體，但目前的生產(chǎn)系統(tǒng)仍需最佳化，以產(chǎn)生完全人或人化的活性抗體。
因此明顯需要一種生產(chǎn)完全人抗體并以高于在人骨髓瘤細胞中觀測的產(chǎn)量生產(chǎn)的方法。
因此提供一種人體細胞，其產(chǎn)生類似翻譯后和翻譯期間加工例如但非限于糖基化的人類型蛋白質(zhì)，這對本領(lǐng)域來講是一大進展。另外，提供一種生產(chǎn)重組哺乳動物細胞，及從此重組哺乳動物細胞中大規(guī)模生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，也是有益的。
本發(fā)明因而進一步提供了一種在重組哺乳動物細胞中生產(chǎn)免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)的方法，包括提供一種哺乳動物細胞，該細胞在其基因組中包含編碼腺病毒的至少一種無限增殖的E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物和/或其片段的核酸，并進一步另外還包含編碼所述免疫球蛋白的第二種核酸，將所述細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從所述細胞和/或培養(yǎng)基中收獲至少一種單克隆抗體。
在此之前，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)以可再生及可大規(guī)模生產(chǎn)方式適于生產(chǎn)免疫球蛋白的人體細胞。本發(fā)明的細胞包含至少一種無限增殖化腺病毒E1蛋白，并能相對不依賴于外源生長因子而生長。
另外，這些細胞能大量生產(chǎn)免疫球蛋白，并能正確加工產(chǎn)生的免疫球蛋白。已用于生產(chǎn)免疫球蛋白的細胞是腫瘤衍生的這一事實，增加了使用這些特殊細胞系的額外危險性，并使分離免疫球蛋白的步驟非常嚴格，以避免在任何制備物中有轉(zhuǎn)化活性或致瘤性物質(zhì)。因此優(yōu)選使用本發(fā)明的方法，其中所述細胞衍生自原代細胞。為能無限地生長，原代細胞需要無限增殖化，這在本發(fā)明中已通過導入腺病毒E1蛋白而達到。為通過細胞培養(yǎng)而大規(guī)模(持續(xù))生產(chǎn)免疫球蛋白，優(yōu)選細胞能不需貼壁而生長。本發(fā)明的細胞具有此能力。當細胞在其基因組中包含編碼E2A(或其功能性衍生物或類似物或片段)的腺病毒衍生的序列時，非依賴貼壁的細胞生長能力得以改善。在一優(yōu)選的實施方案中，E2A編碼序列編碼溫度敏感性的突變體E2A，如ts125。另外，所述細胞還可包含一種核酸(如編碼tTa的核酸)，當其置于啟動子的控制下(如Teto啟動子)時，可調(diào)節(jié)相應基因的表達。核酸可編碼免疫球蛋白的重鏈，輕鏈和/或可變輕鏈?；蛘撸环N分離的或獨立的核酸可編碼Ig(或其功能性衍生物，同源物和/或其片段)的一或多個可變區(qū)，作為第一種核酸(如上述)的相應物。本文所述的一或多種核酸可編碼ScFv并可以是人或人化的。本發(fā)明的核酸優(yōu)選置于可誘導的啟動子(或其功能性衍生物)的控制下。
為獲得從中易于分離所需免疫球蛋白的潔凈且安全的生產(chǎn)系統(tǒng)，優(yōu)選使用本發(fā)明方法，其中所述人體細胞不包括其它腺病毒序列。本發(fā)明的方法最優(yōu)選的細胞是ECACC保藏號96022940的PER.C6或其衍生物。已發(fā)現(xiàn)PER.C6與例如通過腺病毒E1區(qū)而無限增殖化的轉(zhuǎn)化的人293細胞相比更穩(wěn)定，尤其更易使用。PER.C6細胞已精確定性并證實，表明具有良好的大規(guī)模生產(chǎn)，在懸浮液中生長及非依賴于生長因子等特點。另外，PER.C6可以高度可再生方式摻入懸浮液中，使其更適于大規(guī)模生產(chǎn)。為此，已確定PER.C6細胞系在生物反應器中可生長至非常高的密度。
本發(fā)明的細胞，尤其PER.C6，具有可在無動物或人血清，或動物或人血清組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的優(yōu)點。因此，分離單克隆抗體很簡單，且由于培養(yǎng)基中沒有另外的人或動物蛋白從而安全性增加。沒有血清存在還提高系統(tǒng)的可靠性，因為使用本發(fā)明的合成培養(yǎng)基增強了再生性。本發(fā)明還提供了重組哺乳動物細胞在生產(chǎn)免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)中的應用，所述細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種應用，其中所述細胞衍生自原代細胞，優(yōu)選其中所述人體細胞是PER.C6細胞或其衍生物。
本發(fā)明還提供了一種應用，其中所述細胞在其基因組中還包含編碼E2A(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，優(yōu)選E2A是溫度敏感性的。另外，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的方法，其中所述細胞還包含反式激活蛋白以誘導所述可誘導的啟動子。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明所得的免疫球蛋白。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種人體細胞，該細胞在其基因組中具有編碼腺病毒E1蛋白(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白，并具有編碼人重組蛋白的基因，優(yōu)選人體細胞衍生自保藏在ECACC中保藏號No.96022940的PER.C6。
在又一實施方案中，本發(fā)明提供了這樣一種人體細胞，PER.C6/E2A，其在基因組中還包含編碼E2A(或其功能性衍生物或類似物或片段)的序列，優(yōu)選其中所述E2A是溫度敏感性的。欲在本發(fā)明的細胞中表達的免疫球蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。重組免疫球蛋白例如包括但非限于Herceptin，Rituxan(Rituximab)，CAMPATH-1H和15C5。
本發(fā)明還提供了在重組哺乳動物細胞中生產(chǎn)至少一個免疫球蛋白可變區(qū)的方法，其利用本發(fā)明的無限增殖的重組哺乳動物細胞，在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從重組哺乳動物細胞和/或培養(yǎng)基中收獲所選擇的Ig的至少一個可變區(qū)。免疫球蛋白，免疫球蛋白的可變區(qū)，或其衍生物，可用于治療哺乳動物或生產(chǎn)藥物組合物。
本發(fā)明另一方面提供了生產(chǎn)非腺病毒或腺病毒蛋白的用作疫苗的病毒蛋白的方法，包括提供一種細胞，其具有編碼腺病毒的E1基因或其功能性衍生物的至少一個基因產(chǎn)物的至少一個序列，提供給所述細胞以編碼所述病毒蛋白的核酸，將所述細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使所述病毒蛋白表達，并從所述培養(yǎng)基和/或所述細胞中收集病毒蛋白。直至本發(fā)明，很少發(fā)現(xiàn)(人體)細胞適于以任何可再生及可大規(guī)模生產(chǎn)方式和/或足夠高的產(chǎn)量和/或易純化方式，生產(chǎn)用作疫苗的病毒蛋白。我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)優(yōu)選在其基因組中包含腺病毒E1序列的細胞能大量生產(chǎn)病毒蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選的細胞衍生自人體原代細胞，優(yōu)選細胞通過所述E1基因的產(chǎn)物而無限增殖。為了能生長，原代細胞當然需要無限增殖化。這種細胞例如是衍生自人胚胎成視網(wǎng)膜細胞的細胞。
本發(fā)明的細胞中重要的是在細胞周期期間，E1基因序列不喪失。因此優(yōu)選編碼E1基因的至少一個基因產(chǎn)物的所述序列存在于所述(人體)細胞的基因組中?？紤]到安全原因，在本發(fā)明的細胞中最好避免有非所需的腺病毒序列。因此本發(fā)明的另一實施方案提供了不產(chǎn)生腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細胞。然而，為通過細胞培養(yǎng)大規(guī)模(持續(xù))生產(chǎn)病毒蛋白，優(yōu)選使細胞能不需貼壁而生長。本發(fā)明的細胞具有此能力。為獲得從中易于回收及如果需要純化病毒蛋白的潔凈及安全的生產(chǎn)系統(tǒng)，優(yōu)選使用本發(fā)明的方法，其中所述人體細胞不包含其它腺病毒序列。本發(fā)明使用的優(yōu)選的細胞是在ECACC中保藏號No.96022940的PER.C6，或其衍生物。
因此，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明細胞的方法，其中所述細胞還包含編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或片段的序列，優(yōu)選細胞中所述編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或片段的序列，存在于所述人體細胞的基因組中，更優(yōu)選的是細胞中所述E2A編碼序列編碼溫度敏感性突變體E2A。另外，本發(fā)明還提供了一種方法，其中所述(人體)細胞能在懸浮液中生長。
本發(fā)明還提供了一種方法，其中所述人體細胞能在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的細胞，尤其PER.C6所具有的另一優(yōu)點是，其可在無血清或血清組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因此，分離是容易的，安全性增加且此系統(tǒng)的可靠性良好(合成培養(yǎng)基是再現(xiàn)性最好的)。本發(fā)明的人體細胞，尤其那些基于原代細胞和HER細胞的細胞，能正常翻譯后及翻譯期間修飾及裝配。這意味著它們非常適用于制備用于疫苗中的病毒蛋白。
因此本發(fā)明提供了一種方法，其中所述病毒蛋白包含一種經(jīng)過翻譯后和/或翻譯期間修飾的蛋白質(zhì)，尤其其中所述修飾包含糖基化。此疫苗可用于接種人體，然而此疫苗在動物體內(nèi)也有效。在此實施方案中，疫苗優(yōu)選是根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的，其中衍生所述細胞的物種與衍生疫苗中病毒蛋白的物種相同。病毒蛋白可以是完整病毒蛋白或其功能性等價物。病毒蛋白的功能等價物是病毒蛋白的至少一個免疫原部分。迄今無法以任何可靠方式生產(chǎn)的病毒疫苗例如是流感疫苗。本發(fā)明提供了一種方法，其中所述病毒蛋白包含至少流感病毒神經(jīng)氨酸酶和/或血凝素之一。可根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的其它病毒蛋白(亞單位)包括來自如下病毒的蛋白，如腸道病毒如鼻病毒，口蹄疫病毒，或脊髓灰質(zhì)炎病毒，皰疹病毒，如單純皰疹病毒，假狂犬病病毒或牛皰疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，如人免疫缺陷病毒或細小病毒或乳多空病毒，輪狀病毒或冠狀病毒，如傳染性胃腸炎病毒或黃病毒，如壁虱腦炎病毒或黃熱病病毒，披膜病毒，如風疹病毒或東方、西方或委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒，肝炎病毒，如甲型或乙型肝炎病毒，瘟病毒屬，如豬瘟病毒，或彈狀病毒，如狂犬病毒。本發(fā)明還提供了一種人體細胞在生產(chǎn)用于疫苗的至少一種病毒蛋白中的應用，該細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一個E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒。當然，對于這種應用，本發(fā)明方法中優(yōu)選使用的細胞也是優(yōu)選的。本發(fā)明還提供了得自本發(fā)明方法的產(chǎn)物，尤其根據(jù)本發(fā)明獲得的病毒蛋白，特別是與適當?shù)馁x形劑和一些形式(亞單位)的佐劑組成藥物組合物。如果從已注冊的疫苗中不能得出，施用的劑量和途徑通過正常臨床測試而加以區(qū)分。
因此，本發(fā)明還提供了一種用于疫苗中的病毒蛋白，所述病毒蛋白沒有任何非人哺乳動物蛋白質(zhì)物質(zhì)，本發(fā)明還提供了包含這種病毒蛋白的藥物配方。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法或應用獲得的流感疫苗。
本發(fā)明另一方面提供了具有抗細胞程序死亡活性的腺病毒E1B蛋白或其功能性衍生物，同源物和/或片段在真核細胞中增加蛋白質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)生中的應用，所述應用包括提供所述E1B蛋白，其衍生物，同源物和/或片段給所述真核細胞。在一優(yōu)選的實施方案中，所述應用包括本發(fā)明的細胞。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明還提供了所述應用在本發(fā)明方法和/或應用中的應用。
實施例為舉例說明本發(fā)明而提供了以下實施例，無限制本發(fā)明之意。人紅細胞生成素(EPO)分子含有4個碳水化合物鏈，其中3個含有與天冬酰胺的N鍵，一個含有與絲氨酸殘基的O鍵。糖基化在EPO的生物活性中的重要性已充分證實(Delorme等，1992；Yamaguchi等，1991)。將編碼人EPO的cDNA克隆入PER.C6細胞和PER.C6/E2A細胞中并在其中表達，顯示表達，并分析糖基化模式。
實施例1構(gòu)建基本表達載體將質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)用NruI和EcoRV消化，在5’末端通過蝦堿性磷酸酶(SAP，GIBCOLifeTech.)去磷酸化，并從凝膠中純化出缺失巨細胞病毒CMV的立即早期增強子和啟動子的質(zhì)粒片段。將含有全長CMV增強子/啟動子(-735～+95)及產(chǎn)生重組腺病毒的重疊腺病毒衍生序列的質(zhì)粒pAdApt，用AvrII消化，用Klenow聚合酶補平，并用HpaI消化；從瓊脂糖凝膠中純化含有CMV增強子和啟動子的片段。將此CMV增強子和啟動子片段平端對平端地連接于pcDNA3.1/Hygro(-)的NruI/EcoRV片段。所得質(zhì)粒稱為pcDNA2000/Hyg(-)。
將質(zhì)粒pcDNA2000/Hyg(-)用PmlI消化，并從凝膠中純化出缺失潮霉素抗性標記基因的線性化質(zhì)粒，并再連接。所得質(zhì)粒稱為pcDNA2000。將質(zhì)粒pcDNA2000用PmlI消化并通過SAP在兩端去磷酸化。將含有野生型人DHFR cDNA的質(zhì)粒pIG-GC9(Havenga等，1998)，通過聚合酶鏈反應(PCR)在cDNA上游和下游導入非編碼的PmlI位點，而獲得野生型DHFR基因。所用PCR引物是DHFR上游5’GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATG GTT GGTTCG CTA AAC TG-3′，和DHFR下游5’GAT CCA CGT GAG ATCTTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3′。將PCR產(chǎn)物用PmlI消化并連接于pcDNA2000(用PmlI消化并用SAP去磷酸化)中，以獲得pcDNA2000/DHFRwt(圖1)。野生型序列和正確使用的克隆位點通過雙鏈測序證實。另外，人DHFR基因的突變體(DHFRm)，通過選擇在具有高轉(zhuǎn)錄活性的基因組區(qū)域可能整合的轉(zhuǎn)基因，用于在PER.C6和PER.C6/E2A細胞中達到10,000倍高的氨甲喋呤抗性。此突變體含有通過PCR導入的32位(苯丙氨酸取代為絲氨酸)和159位(亮氨酸取代為丙氨酸)氨基酸取代。對質(zhì)粒pIG-GC12(Havenga等，1998)進行PCR用于獲得人DHFR的突變體。此突變體的克隆與野生型DHFR克隆相似。用突變體DHFR所獲質(zhì)粒稱為pcDNA2000/DHFRm。
將pIPspAdapt 6(Galapgos)用限制酶AgeI和BamHI消化。所得多接頭片段具有以下序列5’-ACC GGTGAA TTC GGC GCGCCG TCG ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCGGCC GCA ATT CGC TAG CGT TAA CGG ATC C-3′。劃線處為所用的AgeI和BamHI識別位點。此片段含有一些單一限制酶識別位點，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化及連接于AgeI/BamHI消化的并經(jīng)瓊脂糖凝膠純化的質(zhì)粒pcDNA2000/DHFRwt質(zhì)粒。所得載體稱為pcDNA2001/DHFRwt(圖2)。
pIPspAdapt 7(Galapgos)用AgeI和BamHI限制酶消化，并具有以下序列5’-ACC GGTGAA TTG CGG CCG CTC GCG AACGCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AATTCG CTA GCG TTA ACG GAT CC-3′。下劃線處是所用的AgeI和BamHI識別位點。此多接頭片段含有一些單一限制酶識別位點(不同于pIPspAdapt 6)，其純化自瓊脂糖凝膠，并連接于AgeI/BamHI消化的及經(jīng)瓊脂糖凝膠純化的pcDNA2000/DHFRwt。獲得pcDNA2002/DHFRwt(圖3)。
將pcDNA2000/DHFRwt用限制酶PvuII部分消化。在此質(zhì)粒中有兩個PvuII位點，在SV40 poly(A)和CoLEl之間的位點而非在BGH poly(A)下游的PvuII位點進行克隆。將質(zhì)粒的單位點消化的混合物用SAP去磷酸化，并用Klenow酶平端化及自瓊脂糖凝膠中純化。將pcDNA2001/DHFRwt用MunI和PvuII限制酶消化，及用Klenow酶和游離核苷酸補平，使兩端均為平端。將所得含有CMV啟動子-接頭-BGH poly(A)的片段從凝膠中分離，并與載體分離。將此片段連接于部分消化及去磷酸化的載體，檢測方向及插入位點。所得質(zhì)粒稱為pcDNAs3000/DHFRwt(圖4)。
實施例2構(gòu)建EPO表達載體在成年人肝臟cDNA文庫中使用寡核苷酸引物EPO-START5’AAA AAG GAT CCG CCA CCA TGC GGG TGC ACG AAT GTCCTG CCT G-3′，和EPO-STOP5’AAA AAG GAT CCT CAT CTGTCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3′(CambridgeBioscience公司)，通過PCR克隆全長人EPOcDNA。將擴增的片段克隆入用BamHI線性化的pUC18中。通過雙鏈測序法檢測序列。將含有在pUC18中的EPO cDNA的此質(zhì)粒用BamHI消化，并將EPO插入序列自瓊脂糖凝膠中純化。質(zhì)粒pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm用BamHI線性化，并通過SAP在5’突出端去磷酸化，并將質(zhì)粒從瓊脂糖凝膠中純化。將EPOcDNA片段連接于pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm的BamHI位點；所得質(zhì)粒稱為pEPO2000/DHFRwt(圖5)和pEPO2000/DHFRm。
質(zhì)粒pMLPI.TK(如WO97/00326所述)是設(shè)計與改良的包裝細胞系如PER.C6(如WO97/00326和US 08/892 873所述)組合使用的銜接子質(zhì)粒的一實例。首先，用以下引物從pZipΔMo+PyF101(N-)模板DNA(見于PCT/NL96/00195所述)中產(chǎn)生PCR片段LTR-1(5’-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CATGGA AAA ATA CAT AAC TG-3′)和LTR-2(5’-GCG GAT CCTTCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGGGCG ACT CAG TCA ATCG-3′)。然后將PCR產(chǎn)物用BamHI消化，并連接于用Pvu II和BamHI消化的pMLP10(Levrero等，1991)中，從而產(chǎn)生載體pLTR10。此載體含有腺病毒1-454bp序列，后接由Mo-MuLV的一部分組成的啟動子，其野生型增強子由多瘤病毒突變體(PyF101)的增強子所取代。此啟動子片段稱為L420。接著，插入小鼠H SA基因的編碼區(qū)。將p LTR10用BstBI消化隨后通過Klenow處理及用NcoI消化。用以下引物在pUC18-H SA(Kay等，1990)上進行PCR擴增而獲得HSA基因HSA1(5’-GCG CCA CCATGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3’)和HSA2(5’-GTT AGATCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATGTAG AA-3′)。將269bp的PCR片段用NcoI和Bgl II位點亞克隆入穿梭載體中。測序分析證實摻入正確的HSA基因編碼序列，但在TAG終止密碼子之后有額外的TAG插入體。包括TAG重復的HSA基因的編碼區(qū)然后用NcoI/SalI酶切為片段，并克隆入經(jīng)NcoI/BstBI酶切的3.5kb的p LTR 10中，產(chǎn)生p LTR-HSA10。將此質(zhì)粒用EcoRI和BamHI消化，之后將含有剩余的ITR，包裝信號，L420啟動子和HSA基因的片段插入用相同酶消化的載體pMLPI.TK中，從而置換啟動子和基因序列，產(chǎn)生新的銜接子質(zhì)粒pAd5/L420-HSA。
將pAd5/L420-HSA質(zhì)粒用Avr II和Bgl II消化，隨后用Klenow處理，并連接于平端的1570bp的pcDNA1/amp[Invitrogen]的片段中，該片段是通過用HhaI和AvrII消化，隨后用T4 DNA聚合酶處理而獲得的。此銜接子質(zhì)粒稱為pAd5/CLIP。
為能從剩余的ITR中除去載體序列，將pAd5/L420-HSA用EcoRI部分消化，并分離線性化的片段。將序列為5’-TTA AGTCGA C-3′的寡聚物自身退火，產(chǎn)生具有SalI位點和EcoRI突出端的接頭。將此接頭連接于部分消化的pAd5/L420-HSA載體，并選擇這樣的克隆，該克隆中接頭插入pAd5/L420-HSA中剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位點中，產(chǎn)生pAd5/L420-HSA.sal。
為能從剩余的ITR中除去載體序列，將pAd5/CLIP也用EcoRI部分消化，并分離線性化的片段。將EcoRI接頭5’-TTA AGT CGAC-3′連接于部分消化的pAd5/CLIP載體，并選擇這樣的克隆，該克隆中接頭插入剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位點中，產(chǎn)生pAd5/CLIP.sal。對載體pAd5/L420-HSA也進行修飾以產(chǎn)生位于剩余的ITR上游的PacI位點。之后，將pAd5/L420-HSA用EcoRI消化，并連接于PacI接頭(5’-AAT TGT CTT AAT TAA CCG CTTAA-3’)。將此連接混合物用PacI消化，并在瓊脂糖凝膠中分離線性化DNA以除去串聯(lián)的接頭之后再連接。由此產(chǎn)生銜接子質(zhì)粒pAd5/I420-HSA.pac。
將此質(zhì)粒用AvrII和Bgl II消化。將此載體片段與用相同限制酶消化的接頭寡核苷酸連接。此接頭是通過退火以下序列的寡聚物而產(chǎn)生的PLL-1(5’-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACCGGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GATCTG G-3′)和PLL-2(5’-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATCCGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAGGGA TGG C-3’)。將退火的接頭分別連接于Avr II/Bgl II消化的pAd5/L420-HSA.pac片段，產(chǎn)生pAdMire.pac。隨后，將含有sal接頭的0.7kb的pAd5/CLIP.sal的ScaI/BsrGI片段，在除去含有pal接頭的片段之后，克隆入pAdMire.pac質(zhì)粒的ScaI/BsrGI位點中。所得質(zhì)粒稱為pAdMire.sal。
將質(zhì)粒pAd5/L420-HSA.pac用AvrII消化，并將5’突出端用Klenow酶補平。用HindIII的第二次消化除去L420啟動子序列。分離載體片段并分別連接于含有CMV啟動子序列的PCR片段中。此PCR片段是用以下引物從pCMVLacI(Stratagene)中擴增CMV序列之后而獲得的CMVplus(5’-GAT CGG TAC CAC TGC AGTGGT CAA TAT TGG CCA TTA GCC-3’)和CMVminA(5’-GATCAA GC TTC CAA TGC ACC GTT CCC GGC-3’)。將此PCR片段首先用PstI消化，然后通過T4 DNA聚合酶處理除去3’突出端。接著將此DNA用Hind III消化并連接于經(jīng)Avr II/Hind III消化的pAd5/L420-HAS.pac載體中。所得質(zhì)粒稱為pAd5/CMV-HAS.pac。將此質(zhì)粒隨后用Hind III和BamHI消化，分離載體片段并連接于經(jīng)Hind III/Bgl II消化后的pAdMire.pac的多接頭序列中。所得質(zhì)粒稱為pAdApt.pac，并含有人CMV啟動子/增強子(BoshartM等，1985)的-735～+95位核苷酸。將含有用于正確翻譯的完全Kozak序列的全長人EPOc DNA(Genbank登記號M11319)，在經(jīng)BamHI消化后從pUC18主鏈中取出。將此cDNA插入體經(jīng)瓊脂糖凝膠純化并連接于pAdApt.pac中，該pAdApt.pac也用BamHI消化，接著在5’和3’插入位點用SAP去磷酸化，并也經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，以除去短BamHI-BamHI接頭序列。將所得環(huán)狀質(zhì)粒用KpnI，DdeI和NcoI限制消化檢測，均示出正確條帶。另外，通過雙鏈測序法確定方向和序列。所得具有正確方向的人EPOc DNA的質(zhì)粒稱為pAdApt.EPO(圖6)。
實施例3構(gòu)建UBS-54表達載體包含內(nèi)含子序列和連接(“鉸鏈”)區(qū)的人免疫球蛋白G1(IgG1)基因的重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)，是用上游和下游引物通過PCR產(chǎn)生的。上游引物(CAMH-UP)序列是5’-GAT CGA TATCGC TAGCAC CAA GGG CCCATC GGT C-3′，其中退火核苷酸以斜體字表示，兩個相接的限制酶識別位點(EcoRV和NheI)是下劃線處。
下游引物(CAMH-DOWN)的序列是5’-GAT CGT TTAAACTCA TTT ACC CGG AGA CAG-3’，其中退火核苷酸以斜體字表示，導入的PmeI限制酶識別位點是劃線處。
人IgG1重鏈的各區(qū)域如下排列CH1-內(nèi)含子-鉸鏈-內(nèi)含子-CH2-內(nèi)含子-CH3。在質(zhì)粒(pCMgamma NEO Skappa VgammaCgamma hu)上進行PCR，所述質(zhì)粒含有抗人血纖蛋白原的D二聚體(Vandamme等，1990)的人化抗體的重鏈。此抗體稱為15C5，且其人化是通過導入包括內(nèi)含子序列的人恒定區(qū)而進行的(Bulens等，1991)。
PCR產(chǎn)生1621個核苷酸的產(chǎn)物。導入NheI和PmeI位點以易于克隆入pcDNA2000/Hyg(-)多接頭中。NheI位點編碼二個氨基酸(Ala和Ser)，其是恒定區(qū)CH1的一部分，但不與模板中存在的DNA雜交(Crowe等，1992)。
將PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并連接于經(jīng)NheI和PmeI消化及瓊脂糖凝膠純化的pcDNA2000/Hygro(-)中。產(chǎn)生質(zhì)粒pHC2000/Hyg(-)(圖7)，其可用于將包括內(nèi)含子的人重鏈恒定區(qū)連接于任何鑒別的免疫球蛋白重鏈的任何可能的可變區(qū)，以進行人化。
人免疫球蛋白(IgG1)基因的輕鏈恒定區(qū)，是用上游和下游引物通過PCR產(chǎn)生的。上游引物(CAML-UP)的序列是5’-GAT CCGTAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3′，其中退火核苷酸以斜字體表示，導入的SunI限制酶識別位點是下劃線處。下游引物(CAML-DOWN)的序列是5’-GAT CGT TTA AACCTA ACA CTC TCCCCT GTT G-3’，其中退火核苷酸以斜字體表示，導入的PmeI限制酶識別位點是下劃線處。在質(zhì)粒(pCMkappa DHFR13 15C5 kappa人化的)上進行PCR，該質(zhì)粒攜帶連接于人IgG1輕鏈恒定區(qū)的15C5小鼠信號序列和小鼠輕鏈可變區(qū)(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。
PCR產(chǎn)生340個核苷酸的產(chǎn)物。導入SunI和PmeI位點以克隆入pcDNA2001/DHFRwt多接頭。SunI位點編碼兩個氨基酸(Arg和Thr)，其蘇氨酸殘基是人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的一部分，而精氨酸是CAMPATH-1H(Crowe等，1992)的可變區(qū)的一部分。這使得隨后可進行3’克隆入質(zhì)粒唯一的SunI位點。將PCR產(chǎn)物用SunI和PmeI限制酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，連接于經(jīng)BamHI，PmeI消化的及瓊脂糖凝膠純化的用Klenow酶和游離核苷酸平端化的pcDNA2001/DHFRwt中。正確方向的連接導致在5’端喪失BamHI位點，及保留SunI和PmeI位點。所得質(zhì)粒稱為pLC2001/DHFRwt(圖8)，該質(zhì)?？捎糜趯⑷溯p鏈恒定區(qū)連接于任何鑒別的免疫球蛋白輕鏈的任何可能的可變區(qū)以人化。
pNUT-C gamma(Huls等，1999)含有人IgG1重鏈恒定區(qū)，內(nèi)含子和絞鏈區(qū)(Huls等，1999)，并在第一個恒定區(qū)上游接受由以下前導肽序列為先導的完全人化的單克隆抗體UBS-54的γ鏈可變區(qū)，所述前導肽序列為MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列5’-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATCTCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3′)。所產(chǎn)生的插入體長度大約為2kb。完整的γ鏈是用上游引物(UBS-UP)和下游引物CAMH-DOWN通過PCR擴增的。UBS-UP的序列為5′-GAT CAC GCGTGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3′其中導入的MluI和NheI位點是下劃線處，完全的Kozak序列是斜體字處。將所得PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化并連接于pcDNA2000/Hygro(-)質(zhì)粒，該質(zhì)粒也是用NheI和PmeI消化，用tSAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化的。所得質(zhì)粒稱為pUBS-Heavy2000/Hyg(-)(圖9)。pNUT-C kappa含有人IgG1 kappa(Huls等，1999)輕鏈恒定區(qū)，及接受由以下前導肽為先導的完全人化的單克隆抗體UBS-54kappa鏈的可變區(qū)，所述前導肽為MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列5’-ATG GCA TGC CCT GGCTTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTTTCC ATG-3’，關(guān)于此質(zhì)粒的詳述見UbiSys所述)。產(chǎn)生的插入體長度大約為1.2kb。完整的插入體是用上游引物UBS-UP和下游引物CAML-DOWN通過PCR擴增的，以此修飾翻譯起始位點。將所得PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并連接于pcDNA2001/DHFRwt中，產(chǎn)生pUBS-Light2001/DHFRwt(圖10)，pcDNA2001/DHFRwt也是用NheI和PmeI消化的，用tSAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化的。為除去位于pNUT-Cgamma中可變區(qū)和第一個恒定區(qū)之間的額外內(nèi)含子，及將信號肽和可變區(qū)與野生型人IgG1重鏈恒定區(qū)連接，缺失pNUT-Cgamma中羧基末端恒定區(qū)中的許多多態(tài)性，用UBS-UP和具有以下序列的UBSHV-DOWN引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物5’-GAT CGC TAG CTG TCG AGA CGG TGACCA G-3′，其中導入的NheI位點是下劃線處，退火核苷酸以斜體字表示。所得PCR產(chǎn)物用NheI限制酶消化，經(jīng)凝膠純化并連接于經(jīng)NheI消化和SAP去磷酸化的，及經(jīng)凝膠純化的pHC2000/Hyg(-)質(zhì)粒中。具有正確方向的插入體和開放讀框稱的該質(zhì)粒為pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)(圖11)。
為除去位于pNUT-Ckappa中可變區(qū)和恒定區(qū)之間的額外內(nèi)含子，及將信號肽和可變區(qū)連接于人IgG1輕鏈的野生型恒定區(qū)，用UBS-UP和具有以下序列的UBSLV-DOWN引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物5’-GAT CCG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC-3′，其中導入的SunI位點是下劃線處，退火核苷酸是黑體字處。然后將所得PCR產(chǎn)物用MluI和SunI限制酶消化，經(jīng)凝膠純化，并連接于經(jīng)MluI和SunI消化的，經(jīng)凝膠純化的pLC2001/DHFRwt質(zhì)粒中。所得質(zhì)粒稱為pUBS2-Light2001/DHFRwt(圖12)。UBS-54的全長重鏈的PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，并用Klenow酶平端化。將此片段連接于質(zhì)粒pcDNAS3000/DHFRwt中，該質(zhì)粒用BstXI限制酶消化，平端化，通過SAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化。具有重鏈插入體的質(zhì)粒稱為pUBS-Heavy3000/DHFRwt。接著，將輕鏈的PCR產(chǎn)物用MluI和PmeI限制酶消化，平端化，經(jīng)凝膠純化，并連接于pUBS-Heavy3000/DHFRwt中，該質(zhì)粒用HpaI消化，通過tSAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化。所得載體稱為pUBS-3000/DHFRwt(圖13)。將編碼不含可變區(qū)和第一個恒定區(qū)之間的內(nèi)含子，但具有野生型羧基端恒定區(qū)的UBS-54的重鏈的基因(2031個核苷酸)，在用EcoRI和PmeI消化pUBS2-2000/Hyg(-)，及用Klenow酶和游離核苷酸平端化EcoRI位點之后，經(jīng)凝膠純化。接著，將該插入體連接于pcDNAs3000/DHFRwt質(zhì)粒，該質(zhì)粒用BstXI消化，平端化，用SAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化。所得質(zhì)粒稱為pUBS2-Heavy3000/DHFRwt。然后將pUBS2-Light2001/DHFRwt用EcoRV和PmeI消化，并將含有信號肽以及相連接的UBS-54的Kappa鏈的可變區(qū)和沒有內(nèi)含子序列的人IgG1Kappa鏈的恒定區(qū)的755個核苷酸插入體經(jīng)凝膠純化，并連接于pUBS2-Heavy3000/DHFRwt中，該質(zhì)粒用HpaI消化，用tSAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化。所得質(zhì)粒稱為pUBS2-3000/DHFRwt(圖14)。
將質(zhì)粒pRc/CMV[Invitrogen]用BstBI限制酶消化，用Klenow酶平端化，接著用XmaI酶消化。將含有新霉素抗性基因的此片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并連接于pUBS-Light2001/DHFRwt質(zhì)粒，該質(zhì)粒用XmaI和PmlI限制酶消化，隨后用SAP去磷酸化并經(jīng)凝膠純化以除去DHFRcDNA。所得質(zhì)粒稱為pUBS-Light2001/Neo。將此片段也連接于經(jīng)XmaI/PmlI消化及凝膠純化的pcDNA2001/DHFRwt質(zhì)粒，產(chǎn)生pcDNA2001/Neo。將UBS-54可變區(qū)的PCR產(chǎn)物和消化及純化的恒定區(qū)PCR產(chǎn)物用于與MluI/PmeI消化的pcDNA2001/Neo三點連接。所得質(zhì)粒稱為pUBS2-Light2001/Neo。
實施例4構(gòu)建CAMPATH-1H表達載體Cambridge生物科學公司(英國)生產(chǎn)了一種396個核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接公布的CAMPATH-1H輕鏈的信號序列和可變區(qū)(Crowe等，1992)。此片段在5’末端含有導入的和單一的Hind III位點，在3’末端含有導入的和單一的SunI位點，將此片段導入適當?shù)拇┧筝d體中。將此質(zhì)粒用Hind III和SunI消化，并將所得CAMPATH-1H輕鏈片段經(jīng)凝膠純化，并連接于經(jīng)Hind III/SunI消化和瓊脂糖凝膠純化的pLC2001/DHFRwt中。所得質(zhì)粒稱為pCAMPATH-Light2001/DHFRwt。Cambridge生物科學公司(英國)生產(chǎn)了一種438個核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接CAMPATH-1H重鏈可變區(qū)的信號序列和公布的可變區(qū)(Crowe等，1992)，將此片段克隆入適當?shù)目寺≥d體中。此產(chǎn)物在5’末端含有單一的Hind III限制酶識別位點，在3’末端含有單一的NheI限制酶識別位點。此質(zhì)粒用Hind III和NheI消化，所得CAMPATH-1H重鏈片段經(jīng)凝膠純化，并連接于純化的及經(jīng)Hind III/NheI消化的pHC2000/Hyg(-)中。所得質(zhì)粒稱為pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(-)。
實施例5；構(gòu)建15C5表達載體抗人血纖蛋白片段D二聚體的人化形式的單克隆抗體15C5的重鏈(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由包含內(nèi)含子序列的人恒定區(qū)，絞鏈區(qū)和可變區(qū)及前導的來自15C5kappa輕鏈的信號肽組成，其是用質(zhì)?！皃CMgamma NEO Skappa Vgamma Cgammahu”作模板用CAMH-DOWN作下游引物，和15C5-UP作上游引物，通過PCR而擴增。15C5-UP引物具有以下序列5’-GA TCA CGCGTG CTA GCC ACC ATG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGAATC-3′，其中導入的MluI和NheI限制酶識別位點是下劃線處，完整的Kozak序列是斜體字處。為適當?shù)膶牒线m的Kozak結(jié)構(gòu)，在+4位的腺嘌呤(ATG起始密碼子中腺嘌呤是+1位)用鳥嘌呤置換，導致精氨酸突變?yōu)楦拾彼?。為防止引物二聚體化，將+6位的鳥嘌呤用胸腺嘧啶置換，+9位的胞嘧啶用胸腺嘧啶置換。后一種突變中蘇氨酸殘基保持原樣。所得PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，經(jīng)凝膠純化并連接于經(jīng)NheI和PmeI消化的，及通過SAP去磷酸化和凝膠純化的pcDNA2000/Hygro(-)中。所得質(zhì)粒稱為p15C5-Heavy2000/Hyg(-)?？谷搜w蛋白片段D二聚體的人化形式單克隆抗體15C5的輕鏈(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由人恒定區(qū)和可變區(qū)以及前導的20個氨基酸的信號肽組成，將其用質(zhì)粒pCMkappaDHFR1315C5 kappahu作模板，用CAML-DOWN作下游引物，15C5-UP作上游引物，通過PCR擴增。所得PCR產(chǎn)物用NheI和PmeI限制酶消化，經(jīng)凝膠純化并連接于經(jīng)NheI和PmeI消化的，及通過SAP去磷酸化及經(jīng)瓊脂糖凝膠純化的pcDNA2001/DHFRwt中。所得質(zhì)粒稱為p15C5-Light2001/DHFRwt。
實施例6確定氨甲喋呤、潮霉素和G418選擇水平將PER.C6和PER.C6/E2A以不同密度種植。在這些敏感性研究中氨甲喋呤(MTX)的起始濃度范圍在0nM至2500nM之間。確定這兩種細胞系的致死濃度；當在6孔平皿中細胞以100,000個細胞/孔的密度種植時，在10nM濃度每孔仍100％鋪滿，在25nM濃度，90-100％鋪滿，而在50nM濃度大多數(shù)細胞被殺死，在溫育6-15天之后則更多細胞被殺死。這些結(jié)果概括示于表1。對PER.C6細胞測試其對潮霉素和G418組合的抗性，以選擇突出生長的穩(wěn)定集落，該集落表達由攜帶潮霉素或新霉素抗性基因的質(zhì)粒編碼的各重組單克隆抗體的重鏈和輕鏈。當細胞在含有100μg/ml潮霉素和250μg/ml G418的正常培養(yǎng)基上生長時，未轉(zhuǎn)染的細胞被殺死，穩(wěn)定的集落可顯現(xiàn)(見實施例7)。
將CHO-dhfr細胞ATCCCRL9096以不同濃度種植于各自的培養(yǎng)基中。在這些敏感性研究中氨甲喋呤的起始濃度范圍在大約0.5nM至500nM之間。確定此細胞系的致死濃度，接著在IgG重鏈選擇(hyg)和輕鏈選擇(dhfr)的情況中在潮霉素中生長選擇之后，直接使用。
實施例7轉(zhuǎn)染EPO表達載體以獲得穩(wěn)定的細胞系將PER.C6和PER.C6/E2A細胞系的細胞以大約2-3×106個細胞/平皿種植于40個組織培養(yǎng)平皿(直徑10cm)中，并在各自的條件下保持過夜(PER.C6/E2A的條件為39℃，10％ CO2濃度，PER.C6的條件為37℃，10％ CO2濃度)。第二天，在37℃用Lipofectamine(Gibco)進行轉(zhuǎn)染。在用新鮮培養(yǎng)基(DMEM)置換4小時之后，將PER.C6/E2A細胞再移至39℃環(huán)境中，而PER.C6/E2A細胞保持37℃。將每個細胞系的20個平皿用5μg經(jīng)ScaI消化的pEPO2000/DHFRwt轉(zhuǎn)染，另20個平皿用5μg經(jīng)ScaI消化的pEPO2000/DHFRm轉(zhuǎn)染。另13個平皿作為氨甲喋呤殺傷力和轉(zhuǎn)染效率的陰性對照，轉(zhuǎn)染效率為大約50％。第二天，在溶解于含有透析的FBS的培養(yǎng)基中的DHFRwt中加入濃度為100-1000nM的MTX，在DHFRm中加入濃度為50.000-500.000nM的MTX。將細胞溫育4-5周。每2-3天更換一次組織培養(yǎng)基(含有MTX)。監(jiān)測細胞每天的死亡情況，將陽性與陰性對照結(jié)果相比較。挑取突出生長的集落并亞克隆。在接受突變體DHFR基因的轉(zhuǎn)染體中不能傳代培養(yǎng)陽性克隆，主要是由于所應用的高濃度MTX的毒性效應所致。從用野生型DHFR基因轉(zhuǎn)染的PER.C6和PER.C6/E2A細胞中，只有當細胞在100nMMTX中生長時在第一代中可建立細胞系。盡管在250和500nM MTX的平皿中呈現(xiàn)集落，這些克隆在傳代培養(yǎng)期間無價值，將其殺死。
實施例8轉(zhuǎn)染的細胞的傳代培養(yǎng)將從每個細胞系中選擇的大約50個對MTX閾值濃度有抗性的集落，以其各自的培養(yǎng)基加上MTX生長于96孔，24孔，6孔平板和T25瓶中。當細胞在T25組織培養(yǎng)瓶中生長時，將每個克隆的至少一個小瓶冷凍儲存，隨后測試人重組EPO的產(chǎn)生。為此，使用購自R&D系統(tǒng)的ELISA試劑盒(Quantikine IVD human EPO，Quantitative Colorimetric Sandwich ELISA，cat.#DEPOO)。由于不同的克隆呈現(xiàn)不同的生長特性和生長曲線，EPO生產(chǎn)標準設(shè)定如下開始時將細胞種植于T25組織培養(yǎng)瓶中，濃度為0.5-1.5×106個細胞/瓶。在第4天，取上清并用于EPOELISA中。由此生產(chǎn)水平設(shè)定為ELISA單位/106個種植的細胞/天(U/1E6/天)。這些克隆中的一些見表2所示。
良好生產(chǎn)克隆是基于高表達，培養(yǎng)行為及生存性選擇的。為檢測在延期生長期間在滾瓶和生物反應器中的長期生存性，懸浮生長能力，將最佳生產(chǎn)克隆的多個小瓶冷凍，并選擇以下每個細胞系的最佳生產(chǎn)者進行進一步研究P8，P9，E17和E55，其中“P”代表PER.C6，“E”代表PER.C6/E2A。將這些克隆傳代培養(yǎng)并在2個月內(nèi)提高氨甲喋呤劑量。從區(qū)域值濃度開始，并提高至0.2m M。在這兩個月期間，定期進行EPO ELISA試驗，以檢測EPO產(chǎn)生量的增加情況。在最高氨甲喋呤濃度，選擇最穩(wěn)定的生產(chǎn)者，與得自最佳CHO克隆的數(shù)量進行對比，并用于細胞存庫(RL)。將所有其它克隆的5個小瓶冷凍。通過Southern印跡分析檢測擴增的EPOc DNA拷貝數(shù)目。
實施例9在生物反應器中生產(chǎn)EPO將產(chǎn)生EPO的最佳轉(zhuǎn)染PER.C6的穩(wěn)定細胞系，P9，置于懸浮液中并按比例擴容至1-2升發(fā)酵罐中。為將P9置于懸浮液中，用PBS沖洗貼壁細胞，接著用PER.C6的JRHExCeLL525培養(yǎng)基(JRH)溫育，之后細胞自瓶中脫落，形成懸浮培養(yǎng)物。將細胞保持在兩種濃度的MTX中0nM和100nM。在這些濃度中(在滾瓶)達到的EPO的一般生產(chǎn)水平分別為1500和5700單位/106種植的細胞/天。盡管在沒有MTX的情況下產(chǎn)量較低可解釋為由于整合的DNA除去所致，但似乎也有整合的DNA的抑制效應，因為在較低濃度MTX中長期保持的細胞當它們再一次移至100nMMTX濃度時能達到它們從前的產(chǎn)量(見實施例11)。
將懸浮的P9細胞與100nM MTX正常培養(yǎng)生長，并用于接種生物反應器。對兩種生物反應器設(shè)定進行測試；灌流和重復分批培養(yǎng)。
A在2升生物反應器中灌流將細胞以0.5×106個細胞/ml濃度種植，并在細胞達到大約2.3×106個細胞/ml密度之后3天開始灌流。灌流速率為每24小時1體積，流量為每24小時250ml。在此設(shè)定中，P9細胞停留在大約5×106細胞/ml的恒定密度下，且?guī)缀?5％的生存力超過一個月。定期確定EPO濃度并示于圖15。在2升灌流的生物反應器中，P9細胞能保持大約6000ELISA單位/ml的生產(chǎn)水平。灌流速率為1工作體積/天(1.5-1.6升)時，這意味著在此2升生物反應器中，在沒有MTX的情況下，P9細胞生產(chǎn)大約1×107單位/天/2升生物反應器。
B.在2升生物反應器中重復分批培養(yǎng)將在滾瓶中生長的P9懸浮細胞接種于沒有MTX的2升生物反應器中，并至生長為大約1.5×106個細胞/ml密度，之后除去1/3的細胞群(每2-3天±1升)，并將剩余的培養(yǎng)物用新鮮培養(yǎng)基稀釋至密度為0.5×106個細胞/ml。將此步驟重復3周，工作體積保持在1.6升。確定除去的培養(yǎng)基中EPO濃度，結(jié)果示于圖16。平均濃度為大約3000 ELISA單位/ml。對平均2天后將細胞群稀釋，這意味著在此2升生物反應器中，在沒有MTX的情況下，P9細胞生產(chǎn)大約1.5×106單位/天。
C.在具有不同濃度溶解氧，溫度和pH設(shè)定值的1升生物反應器中重復分批培養(yǎng)將P9懸浮細胞在存在100nM MTX的情況下，在滾瓶中生長，并用于接種4×1升生物反應器，至在JRH ExCeLL525培養(yǎng)基中密度為0.3×106個細胞/ml。在3′5和7天后確定EPO產(chǎn)量。測試的第一種設(shè)定值是溶解氧的濃度(％DO)為0.5％，10％，150％，陽性對照為50％。50％DO是正常保持PER.C6和P9細胞的條件。在另一試驗中，在不同溫度下(32℃，34℃，37℃和39℃)接種P9細胞并測試EPO產(chǎn)量，其中37℃是PER.C6和P9細胞的正常設(shè)定值。在又一試驗中，在不同pH值(pH6.5，pH6.8，pH7.0和pH7.3)下接種新鮮P9細胞并測試EPO產(chǎn)量。PER.C6細胞在pH7.3的情況下正常保持。EPO產(chǎn)量(在種植3天后)結(jié)果示于圖17。明顯地，當溫度從32℃升至39℃時，EPO濃度增加，PER.C6/E2A細胞在39℃也可見到此結(jié)果(表4)，且50％DO對P9細胞而言是測試范圍內(nèi)最佳的。在pH6.5，細胞不能存活，因為在此生物反應器中的存活性在7天之后降低80％。對在這些設(shè)定值中產(chǎn)生的EPO樣品檢測糖基化及在2D電泳中的電荷情況(也見于實施例17)。
實施例10擴增DHFR基因?qū)嵤├?所述的一些細胞系用于擴增試驗，以確定在2個月以上的時間內(nèi)，通過提高MTX濃度而發(fā)生的DHFR基因數(shù)目增加的可能性。起始濃度為閾值濃度(100nM)，并以200nM，400nM，800nM和1200nM梯度加至1800nM。在此期間，定期進行EPO ELISA試驗，以檢測每天每106個種植的細胞的ELISA單位數(shù)(圖18)。在最高MTX濃度(1800nM)，冷凍一些小瓶。從中獲取細胞沉淀，提取DNA并接著用Bgl II消化，因為此酶在p EPO2000/DHFRwt中的野生型DHFR基因附近切割(圖5)，因此這種大小的獨特DHFR條帶可與Southern印跡中內(nèi)源性DHFR條帶相區(qū)別。將此DNA進行印跡，并將印跡與放射性DHFR探針雜交，接著用腺病毒E1探針作背景對照(圖19)。在磷光顯影儀中測定雜交條帶的強度，并對背景水平校正。結(jié)果示于表3。明顯地，盡管在此情況下只有內(nèi)源性DHFR而無整合的載體，仍可在PER.C6細胞中獲得擴增的DHFR基因。
實施例11在穩(wěn)定的細胞系中EPO表達的穩(wěn)定性將實施例8中所述的一些細胞系在有或無MTX的情況下長期培養(yǎng)。定期測定EPO濃度，其中細胞以1.0-1.5×106個細胞/T25瓶的密度種植，培養(yǎng)4天，計算每天每106個種植的細胞產(chǎn)生的EPO的水平。結(jié)果示于圖20。從中可得出當細胞在存在MTX的情況下培養(yǎng)時，EPO在P9細胞中相對穩(wěn)定表達，在沒有MTX的情況下，EPO產(chǎn)量降低。然而，當P9細胞在無MTX的情況下長期培養(yǎng)之后再置于100nM MTX中時，EPO表達水平達到其原始水平(±3000ELISA單位/106個種植的細胞/天)，推測整合的質(zhì)粒被抑制但是穩(wěn)定整合的，并能再次恢復生產(chǎn)。P8和P9細胞之間似乎有差異，因為在存在MTX的情況下P8的生產(chǎn)水平在后期降低(圖20A)，而P9的生產(chǎn)水平至少穩(wěn)定62代(圖20B)。
實施例12在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后，在貼壁細胞和懸浮細胞中重組EPO的瞬時表達pEPO2000/DHFRwt，pEPO 2000/DHFRm和pAdApt.EPO質(zhì)粒經(jīng)層析純化自大腸桿菌，并用Lipofectamine，電穿孔，PEI或其它方法轉(zhuǎn)染。計數(shù)PER.C6或PER.C6/E2A細胞，并種植于DMEM+血清或JRHExCell 525培養(yǎng)基或適當?shù)呐囵B(yǎng)基中，以懸浮轉(zhuǎn)染。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，依賴于所用的轉(zhuǎn)染方法，在37℃進行轉(zhuǎn)染16小時。接著將細胞置于不同溫度下，并將培養(yǎng)基用有或無血清的新鮮培養(yǎng)基置換。在必需獲取完全沒有血清組分的培養(yǎng)基的情況下，在3小時后再除去無血清的新鮮培養(yǎng)基，再用無血清組分的培養(yǎng)基置換。為確定重組EPO產(chǎn)量，在不同時間取樣品。重組蛋白的產(chǎn)量用ELISA試劑盒(R&D Systems)確定，其中1單位等于大約10ng重組的CHO細胞產(chǎn)生的EPO蛋白(100,000單位/mg)。用于這些試驗的細胞，由于其起源，特性和溫度不同，而以不同速率生長?？紤]用于ELISA試劑盒中的抗血清在非糖基化和高糖基化的重組EPO之間沒有辨別力，因此重組EPO的產(chǎn)量以ELISA單位/106種植的細胞/天計算。通常地，用于這些計算的樣品在轉(zhuǎn)染后置換培養(yǎng)基4天后取得。
在37℃用Lipofectamine轉(zhuǎn)染，接著在39℃在有血清的情況中生長的PER.C6/E2A細胞，典型地生產(chǎn)3100單位/106個細胞/天。在不用任何無血清培養(yǎng)基再置換而不存在血清組分時，這些Lipofectamine轉(zhuǎn)染的細胞典型地生產(chǎn)2600單位/106個細胞/天。在37℃用Lipofectamine轉(zhuǎn)染，接著在37℃在有血清的情況下生長的PER.C6細胞，典型地生產(chǎn)750單位/106個細胞/天，在無血清情況下生產(chǎn)590單位/106個細胞/天。為進行對比，將相同表達質(zhì)粒pEPO2000/DHFRwt和pEPO 2000/DHFRm用于轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞(CHO，ECACCNo.85050302)，使用Lipofectamine，PEI，磷酸鈣方法及其它方法。當CHO細胞用Lipofectamine轉(zhuǎn)染，接著在有血清的HamsF12培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，產(chǎn)量為190單位/106個細胞/天。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，產(chǎn)量為90單位/106個細胞/天，在DMEM中轉(zhuǎn)染時可獲得較高產(chǎn)量。
將含有貼壁的PER.C6/E2A細胞的不同平板在37℃也用pEPO2000/DHFRwt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，接著置于32℃，34℃，37℃或39℃下，以確定溫度對重組EPO產(chǎn)生的影響。從培養(yǎng)4天的樣品中計算結(jié)果是溫度依賴性產(chǎn)量水平在250-610單位/106個種植的細胞/天，由此推測在PER.C6和PER.C6/E2A之間觀測到的產(chǎn)量水平不同部分是由于溫育溫度所致(也見于實施例17)。由于PER.C6/E2A在37℃生長良好，其它研究均在37℃進行。
將含有貼壁的PER.C6和PER.C6/E2A細胞的不同平板，用pEPO2000/DHFRwt，pEPO2000/DHFRm和pAdApt.Epo經(jīng)Lipofectamine轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染4小時后，將DMEM用另一含血清的DMEM培養(yǎng)基或無血清的JRH培養(yǎng)基置換，幾天后EPO在上清中累積，確定在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)生的EPO濃度。將PER.C6細胞在37℃溫育，而PER.C6/E2A細胞保持在39℃。從不同質(zhì)粒所得數(shù)據(jù)進行平均，因為它們含有相似的表達盒。從培養(yǎng)6天的樣品中計算結(jié)果如下在DMEM中生長的PER.C6產(chǎn)量為400單位/106種植細胞/天，當它們保持在JRH培養(yǎng)基中時，其產(chǎn)量為300單位/106種植細胞/天。在DMEM中生長的PER.C6/E2A產(chǎn)量為1800單位/106種植細胞/天，當它們保持在JRH培養(yǎng)基中時，其產(chǎn)量為1100單位/106種植細胞/天。在PER.C6和PER.C6/E2A中再一次觀測到產(chǎn)量水平明顯不同，盡管這可部分是由于溫度不同所致(如上所述)。然而在DMEM培養(yǎng)基和JRH培養(yǎng)基中，PER.C6/E2A細胞的產(chǎn)量也明顯不同，這種效果在PER.C6細胞中幾乎完全不存在。
在此系統(tǒng)中所得的EPO表達數(shù)據(jù)概括示于表4。PER.C6及其衍生物可按比例擴大用于DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。根據(jù)Wurm和Bernard(1999)所述，對懸浮細胞的轉(zhuǎn)染可在1-10升裝置中進行，其中經(jīng)電穿孔可得到1-10mg/L(0.1-1pg/細胞/天)的重組蛋白產(chǎn)量。需要這樣的系統(tǒng)，其能良好控制且產(chǎn)量更高，尤其篩選在穩(wěn)定裝置中不能產(chǎn)生的大量蛋白質(zhì)和毒性蛋白時。對最佳的PER.C6細胞在無血清的情況下用Lipofectamine轉(zhuǎn)染，所得產(chǎn)量為590單位/106細胞/天(±5.9pg/細胞/天，當1ELISA單位大約為10ngEPO時)，而PER.C6/E2A的產(chǎn)量為31pg細胞/天(在有血清的情況下)。用于懸浮培養(yǎng)PER.C6和PER.C6/E2A的培養(yǎng)基(JRH ExCell 525)不支持用類似PEI的組分有效地瞬時DNA轉(zhuǎn)染。因此將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)為在用含有重組人EPO cDNA的pEPO2000/DHFRwt和pEPO2000/DHFRm，和含有編碼重組蛋白的其它cDNA’s的pcDNA2000/DHFRwt轉(zhuǎn)染后，能產(chǎn)生重組EPO。
在經(jīng)調(diào)節(jié)的支持用純化的質(zhì)粒DNA瞬時DNA轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中生長的1-10升PER.C6和PER.C6/E2A的懸浮培養(yǎng)物，通過電穿孔或其它方法，用相同表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。幾小時后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，用無血清的新鮮培養(yǎng)基置換。使重組蛋白在上清中累積幾天，之后收集上清并除去所有細胞。將上清用于下游加工以純化重組蛋白。
實施例13產(chǎn)生AdApt.EPO重組腺病毒在適當細胞系中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，用pWE/Ad.Afl II-rITR.tetO-E4，pWE/Ad.Afl II-rITR.ΔE2A，pWE/Ad.Afl II-rITR.ΔE2A，tetO-E4粘粒與pAd.Apt.EPO共轉(zhuǎn)染。接著將細胞在其適當溫度下保持幾天，直至觀測到全部cpe。然后將細胞通過幾次冷凍/融解步驟以從細胞中釋放所有病毒，之后將細胞碎片離心。就IGAd5/AdAptEPO.dE2A而言，將上清用于感染細胞，隨后通過幾次稀釋經(jīng)瓊脂糖覆蓋而進行噬斑純化。幾天后，當在最高稀釋液中可明顯見到單個的噬斑時，挑取9個噬斑和一個陰性對照(在明顯的噬斑之間挑取細胞，從而幾乎不含病毒)，并檢測在A549細胞上的EPO產(chǎn)量。所有挑取噬斑的病毒均是陽性的，陰性對照不產(chǎn)生重組蛋白。將一陽性生產(chǎn)者用于感染適當?shù)募毎?，并將病毒從T25燒瓶開始增殖至滾瓶裝置中。滾瓶中上清用于純化病毒，之后確定病毒顆粒(vp)數(shù)目，并與通過本領(lǐng)域已知方法確定的感染單位(IU′s)數(shù)目相對比。然后確定vp/IU比率。
實施例14用IGAd5/AdAptEPOdE2A感染貼壁和懸浮的PER.C6細胞將實施例13中純化的病毒用于在PER.C6細胞及其衍生物中瞬時表達重組EPO。IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A病毒用于感染PER.C6細胞，而IG.Ad5/AdApt.EPO.tetOE4和IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.tetOE4病毒可用于感染PER.C6/E2A細胞，以使復制的可能性較低，并另外防止由于復制所致的重組蛋白產(chǎn)生受抑制。在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中，在感染復數(shù)(moi)在20，200，2000，20000vp/細胞范圍，對貼壁的細胞及懸浮的細胞進行感染。在6孔平板至滾瓶的不同裝置中，進行4小時感染，之后除去含有病毒的上清。用PBS沖洗細胞或直接更換新培養(yǎng)基。然后使細胞產(chǎn)生重組EPO若干天，其間取樣并確定EPO產(chǎn)量。對與死亡細胞相比存活的細胞數(shù)也進行檢測。再以ELISA單位/1E6種植的細胞/天計算產(chǎn)生的EPO量，因為不同的細胞系由于代次和環(huán)境因素如溫度及選擇壓力而有不同的生長特性。將生長PER.C6細胞的懸浮液種植于滾瓶中的250ml JRHExCell525培養(yǎng)基中(106個細胞/ml)，接著用純化的IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A病毒，以moi為200vp/細胞感染。用于vp測定的估值較高(vp/IU比率為330，表示moi為0.61 IU/細胞)。因此，不是所有的細胞均被感染病毒擊中。在取自此設(shè)定值培養(yǎng)6天的樣品中，重組EPO的典型產(chǎn)量為190單位/106種植的細胞/天，而在包括存活和死亡細胞的培養(yǎng)基50％由新鮮培養(yǎng)基更換的情況下，產(chǎn)量為大約240單位/106細胞/天。更換培養(yǎng)基不影響存活細胞的存活性，但除去的重組蛋白可加入在試驗末期所得的量中。將moi設(shè)定為20vp/細胞，類似于大約0.06感染單位/細胞，進行相同試驗。不更換培養(yǎng)基所得產(chǎn)量為70ELISA單位/106細胞/天，而在50％培養(yǎng)基在第3天被更換的情況下，測定的產(chǎn)量為80單位/106細胞/天。這表明當用于感染PER.C6細胞的感染單位數(shù)量增加時，存在劑量應答效應。
另外，將生長于DMEM中的PER.C6細胞種植于6孔平板中，并置于有血清的2mlDMEM中過夜以貼壁。第二天，將細胞用另一批IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A病毒感染(vp/IU＝560)，感染復數(shù)(moi)為200vp/細胞(0.35感染單位/細胞)。4小時后，將含有病毒的培養(yǎng)基除去，置換以含有血清的新鮮培養(yǎng)基，并每天換用新鮮培養(yǎng)基兩周以上，使細胞產(chǎn)生重組EPO。在培養(yǎng)4天的樣品中計算的重組EPO產(chǎn)量為60單位/106細胞/天。在此系統(tǒng)中所得表達數(shù)據(jù)概括示于表5。
由于腺病毒早期區(qū)4(E4)的tTA-tetO調(diào)節(jié)的表達削弱了重組病毒在沒有活性E4的情況下的復制能力，也可使用潛在產(chǎn)生蛋白質(zhì)的PER.C6/E2A以及其親本PER.C6細胞系，以產(chǎn)生重組蛋白，其中設(shè)定重組腺病毒攜帶作為轉(zhuǎn)基因的人EPO c DNA，且E4基因在tet操縱子的控制下。這時在PER.C6/E2A細胞系中產(chǎn)生非常低的E4mRNA水平，導致非常低但可檢測的重組和復制病毒，在PER.C6中檢測不到此病毒。為了以此方式生產(chǎn)重組EPO，將兩個病毒IG.Ad5/AdApt.EPO.tet OE4和IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.tet OE4用于感染PER.C6細胞及其衍生物。在小裝置(6孔平板和T25培養(yǎng)瓶)和大裝置(滾瓶和發(fā)酵罐)中，以不同moi的純化腺病毒感染貼壁和懸浮的細胞。在不同時間取樣品，并確定EPO水平。
由于在病毒主鏈中缺失E1和E2A的病毒可在PER，C6/E2A細胞中被互補而在原始PER.C6細胞中不能互補，所用設(shè)定條件為將這兩種細胞系的混合物在有IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.病毒的情況下培養(yǎng)。病毒在PER.C6/E2A中復制，接著感染的細胞裂解，隨之感染PER.C6或PER.C6/E2A細胞系。相反，在PER.C6中病毒不復制，且細胞不會由于病毒顆粒產(chǎn)生導致裂解，但產(chǎn)生分泌于上清中的重組EPO。設(shè)立穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)/復制/EPO生產(chǎn)系統(tǒng)，其中恒流加入新鮮培養(yǎng)基和新鮮PER.C6和PER.C6/E2A細胞，同時除去已用的培養(yǎng)基，死亡的細胞和碎片。同時，從此系統(tǒng)中取重組EPO，并通過除去病毒顆粒的下游處理方法加以純化。
實施例15純化和分析重組EPO在生物反應器中大批生產(chǎn)生長的細胞，并根據(jù)本領(lǐng)域已知方法純化分泌的重組人EPO蛋白。對取自PER.C6和PER.C6/E2A穩(wěn)定克隆或轉(zhuǎn)染子的純化的重組人EPO蛋白，通過本領(lǐng)域已知方法，檢測與商購的EPO和純化自人源(尿液)的EPO對比的糖基化與折疊情況(見實施例16和17)。在體內(nèi)試驗和鼠脾(如Krystal所述)及在體外分析中，測試得自PER.C6和PER.C6/E2A的純化的及糖基化的EPO蛋白的生物活性(見實施例18)。
實施例16在PER.C6中的β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性已知中國倉鼠卵巢(CHO)細胞不含有β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，導致在這些CHO細胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性和重組糖蛋白的N及O聯(lián)寡糖的末端沒有α-2，6-連接的唾液酸。由于CHO細胞中存在α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因，在這些細胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)典型是2，3鍵連類型的。然而純化自人尿液的EPO不含有α-2，3-和α 2，6-連接的唾液酸。為確定人體細胞系PER.C6細胞是否能生產(chǎn)含有α-2，3-和α-2，6-鍵的重組EPO，在用EPO表達載體轉(zhuǎn)染后對在PER.C6細胞中生產(chǎn)的EPO進行直接神經(jīng)氨酸酶分析。作為對照，使用商購的Eprex樣品，其衍生自CHO細胞，并只含有α-2，3型的唾液酸連接。所用的神經(jīng)氨酸酶來自新城疫病毒(NDV)，其特異地酶切來自N聯(lián)和O聯(lián)的聚糖的α-2，3-連接的神經(jīng)氨酸(唾液酸)，及來自霍亂弧菌(VC)，其非特異地酶切所有N-和O-聯(lián)唾液酸(α-2，3′α-2，6和α-2，8連接)。這兩種神經(jīng)氨酸酶均購自Bbehringer，并根據(jù)生產(chǎn)者提供的指導，將樣品與其溫育。結(jié)果示于圖21A。與1泳道(未處理的PER.C6 EPO)相比，在2和3泳道(用NDV神經(jīng)氨酸酶處理的)觀測到輕微位移。當此EPO樣品與VC衍生的神經(jīng)氨酸酶溫育時，與NDV處理的樣品相比觀測到較快的遷移帶。然而對于商購的Eprex，只在應用NDV衍生的神經(jīng)氨酸酶時觀測到位移(6和7泳道，與5道中未處理樣品相比)，而在使用VC衍生的神經(jīng)氨酸酶時未觀測到位移。
為進一步示出CHO細胞中確實不存在α-2，6-連接類型的唾液酸，但它們確實存在于PER.C6細胞表面的蛋白質(zhì)中，進行以下試驗將CHO細胞經(jīng)胰蛋白酶-EDTA自固體支持物中釋出，而對PER.C6使用的是懸浮細胞。將這兩種懸浮液均用Mem-5％FBS沖洗一次，并在此培養(yǎng)基中在37℃溫育1小時。在用PBS沖洗之后，將細胞以大約106細胞/ml再懸浮于結(jié)合培養(yǎng)基中(Tris緩沖鹽水，pH7，5，0.5％BSA，和均為1mM的MgCl2，MnCl2，和CaCl2)。將細胞等份在室溫下用DIG標記的凝集素，Sambucus nigra凝集素(SNA)和Maackia amurensis凝集素(MAA)溫育1小時，所述凝集素分別特異結(jié)合α-2，6-Gal和α-2，3-Gal型的唾液酸連鍵。將對照細胞用無凝集素的培養(yǎng)基溫育。1小時之后，將經(jīng)凝集素處理的和對照細胞均用PBS沖洗，然后在室溫用FITC標記的抗DIG抗體(Boehringer.Mannheim)溫育1小時。接著，將細胞用PBS沖洗，在FACsorb裝置上(Becton Dickinson)分析熒光強度。FACS分析結(jié)果示于圖21B。當用SNA凝集素溫育CHO細胞時，與未處理的細胞相比未觀測到位移，而當用此凝集素溫育PER.C6細胞時，與未處理的細胞(空心區(qū)域)相比觀測到明顯位移(黑色區(qū)域)。當這兩種細胞均用MAA凝集素溫育時，與未處理的細胞相比均呈現(xiàn)明顯位移。
從這些EPO消化和FACS結(jié)果推斷，在PER.C6細胞中存在α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性，而在CHO細胞中沒有。
實施例17確定PER.C6中生產(chǎn)的EPO中唾液酸含量在EPO的N-或O-聯(lián)聚糖上存在的末端神經(jīng)氨酸(或唾液酸)，保護該蛋白質(zhì)不會通過肝臟中的酶而從血流中清除。另外，由于這些唾液酸是負電荷的，因此可依賴于其電荷或特異pI分辨不同EPO形式。因此，將PER.C6和CHO細胞生產(chǎn)的EPO用于2維電泳，其中第一維電泳基于電荷分離蛋白質(zhì)(pH3-10)，第二維電泳基于分子量進一步分離蛋白質(zhì)。接著，將蛋白質(zhì)在western印跡中印跡，并用抗EPO抗體檢測。
也可通過用Coomassie藍或銀染色法將凝膠染色，然后從凝膠中除去不同的斑點而檢測分離的EPO蛋白，并通過質(zhì)譜法確定蛋白質(zhì)中不同N或O聯(lián)糖基化的特異聚糖組合物。
在圖22A中，示出衍生自P9上清的許多EPO樣品。P9是穩(wěn)定表達重組人EPO的PER.C6細胞系(見實施例8)。將這些樣品與商購的Eprex相比，Eprex只含有具有大約9-14個唾液酸的EPO形式，Eprex因此應是負電荷的，并聚集于凝膠的pH3一側(cè)。圖22B示出衍生自貼壁裝置中P9的EPO，與衍生自CHO細胞的EPO之間的對比，在貼壁裝置中細胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而CHO細胞是用pEPO2000/DHFRwt載體轉(zhuǎn)染的。在CHO樣品中明顯不能檢測到較低形式的EPO，而在P9樣品中可見到所有形式的EPO。唾液酸含量通過計數(shù)在第一維中分離的1-14條帶而得出。由于通過使用ECL進行western印跡，并且由于還不清楚是否抗體用于檢測印跡上EPO分子，及由于未知糖基化是否能抑制抗體識別或移至硝酸纖維素，因此還不能確定這些混合物中每種形式EPO的百分率。然而，可確定含有唾液酸的分離形式的EPO分子的存在?？赏茢郟ER.C6細胞能產(chǎn)生全部14種含有唾液酸的重組人EPO的異構(gòu)體。
實施例18PER.C6產(chǎn)生的EPO的體外功能性重組EPO在體內(nèi)的功能通過其在血流中的半衰期確定。通過肝臟中結(jié)合未被唾液酸保護的聚糖中半乳糖殘基的酶及通過腎臟清除而清除EPO。通過腎臟的這種過濾是否由于錯誤折疊或由于糖基化不足或錯誤糖基化所致還未知。另外，到達骨髓中其靶位并與祖細胞上EPO受體結(jié)合的EPO分子，也自循環(huán)中清除。與EPO受體結(jié)合及下游信號傳導主要依賴于EPO分子的適當糖基化狀態(tài)。唾液酸在一定程度上可抑制EPO與其受體的結(jié)合，導致該蛋白質(zhì)的功效較低。然而，由于唾液酸阻止EPO被清除，因此這些糖是其保護朝向與EPO受體運動的蛋白質(zhì)這一功能所必需的。當唾液酸在體外自EPO中除去時，發(fā)生與受體更好的結(jié)合，導致更強的下游信號傳導。這意味著在體內(nèi)和體外的功能性明顯不同，盡管唾液酸化不是可導致體內(nèi)半衰期短但在體外可檢測到恰當?shù)腅PO受體結(jié)合性(Takeuchi等，1989)。
一些關(guān)于EPO功能性的體外分析已經(jīng)闡述，其中刺激IL3′GM-CSF和EPO依賴性人體細胞系TF-1是最常使用的。由此可確定每mg的體外單位數(shù)(Kitamura等，1989；Hammerling等，1996)。其它體外分析是在骨髓細胞瓊脂糖層下由EPO刺激分化的紅色集落形成，59Fe在培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞(Krystal等，1981和1983；Takeuchi等，1989)，和大鼠骨髓細胞(Goldwasser等，1975)中的亞鐵血紅素中的摻入，及放射免疫分析(RIA)，在RIA中確定抗血清對EPO的識別。將PER.C6生產(chǎn)的EPO如下用于刺激TF-1細胞將細胞以約10,000個細胞/孔密度種植于96孔平板中，培養(yǎng)基中不含IL3或GM-CSF，它們是可刺激所培養(yǎng)的這些細胞非限制生長的生長因子。接著加入培養(yǎng)基至終濃度為0.0001，0.001，0.01，0.1，1和10單位/ml。這些單位是通過ELISA確定的，同時已知陽性對照Eprex的單位(4000單位/ml)，并將其稀釋為相同濃度。將細胞與這些EPO樣品溫育4天，之后進行MTS分析(Promega)，以在490nm經(jīng)熒光測定檢測存活細胞(在將MTS移至formazan中后可檢測到熒光)。圖23示出衍生自PER.C6/E2A細胞的兩個樣品的活性，所述PER.C6/E2A細胞用EPO表達載體轉(zhuǎn)染，接著在37℃和39℃溫育4天。結(jié)果提示在39℃所得樣品比在37℃所得樣品更有活性，這可表明唾液酸含量在較高溫度是亞適的。由此示出PER.C6生產(chǎn)的EPO在體外分析中可刺激TF-1細胞，強烈提示在此人體細胞系中生產(chǎn)的EPO可與EPO受體相互作用，并刺激分化。
實施例19在PER.C6和PER.C6/E2A中生產(chǎn)重組的小鼠抗體、人化抗體及人單克隆抗體A.瞬時DNA轉(zhuǎn)染將編碼小鼠單克隆抗體，人化單克隆抗體的和人單克隆抗體(mAbs)重鏈和輕鏈的cDNA在兩種不同系統(tǒng)中克隆一個系統(tǒng)是將重鏈和輕鏈整合入一個單一質(zhì)粒中(一種修飾的pcDNA2000/DHFRwt質(zhì)粒)，另一個系統(tǒng)將重鏈和輕鏈cDNA’s分別克隆入兩個不同質(zhì)粒中(見實施例1，3′4和5)。這些質(zhì)?？蓴y帶相同選擇標記(如DHFR)，或者它們可攜帶自己的選擇標記(一個含有DHFR基因，一個含有例如neo抗性標記)。就瞬時表達系統(tǒng)而言，載體主鏈中存在何種選擇標記不是問題，因為接著不再進行選擇。在本領(lǐng)域通用及常用的轉(zhuǎn)染方法中，等量的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染。在一個單一質(zhì)粒上整合重鏈和輕鏈的缺點是驅(qū)動這兩個cDNA’s表達的啟動子可彼此互相影響，導致這兩個亞單位的表達水平不相等，盡管每個基因的cDNA拷貝數(shù)非常一致。
將含有小鼠和人化的單克隆抗體重鏈和輕鏈的cDNA’s的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，幾天后通過本領(lǐng)域已知方法確定正確折疊的抗體的濃度。檢查培養(yǎng)PER.C6和PER.C6/E2A細胞的條件如溫度和使用的培養(yǎng)基。生產(chǎn)的重組抗體的功能性通過確定特異抗原的親和性而控制。
B.瞬時病毒轉(zhuǎn)染將編碼重鏈和輕鏈的cDNA’s在兩個不同系統(tǒng)中克隆一個是將重鏈和輕鏈整合入一個單一銜接子質(zhì)粒中(一種修飾的pAdApt.pac)，另一個將重鏈和輕鏈cDNA’s分別克隆入兩個不同的銜接子中(每個分別在pAdApt.pac中)。在第一個系統(tǒng)中，增殖病毒，其在腺病毒主鏈中攜帶E1缺失體(dE1)和E2A缺失體(dE2A)，或在tetoE4插入體中的這兩個缺失體。在第二個系統(tǒng)中，將重鏈和輕鏈分別克隆在pAdApt.pac中，并分別增殖為具有相同腺病毒主鏈的病毒。這些病毒用于對貼壁的和懸浮生長的PER.C6和PER.C6/E2A細胞進行單獨或共轉(zhuǎn)染。幾天后，取樣品確定全長重組抗體的濃度，之后在親和性研究中通過特異抗原確定這些抗體的功能性。
C.整合質(zhì)粒的穩(wěn)定生產(chǎn)和擴增將同時攜帶重鏈和輕鏈的表達質(zhì)粒與分別攜帶重鏈和輕鏈的質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染貼壁的PER.C6和PER.C6/E2A和CHO-dhfr細胞。接著將細胞暴露于MTX和/或潮霉素和新霉素，選擇不同質(zhì)粒的整合。另外，用G418和潮霉素進行雙選擇，以選擇攜帶潮霉素和新霉素抗性基因的質(zhì)粒的整合。確定功能性全長單克隆抗體的表達，并將最佳表達克隆用于接下來的研究中，包括整合的穩(wěn)定性，拷貝數(shù)檢測，確定兩個亞單位的水平，及在最佳生產(chǎn)細胞系用于在較大裝置如灌流的和(補料)分批生物反應器中生產(chǎn)mAb之后，確定隨著MTX濃度提高的擴增能力，之后對mAbs的數(shù)量和質(zhì)量進行優(yōu)佳化。
實施例20轉(zhuǎn)染mAb表達載體以獲得穩(wěn)定細胞系將PER.C6細胞以大約2.5×106個細胞/平皿的密度，種植于47個組織培養(yǎng)平皿(直徑10cm)中的DMEM加10％PBS中，并在其標準條件(10％ CO2濃度，37℃)培養(yǎng)過夜。第二天，在39個平皿中在37℃使用標準Lipofectamine方法，每個平皿用1ug經(jīng)MunI消化的及純化的pUBS-Heavy2000/Hyg(-)，和1ug經(jīng)ScaI消化的及純化的pUBS-Light2001/Neo(見實施例3)進行共轉(zhuǎn)染，作為對照在另兩個平皿中用1ug經(jīng)MunI消化的及純化的pcDNA2000/Hyg(-)，和1ug經(jīng)ScaI消化的及純化的pcDNA2001/Neo進行共轉(zhuǎn)染。作為轉(zhuǎn)染效率的對照，另4個平皿用LacZ對照載體轉(zhuǎn)染，另2個平皿不進行轉(zhuǎn)染以作為陰性對照。
5小時后，將細胞用DMEM沖洗兩次，再補充無選擇劑的新鮮培養(yǎng)基。第二天，將培養(yǎng)基用含有不同選擇試劑的新鮮培養(yǎng)基置換將33個重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)染物平皿，2個用空載體轉(zhuǎn)染的平皿和2個陰性對照平皿(未轉(zhuǎn)染)，只與50ug/ml潮霉素溫育，將2個重鏈和輕鏈共轉(zhuǎn)染物平皿和2個轉(zhuǎn)染效率平皿(LacZ載體)只占500ug/mlG418溫育，另2個轉(zhuǎn)染效率平皿未用選擇培養(yǎng)基處理但轉(zhuǎn)染效率大約為40％。將2個平皿與50ug/ml潮霉素和250ug/ml G418組合溫育，另2個平皿用25ug/ml潮霉素和500ug/ml G418組合溫育。
由于細胞在只與潮霉素溫育時是過生長的，確定潮霉素和G418選擇組合會立即殺死只整合轉(zhuǎn)染的兩種載體之一的細胞。因此在種植7天后，將所有共轉(zhuǎn)染物用100ug/ml潮霉素和500ug/ml G418組合進一步溫育。2或3天用含有相同濃度選擇劑的培養(yǎng)基更新細胞。在種植14天后，將濃度調(diào)節(jié)為250ug/ml G418和50ug/ml潮霉素。在種植22天后，已有大量集落生長至可選擇，挑取及傳代培養(yǎng)的程度。從10cm平皿中選擇并挑取大約300個分離的集落，接著經(jīng)由96孔和/或24孔平板經(jīng)6孔平板至T25燒瓶中生長。在此階段，將細胞冷凍(4小瓶/傳代培養(yǎng)的集落)，并經(jīng)實施例26所述的ELISA確定上清中重組UBS-54mAb的產(chǎn)量水平。
將CHO-dhfr細胞以大約106個細胞/平皿的密度，種植于含有DMEM加10％PBS并包括次黃嘌呤和胸苷的組織培養(yǎng)平皿(直徑10cm)中，在標準條件下培養(yǎng)過夜，并在第二天用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt，經(jīng)標準Lipofectamine方法共轉(zhuǎn)染。幾小時后，更換新鮮培養(yǎng)基，并分為不同密度，以在發(fā)生穩(wěn)定整合時，使細胞適合選擇培養(yǎng)基并且不會發(fā)生未轉(zhuǎn)染細胞的過度生長。首先針對潮霉素抗性選擇集落，接著加入MTX以在這些傳代培養(yǎng)的細胞系中選擇這兩個質(zhì)粒的雙整合體。
如用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/Neo轉(zhuǎn)染所述，用pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS2-Light2001/Neo在PER.C6和PER.C6/E2A中進行轉(zhuǎn)染，并通過接著用潮霉素隨后用G418溫育選擇，或如上述用兩種選擇劑組合選擇。將CHO-dhfr細胞用pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS2-Light2001/DHFRwt，如用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt轉(zhuǎn)染所述轉(zhuǎn)染，并相繼進行選擇，其中細胞首先用潮霉素選擇，之后通過在MTX上選擇控制輕鏈載體整合。另外，將PER.C6和PER.C6/E2A細胞用pUBS-3000/Hyg(-)和pUBS2-3000/Hyg(-)轉(zhuǎn)染，而CHO-dhfr細胞用pUBS-3000/DHFRwt和pUBS2-3000/DHFRwt轉(zhuǎn)染，之后通過提高MTX濃度進行整合質(zhì)粒的選擇和擴增。在pcDNAs3000質(zhì)粒的情況下，預期重鏈和輕鏈的mRNA’s數(shù)目相同，而在兩個獨立載體的情況下，還不清楚在免疫球蛋白的兩個亞單位之間是否達到恰當平衡。另外用實施例4和5所述的表達載體對PER.C6和PER.C6/E2A及CHO-dhfr細胞進行轉(zhuǎn)染，以獲得分別表達人化的IgG1mAb CAMPATH-1H和人化的IgG1 mAb 15C5的穩(wěn)定細胞系。
實施例21傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞從用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/Neo轉(zhuǎn)染的PER.C6細胞中，取在含有潮霉素和G418的培養(yǎng)基中生長的大約300個集落，將它們生長于具有其各自的培養(yǎng)基加上各自選擇劑的96孔，24孔，和6孔平板中。對能在24孔平板中生長的細胞，通過實施例26所述的ELISA檢測mAb的產(chǎn)生情況。如果細胞表現(xiàn)陽性，將每個克隆的至少一個小瓶冷凍并貯存，隨后將細胞進行測試及傳代培養(yǎng)。在高表達，培養(yǎng)性質(zhì)和存活性的基礎(chǔ)上選擇良好的生產(chǎn)克隆。為檢測長期存活性，整合質(zhì)粒的擴增以及在延長的期間的懸浮生長，將最好的生產(chǎn)克隆冷凍，從中選擇每個細胞系的一些最佳生產(chǎn)者，以進行進一步研究。對用不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr細胞，和用重鏈和輕鏈的其它組合及選擇標記的其它組合轉(zhuǎn)染的PER.C6和PER.C6/E2A細胞，進行相似的試驗。
實施例22在生物反應器中生產(chǎn)mAb將PER.C6的最佳生產(chǎn)UBS-54的轉(zhuǎn)染的細胞系形成懸浮液，即通過用PBS洗細胞，然后在JRH ExCell 525培養(yǎng)基中培養(yǎng)此細胞，首先在小培養(yǎng)瓶隨后在滾瓶中培養(yǎng)，并放大至1-2升發(fā)酵罐。將細胞用潮霉素和G418選擇，直至整合的載體長期穩(wěn)定。這是在細胞還處于貼壁階段或當細胞處于懸浮液中時進行。
懸浮生長的生產(chǎn)mAb的PER.C6細胞通常用潮霉素和G418培養(yǎng)，并用于從滾瓶中接種生物反應器。在細胞在灌流生物反應器及補料分批培養(yǎng)裝置中生長之后，檢測產(chǎn)生的mAb的產(chǎn)量，功能性和質(zhì)量。
A.在2升生物反應器中灌流將細胞以大約0.5×106個細胞/ml的濃度種植于無選擇劑的懸浮培養(yǎng)基中，在幾天后細胞密度達到大約2-3×106個細胞/ml時，開始灌流。灌流速率通常為1體積/24小時，流量大約為250ml/24小時。在此裝置中，細胞密度恒定在大約5×106個細胞/ml，且在一個月以上時間內(nèi)幾乎為95％的存活性。常規(guī)基礎(chǔ)上確定mAb的產(chǎn)量水平。
B.在2升生物反應器中補料分批培養(yǎng)在開始階段，將在滾瓶中生長的生產(chǎn)mAb的PER.C6懸浮細胞，用于接種無選擇劑的2升生物反應器，密度為在300-500ml工作體積中0.3-0.5×106個細胞/ml，并培養(yǎng)生長至細胞培養(yǎng)物的存活性降至10％。培養(yǎng)物生存時間標準是在接種后，存活細胞密度降至0.5×106個細胞/ml之下的天數(shù)。細胞通常生長至密度為2-3×106個細胞/ml，之后培養(yǎng)基組分變得有限，及存活性降低。另外，確定培養(yǎng)基中有多少必需組分如葡萄糖和氨基酸被細胞消耗。接著，確定產(chǎn)生了何種氨基酸和在培養(yǎng)物中有何其它累積的產(chǎn)物?；诖?，產(chǎn)生濃縮的補料樣品，其在規(guī)定的時間點加入以提高培養(yǎng)物生存時間，從而提高上清中mAb濃度。在另一裝置中，配制10倍濃縮的培養(yǎng)基樣品，并在不同時間加入細胞中，也提高細胞的存活性至更長一段生存時間，最終在上清中產(chǎn)生較高濃度的mAb。
實施例23瞬時表達人化的重組單克隆抗體將正確組合的含有的UBS-54重鏈和輕鏈基因載體，用于在PER.C6細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染試驗。為此，何種選擇標記導入質(zhì)粒主鏈中不是重要的，因為表達持續(xù)很短的時間(2-3天)。轉(zhuǎn)染方法一般是lipofectamine法，但也可使用其它陽離子脂質(zhì)化合物以有效轉(zhuǎn)染。瞬時方法是從T25培養(yǎng)瓶裝置推至至少10升生物反應器裝置。在第一天，將大約3.5×106的PER.C6和PER.C6/E2A細胞種植于T25燒瓶中。在第二天，將細胞用8ug質(zhì)粒DNA經(jīng)lipofectamine法轉(zhuǎn)染，并在2-4小時后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。然后，收集上清，在用于人IgG1免疫球蛋白的定量ELISA中測定抗體滴度(CLB，見實施例26)。在此系統(tǒng)中，就PER.C6而言，人抗體的總水平大約為4.8ug/106種植的細胞，就PER.C6/E2A而言，為11.1ug/106種植的細胞。為確定產(chǎn)生的抗體中有多少是完整的并由兩個重鏈和兩個輕鏈構(gòu)成的，以及單獨的，及通過二硫鍵的連接的重鏈和/或輕鏈的表達水平，進行分別識別亞單位的對照ELISA。使用檢測人(人化的)IgG1亞單位的不同捕捉和染色抗體組合。檢測PER.C6轉(zhuǎn)染物(用對照載體或pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt轉(zhuǎn)染的)的上清中完整大小的mAb產(chǎn)量(圖24)。將樣品用及不用DTT處理，由此可分辨完整大小的mAb(未還原)與重鏈或輕鏈(還原的)之間的不同。正如所期望的，只有當輕鏈被共表達時，才分泌重鏈，大多數(shù)抗體是完整大小的。
實施例24用于進行瞬時轉(zhuǎn)染的放大系統(tǒng)PER.C6及其衍生物用于DNA轉(zhuǎn)染放大系統(tǒng)。根據(jù)Wurm和Bernard(1999)所述，轉(zhuǎn)染懸浮細胞可在1-10升的裝置中進行，其中經(jīng)電穿孔所得重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為1-10mg/l(0.1-1pg/細胞/天)。
需要一種能被良好控制及產(chǎn)量更高的系統(tǒng)，尤其是用于篩選在穩(wěn)定裝置中不能生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)和毒性蛋白。另外，由于細胞系如CHO受細胞程序死亡誘導劑如lipofectamine的嚴重影響，因此本領(lǐng)域需要一種對此有抗性的細胞。由于PER.C6幾乎不受轉(zhuǎn)染方法影響，因此PER.C6及其衍生物可用于此目的。在調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中生長的，以支持用純化的質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染的PER.C6和PER.C6/E2A的1-50升懸浮培養(yǎng)物，用于經(jīng)電穿孔或其它方法，用相同表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。在幾個小時之后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并用無血清的新鮮培養(yǎng)基置換。使重組蛋白質(zhì)在上清中累積幾天，之后收集上清并除去所有細胞。將上清用于下游加工以純化重組蛋白。
實施例25用于進行病毒感染的放大系統(tǒng)將實施例3′4和5所述抗體的重鏈和輕鏈cDNA’s，分別及組合地克隆入重組腺病毒銜接子質(zhì)粒中。進行的組合要保證形成的抗體的重鏈和輕鏈表達水平相同。當分別克隆重鏈和輕鏈，然后分別產(chǎn)生病毒并增殖時，確定病毒顆粒的感染能力和濃度，最后共同感染PER.C6及其衍生物，以在上清中產(chǎn)生重組mAbs。銜接子載體和重組腺病毒的產(chǎn)生及mAbs的產(chǎn)生如關(guān)于重組EPO所述(見實施例13和14)。
實施例26開發(fā)ELISA以測定人mAbs將Greiner microlon平板#655061用抗人IgG1κ單克隆抗體(Pharmingen#M032196 0.5)，以在PBS中4ug/ml濃度，100ul/孔包被。在4℃溫育過夜，或在37℃溫育90分鐘。然后，用0.05％ Tween/PBS(400ul/孔)將孔沖洗3次，接著用100ul溶于0.05％ Tween/PBS中的5％奶/孔，在37℃封閉30分鐘。然后用400ul 0.05％ Tween/PBS/孔將平板沖洗3次。作為標準物，使用純化的人IgG1抗體(Sigma，#108H9265)，在0.5％奶/0.05％ Tween/PBS中稀釋為50-400ng/ml。將每孔100ul的標準物在37℃溫育1小時。然后，將平板用400ul/孔的0.05％ Tween/PBS沖洗3次。作為二抗，使用生物素標記的小鼠單克隆抗人IgG1抗體(Pharmingen #M045741)，濃度為2ng/ml。加入100ul/孔的此抗體，在37℃溫育1小時，并用400ul 0.05％Tween/PBS將孔沖洗3次。
接著，加入綴合物100ul/孔的1∶1000稀釋的鏈霉親和素-HRP溶液(Pharmingen #M045975)，在37℃溫育1小時，并將平板再用400ul 0.05％ Tween/PBS沖洗3次。
將一片ABTS(Boehringer Mannheim #600191-01)溶解于50mlABTS緩沖液(Boehringer Mannheim #60328501)中，并將100ul此溶液加入每個孔中，在室溫或37℃溫育1小時。最后，在405nm測定OD。將得自用編碼mAb載體轉(zhuǎn)染的細胞的上清樣品溶解并稀釋于0.5％奶/0.05％ Tween/PBS中。如果樣品不符合標準曲線的線性范圍，使用其它稀釋液。
實施例27在人體細胞中生產(chǎn)用于重組亞單位疫苗的流感HA和NA蛋白確定編碼已知的和規(guī)律性出現(xiàn)的新流感病毒株的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的基因的cDNA序列，并用引物通過PCR產(chǎn)生這些cDNA序列，以方便地克隆入pcDNA2000，pcDNA2001，pcDNA2002和pcDNAs3000載體中(見實施例1)。接著，將這些所得表達載體轉(zhuǎn)染入PER.C6及其衍生物中，以穩(wěn)定和瞬時表達重組蛋白，使重組HA和NA蛋白因此可在嚴格的和限定的條件下，用人體細胞經(jīng)完全標準化方式生產(chǎn)。將細胞在標準時間內(nèi)培養(yǎng)以累積這些重組HA和NA蛋白。當使用pcDNAs3000載體時，可同時克隆這兩個cDNA’s，并使細胞同時生產(chǎn)這兩種蛋白。從分離的或組合的培養(yǎng)物中，通過標準方法純化蛋白質(zhì)，及通過本領(lǐng)域已知方法確定最終HA和NA滴度，并檢測蛋白質(zhì)的活性。然后，將純化的重組蛋白用于免疫接種研究，并最終用于大規(guī)模免疫接種。
豬流感病毒A/豬/Oedenrode/7C/96的HA1片段(Genbank登記號AF092053)，是通過PCR獲得的，使用具有以下序列的正向引物5’-ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGAGCT AC 3’，和具有以下序列的反向引物5’-GAT GCT AGC TCATCT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT CCG 3’。將所得1.0kb的PCR產(chǎn)物用AscI和NheI限制酶消化，并與經(jīng)AscI和NheI消化的及純化的pcDNA2001/DHFRwt載體連接，產(chǎn)生pcDNA2001/DHFRwt-swHA1。另外，將相同病毒的HA2片段通過PCR擴增，使用與HA1相同正向引物，和具有以下序列的另一種反向引物5’GATGCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC3’。將所得1.6kb的HA2 PCR產(chǎn)物以與HA1相同方式克隆，產(chǎn)生pcDNA2001/DHFRwt-swHA2。
實施例28整合編碼翻譯后修飾酶的cDNA′s由于在穩(wěn)定及瞬時轉(zhuǎn)染和感染的PER.C6和PER.C6/E2A中重組蛋白的生產(chǎn)水平非常高，及由于MTX濃度提高在依賴于DHFR的擴增時通常獲得更高表達水平，所以參與翻譯后修飾的酶的內(nèi)源水平可發(fā)生“超出滴定范圍”。因此，編碼參于不同種類翻譯后修飾和加工如糖基化，磷酸化，羧化，折疊和運輸?shù)娜祟惷傅腸DNA’s，在PER.C6和PER.C6/E2A中是過表達的，在小和大裝置中均能生產(chǎn)更有功能的重組蛋白至極限水平。CHO細胞可遺傳工程化以導入α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，從而增強tPA和人紅細胞生成素的表達和生物活性(Zhang等，1998；Minch等，1995；Jenkins等，1998)。其它基因如β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶也可導入昆蟲和CHO細胞中，以改良N聯(lián)寡糖分支結(jié)構(gòu)，和增強唾液酸在末端殘基的濃度(Weikert等，1999；Hollister等，1998)。PER.C6細胞通過整合編碼α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和β-1，4一半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA’s而修飾，以進一步提高在人體細胞系中產(chǎn)生的重組蛋白的唾液酸含量。
實施例29通過腺病毒E1B在CHO-dhfr細胞中的過表達而抑制細胞程序死亡已知過表達重組外源蛋白的中國倉鼠卵巢細胞，對細胞程序死亡信號高度敏感，與野生型或衍生這些細胞的起源細胞相比，導致在這些穩(wěn)定生產(chǎn)細胞系中死亡率通常較高。另外，當在轉(zhuǎn)染中使用如Lipofectamine時，CHO細胞死于細胞程序死亡。因此，CHO細胞在生產(chǎn)重組蛋白中存在很大弊端，即細胞非常容易由于不同原因而死于細胞程序死亡。由于已知腺病毒的E1B基因有抗細胞程序死亡作用(White等，1992；Yew和Berk，1992)，將表達所述抗體重鏈和輕鏈的穩(wěn)定CHO-dhfr細胞(見實施例3′4，和5)，用腺病毒E1BcDNA’s轉(zhuǎn)染，以穩(wěn)定或瞬時表達E1B蛋白，最終保證在這些細胞中細胞程序死亡的作用較低，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。將瞬時轉(zhuǎn)染的細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞與野生型的CHO-dhfr細胞，在FACS分析中對比由于轉(zhuǎn)染方法或由于它們過表達重組蛋白所致的細胞死亡情況。產(chǎn)生穩(wěn)定的CHO細胞系，其中腺病毒的E1B蛋白是過表達的。接著，將由于這些穩(wěn)定的產(chǎn)生E1B的CHO細胞中Lipofectamine的作用而產(chǎn)生的細胞程序死亡應答，與沒有E1B基因的親本細胞的細胞程序死亡應答相對比。這些試驗是用FACS分析和能確定細胞程序死亡率的商購試劑盒進行的。
實施例30通過腺病毒E1B在人體細胞中過表達抑制細胞程序死亡PER.C6細胞及其衍生物確實表達腺病毒的E1A和E1B基因。其它人體細胞如A549細胞用于穩(wěn)定過表達腺病毒E1B，以確定存在腺病毒E1B基因?qū)辜毎绦蛩劳龅淖饔茫珀P(guān)于CHO細胞所述內(nèi)容(見實施例29)。大多數(shù)細胞確實對轉(zhuǎn)染劑如Lipofectamine或其它陽離子脂質(zhì)應答，導致嚴重細胞程序死亡，最終導致分泌的重組蛋白濃度較低，主要是由于在此處理中只有少量細胞存活。比較穩(wěn)定的E1B過表達細胞與親本的細胞系對毒性蛋白過表達或細胞程序死亡誘導蛋白的應答，及對轉(zhuǎn)染劑如Lipofectamine的應答。
實施例31產(chǎn)生缺失功能性DHFR蛋白的PER.C6衍生的細胞系將PER.C6細胞用不同的系統(tǒng)剔除DHFR基因，以獲得可用于擴增外源性整合的DHFR基因的細胞系，所述DHFR基因是在實施例1-5所述的載體上或其它DHFR表達載體上編碼的。篩選PER.C6細胞的不同染色體存在情況，并選擇攜帶人DHFR基因的低拷貝數(shù)的染色體。接著，將這些細胞用于剔除試驗，其中DHFR基因的開放讀框被破壞并由選擇標記取代。為獲得雙剔除的細胞系，除去這兩個等位基因，通過用不同的選擇標記同源重組或其它系統(tǒng)如關(guān)于CHO細胞所述的系統(tǒng)(Urlaub等，1983)進行。
也可使用其它系統(tǒng)，其中DHFR蛋白的功能性較低或完全除去，例如通過使用抗有義RNA或經(jīng)RNA/DNA雜交體，其中此基因未除去或剔除，但此基因的下游產(chǎn)物的功能被干擾。
實施例32用蛋白酶和神經(jīng)氨酸酶抑制劑長期生產(chǎn)重組蛋白將實施例8所述的穩(wěn)定克隆用于在有或無MTX，血清和蛋白酶抑制劑的情況下長期表達。穩(wěn)定或轉(zhuǎn)染的細胞在累積重組人EPO蛋白的幾天期間，觀測到平坦曲線而非直線增加，表明累積的EPO隨著時間而降解。這也許是由于外在因素如光線或溫度等所致滅活也可由于由存活的細胞產(chǎn)生的或死亡的細胞裂解釋放的特異蛋白酶消化重組EPO蛋白所致。因此，轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入提高濃度的CuSO4，并對穩(wěn)定生產(chǎn)細胞檢測更穩(wěn)定的生產(chǎn)曲線將細胞培養(yǎng)幾天并在不同時間確定EPO數(shù)量。已知CuSO4是蛋白酶活性的抑制劑，其在下游處理和EPO純化期間可易于除去。在基于DNA轉(zhuǎn)染和病毒感染的瞬時表達之后，最佳濃度的CuSO4用于生產(chǎn)重組人EPO蛋白。另外，最佳濃度的CuSO4還用于在穩(wěn)定的克隆中生產(chǎn)EPO。在EPO中存在末端唾液酸對保證重組蛋白的長半衰期是重要的情況下，必需生產(chǎn)高唾液酸化的EPO。由于活細胞產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶，該酶可由應力因素活化而分泌，由于這些應力因素使得產(chǎn)生的EPO釋放其唾液酸并產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶。為防止唾液酸的剪掉，在培養(yǎng)基中加入神經(jīng)氨酸酶抑制劑，導致唾液酸長期吸附于產(chǎn)生的EPO。
實施例33在人體細胞中用可擴增的谷氨酰胺合成酶系統(tǒng)穩(wěn)定表達重組蛋白質(zhì)將PER.C6及其衍生物通過谷氨酰胺合成酶(GS)系統(tǒng)，用于穩(wěn)定表達重組蛋白。首先，檢測細胞在不含谷氨酰胺培養(yǎng)基中的生長能力。如果細胞在不含谷氨酰胺培養(yǎng)基中不能生長，意味著這些細胞不表達足夠的GS，最終導致細胞死亡。GS基因可作為選擇標記整合入表達載體中(如針對DHFR基因所述內(nèi)容)，并可通過提高甲硫氨酸sulphoximine(MSX)濃度，引起相應重組蛋白過表達而擴增，因為完全穩(wěn)定整合的載體將被共擴增，如DHFR所示出的一樣。在Sanders等(1984)報道之后，GS基因表達系統(tǒng)具有可行性，而且Cockett等(1990)比較了DHFR選擇系統(tǒng)與GS之間的不同。使用GS生產(chǎn)重組mAbs首先由Bebbington等(1992)闡述。
如實施例1所述將GS基因克隆入載體主鏈中，或?qū)⒕幋a重組蛋白和mAbs的重鏈和輕鏈的cDNA’s克隆入攜帶GS基因的適當載體中。接著，將這些載體轉(zhuǎn)染入PER.C6中，并在使細胞通過載體的穩(wěn)定整合而生長的MSX濃度下選擇。
實施例34在人體細胞中生產(chǎn)重組HIV gp120蛋白確定編碼來自人免疫缺陷病毒(HIV)的高度糖基化的包膜蛋白gp120的cDNA，并用引物通過PCR獲得該cDNA，所述引物在上游具有完全Kozak序列以正確開始翻譯，及具有常規(guī)的限制識別序列以克隆入實施例1所述的表達載體中。接著，對PCR產(chǎn)物的兩個鏈均進行測序，以確定沒有引入PCR錯誤。
將表達載體轉(zhuǎn)染入PER.C6，其衍生物和CHO-dhfr細胞中，以獲得穩(wěn)定的生產(chǎn)細胞系。CHO產(chǎn)生的和PER.C6產(chǎn)生的gp120之間糖基化不同，是在2D電泳試驗和隨后的質(zhì)譜試驗中確定的，因為gp120是具有主要為O-聯(lián)的寡糖的重度糖基化的蛋白質(zhì)。通過本領(lǐng)域已知方法純化重組蛋白，接著用于功能性及其它分析中。純化的蛋白質(zhì)用于免疫接種目的，以預防HIV感染。


1.pcDNA2000/DHFRwt2.pcDNA2001/DHFRwt3.pcDNA2002/DHFRwt4.pcDNAs3000/DHFRwt5.pEPO2000/DHFRwt6.pAdApt.EPO7.pHC2000/Hyg(-)8.pLC2001/DHFRwt9.pUBS-Heavy2000/Hyg(-)10.pUBS-Light2001/DHFRwt11.pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)12.pUBS2-Light2001/DHFRwt13.pUBS-3000/DHFRwt14.pUBS2-3000/DHFRwt15.在2升灌流生物反應器中以ELISA單位/ml給定的EPO濃度。
16.在2升重復分批生物反應器中EPO濃度，其中每2-3天將細胞密度調(diào)整為0.5×106個細胞/ml。
17.在不同條件的4×1升重復分批生物反應器中，在用0.3×106個細胞/ml接種3天后，來自穩(wěn)定生產(chǎn)的P9細胞中的EPO濃度。左側(cè)，溶解氧的不同設(shè)定值。中間，不同溫度。右側(cè)，不同的恒定pH值。對P9細胞的標準設(shè)定為50％DO，37℃和pH7.3。在每輪發(fā)酵中進行具有這些設(shè)定值的單獨對照發(fā)酵，如每系列的第4條所述。
18.在PER.C6衍生的細胞系P8和P9中，隨著MTX濃度提高的EPO產(chǎn)量，以ELISA單位/106個種植的細胞/天計算。
19.隨著MTX濃度提高，DHFR基因的擴增。衍生自正常PER.C6細胞(在存在MTX的情況下不生長)及P8和P9細胞(在存在100nM，800nM和1800nM MTX的情況下培養(yǎng))的，經(jīng)BgIII消化的DNA的Southern印跡。此印跡首先與放射性的DHFR探針雜交，接著剝離，然后與放射性腺病毒E1探針作內(nèi)部對照溫育。
20.兩個細胞系P8(A)和P9(B)的重組EPO表達的穩(wěn)定性。將細胞在有或無MTX的情況下，在4個月以上的時間內(nèi)培養(yǎng)大約60代，EPO產(chǎn)量以ELISA單位/106個種植的細胞/天計算。
21.與CHO細胞對比，在PER.C6細胞中β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的活性。A用EPO表達質(zhì)粒(左)和Eprex(右)轉(zhuǎn)染的PER.C6細胞上清中EPO的Western印跡。PER.C6-EPO在未處理的(1泳道)，用NDV衍生的神經(jīng)氨酸酶在兩個單獨的緩沖液中處理后的(2和3泳道)，及用VC衍生的神經(jīng)氨酸酶處理后的(4泳道)條件一電泳。Eprex也是在未處理的(5泳道)，和用神經(jīng)氨酸酶相似處理的(5-8泳道)條件下電泳。B.與用非凝集素處理的細胞(空心區(qū)域)進行的FACS分析相對比，PER.C6(右側(cè)組)和CHO細胞(左側(cè)組)的FACS分析位移，這兩種細胞用識別與細胞溫育的兩種DIG連接的凝集素的抗DIG抗體處理(產(chǎn)生黑色區(qū)域)，所述兩種DIG連接的凝集素特異性識別唾液酸和半乳糖之間的α-2，6-連接(Sambucus nigra凝集素，上組)，和α-2，3唾液酸-半乳糖連接(Maackia amurensis凝集素，下組)。
22.在不同培養(yǎng)裝置下產(chǎn)生的重組EPO的2D/Western分析。A.將穩(wěn)定表達重組人EPO的P9細胞生長于T175燒瓶中的DMEM培養(yǎng)基中，和滾瓶和生物反應器中的JRH ExCell 525培養(yǎng)基中，并進行2D電泳分離，印跡并與H162溫育，H162是一種抗EPO抗血清。將含有全部范圍的含有唾液酸的EPO樣品(來自P9上清)，與商購的Eprex(左側(cè))相對比，商購的Eprex只包含含有較高唾液酸的EPO。B.將衍生自生長于貼壁裝置的DMEM培養(yǎng)基中的貼壁P9細胞的EPO，與衍生自瞬時轉(zhuǎn)染的CHO細胞的EPO相對比，CHO細胞也是在DMEM中培養(yǎng)的。在培養(yǎng)期間存在PBS，但在EPO開始累積之前除去。這些樣品(1-14)中推測的唾液酸含量在兩個印跡之間表示。
23.與在CHO細胞中產(chǎn)生的商購的Eprex相比，用人TF-1細胞在37℃生產(chǎn)的PER.C6/E2A-EPO的體外功能分析，24.用抗人IgG1重鏈抗體，對用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt共轉(zhuǎn)染(6泳道)，或用各自的載體轉(zhuǎn)染(4和5泳道)的PER.C6細胞上清，進行Western印跡。作為陽性對照，加樣稀釋的人血清(IgG，泳道1)，作為陰性對照，用編碼LacZ的表達載體轉(zhuǎn)染(對照，泳道3)，及加樣標記物(M，大小未標示)(泳道2)。上面一組得自用轉(zhuǎn)染物的樣品加樣的凝膠，該轉(zhuǎn)染物未用DTT處理，其中重鏈和輕鏈的二硫鍵保持完整，并對大約220kD的全長mAb進行檢測。下面一組示出用DTT處理的相同轉(zhuǎn)染物的樣品，其中二硫鍵被除去，導致重鏈和輕鏈完全分離。將印跡與識別人IgG1重鏈的抗體溫育。由于用于ECL-western步驟的二抗(多克隆)的背景識別，輕鏈被染色。
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表重組EPO的產(chǎn)量表1在與不同濃度MTX溫育6和15天后，氨甲喋呤(MTX)殺死PER.C6和PER.C6/E2A的概況。細胞在0天接種，在第1天開始與MTX溫育，并持續(xù)溫育6天。然后評價鋪滿率(％)，并將培養(yǎng)基用加上MTX的新鮮培養(yǎng)基更換，再持續(xù)溫育9天。之后再評價鋪滿率(％)(第15天)。

表2穩(wěn)定表達重組人EPO的貼壁的PER.C6和PER.C6/E2A細胞系。細胞系是通過穩(wěn)定整合和表達pEPO2000/DHFRwt產(chǎn)生的(圖5)。在含有100nM MTX的T25燒瓶中生長4天后，在上清中確定產(chǎn)量水平。


表3內(nèi)源性和整合的DHFR DNA的擴增率。圖19中Southern印跡中的雜交帶的強度是在磷光顯影計中測定的，并校正背景水平以最終計算內(nèi)源性和整合的DHFR基因的大約擴增率。


表4在瞬時DNA轉(zhuǎn)染中EPO的產(chǎn)量。每106個種植的細胞的產(chǎn)量是經(jīng)EPO ELISA在PER.C6，PER.C6/E2A和CHO細胞的上清中確定的，所述細胞用pEPO2000/DHFRwt表達載體轉(zhuǎn)染，并在有或無胎牛血清，在不同溫度下溫育，如實施例12所述。

表5在病毒感染后所得EPO產(chǎn)量。每106個種植的細胞的產(chǎn)量是經(jīng)EPO ELISA在PER.C6細胞的上清中確定的，PER.C6細胞用重組IG.Ad5.AdApt.EPO.dE2A腺病毒感染，如實施例14所述。在兩個不同裝置(滾瓶懸浮培養(yǎng)和6孔貼壁培養(yǎng))，以不同vp/IU比率(330和560)使用兩批不同的病毒。

權(quán)利要求
1.一種在細胞中生產(chǎn)至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)的方法，包括提供一種真核細胞，該細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，該細胞不從其基因組或整合入其中的序列編碼結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白，所述方法包括提供編碼重組蛋白質(zhì)物質(zhì)的基因給所述細胞，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞，并從所述細胞和/或所述培養(yǎng)基中收獲至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)。
2.一種在真核細胞中增加重組蛋白質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)的方法，包括提供編碼至少一部分所述蛋白質(zhì)物質(zhì)的核酸給所述真核細胞，其中所述編碼序列在CMV啟動子，E1A啟動子或其功能性同源物，衍生物和/或片段的控制下，并且進一步提供E1A活性或類E1A活性所述細胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
4.權(quán)利要求1-3的任一方法，其中所述細胞是人體細胞。
5.權(quán)利要求1-4的任一方法，其中所述收獲的至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)是由所述基因編碼的。
6.一種在細胞中生產(chǎn)至少一種人體重組蛋白的方法，包括提供一種編碼所述人體重組蛋白的基因給人體細胞，該細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，且該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞，并從所述細胞和/或所述培養(yǎng)基中收獲至少一種蛋白質(zhì)物質(zhì)。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述腺病毒的至少一種E1蛋白包括E1A蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述腺病毒的至少一種E1蛋白包括E1B蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
9.權(quán)利要求1-8的任一種方法，其中所述細胞與通常的哺乳動物細胞系相比，能生產(chǎn)2-200倍多的重組蛋白和/或蛋白質(zhì)物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述通常的哺乳動物細胞系選自CHO，COS，Vero，Hela，BHK，和Sp-2細胞系。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述重組蛋白和/或蛋白質(zhì)物質(zhì)是經(jīng)過翻譯后和/或翻譯期間修飾的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述修飾包括糖基化。
13.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述重組蛋白和/或蛋白質(zhì)物質(zhì)是紅細胞生成素，或其功能性衍生物，同源物或片段。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述人體細胞在24小時內(nèi)每一百萬個細胞能產(chǎn)生超過100單位的紅細胞生成素或其功能性衍生物。
15.權(quán)利要求13的方法。其中所述人體細胞在24小時內(nèi)每一百萬個細胞能產(chǎn)生超過500單位的紅細胞生成素或其功能性衍生物。
16.權(quán)利要求13的方法。其中所述人體細胞在24小時內(nèi)每一百萬個細胞能產(chǎn)生超過1000單位的紅細胞生成素或其功能性衍生物。
17.權(quán)利要求13的方法。其中所述人體細胞在24小時內(nèi)每一百萬個細胞能產(chǎn)生超過5000單位的紅細胞生成素或其功能性衍生物。
18.一種通過存在至少一種腺病毒E1蛋白或其功能性衍生物，同源物和/或片段而無限增殖化的重組哺乳動物細胞，其進一步包括一種功能性形式的核酸，以表達免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)或其功能性衍生物，同源物和/或片段。
19.權(quán)利要求18的重組哺乳動物細胞，其中所述至少一種腺病毒E1蛋白包括E1A蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
20.權(quán)利要求18或19的重組哺乳動物細胞，其中所述至少一種腺病毒E1蛋白包括E1B蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
21.權(quán)利要求18-20任一項的重組哺乳動物細胞，其包含編碼至少一種腺病毒E1蛋白的衍生自腺病毒的核酸。
22.權(quán)利要求21的重組哺乳動物細胞，其中所述衍生自腺病毒的核酸編碼E1A和/或E1B蛋白。
23.權(quán)利要求18-22任一項的重組哺乳動物細胞，其中所述細胞衍生自原代細胞。
24.權(quán)利要求18-23任一項的重組哺乳動物細胞，其衍生自人體細胞。
25.權(quán)利要求24的重組哺乳動物細胞，其是ECACC保藏號為96022940的PER.C6或其衍生物。
26.權(quán)利要求18-25的任一項的重組哺乳動物細胞，其中所述細胞還包括編碼E2A或其功能性同源物，片段和/或衍生物的核酸。
27.權(quán)利要求26的重組哺乳動物細胞，其中所述編碼E2A的的核酸包括溫度敏感性突變體E2A。
28.權(quán)利要求18-27任一項的重組哺乳動物細胞，其中所述功能性形式的用以表達至少一個可變區(qū)的核酸編碼免疫球蛋白的重鏈，可變重鏈，輕鏈和/或可變輕鏈。
29.權(quán)利要求18-28任一項的重組哺乳動物細胞，還包括另一種功能性形式的核酸，用以表達所述至少一個可變區(qū)的至少一個相應物(counterpart)。
30.權(quán)利要求18-29任一項的重組哺乳動物細胞，其中所述功能性形式的用以表達至少一個可變區(qū)和/或其至少一個相應物的核酸編碼ScFv。
31.權(quán)利要求18-30任一項的重組哺乳動物細胞，其中至少一個所述可變區(qū)包括人或人化的氨基酸序列。
32.權(quán)利要求18-31任一項的重組哺乳動物細胞，其中至少一個所述可變區(qū)是由在可誘導啟動子控制下的核酸編碼的。
33.一種生產(chǎn)免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)的方法，包括將權(quán)利要求18-32任一項重組哺乳動物細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，并從所述重組哺乳動物細胞和/或所述培養(yǎng)基中收獲所述免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述重組哺乳動物細胞每天每106個細胞能生產(chǎn)超過10μg的所述免疫球蛋白的至少一個所述可變區(qū)。
35.權(quán)利要求18-34任一項的重組哺乳動物細胞在生產(chǎn)免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)中的應用，所述免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)具有不同于其分離的天然相應物(counterpart)的翻譯后修飾。
36.權(quán)利要求35的應用，其中所述細胞每天每106個細胞能生產(chǎn)超過10μg的所述免疫球蛋白的至少一個所述可變區(qū)。
37.一種免疫球蛋白或其功能性部分，同源物和/或衍生物，其可通過權(quán)利要求33或34的方法，或權(quán)利要求35或36的應用獲得。
38.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求37的免疫球蛋白的至少一個可變區(qū)。
39.權(quán)利要求37的免疫球蛋白或其功能性部分，同源物和/或衍生物在治療個體中的應用。
40.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述重組蛋白和/或所述蛋白質(zhì)物質(zhì)包括一種非腺病毒蛋白的病毒蛋白。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括至少一種流感病毒神經(jīng)氨酸酶和/或血凝素。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括腸道病毒或其功能性等價物。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述腸道病毒包括鼻病毒，口蹄疫病毒或脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白。
44.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括皰疹病毒蛋白或其功能性等價物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述皰疹病毒蛋白包括單純皰疹病毒，假狂犬病病毒或牛皰疹病毒蛋白。
46.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括正粘病毒蛋白。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述正粘病毒蛋白包括流感病毒，副粘病毒，如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒蛋白。
48.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，細小病毒或乳多空蛋白。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白包括人免疫缺陷病毒蛋白。
50.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括輪狀病毒或冠狀病毒蛋白。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述輪狀病毒或冠狀病毒蛋白包括傳染性胃腸炎病毒或黃病毒，如壁虱腦炎病毒，或黃熱病病毒蛋白。
52.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括披膜病毒，如風疹病毒蛋白，或東方、西方或委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒蛋白。
53.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括肝炎病毒蛋白，如甲型肝炎病毒蛋白或乙型肝炎病毒蛋白。
54.權(quán)利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括瘟病毒屬蛋白，如豬瘟病毒蛋白或彈狀病毒屬蛋白，如狂犬病毒蛋白。
55.一種人體細胞在生產(chǎn)用于疫苗的至少一種病毒蛋白中的應用，所述人體細胞的基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白。
56.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54的任一項的方法，其中所述細胞衍生自原代細胞。
57.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54或56任一項的方法，其中所述人體細胞通過存在所述E1編碼序列而無限增殖化。
58.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56或57任一項的方法，其中所述細胞在其基因組中還包括編碼E2A，或其功能性衍生物，或類似物或片段的序列。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述E2A編碼序列編碼溫度敏感性突變體E2A。
60.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-59任一項方法，其中所述人體細胞不包括其它腺病毒序列。
61.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-60任一項的方法，其中所述人體細胞能懸浮培養(yǎng)。
62.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-61任一項的方法，其中所述細胞是ECACC保藏號為96022940的PER.C6，或其衍生物。
63.權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-62任一項的方法，其中所述人體細胞能在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
64.一種人體細胞在生產(chǎn)重組蛋白中的應用，所述人體細胞基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白。
65.權(quán)利要求64的應用，其中所述人體細胞與通常的哺乳動物細胞系相比，能產(chǎn)生2-200倍多的重組蛋白。
66.權(quán)利要求64或65的應用，其中所述細胞衍生自原代細胞。
67.權(quán)利要求64-66的應用，其中所述人體細胞是PER.C6或其衍生物。
68.權(quán)利要求64-67的應用，其中所述細胞基因組中還包括編碼E2A或其功能性衍生物或類似物或片段的序列。
69.權(quán)利要求68的應用，其中所述E2A編碼序列編碼溫度敏感性突變體E2A。
70.一種根據(jù)權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一項的方法獲得的重組蛋白，所述重組蛋白具有不同于分離的天然相應蛋白的人糖基化模式。
71.一種重組紅細胞生成素分子，通過權(quán)利要求1-17，56-63的方法，或權(quán)利要求64-69的人體細胞的應用而獲得。
72.一種人體細胞，其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性腺病毒蛋白，并具有編碼重組蛋白的基因。
73.權(quán)利要求72的人體細胞，其衍生自ECACC保藏號為96022940的PER.C6。
74.權(quán)利要求72或73的人體細胞，在其基因組中還包括編碼E2A或其功能性衍生物，類似物或片段的序列。
75.權(quán)利要求74的人體細胞，其中所述E2A是溫度敏感性的。
76.權(quán)利要求18-32，72-76任一項的細胞，其中內(nèi)源性DHFR核酸至少功能性缺失。
77.權(quán)利要求76的細胞在權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一項方法中的應用，或在權(quán)利要求35，36，39，55，64-69任一項應用中的應用。
78.通過權(quán)利要求1-12，40-63的任一項的方法，或 64-69任一項的應用而獲得的用于疫苗中的一種病毒蛋白，所述病毒蛋白不含任何非人哺乳動物蛋白質(zhì)物質(zhì)。
79.具有抗細胞程序死亡活性的腺病毒E1B蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段在增強真核細胞中蛋白質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)中的應用，所述應用包括提供所述E1B蛋白，其衍生物，同源物和/或片段給所述真核細胞。
80.權(quán)利要求79的應用，包括權(quán)利要求18-32，72-78的細胞。
81.權(quán)利要求79或80的應用，用于權(quán)利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一項的方法中，或權(quán)利要求35，36，39，55，64-69任一項的應用中。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用編碼腺病毒的至少一種E1蛋白的序列在人體細胞系中生產(chǎn)重組蛋白的方法和組合物,其中所述細胞的基因組不編碼腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明的方法和組合物特別適用于產(chǎn)生經(jīng)翻譯后修飾如糖基化的感興趣人重組蛋白的穩(wěn)定表達。這種蛋白質(zhì)與其在非人系統(tǒng)如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中生產(chǎn)的相應物相比可具有有利的性質(zhì)。
文檔編號A61K39/145GK1360638SQ00808938
公開日2002年7月24日 申請日期2000年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月15日
發(fā)明者古阿斯·阿特布爾, 卡林娜·科妮莉亞·費爾胡爾斯特, 戈韋·約翰·斯豪滕, 阿方薩斯·赫拉爾杜斯·科內(nèi)利斯·瑪, 麗亞·烏伊德哈格, 亞伯拉罕·布特 申請人:荷蘭克魯塞爾公司