專利名稱：肝癌細(xì)胞特異的基因工程腺病毒的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝癌細(xì)胞特異的基因工程腺病毒的構(gòu)建及應(yīng)用。
腺病毒是一種雙鏈DNA病毒。除了引起呼吸道疾病及象感冒癥狀之外，至今未發(fā)現(xiàn)腺病毒引起其它嚴(yán)重疾病。腺病毒的基因組有36000左右堿基對(duì)。編碼的基因分為早期基因和晚期基因。早期基因當(dāng)中除了基因組3之外，其它基因都是病毒復(fù)制繁殖所必需的。象基因組E1，E2和E4缺失的病毒變種在一般細(xì)胞中是不會(huì)復(fù)制繁殖的(Shenk T.，F(xiàn)undamantal Virology，Third Edition，979-1005，1996)?，F(xiàn)在常用的腺病毒載體，都是復(fù)制缺陷型(Replication-deficient)。由于腺病毒基因組的基因表達(dá)調(diào)控已研究得較清楚，同時(shí)腺病毒可以感染各種類型的細(xì)胞，不會(huì)引起嚴(yán)重疾病，不會(huì)整合到染色體中去，腺病毒很穩(wěn)定且易生產(chǎn)。因此腺病毒被認(rèn)為可發(fā)展成具有巨大應(yīng)用潛力的基因治療的載體。
早在上世紀(jì)50年代，腺病毒就被科學(xué)家用來嘗試治療腫瘤。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的Smith博士等人嘗試?yán)靡吧偷南俨《局委熥訉m癌(Smith et.al.，Cancer 91211-1218，1956)。他們把腺病毒直接注射到原位子宮腫瘤中，發(fā)現(xiàn)65％的病人表現(xiàn)出療效。同時(shí)沒有一位病人出現(xiàn)任何副作用(Smith et.al.，Cancer 91211-1218，1956)?？上У氖怯捎诋?dāng)時(shí)病毒純化技術(shù)的落后和子宮腫瘤注射操作的困難，使得這項(xiàng)試驗(yàn)沒有進(jìn)展下去。
直到1996年，美國(guó)的ONYX制藥公司，采用基因工程技術(shù)，將早期基因EIB當(dāng)中的p55K編碼區(qū)切除而改造成一種傾向于在p53腫瘤細(xì)胞缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的腺病毒變種dl1520(Barker and Berk，Virology 156107-121，1987)。這種病毒在p53缺陷的細(xì)胞中復(fù)制效率比在p53正常的細(xì)胞中要高100倍(Bischoff et.al.，Science 274373-376，1996)。但由于p55K蛋白的功能除了與p53結(jié)合而使p53失去活性的功能之外，還參與病毒信使RNA在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸。由于p55蛋白的缺失而嚴(yán)重影響到病毒mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，以致dl1520的復(fù)制能力比野生型腺病毒要低成千上萬倍(Babiss et.al.，Mol.Cell.Biol.52551-2558，1985)。這嚴(yán)重影響到它殺死腫瘤細(xì)胞的能力。
1997，美國(guó)另一家生物制藥公司—Calydon提出利用組織特異基因激活子去控制腺病毒的復(fù)制。他們成功地將人體前列腺細(xì)胞專一的抗原基因(PSA)的激活子和增強(qiáng)子放到腺病毒的早期基因EIA的激活子和編碼區(qū)之間，產(chǎn)生的基因工程病毒CN706在PSΛ+細(xì)胞中的復(fù)制水平比PSΛ-細(xì)胞中要高100倍(Rodrigucz et.al.，Cancer Research 572559-2563，1997)。隨后，另一家生物公司利用類似技術(shù)生產(chǎn)出傾向于在甲胎球蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞中復(fù)制的腺病毒變種(Avela041).他們將甲胎球蛋白(AFP)的激活子和增強(qiáng)子放到腺病毒早期基因IA的編碼區(qū)上面，取代EIA基因的激活子。早期基因EIB仍然由野生的EIB自己的激活子控制。這種變種在AFP+細(xì)胞中比在AFP-細(xì)胞中復(fù)制水平要高100至1000倍。動(dòng)物試驗(yàn)表明，這種變種能使AFP+腫瘤生長(zhǎng)放緩(Halleubeck et.al.，Human Gene Therapy101721-1733，1999)。但上述的幾種基因工程在肝臟腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制特異性不高，殺死腫瘤細(xì)胞的能力還有待進(jìn)一步提高。
本發(fā)明的目的是制備一種在肝臟腫瘤細(xì)胞中復(fù)制特異性更高，殺死腫瘤細(xì)胞能力更強(qiáng)的基因工程腺病毒。本發(fā)明的實(shí)施方案如下將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強(qiáng)子和靜止子被組裝成一個(gè)只在肝癌細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控的激活開關(guān)，取代腺病毒的早期表達(dá)基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達(dá)基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，這樣基因EIA和EIB在轉(zhuǎn)錄水平上同時(shí)受肝癌細(xì)胞專一的激活開關(guān)控制。同時(shí)在病毒的基因組中，將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除，以增加病毒殺死細(xì)胞的能力。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長(zhǎng)的基因(ENDOSTATIN)。經(jīng)過上述基因改造后成為本發(fā)明的SF-1人類腺病毒血清型5(保藏號(hào)CGMCC NO.0589，保藏日期2001年6月14日)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其原因1)利用一個(gè)腫瘤細(xì)胞專一基因激活開關(guān)同時(shí)控制病毒的兩個(gè)早期基因。在我們構(gòu)建的基因工程病毒SF-1中，病毒的兩個(gè)早期基因同時(shí)被一個(gè)腫瘤細(xì)胞專一的基因啟動(dòng)子所控制。這樣使SF-1中EIA和EIB的表達(dá)，同時(shí)受到肝臟腫瘤細(xì)胞的專一轉(zhuǎn)錄因子(HCCSS)在轉(zhuǎn)錄水平上的控制。而在翻譯水平上，基因EIB是通過翻譯中介因子來完成的。
以上介紹的幾種病毒變種都是只有一個(gè)基因被腫瘤基因開關(guān)控制，所以用本發(fā)明的SF-1的腺病毒的腫瘤細(xì)胞的特異性更高(要比以上介紹的幾種病毒變種在肝臟腫瘤細(xì)胞中復(fù)制的特異性高出100倍)。同時(shí)，利用一個(gè)腫瘤專一基因的激活開關(guān)同時(shí)控制兩個(gè)病毒基因而構(gòu)建只在腫瘤中復(fù)制的技術(shù)，在世界上還未見有報(bào)導(dǎo)。2)在我們構(gòu)建的肝癌專一的基因工程病毒變種中，早期基因EIB當(dāng)中的p19K蛋白編碼區(qū)以被切除?；駿IB編碼至少兩個(gè)蛋白，P55和P19。P19蛋白被認(rèn)為是抑制細(xì)胞雕亡的抑制蛋白，有了它，病毒感染之后死亡得較慢，而切除p19K蛋白的變種比野生型腺病毒的殺傷腫瘤的能力更強(qiáng)。這在我們的實(shí)驗(yàn)中以得到驗(yàn)證。因此，本發(fā)明制備的腺病毒變種比已發(fā)表的變種可能會(huì)有更好的治療腫瘤的效果。在腫瘤細(xì)胞專一的腺病毒中缺失P19K蛋白的工作，作者還未見報(bào)道。3)本發(fā)明制備的腺病毒變種中同時(shí)攜帶有腫瘤生長(zhǎng)所需血管的抑制基因。這樣制備的產(chǎn)品可以在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中隨著病毒的復(fù)制而不斷轉(zhuǎn)錄翻譯生產(chǎn)出抑制腫瘤血管生產(chǎn)的抑制劑，以進(jìn)一步達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的效果。這與發(fā)表的腺病毒變種也是不一樣的。利用腺病毒做載體，去表達(dá)血管生長(zhǎng)抑制因子，已有前例。但是，利用只感染腫瘤細(xì)胞的基因工程病毒去表達(dá)血管生長(zhǎng)因子，是本發(fā)明特征之一。4)本發(fā)明的基因工程病毒，不但表現(xiàn)出比所有已發(fā)表的癌細(xì)胞專一的病毒更好的特異性，而且能在靜脈給藥的情況下，6個(gè)星期內(nèi)治愈動(dòng)物身上的腫瘤，藥效特別好。本發(fā)明用于制備肝臟腫瘤細(xì)胞特異復(fù)制腺病毒的DNA組件組成有1)pXC 1，本質(zhì)粒購(gòu)于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人類腺病毒血清型5的左手6Kb左右的DNA序列，編碼早期基因EIA和EIB。2)pBHG11，本質(zhì)粒購(gòu)于加拿大的Microbix Biosystems，INC，含有人類腺病毒血清型5的全長(zhǎng)基因，但是其中從矸基對(duì)188至1339(包含病毒的包裝序列)和矸基對(duì)從27865至30995兩段DNA以被切除。3)甲胎球蛋白基因的調(diào)控開關(guān)(HCCSS)從人類基因組中分離出來，其中包括從矸基對(duì)-163至+34的激活子，從矸基對(duì)-3856至-3267的增強(qiáng)子和從矸基對(duì)-1800至-953的靜止子?？寺〉絧GEM-T載體(Promaga)之中。4)Endostatin基因來自于InvivoGen，Inc.它是抑制血管生長(zhǎng)的基因。
以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的用于建造肝臟腫瘤細(xì)胞特異性，并表達(dá)心血管形成生長(zhǎng)抑制劑基因工程腺病毒的制備和用途作了詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1SF-1人類腺病毒血清型5的制備兩個(gè)新的限制性脢切位點(diǎn)SpeI和SalI被通過定點(diǎn)突變方法加到pXC.1之中，然后將甲胎球蛋白的調(diào)控組件HCCSS兩端加上SpeI和SalI切口，然后用限制性內(nèi)切脢切割HCCSS將切割好的HCCSS片段克隆到通過SpEI和SalI切割的PXC.1之中。與此同時(shí)，在EIA和EIB基因之間加入一種翻譯中介因子，從而使EIB的翻譯受中介因子控制而產(chǎn)生中間質(zhì)粒WP-1，接著將進(jìn)行下一步驟。
質(zhì)粒pBHG11之中有Pac I單一限制脢切口，腺病毒早期基因E3之中的致死基因(ADP)被克隆到Pac I切口之中，然后再克隆ENDOSTATIN基因到此之中而產(chǎn)生中間質(zhì)粒WP-2，接著將進(jìn)行下一步驟。
中間質(zhì)粒WP-1和WP-2分別用NruI和ClaI內(nèi)切脢切割，并用phenol和chloroform純化溶在重蒸水之中(1μg/ml)。轉(zhuǎn)化有腺病毒左手區(qū)域大約6Kb片段DNA的293細(xì)胞種在玻璃皿之中，48小時(shí)之后達(dá)到80％左右的細(xì)胞密度。然后用Transfectin(Gibco，Lifescience)同DNA混合并轉(zhuǎn)化293細(xì)胞。8天之后細(xì)胞被括下來收集于15ml試驗(yàn)之中，然后注-80℃和+37℃凍融三次，細(xì)胞液用來轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并挑選單個(gè)分離的病毒斑點(diǎn)，6個(gè)病毒斑點(diǎn)被挑選并感染已生長(zhǎng)好的293細(xì)胞。5天左右時(shí)間，細(xì)胞裂變，收集細(xì)胞液于試管之中，并分裝到小試管之中，保存在負(fù)80℃的冰箱之中，用于以下實(shí)驗(yàn)。首先200微升的細(xì)胞液被用來提取DNA。然后用聚合鏈?zhǔn)椒从?PCR)重新驗(yàn)證得到病毒的結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，得到的病毒正如設(shè)計(jì)的那樣如

圖1病毒結(jié)構(gòu)示意圖。HCCSS被正確地放在早期基因EIA之上，早期基因EIB被用轉(zhuǎn)譯切入信號(hào)(TS)連于早期基因EIB之后。在早期基因區(qū)域E3，包含著ADP基因和ENDOSTATIN基因。經(jīng)上述分析，基因插入的位置和方向都正確。命名這個(gè)病毒為SF-1。實(shí)驗(yàn)比較1病毒在各種細(xì)胞中的復(fù)制8種人體細(xì)胞其中包括人體正常細(xì)胞內(nèi)體細(xì)胞(Human MicrovescularEndothelium Cells)微小通氣道細(xì)胞(Small airway cell)，人體肝臟細(xì)胞(humanhepatocytes)和人體成纖維細(xì)胞(fibroblast)。這些細(xì)胞和人體胸腺細(xì)胞(HBL-100)都不生產(chǎn)甲胎球蛋白，而肝臟腫瘤細(xì)胞Hep3B SW620和H1299都生產(chǎn)高水平的甲胎球蛋白。
將細(xì)胞長(zhǎng)在培養(yǎng)皿中，24小時(shí)之后，三種病毒(WT-Ad(由PXC.1提供)，SF-1和dl1520(由加州大學(xué)提供)被用來感染上述細(xì)胞(2PFU/cell)。四小時(shí)之后，培養(yǎng)基被取出，并用PBS洗一次細(xì)胞然后將新的培養(yǎng)基加入，在37℃含5％CO2的培養(yǎng)廂中培養(yǎng)72小時(shí)，然后細(xì)胞和培養(yǎng)基被一起收入到試管中。然后經(jīng)凍融三次，樣品用于分析有多少新的病毒復(fù)制繁殖起來。
圖2病毒在不同細(xì)胞中的復(fù)制效率結(jié)果表明，SF-1同野生型腺病毒(WT-Ad)相似，能有效地在甲胎球蛋白表達(dá)的細(xì)胞中復(fù)制繁殖，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生超過10000病毒感染顆粒。但是在甲胎球蛋白不生產(chǎn)的細(xì)胞中，野生型WT-Ad能有效地復(fù)制繁殖每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的病毒從1000至50000感染顆粒不等。有趣的是SF-1在這些非甲胎球蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞中基本上不復(fù)制。每個(gè)細(xì)胞生產(chǎn)的感染病毒顆粒從0.05至5個(gè)不等。這樣的復(fù)制水平比起它在甲胎球蛋白生產(chǎn)的肝臟腫瘤細(xì)胞中要低5000至50,000倍。說明SF-1傾向于在肝臟腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。
同樣dl1520在不同細(xì)胞中的復(fù)制繁殖效率也被檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)dl1520在肝臟腫瘤中的復(fù)制比野生腺病毒要低10至5000倍不等。而在非肝癌細(xì)胞中比SF-1復(fù)制又要好50至500倍。說明SF-1的腫瘤選擇性好，而dl1520沒有腫瘤細(xì)胞的選擇性。實(shí)驗(yàn)比較2病毒在人體正常微泡內(nèi)皮細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線將人體微泡內(nèi)皮細(xì)胞種在培養(yǎng)皿中，48小時(shí)之后之三種病毒去感染一個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞，4小時(shí)之后吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，再用PBS洗一遍，然后加新的培養(yǎng)基。然后在不同時(shí)間(6，12，24，36，48，72和108小時(shí))之后將細(xì)胞和培養(yǎng)基一起收集到試管中，凍融三次之后，在293細(xì)胞上檢測(cè)有多少新的病毒產(chǎn)生。
圖3病毒在人體微血管內(nèi)及細(xì)胞中的生長(zhǎng)的曲線表明了3種病毒在開始的24小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)比較相近，但24小時(shí)之后，野生型腺病毒和dl1520在人體微泡內(nèi)細(xì)胞中生長(zhǎng)的很好，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生20000和2000感染顆粒不等，而SF-1在這種細(xì)胞中基本上沒有什幺復(fù)制，表明SF-1的復(fù)制已被嚴(yán)格地限制至腫瘤細(xì)胞而不會(huì)在人體正常細(xì)胞中繁殖。實(shí)驗(yàn)比較3病毒殺死細(xì)胞的效率臟腫瘤細(xì)胞Hep3B種在96孔的培養(yǎng)皿中，24小時(shí)之后，用三種病毒(0.1PFU/Cell)各感染一個(gè)培養(yǎng)皿。然后分別在2天、4天、6天和8天之后測(cè)定細(xì)胞的線粒體活性而計(jì)算細(xì)胞存活率。
圖4病毒殺死肝癌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)曲線表明SF-1殺死Hep3B的效率要顯著高于dl1520，同時(shí)也高于野生型腺病毒，例如感染8天之后，SF-1殺死95％的細(xì)胞，野生型腺病毒殺死60％的細(xì)胞，而dl1520只殺死32％的細(xì)胞。這表明SF-1不但有顯著特異性殺死腫瘤細(xì)胞的活性，而且殺死肝癌細(xì)胞的效率很高。實(shí)驗(yàn)比較4病毒在動(dòng)物模型上殺死腫瘤細(xì)胞的試驗(yàn)首先在裸鼠上建立肝臟腫瘤模型。1×106個(gè)Hep3B細(xì)胞被注射到裸鼠的皮下，四周之后，腫瘤塊長(zhǎng)大到300mm3左右，然后往這些鼠的尾巴血管中注射9？1010顆粒的SF-1.每個(gè)星期測(cè)量腫塊的大小，并按以下公式計(jì)算腫塊的體積V＝長(zhǎng)X(寬)2/2。以注射前測(cè)量的體積為100％而得圖5肝癌動(dòng)物模型上的HEP3B腫瘤大小在接受SF-1靜脈注射之后的變化。表明腫瘤相對(duì)體積結(jié)果。
圖標(biāo)結(jié)果表明Hep3B在裸鼠上生長(zhǎng)很快。6個(gè)星期之后體積增加超過9倍。但是經(jīng)靜脈注射SF-1的老鼠背上的腫塊體積則沒有增加，反而降低，例如注射一針的老鼠腫瘤體積下降到原來注射前的87％，而注射二針的老鼠背上的腫瘤體積則下降到0。則表明SF-1有顯著的殺死腫瘤的能力，注射二針可以殺滅肝臟腫瘤。實(shí)驗(yàn)比較5病毒對(duì)肝癌腫瘤血管生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)方法同上述例六一樣，只是腫塊在SF-1注射之后一周和二周的時(shí)候被收割下來做成切片而用來檢測(cè)腫瘤血管的生長(zhǎng)情況。腫塊切片用CD31單克隆抗體去染色，這樣新生血管中內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)CD31蛋白的細(xì)胞都會(huì)被染成蘭色。圖6SE-1在肝癌動(dòng)物模型上的抗血管生長(zhǎng)的效應(yīng)。表明，沒有注射病毒的動(dòng)物背上腫塊中的血管被CD31抗體染成蘭色的當(dāng)做100％，而被注射SF-1的動(dòng)物背上的腫瘤塊能染成蘭色的在注射一個(gè)星期之后減少為對(duì)照動(dòng)物的42％，二個(gè)星期之后減少為對(duì)照動(dòng)物的18％。而注射dl1520的動(dòng)物，能被CD31抗體染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與對(duì)照相比變化不大，第一個(gè)星期為對(duì)照的98％，第二個(gè)星期為對(duì)照的80％。這組數(shù)據(jù)表明SF-1是一個(gè)具有顯著殺死心血管的，腫瘤細(xì)胞專一的基因工程病毒，具有抗血管增生的功效。
(A OAP上述例六一樣，只是腫塊在WV-A注射之后一周和二周的時(shí)候被收割下來做成切片而用來檢測(cè)腫瘤血管的生長(zhǎng)情況。腫塊切片用CD31單克隆抗體去染色，這樣新生血管中內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)CD31蛋白的細(xì)胞都會(huì)被染成蘭色。圖6表示，沒有注射病毒的動(dòng)物背上腫塊中的血管被CD31抗體染成蘭色的當(dāng)做100％，而被注射WV-A的動(dòng)物背上的腫瘤塊能染成蘭色的在注射一個(gè)星期之后減少為對(duì)照動(dòng)物的42％，二個(gè)星期之后減少為對(duì)照動(dòng)物的18％。而注射dl1520的動(dòng)物，能被CD31抗體染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與對(duì)照相比變化不大，第一個(gè)星期為對(duì)照的98％，第二個(gè)星期為對(duì)照的80％。這組數(shù)據(jù)表明WV-A是一個(gè)具有顯著殺死心血管的，腫瘤細(xì)胞專一的基因工程病毒，具有抗血管增生的功能。
圖1為病毒結(jié)構(gòu)示意2為病毒在不同細(xì)胞中的復(fù)制效率圖3為病毒在人體微血管內(nèi)及細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線圖4為病毒殺死肝癌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)曲線圖5為肝癌動(dòng)物模型上的HEP3B腫瘤大小在接受SF-1靜脈注射之后的變化圖6為SF-1在肝癌動(dòng)物模型上的抗血管生效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種肝癌細(xì)胞特異的基因工程腺病毒的構(gòu)建，其特征在于將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強(qiáng)子和靜止子被組裝成一個(gè)只在肝癌細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控的激活開關(guān)，取代腺病毒的早期表達(dá)基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達(dá)基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，并將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長(zhǎng)的基因(ENDOSTATIN)而改造而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的腺病毒其特征在于應(yīng)用于殺死肝癌細(xì)胞。
全文摘要
將人類的甲球蛋白基因的激活子，增強(qiáng)子和靜止子被組裝成一個(gè)只在肝癌細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控的激活開關(guān)，取代腺病毒的早期表達(dá)基因EIA的激活子。并且將病毒早期表達(dá)基因EIA和EIB用“翻譯中介因子”(TS)連起來，并將基因EIB中的19K蛋白編碼序列切除。在早期基因組3的基因中切割10.4K，10.7K和14.7K基因，并裝入抑制血管生長(zhǎng)的基因(ENDOSTATIN)而改造而成。主要用于殺死肝癌細(xì)胞的能力比現(xiàn)有技術(shù)強(qiáng)得多，實(shí)驗(yàn)表明，注射本發(fā)明的針劑，注射二針劑可殺死肝癌腫瘤。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1393559SQ0111990
公開日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者鄭嚴(yán)光 申請(qǐng)人:上海韋池生物技術(shù)有限公司