專利名稱：通過多位點結(jié)合的尋靶多體造影劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷成像的造影劑。具體說，本發(fā)明涉及新型多體化合物，其在結(jié)合時表現(xiàn)出改善的與生理相關(guān)的靶標如蛋白質(zhì)的親和力和驚人地改善的的弛豫率(relaxivity)特性。這種化合物包括a)兩個或多個影像增強的部分(“IEMs”)；b)兩個或多個靶標結(jié)合的部分(“TBMs”)，提供體內(nèi)定位和多體剛性化；c)用于上述部分連接的構(gòu)架(“骨架”)；d)將IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基(“連接基”)。
本發(fā)明還涉及包含這些化合物的藥物組合物，和在成像過程中用這些化合物和組合物于反差增強的用途。
背景技術(shù)：
診斷成像方法如磁共振成像(MRI)、X-射線、核放射性藥物成像、紫外線-可見光-紅外線光成像和超聲，已多年用于醫(yī)學診斷。人們用添加的造影劑來改善或增加成像的分辨率或提供特定的診斷信息。在一些情況中如用超聲波進行成像，造影劑的引入還是最近的事。
為了有效，造影劑必須與成像方法中所用的電磁輻射的波長相干涉，改變組織的物理特性來得到改變的信號，或在放射性藥物的情況中自身提供放射源。MRI和光學成像方法是獨特的成像技術(shù)，因為它們產(chǎn)生對化學環(huán)境敏感的復雜信號。雖然無論這些試劑在血漿中是游離的、或是結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它靶標、或被捕獲于骨骼中，從X-射線或放射性核素試劑得到的信號都是保持相同的，但一些MRI和光學成像的造影劑在不同的生理環(huán)境中有不同的信號特性。一種光學染料在結(jié)合時可表現(xiàn)出其吸光度、反射率、熒光、磷光、化學發(fā)光、散射或其它光學特性的變化。重要的是，造影劑必須充分靈敏且存在的濃度足夠高，從而能夠觀察到信號的變化。
通過增加IEM的數(shù)量來改善對比度的嘗試尋靶試劑應送遞有意義的濃度的成像部分到靶標，從而在成像過程中能觀察到信號的充分改善。獲得充足的靈敏度是一重要的問題，尤其對MRI而言，其需要濃度范圍為10-1000微摩爾(μM)的影像增強的部分來產(chǎn)生足夠的信號。如果要尋找的靶標以低濃度存在時，對尋靶試劑而言這一問題又進一步復雜化。例如，為了將以低于μM濃度存在的生物受體靶標成像，在靶標部位需要更大地提高信號來提供充足的成像對比度。業(yè)已通過用(1)藥物送遞載體，提供高局部濃度的造影劑，(2)單個造影劑中含有多個IEM[參見，Martin V.V.，等人Bioconjug.Chem.，6第616-23頁(1995)；Shukla，R.等人.，Mag.Reson.Med.，35第928-931(1996)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797頁(1998)]，或(3)具有改善的信號增強特性的特定結(jié)構(gòu)的IEM，來達到增加對比度的目的。理想的尋靶造影劑應有效地將IEM和改善的信號增強特性結(jié)合在一起。
為了將大量影像增強的部分結(jié)合到造影劑中，已將高濃度低分子量的造影劑裝在合適的藥物送遞載體中，如聚合載體或脂質(zhì)體[Bulte J.W.，等人，J.Magn.Reson.Imaging，9第329-335頁(1999)]。不幸的是，這些材料很難指向靶標。
為了增加影像增強部分的數(shù)量，研究者已經(jīng)創(chuàng)造了例如與多個IEM相締合的聚合物、樹枝狀聚合物(dendrimer)、和有機化合物。大量IEM如用于MRI的Gd(III)螯合物可以共價連接于聚合物上[Schunmann-Giapieri，G.等人，J.Invest.Rad.，26第969-974頁(1991)；Corot，C.等人Acta Rad.，38S412第91-99頁(1997)]和樹枝狀聚合物上[Jacques，V.，等人，J.Alloys Cmpd.，249第173-177頁(1997)；Margerum，L.D.，等人，J.Alloys Compd.，249第185-190(1997)；Toth，E.，等人Chem.Eur.J.2第1607-1615頁(1996)]。聚合試劑通常包括分子量分布很寬并很復雜的品種的混合物。這些異質(zhì)的特性對該試劑的性能有不良影響，且使表征變得困難。另外，在合成上很難選擇性地將TBM和多種IEM一起引入。因此，需要一種良好確定的同質(zhì)分子用作能對靶標提供充足成像增強作用的造影劑。
理論上樹枝狀聚合物(如“星芒樹枝狀聚合物”或“瀑布狀樹枝狀聚合物)提供了一種單高分子量的能讓許多IEM共價連接的品種[Fischer，M.等人，Angew，Chem.，Int.Ed.Eng.，38/7第884-905頁(1999)；Weiner，E.C.等人，Mag.Reson.Med.，31第1-8頁(1994)]。然而，與聚合物試劑一樣，樹枝狀聚合物存在明顯的合成上的問題，尤其當選擇性地引入組織特異性尋靶基團時。
已合成了帶有多個影像增強部分的有機分子。本文將這種類型的MRI造影劑稱為“多體螯合物”或“多體”，通常含有2-12個IEM[Shukla，R.等人，Mag.Reson.MEd.，35第928-931頁(1996)；Shukla，R.B.，等人，Acta Radiol.412第121-123頁(1997)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797頁(1998)]。多體螯合物的優(yōu)點包括(1)它們是均質(zhì)的分子，因此與聚合物和樹枝狀聚合物不同，它們具有單一的大小和結(jié)構(gòu)，(2)它們易合成和純化，和(3)容易結(jié)合入尋靶基團。不幸的是，多體螯合物改善MRI信號強度的能力令人失望地低。這是因為由于IEM數(shù)量的增加，與增強信號相關(guān)的質(zhì)子弛豫速率的增強降低了。因此，需要一種增加IEM數(shù)量時弛豫率不減少的造影劑來完成對靶的更高的信號增強。
通過減少造影劑的轉(zhuǎn)動來改善對比度的嘗試已嘗試了通過限制轉(zhuǎn)動運動來增加非-尋靶多體MRI造影劑的弛豫。限制轉(zhuǎn)動運動的嘗試著重于(1)減少分子的柔韌性或(2)通過與靶標結(jié)合限制轉(zhuǎn)動運動。
例如，已合成了帶有連接多個Gd(III)螯合物的剛性構(gòu)架的非-尋靶試劑[Shukla，R.等人，Mag.Reson.Med.35第928-931頁(1996)；Shukla，R.B.，等人ActaRadiol.412第121-123頁(1997)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797頁(1998)；Jacques，V.等人，J.Allovs Cmpd.，249第173-177頁(1997)]。然而，這些結(jié)構(gòu)存在一些缺陷。首先，對于含有兩個以上螯合物的試劑，每個Gd(III)離子所達到的弛豫性比在單個螯合物(如MS-325)中所觀察到的要小。因此，局部螯合物的運動還可進一步減少。第二，這些試劑不是定向的。更重要的是，即使它們是定向的，剛性多體構(gòu)架也將大大增加不需要的背景信號，因為無論造影劑是否結(jié)合于靶標上，都將明顯增加信號。因此，需要一種僅在結(jié)合于靶標時才增強信號的造影劑。
在非共價靶標信號時，信號IEM的轉(zhuǎn)動運動可以有效地被限制，從而將靶標-結(jié)合形態(tài)的弛豫率增加5-10倍之多[美國專利No.4,880,008]。這種弛豫率的增加與在共價連接于靶標的IEM中所觀察到的一樣良好或更好[Schmiedl，U.，Ogan，M.，Paajanen，H.，Martti，M.，Crooke，L.E.，Brito，A.C.和Brash，R.C.Invest.Radio.(1987)22第665-71頁]。利用這種作用的試劑的例子是肝蛋白-靶向造影劑Gd-EOB DTPA(Runge V.M.Crit.Rev.Diagn.Imaging 38第207-30頁(1997)]和Gd-BOPTA[Kirchin M.A.，等人，Invest.Radiol.，33第798-809頁(1998)]或白蛋白-靶向試劑MS-325[Lauffer，R.B.，等人，Radiology，207第529-538頁(1998)]和MP2269[Hofman Mark B.M.等人，Acadademic Radiology，5(suppll)S206-S209(1998)]。據(jù)報道，作為與血清白蛋白的非共價結(jié)合的結(jié)果，對于MS325(47mM-1s-1)弛豫率增加了約7倍[Lauffer，R.B.等人，Radiology，207第529-538(1998)]。

圖1MRI造影劑MS-325的化學結(jié)構(gòu)與白蛋白結(jié)合時，具有圖1化學結(jié)構(gòu)的單體造影劑MS-325表現(xiàn)出信號增強的增加。當結(jié)合時，復合物以比未結(jié)合時慢的速率翻滾。然而奇怪的是，將多個IEM加到靶向造影劑(如MS-325)不能進一步提高對比度，因為在多體結(jié)構(gòu)中單個釓中心的弛豫率降低了。例如，帶有4個Gd(III)離子的白蛋白靶向多體與含有一個Gd(III)的MS-325(47mM-1s-1)相比，每Gd(III)的分子弛豫率僅為9-13(mM-1s-1)[Martin V.V.，等人，Bioconjug.Chem.，6第616-23頁(1995)]。因此，靶向多體螯合物的每個Gd(III)的弛豫率通常比類似的靶向單個螯合物中所觀察到的要小得多。
原理表1表明，僅僅增加IEM的數(shù)量不足以改善總弛豫率，因為盡管存在含兩個苯環(huán)的靶向結(jié)合基團，隨著IEM數(shù)量的增加每個IEM的弛豫率減少了。為了理解表1，重要的是確定尋靶-結(jié)合MRI造影劑能達到其可能最大弛豫率的程度。特定造影劑的這種最大弛豫率約等于結(jié)合于靶標(如人血清白蛋白(HSA))時的分子弛豫率(R1結(jié)合)。RI結(jié)合的平均值是在標準條件組(如特定靶標或蛋白質(zhì)的濃度、藥物濃度、溫度等)下所有結(jié)合分子的平均弛豫率的歸一化的量度，它是由各分子的結(jié)合群量的加權(quán)。因此，由于RI結(jié)合是歸一化的量，通過比較RI結(jié)合值可進行不同分子在結(jié)合狀態(tài)時弛豫率的比較。計算的RI結(jié)合值的比較能提供一種方便的方法來比較化合物而不考慮它們對靶標的親和力。
平均(RI結(jié)合)的計算需要測定游離螯合物的弛豫率(R1游離)和弛豫率的觀察值(Rlobs)和試劑與通常含有4.5％靶標(如HSA)的靶標溶液的結(jié)合百分比。Rlobs是R1游離和R1結(jié)合的摩爾分數(shù)(x)的加權(quán)平均值 其中 和 因此 表1示出一系列白蛋白-定靶造影劑的化學結(jié)構(gòu)和結(jié)合弛豫率。在該系列的化合物中，將帶單個IEM的化合物(即MS-325)與一系列含有多個IEM的多體比較，但在所有化合物中存在相同的二苯基環(huán)己基白蛋白TBM和亞甲基磷酸基團。
表1一系列白蛋白靶向造影劑的化學結(jié)構(gòu)和結(jié)合弛豫率。二苯基環(huán)己基靶向結(jié)合部分(TBM)保持恒定。
圖2是表1所示的相同數(shù)據(jù)的圖解。每個IEM的平均RI結(jié)合對IEM的數(shù)量(在此為Gd(III)螯便物)在20MHz作圖。
圖2含有單個二苯基環(huán)己基蛋白質(zhì)結(jié)合基團的一系列多體造影劑的結(jié)合弛豫率性(每個釓)圖。 每個造影劑的螯合物數(shù)量在表1和圖2的分子中，釓螯合物(IEM)、亞甲基磷酸基團和二苯基環(huán)己基基團(TBM)的結(jié)構(gòu)保持不變。表1和圖2中的數(shù)據(jù)顯示隨著螯合的順磁金屬離子數(shù)量的增加，每個金屬離子的弛豫率就降低。雖然Gd(IIII)螯合物的數(shù)量從1(MS-325)到4變化，IEM的數(shù)量增加了4倍，但總弛豫率僅增加了50％左右。這種總弛豫率的有限增加是每個Gd(III)離子弛豫率降低的結(jié)果。請注意，盡管造影劑是結(jié)合的，但每個Gd(III)的平均RI結(jié)合從47mM-1s-1下降至14.9mM-1s-1。這種降低是由于螯合物的局部運動，其隨著IEM數(shù)量的增加也驚人地增加(盡管在單個TBM中有多個芳環(huán))。
顯然，螯合部分數(shù)量的增加也增加分子的轉(zhuǎn)動自由度，至少在釓螯合物的位點附近。由于大小的增加超過了每個多體分子兩個螯合的釓離子，弛豫率的降低特別明顯。例如，對M8-03而言，每個釓的總弛豫率僅約為15mM-1s-1，將近是MS-325中所觀察到的三分之一。因此化合物M8-03的總弛豫率僅為60mM-1s-1，是MS-325的1.3倍(雖然存在4倍數(shù)量的IEM)。顯然，弛豫率的這種有限增加與開發(fā)體內(nèi)MR成像試劑的所增加的合成復雜性和成本不一致。因此，簡單地將多個成像增強部分與單靶向結(jié)合部分的組合不能產(chǎn)生弛豫率相當?shù)脑黾?。所以，存在對合成多體MRI造影劑的需求，其中雖然增加了IEM的數(shù)量但卻能保持各個螯合物的弛豫率。
總而言之，雖然靶標-結(jié)合的造影劑的固定化在增加單個螯合物(如MS-325)的弛豫率上是明顯有效的，但對多體螯合物而言是無效的。因此，為了增加各螯合物位點的弛豫率，需要降低分子總轉(zhuǎn)動相關(guān)時間從而降低各螯合物位點的局部螯合物運動。還需要一種機制來有效地固定靶標-結(jié)合的多體造影劑，從而能在成像時更有效地強化信號。
需要一種方法來改善特定靶標的信號對比度。這個問題已通過一些方法來處理(a)增加IEM的數(shù)量或(2)減少分子的柔性。增加IEM的數(shù)量已證明是不成功的，因為造影劑的大小和結(jié)構(gòu)不均勻，造成合成困難、難以靶向或不能隨著IEM數(shù)量的增加而成比例地增加對比度。降低柔性也是不成功的，因為當未結(jié)合時剛性造影劑造成很大的背景。通過單TBM將多體與靶標結(jié)合不足以顯著降低柔性和增加弛豫率。因此，需要通過增加IEM的數(shù)量而不同時降低分子的弛豫率(僅當結(jié)合于靶時)來改善在特定靶標的對比度。
發(fā)明概述本發(fā)明提供極大改善體內(nèi)造影劑效力的機制。如果多體造影劑在未結(jié)合狀態(tài)是柔性的(導致低弛豫率和弱信號)和在結(jié)合狀態(tài)柔軟較低(導致高弛豫率和強信號)，則就可能極大改善靶標上對噪聲(信號)的對比度。即，重要的是使結(jié)合狀態(tài)的多體造影劑比未結(jié)合狀態(tài)的更剛性化，因為這使未結(jié)合狀態(tài)的背景最小化，而在結(jié)合狀態(tài)保持高弛豫率。這些試劑通過在兩個或多個分開位點的非共價相互作用，結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它特異性靶標。通過將兩個或多個TBM(各對靶標的一個或多個位點有親和力)摻入到試劑中實現(xiàn)多位點結(jié)合。
具體說，本發(fā)明涉及用造影劑與多個IEM(“多體”)和靶標的“多位點”、非共價相互作用，來同時發(fā)生1)引發(fā)與靶標的結(jié)合(從而產(chǎn)生特異性)，2)將若干IEM錨定于靶標和3)從而使此多IEM結(jié)構(gòu)剛性化。本發(fā)明的關(guān)鍵是造影劑在結(jié)合狀態(tài)比未結(jié)合狀態(tài)的柔性小。造影劑與靶標的結(jié)合通過增加金屬離子-成像原子載體的總轉(zhuǎn)動相關(guān)時間，即通過限制轉(zhuǎn)動運動。增加了金屬螯合物IEM的弛豫率和信號強度。多位點結(jié)合減少了在總體上和發(fā)生螯合物運動的局部位點的結(jié)合狀態(tài)的多螯合物結(jié)構(gòu)的柔性，使弛豫率進一步提高，未結(jié)合狀態(tài)分子的柔性提供了優(yōu)于上述帶有連接螯合物剛性結(jié)構(gòu)的多體MRI試劑(結(jié)合和未結(jié)合狀態(tài)的剛度沒有差異)的優(yōu)點。[Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797(1998)]。圖3示意地顯示了多體螯合物的多位點結(jié)合理論。
圖3顯示通過多位點相互作用結(jié)合于靶的多體造影劑例子的關(guān)鍵成分的圖 1)多個分開的TBM促進與靶標的結(jié)合(從而提供特異性和改善的親和力)。TBM可以是相同的或不同的。
2)當結(jié)合到靶標時，TBM在構(gòu)架的幾個位置上錨定多體結(jié)構(gòu)，從而使多體螯合物結(jié)構(gòu)剛性化。
3)當結(jié)合時弛豫率提高到比在溶液中游離時更大的程度，從而改善在特異性靶標上的成像對比度。
除了對成像對比度的改善外，本發(fā)明還提供合成優(yōu)勢。由于通過多位點連接于靶標的結(jié)合時發(fā)生固定化和剛性化，由合成產(chǎn)生的剛性化的化學構(gòu)架(如稠合環(huán)或復雜大環(huán))不是必須的。因此，對化學構(gòu)架結(jié)構(gòu)的限制較少。其它優(yōu)點包括a)與單一相互作用相比，多位點結(jié)合增加了蛋白質(zhì)的親和力并提供更高的靶標特異性[Kramer，R.H.和Karpen，J.W.，Nature，395第710-713(1998)；Clackson，T.等人，Proc，Natl.Acad.Sci.，95第10437-10442(1998)；Rao，J.等人，Science，280第708-711頁(1998)；Mann，D.A.，等人，J.Am.Chem.Soc.，120；第10，575-10，582頁(1998)；Spevak，W.等人，J.Med.Chem.，39第1018-1020頁(1996)；Lee，R.T.等人，Arch.Biochem.Biophys.，299第129-136頁(1992)]。
b)多位點結(jié)合減低了試劑從靶標分離的速度。增加了試劑保持結(jié)合的時間，從而增加診斷利用時間。
c)多位點結(jié)合減少了多螯合物結(jié)構(gòu)的柔性，降低了局部螯合物的運動，并由此改善了各金屬中心的弛豫率。與游離分子相比，僅在結(jié)合時發(fā)生結(jié)合狀態(tài)造影劑的剛性產(chǎn)生更強的成像對比度。與結(jié)合形式相比，游離分子誘導相對小的信號變化；因此在由結(jié)合形式引起的信號與游離分子產(chǎn)生的信號之間可以得到令人驚訝地大的差異。無論是結(jié)合還是非結(jié)合狀態(tài)都是剛性的造影劑沒有這種特性。
d)這種信號強度的結(jié)合依賴性變化也適用于其它成像模態(tài)，在此信號強度的變化可能伴隨著這種結(jié)合，如光學成像。當結(jié)合時信號強度可以增加或減少。有時候，顯示信號的減少與分子的剛性相關(guān)[Rimer，O.，Chauver，M.，Dell’Amico，M.，Noat，G.，和Bourdeaux，M.Eur.J.Biochem.(1995)228第55-59頁]。其它時候，結(jié)合時信號增加[Sudlow G.，Birket D.J.，和Wade D.N.Mol.Pharmacol.12第1052-61頁(1976)；Sudlow G.，Birkett D.J.，和Wade D.N.Mol.Pharmacol.11第824-32頁(1975)；Kane C.D.和Bernlohr，D.A.Anal.Biochem.233第197-204頁；Lakowica，J.R.“熒光光譜法的原理”Plenum Press，New York，NY第211-213頁(1983)]。多位點結(jié)合與僅有單個TBM的光學造影劑相比或是大大減少了信號強度(從而大大增加了信號對比度)或是大大增加了強度。在這情況下，作為造影劑結(jié)合的結(jié)果，靶標位點信號強度的變化將導致改善信號對比度。
本發(fā)明的多位點結(jié)合造影劑包含IEM、直接或通過任選的連接基連接IEM的構(gòu)架和至少兩個分開的TBM。TBM可以是相同的或不同的。有時候，構(gòu)架實際上可以包含IEM或IEM的一部分，例如一些螯合部分也可作為構(gòu)架或構(gòu)架的一部分。
這些多體/多位點結(jié)合化合物是獨特的，因為IEM的局部運動受限，并且通過至少兩個TBM在多體結(jié)構(gòu)中多個分開位點上與靶標的非共價結(jié)合大大提高了結(jié)合弛豫率。這些相互作用讓多體以“假-環(huán)狀”或“拉鏈-狀”方式結(jié)合于靶標蛋白質(zhì)。這種類型的結(jié)合驚人地減少了整個多體(包括TBM、構(gòu)架和各IEM)的柔性。因此，對包括螯合物的IEM而言，減少了局部螯合物運動，而且因為各IEM的松率豫增加，由多體可觀察到顯著增加的MRI信號。這增加了本發(fā)明造影劑與已有技術(shù)的那些通過單個TBM結(jié)合而不是“假-環(huán)狀”或“拉鏈狀”結(jié)合于靶標位點的造影劑的差異。用多體/多位點結(jié)合結(jié)構(gòu)進一步提高對比度，因為它們在非結(jié)合狀態(tài)產(chǎn)生相對低的信號。
本發(fā)明可廣泛應用于所有靶向MRI和光學的應用，包括靶向生物結(jié)構(gòu)(如血清白蛋白)和其它診斷相關(guān)靶標(如血凝塊)的圖像增強劑，尤其是存在用于多體/多位點結(jié)合造影劑的多個結(jié)合位點的那些應用。這些結(jié)合位點不必相同，只要足夠臨近能讓造影劑上的TBM同時結(jié)合即可。
發(fā)明詳述為了更全面的理解本發(fā)明，提供以下具體描述。
在本文中沒有明顯定義的常用化學縮寫可以在“美國化學協(xié)會文體指南(The American Chemical Society Style Guide)”第二版；American ChemicalSociety，Washington，D.C.(1997)或有機化學雜志中找到；“Guidelines to Authors”(作者指南)(2000年5月修訂)，Copyright  2000 American Chemical Society也可在以下網(wǎng)址中查到Http//pubs.acs.org/instruct/joceah.pdf.
本文所引用的出版物全部納入作為參考。
在本申請中，DTPA指呈任一式(I)-(IV)的結(jié)構(gòu) 本文的術(shù)語“特異性親和力”指造影劑被某一特定生物成分比被其它成分的吸收、保持或結(jié)合程度顯著更高的能力。將具有這種特性的造影劑被稱為對“靶標”成分是“靶向”的。缺少這種特性的造影劑被稱為“非特異性”試劑。
本文所用的術(shù)語“弛豫率”指每毫摩爾(mM)濃度的順磁離子的1/T1或1/T2量的增加，其中T1是水質(zhì)子或其它成像或光譜核(包括在除水以外的分子中所發(fā)現(xiàn)的質(zhì)子)的縱向或自旋-晶格的弛豫時間，T2是它們的橫向或自旋-自旋弛豫時間。弛豫率單位為mM-1s-1。
本文所用的術(shù)語“開放配位位點”指通常被水或溶劑分子占據(jù)的金屬螯合物上的位點。
本文所用的術(shù)語“形成常數(shù)”指描述形成該化合物的反應的平衡常數(shù)。
本文所用的術(shù)語“多體”指含有兩個或多個IEM的造影劑或其亞基。
本文所用的術(shù)語“多位點”指連接于造影劑“構(gòu)架”(如下定義)的共價TBM的兩個或多個位點。
本文所用的術(shù)語“多位點結(jié)合”指兩個或多個不同的TBM與靶標的非共價相互作用。這些非共價相互作用彼此無關(guān)，且尤其可能是疏水、親水、偶極-偶極、pi-堆積或路易斯酸-堿的相互作用。
本文所用的術(shù)語“假-環(huán)狀結(jié)構(gòu)”指通過2個TBM在2個不同位點通過非共價相互作用連合于靶標的造影劑。
圖4顯示多位點結(jié)合結(jié)構(gòu)的典型例子 本文所用的術(shù)語“拉鏈狀結(jié)構(gòu)”指通過3個或多個TBM在3個或多個不同位點上通過非共價相互作用結(jié)合于靶標的造影劑(參見圖4)。
本發(fā)明涉及新型的隨著結(jié)合靶標時柔性降低而提供診斷成像對比度的化合物。這些化合物包含a)兩個或多個影像增強部分(“IEMs”)；b)兩個或多個靶標結(jié)合的部分(“TBMs”)，提供用于體內(nèi)定位和多體剛性化；c)用于上述部分連接的構(gòu)架(“骨架”)；
d)將IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基(“連接基”)。
用于本發(fā)明的診斷成像技術(shù)的用途包括(但不限制于)MRI和紫外線-可見光-紅外線成像。
影像增強部分(“IEMs”)在本發(fā)明中，IEM可以是用于在成像過程中提供信號或改善對比度的化學制劑或物質(zhì)。另外，可任選地將IEM或IEM的一部分用作構(gòu)架或構(gòu)架的一部分，且可以具有次要的靶向功能。
IEM可包含有機分子、金屬離子或螯合物。[Bonnemain，B.J.Drug Target.，6第167-74頁(1998)；Swanson，D.P.，等人，“醫(yī)學造影用藥不透放射性的造影劑、放射性藥物、磁共振成像和超聲波增強劑”，McGraw Hill，Inc.，(1990)；Johnson，I.Histochem.J.30第123-40頁(1998)]中敘述了IEM的許多例子。
一種特別有用的IEM是帶有一個或多個環(huán)狀或非環(huán)狀有機螯合劑(與有一個或多個金屬離子絡(luò)合)的生理相容性的金屬螯合物。用于光學成像的優(yōu)選的金屬離子包括那些原子序數(shù)為13，21-31、39-42、44-50或57-83的離子。用于MRI的選優(yōu)的金屬離子包括那些原子序數(shù)為21-29，42，44或57-83，更優(yōu)選的是原子序數(shù)為21-29、42、44、或57-83的金屬離子的順磁形式。特別優(yōu)選的順磁金屬離子選自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)和Eu(II和III)。最優(yōu)選的是Gd(III)。
如果IEM是金屬螯合物，在成像劑通過人體時(包括結(jié)合于靶組織時)，它必須不能有任何明顯程度的解離。游離金屬離子的顯著釋放將導致毒性，這通常是不能接受的。
通常，金屬螯合物的毒性程度與排泄前體內(nèi)它的解離程度相關(guān)。毒性通常隨著游離金屬離子量的增加而增加，因此為了防止毒性濃度的游離金屬離子，高形成常數(shù)的是優(yōu)選的。具體說，優(yōu)選的是形成常數(shù)至少為1015M-1，或至少為1016M-1，或至少為1017M-1、或至少為1019M-1、或至少為1020M-1，或至少為1022M-1，或至少為1024M-1或更高。如果金屬離子解離的動力學很慢，則具有較低的形成常數(shù)(即至少為1010M-1)的復合物也是足夠的。
毒性也是復合物中開放配位位點數(shù)的函數(shù)。通常，水配位位點較少就降低了螯合劑釋放順磁金屬的趨勢。因此，較佳地復合物含有2個、1個或0個開放配位位點。通常2個以上開放位點的存在，通過在體內(nèi)金屬離子的釋放將不可接受地增加毒性。
弛豫率R1和R2(分別定義為每mM金屬離子1/T1或1/T2的增加)衡量造影劑提高光譜或成像核弛豫速率的能力。弛豫率單位為mM-1s-1。對臨床MRI、水質(zhì)子MRI最常用的形式而言，當結(jié)合于螯合配位體的順磁離子依舊帶有一個或多個水交換的開放配位位點時，弛豫率較高(R.B.Lauffer，Chemical Reviews，87第901-927頁(1987)]。然而，這必須與金屬螯合物的穩(wěn)定性平衡，后者通常隨著開放配位位點數(shù)增加而降低，毒性如上述。因此，較佳地除了鐵螯合物Fe(II)或Fe(III)以外，復合物僅含有一個或兩個開放配位位點。對Gd(III)而言，一個或兩個開放配位位點是最佳的。
為了有效地提高MRI影像，復合物必須能夠增加光譜核的弛豫速率、或弛豫率、1/T1(縱向或自旋-晶格)和/或1/T2(橫向或自旋-自旋)。較佳地，光譜核是水質(zhì)子，但其它常見的光譜核包括31P、13C、23Na、19F和除水以外的分子中的質(zhì)子。光譜核可構(gòu)成IEM、TBM、其它生物分子或注射的生物標記物。
對MRI造影劑而言，一般通過造影劑順磁離子和受弛豫的核(如水分子中的氫原子)之間的偶極-偶極相互作用來增加弛豫率(1/T1或1/T2)。已知，如果由兩個偶極子所確定的矢量(即由順磁離子和水的氫質(zhì)子所確定的矢量)的旋轉(zhuǎn)速率降低，則會改善這種偶極相互作用的效率(即馳豫率)(R.B.Lauffer，ChemicalReview，87第901-927頁(1987))。
矢量旋轉(zhuǎn)擴散一個弧度的所需的時間稱為“旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間”；旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間的倒數(shù)為“旋轉(zhuǎn)速率”。通常，大分子比小分子在溶液中旋轉(zhuǎn)得較慢。一種增加弛豫率的方法是在小分子造影劑和大分子間形成非共價加合物。通過形成加合物，偶極矢量的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間將與大分子的相同。然而小分子可能依舊圍繞一個或多個軸旋轉(zhuǎn)(所謂“局部螯合物動動”)。偶極矢量的轉(zhuǎn)動相關(guān)時間是此局部螯合物運動和大分子復合物的整體運動的函數(shù)。大分子非共價加合物的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間將小于或等于該大分子本身的；局部螯合物運動越少，非共價加合物的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間越接近該大分子的。
對MRI造影劑而言，通過造影劑金屬離子和受弛豫的核(如水的氫原子)間的偶極-偶極相互作用增加弛豫率。除了通過偶極-偶極相互反應增加組織的1/T1或1/T2值以外，MRI劑還影響增加它們用途和臨床價值的兩個其它磁性特性1)含有高磁化率的金屬螯合物(尤其是Dy、Gd、Tb或Ho的螯合物)的IEM通過產(chǎn)生微觀的磁化率梯度能改變組織的MRI信號強度(A.Villringer等人，Magn.Reson.Med.，6第164-174頁(1988))。在此應用中螯合物無需具有開放配位位點。
2)含有金屬(如Tm或Dy)螯合物的IEM可用于改變光譜核的共振頻率。較佳地該光譜核是水質(zhì)子，但其它常見的光譜核包括31P、13C、23Na、19F和在水以外其它分子中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)子。光譜核可以構(gòu)成造影劑、靶標或水。在此按所用的核和策略，可以使用1-3個開放配位位點。
在本發(fā)明的各個實施例中可以使用各種螯合的配位體作為IEM部分。這些螯合的配位體包括(但不限制于)二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物和其衍生物；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(環(huán)烯)及其衍生物；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二(乙酸，叔-丁-酯)(DO2A-t-丁-酯)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三(乙酸，叔-丁-酯)(DO3A-t-丁-酯)；1，4，7-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7-四氮雜環(huán)十二烷(DO3-t-BOC)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)及其衍生物；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四(亞甲基膦酸)(DOTP)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-a，a’，a”，a-四(甲基乙酸)(DOTMA)；乙二胺-四-乙酸(EDTA)；1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)；亞乙基二-(2-羥基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-氯-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHGP、5-t-丁-EHPG和5-sec-丁-EHPG；苯并二亞乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、芐基-DTPA和二芐基-DTPA；二-(2-羥基芐基)-亞乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大環(huán)類化合物包括至少3個碳原子(較佳地為6個)和至少2個雜原子(O和/或N)，所述的大環(huán)化合物可以包括一個環(huán)或兩個或三個在雜原子環(huán)元素處連接的環(huán)，如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA為1，4-三氮雜環(huán)壬烷-N，N’，N”-三乙酸，苯并-TETA、苯并-DOTMA、苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四乙酸(PDTA)和三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；和1，5，10-N，N’，N”-三(2，3-二羥基苯甲酰基)氨基甲苯(MECAM)的衍生物。
許多適用于MRI劑的合適的鰲合劑是本領(lǐng)域已知的。也可將這些金屬螯合物用于其它形式的生物成像(如光成像)。事實上，最近描述了一系列熒光可檢測的MRI造影劑(Huber，M.M.等人，Bioconjugate Chem.，9第242-249頁(1998)]。對MRI成像而言，優(yōu)選的IEM包括順磁的釓螯合物如二乙三胺五乙酸合釓(GdDTPA)、四胺1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N-四乙酸合釓(GdDOTA)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸合釓(GdDO3A)。本領(lǐng)域已知在一些應用中其它金屬可以取代Gd(III)。優(yōu)選應用于本發(fā)明的鰲合劑是DTPA。WO98/18496、WO86/06605、WO91/03200、WO95/28179、WO96/23526、WO97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和美國專利No.4,899,755描述了用本發(fā)明生成的典型鰲合劑和螯合基團的例子，本文將這些參考文獻全部納入。
靶標結(jié)合部分(“TBM”)在本發(fā)明中，造影劑的另一部分是兩個或多個靶標結(jié)合部分(TBM)。化合物的TBM(1)使造影劑結(jié)合于蛋白質(zhì)或其它靶標上和(2)降低結(jié)合狀態(tài)分子的柔性。這將使待成像位點上造影劑濃度增加，并增加結(jié)合狀態(tài)的弛豫率。對血管血池成像而言，血清白蛋白是優(yōu)選的靶標。其它蛋白質(zhì)靶包括(但不限制于)α酸性糖蛋白、纖維蛋白原、血纖蛋白和膠原。對成像血栓而言，血纖蛋白是優(yōu)選的靶標。因此可以選擇TBM來實現(xiàn)對合適蛋白質(zhì)的特異性和高度結(jié)合親和力。由于血清中存在高濃度的HSA(約0.6mM)，且HSA以相對高的親和力結(jié)合大范圍的分子，因此它是血池造影劑的優(yōu)選靶標血漿蛋白質(zhì)。HSA是心血管成像特別優(yōu)選的靶標。
許多親脂性或兩親的TBM能有效地結(jié)合各種靶標，包括人血清白蛋白(HSA)。它們包括(但不限制于)芳族和飽和的或不飽和的具有4-200個碳原子的脂族基團，其中各碳原子任選地被氧、氮、鹵素、硫或其它能共價結(jié)合碳的原子取代或替代。為了以高度特異性結(jié)合其它蛋白質(zhì)靶標，通常需要特定的尋靶基團?？捎矛F(xiàn)代技術(shù)如組合化學、高通量篩選、噬菌體展示、指數(shù)式富集法配體進化(SELEX)和其它已描述過的方法如美國專利No.5,475,096、5,595,877和5,270,163[參見Gold等人，Ann.Rev.ofBiochem.，64第763-797頁(1995)]中所述的(本文將它們?nèi)考{入作為參考)，可以鑒定具有足夠高親和力和特異性的尋靶基團。
可以用各種平衡結(jié)合方法評估TBM與靶標(如HSA或血纖蛋白)結(jié)合的程度。例如，可以用超濾測定與HSA的結(jié)合。在一典型的用超濾對結(jié)合的測定中，將尋靶基團與4.5％重量/體積HSA(在pH7.4緩沖液中)混合。將樣品加樣于可購得的配備有30KDa分子量的截斷值濾器的離心裝置(Millipore UltrafreeMC Low Binding Regenerated Cellulose 30KDa mol.wt.截斷值目錄#UFC3LTK00)中，該濾器可滲透尋靶基團但不能滲透HSA。用此截斷濾器以2000×g離心20分鐘可以過濾小部分體積(5-10％)樣品，測定濾液樣品中未結(jié)合的尋靶基團的濃度。
為了測定與血纖蛋白的結(jié)合，可在微量滴定板的孔中形成血纖蛋白塊，并將其與尋靶基團接觸。培養(yǎng)足以建立平衡的時間后，吸取上清液(難溶的血纖蛋白在孔的底部保持凝膠塊狀結(jié)合)。然后測定上清液中未結(jié)合的尋靶基團的濃度。
在這兩種方法中，測定結(jié)合的尋靶基團的濃度，作為初始存在的總尋靶基團的濃度與結(jié)合試驗后未結(jié)合的尋靶基團濃度的差。結(jié)合分數(shù)是將結(jié)合的尋靶基團濃度除以總尋靶基團的濃度。較佳地至少10％，更佳地至少50％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％造影劑在藥物和靶標的生理相關(guān)濃度結(jié)合于所需的靶標。較佳地至少92％，更佳地至少94％，優(yōu)選96％或更多的造影劑結(jié)合于超濾或微量滴定板方法中的靶標上。
關(guān)于含有血纖蛋白結(jié)合肽的尋靶部分的詳細描述參見題為“血纖蛋白的尋靶部分”的美國臨時專利申請No.60/146,425；DYX-010.0Prv和同日(1999年7月29日)申請的美國臨時專利申請No.60/146,414(本申請享有的優(yōu)先權(quán))；且本文將它們?nèi)考{入作為參考。
依據(jù)靶標的特性和結(jié)合的特殊需要TBM可以多種多樣。有用的TBM的例子包括藥物、親脂性或兩親有機分子、卟啉、受體配體、類固醇、脂類、激素、肽、寡核苷酸(DNA、RNA及它們化學修飾的形式)、碳水化合物或其它已知能以充分高親和力結(jié)合于待成像的特異性組織中的一種或多種成分的生物分子或物質(zhì)。在一些實施例中，相對其它TBM某種TBM對靶標的親和力比較高，此時將這種較高親和力的TMB稱為“主要”TBM。因此，將親和力比主要TBM低的其它TBM稱為“次要”TBM。
特別優(yōu)選的TBM是那些可逆結(jié)合于血漿、間質(zhì)空隙(細胞間的流體)或細胞內(nèi)空隙中蛋白質(zhì)的TBM。雖然可以使用許多生物分子或物質(zhì)來結(jié)合特異性的靶標，但那些結(jié)合蛋白質(zhì)的是最有用的。
次要TBM可以與主要TBM相同或不同。次要TBM的數(shù)目可以是一個到十個或更多。所需次要TBM的確切數(shù)目取決于TBM對靶標的特異性和TBM對靶標的親和力。由次要TBM提供的附加結(jié)合相互作用應足以束縛復合物并減少各螯合位點的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間。由此弛豫率的增加為影像提供了足夠的對比度增加。次要TBM與靶標的結(jié)合相互作用和親和力可以比主要尋靶TBM所需的低，因為主要TBM與靶標最初的結(jié)合提供了尋靶識別所需的特異性。在一些情況中，靶標可以包括二體結(jié)合位點(在此情況下優(yōu)選兩個相同的TBM)。
本申請所述的造影劑的靶標是廣泛和多樣的。該靶標可以是任何體區(qū)室、細胞、器官或組織或其成分。優(yōu)選的靶標是那些與診斷和治療相關(guān)的靶標，即那些與疾病癥狀相關(guān)的靶標。特別優(yōu)選的靶標是那些與體液相關(guān)的靶，尤其是那些與血液、血漿、淋巴液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的液體相關(guān)的。其它優(yōu)選的靶標是以高濃度存在的蛋白質(zhì)或是對特定配體具有大量結(jié)合位點的蛋白質(zhì)。多個結(jié)合位點提供了與一種或多種次要TBM的接觸。這種靶蛋白質(zhì)中包括酶和糖蛋白。
連接IEM和TBM的構(gòu)架本發(fā)明為多體造影劑提供的第三個成分稱為化學構(gòu)架或“骨架”結(jié)構(gòu)來結(jié)合IEM和TBM，如圖5所示。這種構(gòu)架是在兩個或多個TBM之間的化學構(gòu)架，對此在不同位點直接或通過連接基結(jié)合兩個或多個IEM，形成多體/多位點結(jié)合化合物。這種新型的含有這些構(gòu)架結(jié)構(gòu)的化合物通過TBM在幾個(至少2個)分開的位點上對靶標的非共價結(jié)合限制螯合物的局部運動。這種多體造影劑以“假-環(huán)狀”或“拉鏈狀”形式結(jié)合于靶標，在兩個或多個位點形成相互作用。這種類型的結(jié)合在整個多體造影劑結(jié)構(gòu)中(包括結(jié)合基團、構(gòu)架和各IEM)造成剛性。
通常，構(gòu)架結(jié)構(gòu)可以是差異很大的有機分子，包括1到10個重復的單體亞單元。構(gòu)架可以是開鏈或環(huán)狀的。TBM共價結(jié)合于該結(jié)構(gòu)內(nèi)部或末端。任任何情況下，都必須有至少兩個分開的TBM來將該分子結(jié)合于靶。TBM可以是相同的(均質(zhì)的)或不同的(異質(zhì)的)。異質(zhì)的TBM對靶標可以表現(xiàn)出不同的或類似的結(jié)合親和力。
開鏈和環(huán)狀構(gòu)架還為IEM的連接提供了支持結(jié)構(gòu)。IEM的數(shù)目可以在2-12間不等。IEM可以與TBM交替，IEM可以結(jié)合于線性構(gòu)架結(jié)構(gòu)的內(nèi)部或該結(jié)構(gòu)的末端(可任選通過連接基)，但必須至少連接于該結(jié)構(gòu)上的2個不同位點上。IEM可以是相同的(均質(zhì)的)或不同的(異質(zhì)的)。異質(zhì)的IEM可表現(xiàn)出不同的或類似的產(chǎn)生對比度的能力。
就開鏈構(gòu)架而言，可以由標準方法合成許多類型的結(jié)構(gòu)。特別優(yōu)選的是在整個結(jié)構(gòu)中含有規(guī)則重復的雜原子的構(gòu)架。雜原子通常使IEM或TBM更易連接。特別優(yōu)選的例子是低聚亞烷基胺構(gòu)架。這些低聚亞烷基胺構(gòu)架可以是支鏈的或線狀的。即，這種構(gòu)架可以是含有規(guī)則地分隔開的IEM和TBM的線狀構(gòu)架，也可以是分支的化學構(gòu)架，使得IEM和/或TBM的基團自構(gòu)架上的單個位點發(fā)散開。這種構(gòu)架可以雜原子如氧(醇)或氮(胺)封端。開鏈構(gòu)架特別優(yōu)選的例子是以醇或胺為末端的支鏈或線狀構(gòu)架。
圖5顯示了多體的多位點結(jié)合的一個例子，其中清晰地勾畫出了構(gòu)架部分、IEM、TBM和(任選)的連接基。圖6顯示了另一帶有支鏈連接基的多體的例子。同樣清晰地勾畫出了構(gòu)架部分、IEM、TBM和(任選的)連接基。在圖6中，兩個TBM是結(jié)合于聚胺構(gòu)架的肽，但這些內(nèi)容并不限制本發(fā)明的范圍。
圖5帶有線性連接基的多位點結(jié)合多體的例子 圖6帶有支鏈連接基的多位點結(jié)合多體的例子 式(V)顯示了含有重復胺亞結(jié)構(gòu)的線性構(gòu)架的通式， X＝L-IEM、TBM或IEM其中，m可以是1-10的整數(shù)，n可以為2-10的整數(shù)。較佳地，m為1-2、2-4、4-6、6-8、或8-10。較佳地，n為2-4、4-6、6-8或8-10。
式(VI)顯示了含有重復胺亞結(jié)構(gòu)和末端氧的可以形成醚-鍵連的TBM的線狀構(gòu)架的結(jié)構(gòu)通式， X＝L-IEM、TBM或IEM其中m可以是1-10，n可以為2-10。較佳地，m為1-2、2-4、4-6、6-8、或8-10。較佳地，n為2-4、4-6、6-8、或8-10。
構(gòu)架結(jié)構(gòu)并非限制于含有胺的重復亞結(jié)構(gòu)，也不限于含有末端氧或氮的結(jié)構(gòu)。所述的構(gòu)架可以含有任何可以連接IEM(任選通過連接基)和TBM的重復亞結(jié)構(gòu)。組成該構(gòu)架的碳原子可以任選地被雜原子(選自氧、氮、硫、磷和鹵素)取代或置換。構(gòu)架還可以含有取代基如短鏈烴(1-10個碳原子)。這些烴側(cè)鏈也可任選地被選自氧、氮、硫、磷和鹵素的雜原子取代或置換。因此所述的構(gòu)架可以含有許多常規(guī)的有機基團，例如磷酸二酯、氨基甲酸酯、硫酸酯和磺?；?。同樣，連接于這種構(gòu)架結(jié)構(gòu)上的取代基也可以包括常規(guī)的有機基團，如磷酸二酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺?；桶被?。
圖7顯示了一些線狀和支鏈聚胺構(gòu)架的說明性例子及含有這些構(gòu)架的造影劑的相應實例。圖8提供了低聚體構(gòu)架的例子和含有這些構(gòu)架的造影劑的相應例子。在本發(fā)明中含有雜原子的構(gòu)架是優(yōu)選的例子，因為雜原子使IEM和TBM易于連接(任選通過連接基)。
圖7線狀和支鏈聚胺構(gòu)架的例子 X＝N、O、SL＝連接基圖8低聚構(gòu)架的例子 X＝N、O、SL＝連接基 X＝N、O、SL＝連接基這種構(gòu)架的其它優(yōu)選了例子是在體內(nèi)易降解的構(gòu)架主鏈。生物可降解造影劑具有能被如哺乳動物體內(nèi)存在的酶降解的構(gòu)架。較佳地這種構(gòu)架含有1個或多個生物可降解基團(可以特異性地被酶降解)。特別優(yōu)選的生物可降解構(gòu)架是能被人的酶降解的構(gòu)架。因為已知存在許多酶促反應，因此生物可降解基團的確切結(jié)構(gòu)多種多樣。生物可降解基團特別優(yōu)選的例子包括(但不限制于)羰基、酯、二酯、磷酸酯、二磷酸酯、磷酸二酯、酸酐、磺?；⒘蛩狨ズ桶被姿狨?。這些生物可降解基團可以讓多體造影劑迅速代謝并減少中毒的風險。圖9顯示了多體生物可降解構(gòu)架的一個例子。在該例子中，該構(gòu)架是在含有2個末端醇的分子的存在下由兩個羧酸縮合形成的。這種縮合反應的特定反應條件是本領(lǐng)域已知的。
圖9生物可降解構(gòu)架的例子 X＝連接部分另外，當pH或溫度變化或用超聲波或光能時可以切割生物可降解基團。這些基團可參見前體藥物文獻。(Kratz，F(xiàn).，Beyer，U.和Schutte M.T.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16第245-88頁(1999)；Dougherty，T.J.，Gomer，C.J.Henderson，B.W.，Jori，G.Kessel，D.，Korbelik，M.，Moan，J.，和Peng，Q.J.Natl.Cancer Inst.90第889-905頁(1998)；Wang，W.，Jiang，J.，Ballard，C.E.，和Wang，B.Curr.Pharm.Des.5第265-87頁(1999))。
含有螯合金屬離子的環(huán)狀元件的構(gòu)架是另一類型本發(fā)明的優(yōu)選實施例。特別優(yōu)選的是含有IEM的構(gòu)架，它螯合釓或提供構(gòu)架內(nèi)的以及連接于構(gòu)架的分開IEM中的釓的螯合。圖10顯示了這種構(gòu)架。
圖10用部分釓復合物作為構(gòu)架的多體的例子
將構(gòu)架分成開鏈類和環(huán)狀類并不表示這些類型間的相互排斥。已在考慮結(jié)合有限制運動的環(huán)狀元件的開鏈結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)架的環(huán)狀部分可以是同素環(huán)或雜環(huán)或多環(huán)。因此，這些環(huán)可以是高度受限的如環(huán)丙基環(huán)或可以是構(gòu)象受限較少的環(huán)如環(huán)己基環(huán)。
構(gòu)架的開鏈和環(huán)狀部分都可以任選地被選自氧、氮、硫、磷和鹵素的雜原子取代或置換。這些構(gòu)架還可含有取代基如短鏈烴(1-10個碳原子)。這些烴側(cè)鏈可以任選地被選自氧、氮、硫、磷和鹵素的雜原子取代或置換。所以這些構(gòu)架在其開鏈和環(huán)狀部分可以含有許多常規(guī)的有機基團。一些例子包括(但不限制于)羰基、酯、二酯、磷酸酯、磷酸二酯、酸酐、磺?；⒘蛩狨ズ桶被姿狨?。
這些環(huán)還可包括常規(guī)生物環(huán)狀化合物(如碳水化合物)的衍生物。環(huán)狀部分的優(yōu)選例子包括多環(huán)系統(tǒng)如萘烷的雜環(huán)衍生物。其它例子包括(但不限制于)含有3-7個原子的碳環(huán)，其中至多4個原子被選自O(shè)、S、C(O)、S(O)、S(O)2和NH的部分任選地取代。這些環(huán)任選地被甲基及其衍生物、烷基、鏈烯基、或炔基(含2-100個碳)取代，其中至多10個碳原子被選自氧、氮、硫、磷和鹵素的雜原子取代或被選自O(shè)、S、CO、S(O)、S(O)2和NH的部分置換。就如一些構(gòu)架如以氨基酸為基礎(chǔ)的構(gòu)架可能包括TBM一樣，構(gòu)架同樣也可包括IEM。IEM可以是任何有機部分、金屬離子或螯合物。優(yōu)選的例子是那些帶有環(huán)狀I(lǐng)EM的，更優(yōu)選的是為金屬螯合物的環(huán)狀I(lǐng)EM。圖11顯示了線性和環(huán)狀組合構(gòu)架的優(yōu)選例子及相應的含有這些構(gòu)架的造影劑的例子。
圖11包括環(huán)狀部分構(gòu)架的例子 X＝N、O、S、CH2n＝1-8任選的連接基本發(fā)明一些實施例中造影劑的特征是含有將IEM連接于構(gòu)架的任選連接基。在本文的其它部分描述影像增強部分(IEM)和尋靶部分(TBM)。連接基部分(L)可以是任何小的亞單位，其含有1-30個通過單鍵或多鍵共價連接的碳原子，其中至多10個碳原子可以被O、N、P、S、F、Cl、Br、H或I取代。連接基具有將IEM連接于構(gòu)架的功能。連接基的例子包括線性或分支的被官能團(如羰基、酯、酰胺、胺、脲、硫醚、芳基、磷酸酯、磺胺等)取代的鏈烷、鏈烯或炔。某些實施例中優(yōu)選的連接基含有2個或多個官能團，其中一個連接于構(gòu)架，其它連接IEM。
官能團可以是相同的或不同的。所述官能團的例子包括(但不限制于)酮、酯、酰胺、醚、碳酸酯、磺胺、鏈烷、鏈烯、炔和氨基甲酸酯。制備連接基的優(yōu)選試劑的例子是氨基酸，尤其是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、高絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、氨基苯丙氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、二氨基丙酸、羥基脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；二醇，尤其是乙二醇；二鹵化物，尤其是二氯乙烷、2-巰基乙醇、2-氨基乙醇、1，2-二氨基乙醇；二羧酸，特別是乙二酸、丙二酸、羥基丁二酸、丁二酸、反式丁烯二酸、戊二酸和己二酸；和其它雙官能團、三官能團和多官能團的小分子。
其它連接基(并非限制)可以是脲、醛縮醇、縮酮、二酯、羰基、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫化物、內(nèi)酯、亞胺、磷?；蛄姿岫ユI；取代的或未取代的飽和或不飽和烷基鏈；線性、分支或環(huán)狀一種或不同氨基酸的氨基酸鏈(如血纖蛋白結(jié)合部分的N-或C-端的延伸)；丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和庚二酸；己酸、簡單二胺和二醇。
優(yōu)選連接基的分子量是明確限定的。其分子量的范圍可以為從100以下到1000以上。較佳地，連接基的分子量小于200，更佳地是小于100。另外，理想的是用可以體內(nèi)生物降解的連接基從而為本發(fā)明的造影劑提供有效的排泄途徑。取決于它們在連接基上的位置，這些生物可降解的官能團包括酯、二酯、酰胺、磷酸酯、醚、醛縮醇和縮酮官能團。
通常，可以用已知的方法將金屬螯合物或其它IEM偶聯(lián)于連接基，并將連接基偶聯(lián)于TBM。參見如WO95/28967、WO98/18496、WO98/18497。本發(fā)明考慮在任何位點連接螯合物，只要該金屬螯合物保留了其緊密結(jié)合金屬的能力(以使毒性最小化)。圖12顯示了一些連接基的例子，為簡化省去了氫原子。
圖12具有多個連接點連接基的例子 X＝N、O、S與多位點結(jié)合相互作用關(guān)聯(lián)的對比增強本發(fā)明在其不同實施例中改進了所有順磁金屬(如釓)靶結(jié)合的中心、多體螯合結(jié)構(gòu)的平均弛豫率。表1和表2顯示的例子表明多體IEM結(jié)構(gòu)僅通過單個TBM對靶的結(jié)合是不足以將平均每個Gd(III)的結(jié)合弛豫率改善到可比較的單個IEM結(jié)構(gòu)中所觀察到的水平。雖然通過單個TBM的結(jié)合降低了多體的總轉(zhuǎn)動相關(guān)時間，但各金屬(如釓)螯合物顯然依舊以不受限制的形式轉(zhuǎn)動。這種過量的運動降低了各金屬中心的弛豫率。出人意料的是，發(fā)現(xiàn)即使多體包括具有兩個芳環(huán)的TBM也同樣如此。McMurry等人的PCT WO 96/23526表明，用含有兩個或多個芳環(huán)(以非平面取向)的血漿蛋白質(zhì)結(jié)合部分(PPBM)可改善含有單個IEM造影劑的白蛋白結(jié)合弛豫率。如表1所示，用這種TBM(二苯基環(huán)己基)能為單個IEM(MS-325)的情況提供優(yōu)良的弛豫率增強，而對其多體類似物的每個IEM，卻提供驚人低的白蛋白結(jié)合弛豫率。為了進一步改善尋靶多體的弛豫率，必須降低螯合螯合基團和螯合離子的局部運動。
本發(fā)明描述了由多位點結(jié)合的相互作用及同時柔性的降低而表現(xiàn)出高弛豫率的尋靶多體。將兩個或多個TBM引入靶(條件是結(jié)合時每個IEM的弛豫率沒有明顯減少)，發(fā)現(xiàn)顯著改善了弛豫率，從而在許多情況中結(jié)合狀態(tài)的造影劑的每IEM弛豫率與在單個IEM中所觀察到的類似(提高了7-8倍)。弛豫率(每IEM)的提高是由于尋靶多體結(jié)構(gòu)(包括連接的IEM)柔韌性的降低。通常結(jié)合時弛豫率增加1.5倍或更多。優(yōu)選的圖像清晰度是弛豫率增加至少2或3倍的結(jié)果。更優(yōu)選的是弛豫率增加4倍、5倍和6倍。特別優(yōu)選的是，弛豫率增加7-8倍、9-10倍或10倍以上。在20MHz、37℃優(yōu)選的弛豫率為至少10mM-1s-1(每IEM)，更優(yōu)選的是至少20mM-1s-1(每IEM)，較佳地是至少25mM-1s-1(每IEM)，更佳地是至少30mM-1s-1(每1EM)，佳地是至少35mM-1s-1(每IEM)，最佳的是至少40mM-1s-1(每IEM)。較佳地，在20MHz和37℃時造影劑總弛豫率大于60mM-1s-1。
以下數(shù)據(jù)說明由多位點結(jié)合引起的對比度增強。在表2所示的3個特異性比較中多重TBM的益處是顯然的。在該表格中，本發(fā)明的化合物包括至少2個IEM和至少2個TBM。將本發(fā)明的化合物與僅含有一個IEM或一個TBM的化合物作比較。此比較表明本發(fā)明的化合物的弛豫率(每個IEM)增加。在該表的測定中，所用的靶標是人血清白蛋白(HSA)。首先，M8-04和M8-05分子的比較表明IEM數(shù)量的增加而TBM保持恒定使總弛豫率相應增加。具體說，該比較表明可以加入IEM而每個Gd(III)離子的弛豫率不會有相當?shù)膩G失，只要存在至少兩個TBM且在該分子中間隔適當?shù)木嚯x。
M8-04和M8-05化合物含有2個TBM，各含有苯并稠合的環(huán)戊基、苯基和烷基取代的苯基。這兩個TBM顯然足以限制該分子，從而當IEM(此時為DTPA部分)的數(shù)量自2個增加到4個時，各IEM位點上每個Gd(III)的弛豫率保持相同(在20MHz時為32與32.7mM-1s-1)。因此，與IEM數(shù)量的翻倍相同，該分子的總弛豫率也翻倍(2個IEM時為64mM-1s-1，4個IEM時為131mM-1s-1)。
表2通過多位點結(jié)合弛豫率的增加單TBM對雙TBM
其次，M8-06和M8-05分子的比較表明，當保持IEM的數(shù)量恒定時TBM數(shù)量的增加將增加每個IEM的弛豫率，只要TBM的間距足夠。在這兩種分子中，TBM具有相同的結(jié)構(gòu)，且IEM的結(jié)構(gòu)是相同的釓-螯合的DTPA部分。但M8-06化合物僅含有一個TBM而M8-05化合物含有2個TBM。M8-05化合物中的這兩個TBM更有效地限制分子，因為每個釓的弛豫率在20MHz時自27.0mM-1s-1增加至32.7mM-1s-1。所以，TBM數(shù)量的增加增加了每個IEM的弛豫率，只要TBM間距足夠。
第三，M8-07和M8-08分子的比較(見表2)再次表明當保持IEM數(shù)量恒定時，間距充足的TBM數(shù)量的增加時每個IEM的弛豫率增加。在這兩種分子中，TBM含有相同的烷基取代的聯(lián)苯基結(jié)構(gòu)，且這兩種化合物含有相同數(shù)量的IEM，同時IEM的結(jié)構(gòu)是相同的釓-DTPA部分。M8-07和M8-08分子的核心結(jié)構(gòu)(構(gòu)架)也是相同的四胺。M8-07化合物含單個TBM和4個IEM，而M8-08化合物含有2個TBM和4個IEM。同樣，M8-08化合物中的2個TBM更有效地限制分子，因為存在HSA時每個釓的結(jié)合弛豫率在20MHz時自16.0mM-1s-1增加至44.1mM-1s-1。因此，該計算表明TBM數(shù)量的翻倍使該分子的總弛豫率的增加到2倍以上(2.75倍，從1個TBM時的64.0mM-1s-1增加至2個TBM時的176.5mM-1s-1)。另一方面，M8-07和M8-08化合物的自由弛豫率相當，在20MHz時分別為9.2mM-1s-1和10.3mM-1s-1?；衔颩8-07和M8-08的R1結(jié)合與R1游離的比分別為1.7和4.3，這表明M8-08化合物可以提供更好的靶和背景之間對比度的增強。由于M8-08也增加HSA親和力并因此具有較高的靶特異性(與M8-07相比)，由這種多位點結(jié)合多體產(chǎn)生的對比度的增強比有一個TBM的多體更優(yōu)越。
最后，該表還包括化合物M8-09和M8-10的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)是用于提供含有單個TBM和多個IEM的分子的典型弛豫率的。M8-09和M8-10分子的比較也表明，簡單地將IEM添加到含有一定TBM的分子不能成比例地增加總弛豫率，因為IEM數(shù)量的3倍增加僅得到弛豫率的2倍增加。
因此，在兩個分開的位點限制分子將增加分子總體的和造影劑局部螯合區(qū)域的弛豫率(即降低轉(zhuǎn)動相關(guān)時間)。但是，TBM必須分開足夠的距離，這就有效減少了分子結(jié)合靶標時整個分子的柔韌性。從而使添加至4個IEM時每個IEM的平均RI結(jié)合不會顯著減少。多位點結(jié)合驚人地限制了過整個多體螯合物結(jié)構(gòu)的柔韌性。因此，對包括螯合物的IEM而言，隨著多位點結(jié)合后降低了局部螯合物的運動。結(jié)果，與類似的多位點螯合化合物(僅通過一個TBM結(jié)合，因此對靶向的位點不是“假-環(huán)化”或“拉鏈狀”)相比，觀察到MRI信號驚人地增加。這些多體/多位點結(jié)合結(jié)構(gòu)還進一步增加了對比度的強化，因為在未結(jié)合狀態(tài)它們也產(chǎn)生信號，但該信號比具有剛性分子結(jié)構(gòu)的造影劑所產(chǎn)生的弱，而且它們具有改善的與靶標的親和力。簡而言之，本發(fā)明提供了化合物、組合物和它們的使用方法，其中由于多位點結(jié)合相互作用(多個TBM)的結(jié)果，每個IEM的弛豫率不會因IEM的添加而減少，從而改善了對比度。
用途血池成像具有許多潛在的診斷和治療益處。循環(huán)系統(tǒng)的詳細成像可以為早期檢測提供信息，如動脈瘤、栓塞或血栓和其它凝塊、和血流受限的區(qū)域(如動脈硬化的冠狀動脈中存在的)?？捎酶叻直媛恃爻上窀_診斷的其它常規(guī)循環(huán)疾病是與以下疾病相關(guān)的循環(huán)缺陷糖尿病、心臟病、淋巴水腫、周圍性血管疾病、雷諾氏現(xiàn)象、靜脈炎；和其它對血管內(nèi)部損傷、心雜音、靜脈曲張；和由瓣膜紊亂和脈管炎引起的其它疾病。同樣，直接針對特異性靶標的造影劑可以改善對疾病，如由嗜中性白細胞缺陷導致的中性白細胞減少癥的診斷。另外，MR、光學成像和其它形式的成像比已有方法(需要手術(shù)切割和全身麻醉下插入導管)的侵害性更小。
按本文公開制備的MRI和光學造影劑可以與常規(guī)MRI和光學造影劑相同的方式使用。當對血栓成像時，可能優(yōu)選MR方法和脈沖序列來提高血栓與背景血液和組織的對比度。這些方法包括(但不限制于)輻射血管造影序列(blackblood angiography sequence)，即設(shè)法使血液變深如快速自旋回聲序列(fast spinecho sequence)和血流-破壞梯度回聲序列(flow-spoiled gradient echo sequence)。這些方法還包括不依賴血流的方法，其由于對比增強的血栓和血流及組織間T1的差異來提高對比差異，如反向回收制備的或飽和回收制備的序列將增加血栓和背景組織間的對比度。T2技術(shù)的制備方法證明也是有用的。最后，用于磁化傳遞方法的制劑可以改善與本發(fā)明試劑的對比度。
可以按適用于靜脈內(nèi)給予人或動物模型系統(tǒng)的藥物組合物常規(guī)流程的方法配制此組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無菌等滲緩沖水溶液配制的溶液。需要時該組合物也可含有增溶劑和局部麻醉劑(如利多卡因)來緩解注射位點的疼痛。通常，將組分分開或以單位劑量形式，例如干的凍干粉末或無水濃縮物混合在一起給予?？蓪⒋私M合物存儲于密封的容器中如安瓿或小袋中，以活性單位指明活性成分的量。當組合物是以輸液給予時，可將其分散于含有無菌的藥用級別的“注射用水”或鹽水的輸液瓶中。當以注射給予此組合物時，可提供一安瓿注射用的無菌水或鹽水，從而在施用前混合該成分。
本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明的化合物及其藥學上可接受的鹽，和任何藥學上可接受的成分、賦形劑、載體、佐劑或運載體。
較佳地，以可注射組合物的形式將此高弛豫率的多體造影劑給予患者。優(yōu)選給予MRI造影劑的方法是腸胃外的，即靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)或腔內(nèi)?？砂磁c其它診斷劑或治療劑相類似的方法，將本發(fā)明的藥物組合物給予哺乳動物(包括人)。施用的劑量和施用的方式取決于各種因素，包括患者的年齡、體重、性別、患者的癥狀和遺傳因素，最終可由臨床醫(yī)生在試驗確定各種劑量后進行本文所述的成像來決定。一般而言，診斷敏感性或治療有效所需的劑量范圍約為0.001到50,000μg/kg(主體體重)，較佳地在0.01到25.0μg/kg(主體體重)范圍之間?？砂幢疚乃_的經(jīng)驗地確定最佳劑量。
在以下實施例中將進一步說明本發(fā)明實例中一些高弛豫率多體組合物的合成和用途。以下實施例中所包括的具體參數(shù)僅是為說明本發(fā)明的實施，對本發(fā)明的范圍無任何限制。雖然以上已描述了許多實例和特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求范圍內(nèi)還可以對所述的實施例和特征進行改善和變化。雖然以描述了許多實例和特征，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求范圍內(nèi)還可以對所述的實施例和特征進行改善和變化。
實施例實施例1測定弛豫率的方法用在0.47特斯拉(20MHz H-1拉莫爾頻率)和37℃操作的Bruker NMS-120Minnispec NMR分光光度計評估本發(fā)明化合物的弛豫率。用該裝置的軟件通過逆轉(zhuǎn)恢復脈沖序列(inversion recovery pulse sequence)確定水質(zhì)子的T1。通過制備4份獨立樣品在靶標存在下(通常為4.5％HSA)測定弛豫率。第一份在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中僅含有4.5％HSA，其它三份在PBS中除含有4.5％HSA以外，還分別含有20、30和40μM Gd(III)。將樣品在37℃培養(yǎng)至少15分鐘以確保進行T1測定前溫度的平衡。用感應偶合的等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)確定樣品中Gd(III)的含量。通過以s-1表示的豫率速率(1/T1)對Gd(III)濃度(mM)作曲線確定弛豫率(每個Gd(III)離子)。與該數(shù)據(jù)擬合的線的斜率即為弛豫率。還以類似的方式(但無靶標)測定了無靶標時化合物的弛豫率。
在另外的實驗中如用超濾或平衡滲析確定了這些條件下結(jié)合于靶標的品種的濃度。由已知的結(jié)合于靶標的品種的濃度、存在靶標時的弛豫率、無靶標時的弛豫率可以計算本文所述的平均結(jié)合弛豫率。
實施例2測試血纖蛋白結(jié)合本發(fā)明造影劑的實驗模型在這些實施例中所述對血塊(血栓)成像具有高弛豫率和特異性的造影劑能夠區(qū)分血塊和循環(huán)中的纖維蛋白原。其可以提供對病癥發(fā)展的各種狀態(tài)時血栓的形成進行靈敏有效的探測?？梢杂闷鋪碓\斷是否存在早期和晚期血栓。
可以使用的一種動物模型是兔頸靜脈血栓模型(頸靜脈被鉗制)。在兩處鉗制該靜脈，除去這兩個鉗制處之間的兔血。在兩處鉗制間加入人血纖蛋白原、兔紅血細胞和凝血酶，從而產(chǎn)生含有人血纖蛋白的血栓。通常將這種血栓老化(aged)30分鐘。
在這種兔頸靜脈模型中，常規(guī)測定儀器是用破壞梯度(spoiledgradiet)(SPGR)MRI為36/5/30deg的1.5Tesla。另外，3D GRE 44/10/30deg可以用于1.5Tesla儀器進行成像方法。再者，用于1.5Tesla可以進行IR2000/10/700法。
實施例3實例化合物制備本發(fā)明的優(yōu)選實例是具有圖13所示結(jié)構(gòu)的用于MRI成像的造影劑。 圖13中的造影劑含有4個用作IEM的DTPA-Gd部分。IEM通過包括一系列重復酰胺的連接基連接于乙二胺構(gòu)架。TBM是兩個表現(xiàn)出對血纖蛋白高親和力的肽。這兩個肽可以通過在兩個半胱氨酸殘基間形成二硫鍵而環(huán)化。TBM通過肟和酰胺鍵連接于構(gòu)架。
在37℃、10μM造影劑、2.5mg/ml血纖蛋白、50mM Tris、150mM NaCl、2mM Ca2+、pH7.4時，原型血栓劑與血纖蛋白DD(E)氨基酸片段的結(jié)合為51％結(jié)合。在20MHz和37℃時結(jié)合化合物的弛豫率為101.4mM-1s-1，每個Gd螯合物為25.4mM-1s-1。游離造影劑的弛豫率為67.7mM-1s-1，每個Gd螯合物為16.9mM-1s-1。該造影劑在結(jié)合時弛豫率大為提高。圖14顯示了作為原型MR試劑的血栓肽多體的合成。雖然顯示了特定的肽和造影劑，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解可以用其它肽代替化合物中的，而且化合物中所用的肽不必相同。
圖14靶向人血纖蛋白的多體造影劑的合成 實驗部分二Dde-四胺的合成將四胺(Fluka)(1.50ml)與Dde-OH(NovaBiochem)(4.0g)在30mlEtOH中反應?；亓鞔饲宄旱臏\黃色溶液16小時。反應完成后，真空濃縮反應混合物得到干燥的殘留物。將殘留物溶解于250ml乙醚和2N HCl溶液中。分開淺黃色酸性水層，加入50％NaOH直到pH達到12，然后用EtOAc提取。用鹽水洗滌EtOAc層，干燥(Na2SO4)并過濾。真空蒸發(fā)濾液得到淺黃色塊狀固體(2.9g)，將其在快速硅膠柱上純化，用EtOAc/MeOH(2∶3)和EtOAc/(含有1％的MeOH)(2∶3)洗脫得到呈淺黃色固體的所需產(chǎn)物(2.3g)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.02(s，6H)，2.34(s，4H，2)，2.56(s，)，2.79(s，2H)，2.92-2.94(t，2H)，3.48-3.54(q，2H)，198.2。
MSm/z475.2(M+H)+二Dde-四胺二-Dpr(Boc)2的合成將Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA(4.85g)懸浮于60ml EtOAc(含有12.0ml 2MH2SO4)中。振蕩該燒瓶，分開EtOAc層。用EtOAc提取水層。合并EtOAc層，用鹽水洗滌，無水MgSO4干燥并過濾。真空蒸發(fā)濾液，將所得的固體干燥后得到3.23g呈白色晶狀固體的Boc-Dpr(Boc)-OH游離酸。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.35(s，18H，)，3.30(s，2H)，3.96-3.98(m，1H)，6.87-6.90(d，1H)0℃將作為游離酸的Boc-Dpr(Boc)-OH(1.52g)溶解于15ml DCM中。在其中加入HOAt(0.68g)和DIEA(0.35ml)，0℃攪拌此清澈的溶液。然后將上述二Dde-四胺加到此溶液中，然后再加入HATU(1.90g)和2mmolTEA。加入無水DMF(5ml)，攪拌此反應物36小時。真空蒸發(fā)溶劑，用150mlEtOAc吸收殘留物，用1N HCl、飽和NaHCO3、鹽水洗滌，然后無水Na2SO4干燥，過濾并真空蒸發(fā)得到白色固體(1.92g)。在快速硅膠柱上層析純化該固體，用EtOAc(5％MeOH)洗脫得到呈白色固體的產(chǎn)物(1.3g)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.01(s，6H)，1.35(s，18H)，2.34(s，4H)，2.58(s，3H)，3.30(s，2H)，3.44-3.67(bm，6H)，3.85-4.10(m，1H)，5.44-5.52(d，2H)，5.74(bs，1H)。
MSm/z 1047.7(M+H)+二-Dde-四胺-diDpr.HCl鹽的合成將二Dde-四胺-diDpr(BOC)2溶解于40ml 4N HCl/二噁烷中，攪拌10小時。用冷乙醚研磨此懸浮液，真空蒸發(fā)得到大量白色固體。用高真空泵干燥這些固體，得到以HCl鹽形式的所需產(chǎn)物(1.09g)。
MSm/z647.3(M+H)+合成二Dde-二Dpr-四-GlyDTPA-OtBu0℃將Gly-DTPA五-叔-丁酯(Gly-DTPA-O-tBu)溶解于10ml DMF中。加入HOAt(0.41g)和DIEA(0.52ml)，在0℃攪拌此溶液。將上述二-Dde-四胺-diDpr鹽溶解于3ml DMF中，并加入DIEA(0.13ml)。將HATU(1.14g)和額外的DIEA(0.09ml)加入該混合物中。攪拌此黃色溶液36小時。真空除去溶劑，用EtOAc吸收殘留物。用1N HCl、飽和NaHCO3、鹽水洗滌有機層，無水Na2SO4干燥，過濾并真空干燥得到淺黃色固體(3.15g)。用制備型RP-HPLC(C-4，ACN/H2O)純化?；旌虾兴杌衔锏慕M分，冷凍干燥得到白色固體(0.25g)。
MSm/z 1244.4(M+3H)3+；933.9(M+4H)4+四胺-四-CN-GlyDTPA-O-tBu的合成將二Dde-四胺-二Dpr-四-GlyDTPA-O-tBu(0.38g)溶解于8ml 2％v/v肼的DMF中，室溫攪拌10分鐘。真空濃縮此反應混合物，并用CH3CN吸收殘留物，用預備型RP-HPLC[C-4，CAN/H2O]純化?；旌虾兴杌衔锏慕M分，冷凍干燥得到白色固體(0.25g)。
MSm/z 1702.1(M+2H)2+；1135.1(M+3H)3+二-MeO-三苯甲基-AoA-四-Gly-DTPA-O-tBu的合成0℃將四胺-四-Gly-DPTA-O-tBu(98mg)溶解于3mlDMF中。加入TEA(9μl)和甲氧基三苯甲基氨基氧乙酸琥珀酰亞胺酯(MeO-Trt-AoA-Osu)(29mg)，攪拌過夜，加入MeOH，蒸去溶劑，用DCM提取殘留物，用10％檸檬酸水溶液、鹽水洗滌，無水MgSO4干燥。用制備型RP-HPLC(C-4，ACN/H2O)進一步純化產(chǎn)物?；旌虾兴璁a(chǎn)物的組分，冷凍干燥得到白色固體(87mg)。
MSm/z 2047.5(M+2H)2+；1365.3(M+3H)3+AoA-四-GlyDTPA-OH的合成將二-MeO三苯甲基-AoA-四-GlyDTPA-O-tBu(85mg)溶解于10mlCH3Cl/苯硫基甲烷/DCM/TIS(64/16/16/4)中，在0℃攪拌3小時。TIS指(iPr)3SiH。用20ml水稀釋此反應混合物，用乙醚提取。在制備型RP-HPLC(C-18，ACN/NH4OAc)進一步純化水層。分離產(chǎn)物，冷凍干燥得到白色固體(29mg)。
MSm/z 1214.4(M+2H)2+；809.5(M+3H)3+
SLPCDYYGTCLD-NH2的氧化將肽c[SLPCDYYGTCLD-NH2](10mM在NaPi緩沖液中，pH＝6.8)與NaIO4(20mM)反應。用乙二醇淬滅氧化。在C-18Sep-Pak柱上純化反應物。用含有0.1％TFA的80％CH3CN洗脫產(chǎn)物。真空離心除去溶劑，將所需的產(chǎn)物α-N-乙醛酰-c[SLPCDYYGTCLD-NH2]冷凍干燥成白色粉末。
MSm/z 1315.5(M+H)+化學選擇性連接-最后裝配M8-11的合成22℃，將α-N-乙醛酰-c[SLPCDYYGTCLD-NH2](13.2mg)和AoA-四DPTA-OH(12.3mg)在20mM乙酸鈉緩沖液(pH4.6)中反應。用半制備型RP-HPLC(C-18，CH4CH/5mm NH4OAc)純化反應物。用標準方法將其轉(zhuǎn)化成釓復合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
MSm/z 1674.6(m+3H)3+；1256.3(m+4H)4+實施例4帶有三亞乙基四胺構(gòu)架的造影劑的合成用Di-Dde-四胺-diDpr和上述流程，以及用二氨基-BOC取代的乙烷連接基和Gly-DTPA-OtBu IEM取代，可以將上述各種螯合物結(jié)合于三亞乙基四胺構(gòu)架。螯合物可以是相同的或不同的，產(chǎn)生同質(zhì)螯合物造影劑或包含異質(zhì)螯合物的造影劑。
實施例5M8-07的合成 在4-基苯甲酸(0.7g)和三亞乙基四胺(4.26g)的CH2Cl2(200ml)溶液中加入HOBt(0.89g，5.83mmol)和DIC(0.74g)。室溫攪拌此混合物過夜。過濾得到的沉淀物，減壓下除去溶劑得到黃色油狀物。將反應混合物加樣到C4柱上進行制備型-HPLC(洗脫液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色泡沫的TFA鹽的單酰胺(0.63g)。
LC-MS(m/e)369.1(M+)室溫，在上述單酰胺(0.63g)的乙醚(100ml)和THF(100ml)溶液中緩慢加入LAH(1.30g)。回流此混合物2小時，然后在室溫攪拌過夜。在此混合物中逐滴加入水以淬滅LAH。過濾除去得到的沉淀，減壓下除去溶劑得到無色油狀物。將反應物加樣到C4柱上進行制備型-HPLC(洗脫液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色泡沫的TFA胺鹽(180mg)。
LC-MS(m/e)354.4(M+)在TFA胺鹽(180mg)和二異丙基乙胺(287mg)的DMF(50ml)溶液中加入Gly-DTPA-OtBu(1.88g)的CH2Cl2(50ml)溶液、HOBt(370mg)和DIC(301mg)。室溫攪拌此混合物過夜。減壓下除去溶劑得到黃色油狀物。將此反應混合物加到C4柱上進行制備型-HPLC(洗脫液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色固體的粗產(chǎn)物(0.36g)。
LC-MS(m/e)1719.4(M2+)，1147.2(M3+)在上述白色固體(0.19g)的CH2Cl2(4.5ml)和苯甲醚(4.5ml)溶液中逐滴加入4.5ml 12N HCl。室溫攪拌此混合物3小時。在此混合物中加入40ml水，用乙醚洗滌3次。冷凍干燥水溶液，得到粗產(chǎn)物，然后將其加樣到C18柱上進行制備型-HPLC(洗脫液100mM AcONH4/CH3CN)得到白色固體(50mg)。
LC-MS(m/e)1158.6(M3+)，772.8(M3+)按標準方法將此物轉(zhuǎn)化成釓的復合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology207第529-38頁(1998)]。
實施例6M8-08的合成 4-基苯甲酸。在基硼酸(10g)和4-溴苯甲酸(12.9g)的1-丙醇(150ml)和DME(200ml)溶液中加入三苯基膦(0.128g)、2M碳酸鈉溶液(37ml)和水(30ml)。氮氣氣氛下在此混合物中加入乙酸鈀(82mg)。加熱回流此混合物過夜。移去熱源后，加入100ml水，攪拌2.5小時同時邊冷卻至室溫。用150ml乙酸乙酯稀釋顏色變暗的混合物，將兩相分開。用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌有機層若干次，直到TLC顯示完全除去4-溴苯甲酸(Rf＝0.55，洗脫液CH2Cl2/CH3OH＝5)。用200ml 1N NaOH溶液提取此溶液3次。在合并的水層中加入約50ml 12N HCl使pH達到3。過濾得到的沉淀物，用水洗滌，干燥得到呈白色固體的4-基苯甲酸(8.81g)。Rf＝0.75(洗脫液CH2Cl2/CH3OH＝5)1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.997(s，6H)，2.340(s，3H)，6.961(s，2H)，7.274(d，J＝8.1Hz，2H)，8.177(d，J＝8.1Hz，2H)。
在4-基苯甲酸(1.5g)和三亞乙基四胺(0.43g)的CH2Cl2(60ml)溶液中加入HOBt(0.96g)和DIC(0.79g)。室溫攪拌此混合物過夜。過濾得到的沉淀物，干燥得到白色固體(1.45g)。
LC-MS(m/e)591.3(M+)室溫，在上述白色固體(0.45g)的乙醚(20ml)和THF(80ml)溶液中緩慢加入LAH(0.33g)?；亓鞔嘶旌衔?小時，然后在室溫攪拌過夜。在此混合物中逐滴加入水以淬滅LAH。過濾除去得到的沉淀，減壓下除去溶劑得到淺黃色油狀物。將反應物加樣到C4柱上進行制備型-HPLC(洗脫液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色固體的TFA胺鹽(140mg)。
LC-MS(m/e)564.6(M+)在此TFA胺鹽(50mg)和二異丙基乙胺(38mg)的DMF(30ml)溶液中加入Gly-DTPA-OtBu(193mg)的CH2Cl2(30ml)溶液、HOBt(37.5mg)和DIC(31mg)。室溫攪拌此混合物過夜。減壓下除去溶劑得到褐色油狀物。將此反應混合物加到C4柱上進行制備型-HPLC(洗脫液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈淺黃色固體的粗產(chǎn)物。
LC-MS(m/e)1824.2(M2+)，1216.3(M3+)，912.5(M4+)在此淺黃色固體(0.58g)的CH2Cl2(5ml)和苯甲醚(5ml)溶液中逐滴加入10ml12N HCl。室溫攪拌此混合物3小時。在此混合物中加入40ml水，用乙醚洗滌得到的混合物3次。冷凍干燥水溶液，得到粗產(chǎn)物，然后將其加樣到C18柱上進行制備型-HPLC(洗脫液100mM AcONH4/CH3CN)得到白色固體(11mg)。
LC-MS(m/e)1263.2(M2+)，842.4(M3+)，632.2(M4+)。
按標準方法將此物轉(zhuǎn)化成釓的復合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology207第529-38頁(1998)]。
實施例7含有兩個相同TBM的HSA結(jié)合多體的一般合成 將含有4個叔丁酯保護的DTPA的二胺溶解于二甲基甲酰胺(0.75ml)中。加入RCO3H(3eq)(其表示各種含有TBM的羧酸)、DIC(0.052ml，3.3eq)和HOBt(0.051g，3.3eq)。在逐滴加入DIEA(0.105ml，6eq)之前將反應混合物冷卻至0℃。室溫攪拌此反應混合物共8.5小時。用CH2Cl2稀釋此反應混合物，用0.1NHCl、飽和NaHCO3和鹽水洗滌。Na2SO4干燥有機層，真空除去殘留的溶劑，得到叔丁酯保護的中間體。用DCM吸收產(chǎn)物，在0℃加入HCl，攪拌3小時。蒸發(fā)溶劑得到白色固體，將此固體與GdCl3(4eq)和NaOH(12eq)反應得到終產(chǎn)物。
表3列出了按此方法合成的含有2個相同TBM的化合物及TBM的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
表3含有2個相同的TBM的多體造影劑 實施例8含有兩個不同TBM的HSA結(jié)合的多體的一般合成 將含有4個叔丁酯保護的DTPA的CBz保護的單胺溶解于二甲基甲酰胺(0.75ml)中。加入R1CO2H(1.5eq)(其表示各種含有TBMl的羧酸)、DIC(0.052ml，1.5eq)和HOBt(0.051g，1.5eq)。在逐滴加入DIEA(0.105ml，6eq)之前將反應混合物冷卻至0℃。室溫攪拌此反應混合物共8.5小時。
用CH2Cl2稀釋此反應混合物，用0.1N HCl、飽和NaHCO3和鹽水洗滌。Na2SO4干燥有機層，真空除去殘留的溶劑。
將此化合物溶解于EtOAc中并氫化(5％Pd-C)。濾去催化劑后，將產(chǎn)物與另一羧酸(R2CO2H，1.5eq)(代表各種含有TBM2的羧酸)、DIC(0.052ml，1.5eq)和HOBt(0.051g，1.5eq)反應。室溫攪拌此反應混合物共8.5小時。用CH2Cl2稀釋此反應混合物，用0.1N HCl、飽和NaHCO3和鹽水洗滌。Na2SO4干燥有機層，真空除去殘留的溶劑。將產(chǎn)物懸浮于DCM中，0℃加入HCl，攪拌此反應物3小時。蒸發(fā)掉溶劑后得到白色固體，將此固體與GdCl3(4eq)和NaOH(12eq)反應得到終產(chǎn)物。
表4列出了按此方法合成的化合物及TBM1和TBM2的結(jié)構(gòu)。需注意在一般合成流程中的“R1”代表TBM1，一般合成流程中的“R2”代表TBM2。
表4含有2個不同TBM的多體造影劑
實施例9M8-01的合成 將1，2-二(Boc-氨基)-3-羥基丙烷(1.0eq)和二苯基環(huán)己基亞磷酰胺酸酯(1.1eq)溶解于四氫呋喃(1.5ml/mmol亞磷酰胺酸酯)中，與分子篩攪拌30分鐘。室溫在此混合物中加入四唑(1.2eq)。攪拌此混合物45分鐘，31P NMR顯示反應完成。在此混合物中加入叔-丁基氫過氧化物(1.2eq)。攪拌此反應混合物約1小時，至31P NMR顯示反應完全。過濾除去得到的沉淀和分子篩，然后在濾液中加入二氯甲烷。順序用硫代硫酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌此溶液，硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。在得到的淺黃色油狀物中加入2M氨的甲醇溶液。攪拌此混合物過夜，然后真空除去溶劑。用硅膠柱層析(乙酸乙酯/甲醇洗脫)得到磷酸二酯。
在三氟乙酸和二氯甲烷中攪拌使此磷酸二酯去保護，然后將此混合物冷凍干燥得到二胺-二苯基環(huán)己基-磷酸二酯。用4當量的Gly-DTPA-O-tBu、EDC和HOBt的二氯甲烷(已加入二異丙基乙胺以增加pH)攪拌此二胺過夜。用制備型反相HPLC純化此濃縮的反應混合物。在鹽酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中攪拌來切割2個DTPA單位的叔丁酯，隨后按常規(guī)方法用GdCl3形成DTPA-釓螯合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
實施例10M8-02的合成
將由N-Boc-O-芐基-絲氨酸制備的芐氧基亞甲基-N-Boc-氮丙啶(2.82g)和N，N”-二Boc-二亞乙基三胺(3.9g)在回流的叔丁醇中攪拌2天，然后真空除去溶劑，用快速層析純化殘留物(甲醇和二氯甲烷為洗脫液)得到4.54g物質(zhì)。通過1H NMR光譜的積分證明Boc氫與芳族氫的比例。將這種三Boc-保護的四胺芐醚(3.8g)溶解于70ml 7％乙酸的乙酸乙酯(含有1.0g 10％碳鈀)中。將此反應混合物置于48psi的氫氣中16小時。真空下除去反應混合物的溶劑，快速層析純化(甲醇和二氯甲烷為洗脫液)殘留物，得到3.6g。用上述條件(四唑、叔-丁基氫過氧化物、氨的甲醇溶液)將所得的醇和二苯基環(huán)己基亞磷酰胺酸酯反應，得到相應的磷酸二酯。
在1.0ml TFA和1.0ml DCM中攪拌3小時除去此磷酸二酯的三個Boc基團，然后冷凍干燥此混合物得到54ml三胺。將三胺溶解于1.0ml二氯甲烷中，并逐滴加入含有各6當量Gly-DTPA-O-tBu、EDC和HOBt的2.0ml二氯甲烷溶液(其中加入DIEA將pH調(diào)節(jié)至9.0)。用制備級HPLC(C-4柱，20ml/分鐘，30∶70乙腈∶水到100∶0梯度25分鐘，然后維持10分鐘)純化此濃反應物。用質(zhì)譜驗證該化合物的分子量。在鹽酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中攪拌5小時來切割DTPA亞基的叔丁酯以產(chǎn)生羧酸，然后真空除去溶劑，溶解于水中并冷凍干燥。用常規(guī)方法[參見Lauffer R.B.，等人Radiology 207第529-38頁(1998)]用GdCl3形成DTPA-釓螯合物。
實施例11M8-03的合成 將溴乙酸芐基酯(11ml)的50ml乙腈溶液加入N，N”-二Boc-二亞乙基三胺(14g)的50ml乙腈和19ml三乙胺的溶液中，并攪拌2小時，然后真空除去溶劑，快速層析(己烷/乙酸乙酯為洗脫液)純化殘留物得到11g物質(zhì)。通過在1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合物中攪拌3小時，除去該物質(zhì)中混合物的2個Boc保護基團，然后真空除去溶劑，在水和乙醚間分配，冷凍干燥得到9.2g物質(zhì)。在N，N-二甲基甲酰胺中攪拌Gly-DTPA-O-tBu、DIC和HOBt(各2.2當量)45分鐘，然后將此三胺(1.0g)作為二(三氟乙酸銨)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，并將它們加到反應容器中，加入二異丙基乙胺將pH調(diào)節(jié)至9.0。
攪拌12小時后，用水稀釋此溶液，用乙酸乙酯提取，然后順序用檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉洗滌。真空濃縮乙酸乙酯，快速層析(己烷/乙酸乙酯)得到845mg由質(zhì)譜證明為四聚物的物質(zhì)。在氫氣氣氛中，氫化800mg溶解于10ml己烷、9ml甲醇和1ml三乙胺(含有20％鈀碳)的此物質(zhì)，來除去芐基基團，然后經(jīng)硅藻土過濾并真空濃縮。在含有EDC和HOBt(各1.2當量)的二氯甲烷中攪拌此羧酸(750mg)30分鐘，將上述合成M8-01中所述的二胺-二苯基環(huán)己基-磷酸二酯(80mg)溶解于二氯甲烷中，并加到此羧酸溶液中，加入二異丙基乙胺將pH調(diào)節(jié)至9.0。幾小時后，濃縮此混合物，用制備級HPCL(C-4柱，20ml/分鐘，30∶70乙腈∶水到100∶0梯度25分鐘，然后維持10分鐘)純化得到150mg物質(zhì)，用質(zhì)譜驗證它的分子量。在鹽酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中攪拌5小時，切割DTPA亞單位的叔丁酯，以產(chǎn)生羧酸，然后真空除去溶劑，溶解于水中并冷凍干燥(得到90mg)。按常規(guī)方法用GdCl3形成DTPA-釓螯合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
實施例12M8-09的合成 在(1R-2S)-(+)-順式-1-氨基-2-茚滿醇(15g)的二氯甲烷(90ml)懸浮液中加入二異丙基乙胺(35ml)，然后再加入芐基溴(17.2g)。攪拌此混合物過夜。用水洗滌此溶液，并用0.1N HCl溶液提取2次，將合并水層的pH升至8，用CH2Cl2提取此水層4次。用飽和氯化鈉洗滌合并的有機層，硫酸鈉干燥，過濾并濃縮得到1-芐基氨基-2-茚滿醇(15.62g)，用質(zhì)譜驗證其分子量(M+的m/e＝239.95)。在1-芐基氨基-2-茚滿醇(10.5)和三乙胺(9.2ml)的二氯甲烷(250ml)溶液中逐滴加入4-丁基苯甲酰氯(9.1ml)。攪拌此混合物4小時，然后在真空下濃縮。
將殘留物溶解于乙酸乙酯中，并用水洗滌，硫酸鈉干燥，過濾，減壓下濃縮并用快速層析(己烷/乙酸乙酯為洗脫液)得到1-對-丁基苯甲酰基-1-芐基氨基-2-茚滿醇(12.7g)1H NMR(CDCl3)δ0.93(t，3H)，1.24-1.4(m，2H)，1.5-1.65(m，2H)，2.6(t，2H)，2.8(寬d，1H)，3.07(dd，1H)，4.52(m，1H)，4.65(m，2H)，5.13(m，1H)，7.09-7.32(m，11H)，7.38-7.62(m，2H)。將1-對-丁基苯甲?；?1-芐基氨基-2-茚滿醇(1.26g)和DTPA亞磷酰胺酸酯(2.99g)溶解于四氫呋喃(5ml)中，與分子篩攪拌30分鐘，然后在其中加入四唑(265mg)，攪拌此混合物45分鐘。
31P NMR表明反應完成，在此混合物中加入叔-丁基氫過氧化物(0.433ml)，然后攪拌此反應混合物1小時直到31P NMR顯示反應完成。過濾除去形成的沉淀和分子篩，然后在濾液中加入二氯甲烷。順序用硫代硫酸鈉溶液、碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌此溶液，硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。在得到的淺黃色油狀物中加入2M氨的甲醇溶液。攪拌此混合物過夜，然后減壓下除去溶劑?？焖賹游?乙酸乙酯/甲醇為洗脫液)純化此反應混合物，得到呈白色固體的磷酸二酯31P NMR(THF-d8)δ-0.28；LC-MS(m/e)1165.75(M+)。
通過溶解于二氯甲烷和用12N鹽酸處理，除去DTPA亞單元上的叔丁酯以產(chǎn)生羧酸。幾小時后，加入5N氫氧化鈉水溶液將pH調(diào)節(jié)至1.5，濾去形成的白色沉淀，用鹽酸(pH＝1.5)洗滌2次。冷凍干燥沉淀物48小時，得到呈白色細粉末的產(chǎn)物LC-MS(m/e)885.15(M+)。按常規(guī)方法用GdCl3形成DTPA-釓螯合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
實施例13M8-10的合成 在含有3，4-二氫吡喃(12g)和對甲苯磺酸(tosic acid)(20mg)的乙醚(250ml)中攪拌3-丁炔-1-醇(10g)12小時，然后真空濃縮此溶液，殘留物在乙酸乙酯和水之間分配。用飽和氯化鈉水溶液洗滌此有機溶液，硫酸鈉干燥，并濃縮得到DHP-保護的醇(18.7g)，其無需進一步鑒定或純化。將DHP-醇(18.7g)溶解于乙醚(65ml)中并冷卻至-75℃，然后在此溫度逐滴加入丁基鋰(50.5ml的2.0M溶液)，然后加入多聚甲醛(3.5g)。4小時后，讓此溶液升溫至室溫，加入水(100ml)。棄去水層，真空濃縮有機層得到油狀物，快速層析(乙酸乙酯/己烷為洗脫液)純化得到5-THP-2-戊炔-1，5-醇(13g)，由1H NMR證明其結(jié)構(gòu)。
首先用常規(guī)方法將炔醇(2.0g)轉(zhuǎn)化成甲磺酸酯(882mg甲磺酰氯，1.6ml三乙胺，二氯甲烷)，然后再轉(zhuǎn)化成碘化物(6.2g碘化鈉，無水丙酮)。在三Boc-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(200mg)和碳酸氫鈉(200mg)的8ml乙腈溶液中攪拌此碘代炔(1.2g)1.5小時，然后真空濃縮除去溶劑，并快速層析(乙酸乙酯/己烷為洗脫液)純化，并由1H NMR和LC-MS證明此加合物(240mg)。40℃在4∶2∶1的乙酸∶四氫呋喃∶水(12ml)中攪拌將此加合物(240mg)6小時來除去THP保護，然后用水和乙酸乙酯稀釋此反應物，順序用飽和碳酸氫鈉水溶液和氯化鈉提取有機層，硫酸鈉干燥并濃縮得到醇(250mg)。用上述M8-01合成中所述的標準亞磷酰胺酸酯化學(四唑、叔丁基氫過氧化物、氨/甲醇)合成此醇與1-對-丁基苯甲?；?1-芐基氨基-2-茚滿醇的磷酸二酯。
如上所述通過用酸(三氟乙酸的二氯甲烷溶液)處理除去1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷上的三個Boc保護基團，然后用標準方法將得到的三種胺用Gly-DTPA-O-tBu轉(zhuǎn)化成酰胺(HATU/HOAt，二異丙基乙胺，二氯甲烷)。在4∶1∶1的鹽酸∶苯甲醚∶二氯甲烷中攪拌5小時除去DTPA亞單元的叔丁酯以產(chǎn)生羧酸，然后真空除去溶劑，溶解于水中并冷凍干燥。按常規(guī)方法用GdCl3形成DTPA-釓螯合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
實施例14M8-06的合成 順序?qū)⒁叶放cN-Boc-甘氨酸甲酯和N-Boc-絲氨酸甲酯反應形成二酰胺。用上述方法(四唑、叔丁基氫過氧化物、氨/甲醇)將游離的醇和1-對-丁基苯甲?；?1-芐基氨基-2-茚滿醇轉(zhuǎn)化成磷酸二酯。用上述條件(DIC/HOBt，二異丙基乙胺、二氯甲烷)將芐基-(3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基)丙酸酯和2當量的Gly-DTPA-O-tBu反應形成相應的二酰胺。2當量此二酰胺與乙二胺衍生物反應以形成四聚體。在4∶1∶1的鹽酸∶苯甲醚∶二氯甲烷中攪拌5小時除去DTPA亞單元的叔丁酯以產(chǎn)生羧酸，然后真空除去溶劑，溶解于水中并冷凍干燥。按常規(guī)方法用GdCl3形成DTPA-釓螯合物(參見Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38頁(1998)]。
實施例15M8-04的合成 將乙二胺與2當量N-Boc-絲氨酸甲酯反應形成二酰胺。將此二酰胺進一步反應形成如上所示的二磷酸酯衍生物。按所示的合成流程并用實施例14所述的方法，連接TBM并去保護。
實施例16M8-05的合成 在本合成中用作起始物的二酰胺的二磷酸衍生物與實施例15中所示的合成M8-04中的中間體相同。按所示的合成流程并用實施例14所述的方法，結(jié)合TBM并去保護。
實施例16-由兔頸靜脈模型測定的M8-11的結(jié)合圖15是用實施例1所述的試驗在一個實驗中得到的成像的彩色照片。該實驗顯示了注射前、用對照非靶向的Gd-DTPA化合物注射、用實施例3給出的M8-11注射、用三倍劑量的M8-11注射和用過量序列為LPCDYYGTCLD的肽(以單字母氨基酸形式)注射(其與造影劑的TBM競爭靶標)的成像。因為無TBM的造影劑不結(jié)合并因為存在過量肽時結(jié)合逆轉(zhuǎn)，由M8-11特異性成像凝塊。
實施例16-近紅外光學成像劑M8-24 近紅外熒光成像劑M8-24含有適用于光學成像的IEM(“R”)。由相應熒光染料的羧酸衍生物(如WO 2000/16810中所公開的)制備該試劑。按實施例13中所示的條件將羧酸衍生物結(jié)合于二酰胺的二磷酸衍生物。在實施例13中，類似步驟是Gly-DTPA TBM結(jié)合于二酰胺的二磷酸酯衍生物形成M8-04。這種白蛋白靶向的紅外線造影劑可用于如眼科血管造影和皮膚癌的診斷中。上述光學造影劑可用于MRI血池造影劑的任何用途中。另外，技術(shù)人員將理解通過構(gòu)建染料的不同羧酸衍生物，這種光學造影劑的IEM可以多種多樣。因此這種試劑是適應特定實驗標準如特定的激發(fā)波長所特制的。
權(quán)利要求
1.一種用磁共振成像MRI或光學成像提高對比度的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)多位點造影劑結(jié)合于靶標，(b)在造影劑結(jié)合于靶標后提高靶標上的對比度，(c)用IEM的數(shù)量、分子的剛性或這兩者改善對比度的提高。
2.一種增加造影劑弛豫率的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)多位點造影劑結(jié)合于靶，(b)結(jié)合于靶標時造影劑的弛豫率增加，(c)結(jié)合后造影劑的每IEM的弛豫率沒有減少，且其中造影劑包括a)兩個或多個影像增強部分(“IEMs”)；b)兩個或多個靶標結(jié)合部分(“TBMs”)；c)連接TBM和IEM的構(gòu)架；和d)將IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基。
3.如權(quán)利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少為每個IEM 10mM-1s-1。
4.如權(quán)利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少為每個IEM 15mM-1s-1。
5.如權(quán)利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少為每個IEM 20mM-1s-1。
6.如權(quán)利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少為每個IEM 25mM-1s-1。
7.如權(quán)利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少為每個IEM 30mM-1s-1。
8.一種在動物或人對象中對靶標進行MR成像的方法，包括如下步驟給予MRI造影劑；使造影劑結(jié)合于靶標；將身體靶標所在處的對象部位進行成像；其特征在于，所述的MRI造影劑包括構(gòu)架；至少兩個IEM，各TBM含有順磁金屬離子的螯合物，且直接或通過一個或多個中間的連接基共價結(jié)合于構(gòu)架；和至少兩個TBM，各TBM具有與靶標的親和力，而且共價結(jié)合于構(gòu)架上與IEM結(jié)合的原子不同的原子上；其中結(jié)合后造影劑的弛豫率增加；且所述靶標是蛋白質(zhì)、多糖、細胞、液體、糖蛋白或血栓。
9.一種MRI造影劑，其特征在于，包含構(gòu)架、2-4個共價結(jié)合于所述構(gòu)架的TBM、2-4個IEM的尋靶所述的IEM共價結(jié)合于所述的構(gòu)架或共價結(jié)合于一個或多個連接基，其中如果存在所述的連接基，則所述的連接基共價結(jié)合于所述的構(gòu)架，且其中各IEM含有順磁金屬離子的螯合物，各TBM共價結(jié)合于構(gòu)架的不共價結(jié)合IEM的原子，各TBM具有對靶標的親和力，和當與所述的靶標結(jié)合時造影劑的弛豫率至少比未結(jié)合狀態(tài)時的弛豫率高2倍。
10.一種用于增加造影劑對其靶標親和力的方法，包括使造影劑多位點結(jié)合于靶標，其特征在于，所述的造影劑包含a)兩個或多個影像增強的部分(“IEMs”)；b)兩個或多個靶標結(jié)合部分(“TBMs”)；c)連接TBM和IEM的構(gòu)架；和d)將IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基。
11.一種具有如下結(jié)構(gòu)(IX)的多位點造影劑 X＝L-IEM、TBM或IEM其中m是1-10以內(nèi)的整數(shù)；n是2-10以內(nèi)的整數(shù)；o是0-1；p是0-1；各A分別選自基團O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和B選自基團CH和N；和R是C1-C10直鏈或支鏈烷基、C2-C10直鏈或支鏈鏈烯基或炔基，且其中至多4個碳原子任選地被鹵素、O、N或S取代。
12.一種具有如下結(jié)構(gòu)(V)的多位點造影劑 X＝L-IEM、TBM或IEM其特征在于，所述的各m是1-8以內(nèi)的整數(shù)；各A分別選自基團O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和R是C1-C10直鏈或支鏈烷基、C2-C10直鏈或支鏈鏈烯基或炔基，且其中至多4個碳原子任選地被鹵素、O、N或S取代；和n是2-10以內(nèi)的整數(shù)。
13.如權(quán)利要求12所述的造影劑，其特征在于，所述的A是C＝O。
14.如權(quán)利要求12所述的造影劑，其特征在于，所述的A是O。
15.一種具有如下結(jié)構(gòu)(VI)的多位點造影劑 X＝L-IEM、TBM或IEM其特征在于，所述的各m是1-10的整數(shù)(包含1和10)；n是2-10以內(nèi)的整數(shù)；o是0-1；p是0-1；各A分別選自基團O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和B選自CH和N；R是C1-C10直鏈或支鏈烷基、C2-C10直鏈或支鏈鏈烯基或炔基，且其中至多4個碳原子任選地被鹵素、O、N或S取代。
16.一種具有如下結(jié)構(gòu)(VII)的多位點造影劑
17.如權(quán)利要求11-16任一所述的多位點造影劑，其特征在于，所述的TBM包括取代的芳基。
18.如權(quán)利要求17所述的多位點造影劑，其特征在于，所述的IEM選自以下基團二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和其衍生物；1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(cyclen)及其衍生物；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，7-二(乙酸叔-丁-酯)(DO2A-t-丁-酯)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三(乙酸，叔-丁-酯)(DO3A-t-丁-酯)；1，4，7-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7-四氮雜環(huán)十二烷(DO3-t-BOC)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)及其衍生物；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四(亞甲基膦酸)(DOTP)。
19.如權(quán)利要求18所述的造影劑，其特征在于，所述的IEM是二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)。
20.如權(quán)利要求11-16任一所述的造影劑，其特征在于，所述的TBM是肽。
21.如權(quán)利要求20所述的造影劑，其特征在于，所述的TBM是血纖蛋白結(jié)合肽。
22.一種下式的造影劑(TBM)q-S-[Lm-IEMn]p其特征在于TBM是靶標結(jié)合部分，S是構(gòu)架，L是連接基，IEM是影像增強的部分，和q、m、n和p分別都是整數(shù)，其中q是2-6以內(nèi)的整數(shù)，各m為0或1，各n分別是2-4以內(nèi)的整數(shù)，p是2-4以內(nèi)的整數(shù)，而且其中各TBM通過兩個原子間的化學鍵共價連接于S，如果存在，各L通過兩個原子間的化學鍵共價連接于IEM，如果存在，各L通過兩個原子間的化學鍵共價連接于S，至少兩個TBM連接于構(gòu)架上不同的原子上。
23.一種用于光學或MR成像的造影劑，其特征在于，含有a)兩個或多個影像增強的部分(“IEMs”)；b)兩個或多個靶標結(jié)合部分(“TBMs”)；c)連接TBM和IEM的構(gòu)架；和d)各IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基。其特征在于，其中所述的構(gòu)架包括式(VIII) 且m和n各是整數(shù)，其中m是0-3以內(nèi)的整數(shù)，n是0-2以內(nèi)的整數(shù)，各A是分別選自如下基團NH、NR、O、S、CH2、C＝O、C＝NH、C＝NR和CHR，其中R是C1-C10直鏈或支鏈烷基、C2-C10直鏈或支鏈鏈烯基或炔基，且其中至多4個碳原子任選地被鹵素、O、N、或S取代。
24.化合物M8-24
25.化合物M8-11
26.化合物M8-08
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷成像的造影劑。具體說,本發(fā)明涉及新型的多體化合物,其表現(xiàn)出在結(jié)合內(nèi)源蛋白質(zhì)或其它生理相關(guān)位點時改善的弛豫率。這種化合物包括:a)兩個或多個包括多體亞單位的影像增強部分(“IEMs”)(或信號產(chǎn)生部分);b)兩個或多個靶標結(jié)合部分(“TBMs”),提供體內(nèi)定位和多體剛性化;c)用于上述部分連接的構(gòu)架(“骨架”);和d)將IEMs連接于構(gòu)架的任選的連接基。本發(fā)明還涉及含有這些化合物的藥物組合物,和用這些化合物和組合物提高診斷成像對比度的方法。
文檔編號A61K49/00GK1382062SQ00813045
公開日2002年11月27日 申請日期2000年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者R·B·勞弗, T·J·麥克默瑞, S·迪馬, A·科沃杰伊, J·阿梅迪奧, P·卡拉文, 張昭達, S·奈爾 申請人:埃匹克斯醫(yī)學股份有限公司