專利名稱：抗腫瘤抗體、蛋白質及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與腫瘤細胞特異性結合的抗體和蛋白質，以及涉及與腫瘤細胞特異性結合的這些抗體的生產方法和應用。
基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明特別描述了單克隆抗體或其抗原結合片段，其中單克隆抗體(a)與胎兒胸腺細胞結合；(b)與該細胞結合時抑制細胞的增殖；并(c)不與成人胸腺細胞結合。這些單克隆抗體在與細胞結合時也可誘導同型聚集、誘導與其結合細胞的編程性細胞死亡、并可與E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos中的一種或多種腫瘤細胞系特異性結合?？梢杂美缈蓹z測的標記物標記這些抗體。
由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377產生的單克隆抗體DMF 10.62.3、由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405產生的單克隆抗體DMF 10.167.4、由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404產生的單克隆抗體DMF 10.34.36也在本本發(fā)明還描述了單克隆抗體，它們與雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405或雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404產生的單克隆抗體結合的蛋白質相同的蛋白質結合。該單克隆抗體可以人源化。
另一方面，本發(fā)明描述了單克隆抗體或其抗原結合片段，它與雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系PTA-404或雜交瘤細胞系PTA-405產生的單克隆抗體結合的40kDa蛋白質相結合。
還有一方面，本發(fā)明描述了嵌合單克隆抗體或其抗原結合片段，它們與雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405或雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404產生的單克隆抗體結合的相同的蛋白質結合，其中嵌合抗體包括非人可變區(qū)和輕鏈和重鏈的人的恒定區(qū)。
還有一方面，本發(fā)明描述了單克隆抗體或其抗原結合片段，它們與雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405或雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404產生的單克隆抗體結合的表位相同的表位結合。
本發(fā)明還描述了單克隆抗體或其抗原結合片段，它們與具有下列特征的蛋白質特異性結合(i)分子量為40kDa；(ii)在胎兒胸腺細胞表面表達；(iii)在成人胸腺細胞表面無表達；(iv)與該抗體結合時能阻斷細胞增殖；和(v)與抗體結合時能誘導同型聚集。該單克隆抗體與一種蛋白質特異性結合，該蛋白質的特征還在于(vi)與該抗體結合時能誘導細胞的編程性細胞死亡；和(vii)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一種或多種腫瘤細胞系的細胞表面表達。
本發(fā)明還描述了本文所述的單克隆抗體的抗原結合片段。該抗原結合片段可以用例如可檢測的標記物進行標記。
本發(fā)明還描述了產生本文所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。例如，本發(fā)明描述了雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405或雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404。
本發(fā)明還描述了一種實質上純的蛋白質，其特征在于(i)分子量為40kDa；(ii)在胎兒胸腺細胞表面表達；(iii)在成人胸腺細胞表面無表達；(iv)能阻斷本文所述抗體所結合的細胞增殖；和(v)能誘導本文所述與抗體結合時的同型聚集。該蛋白質還可具有以下特征(vi)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一種或多種腫瘤細胞系的細胞表面表達，和(vii)能誘導本文所述的抗體結合細胞的編程性細胞死亡。
另一方面，本發(fā)明描述了與單克隆抗體結合的實質上純的蛋白質，該單克隆抗體由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、雜交瘤細胞系PTA-405或雜交瘤細胞系PTA-404產生。
本發(fā)明還描述了包含本文所述的單克隆抗體和藥學上可接受的載體的一種藥物組合物。
本發(fā)明還描述了一種檢測受檢者體內腫瘤細胞的方法，該方法包括將受試者細胞樣品與本文所述的一種或多種單克隆抗體結合，并且檢測該抗體與樣品的結合，其中結合表示受檢者體內有腫瘤細胞存在。腫瘤細胞的例子包括胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T細胞白血病。該腫瘤細胞也可存在于患者體內?？梢詫τ糜跈z測腫瘤的單克隆抗體進行標記。
本發(fā)明還描述了一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將該腫瘤細胞與其量足以抑制腫瘤細胞增殖的本文所述的單克隆抗體接觸。
在另一個實施方式中，本發(fā)明描述了一種誘導細胞的編程性細胞死亡的方法，該方法包括將該細胞與其量足以誘導細胞的編程性細胞死亡的本文所述的一種或多種單克隆抗體接觸，該細胞可以是選自由胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T細胞白血病的腫瘤細胞。該細胞可以是體外或體內的細胞。
本發(fā)明也包括一種腫瘤診斷試劑盒，該試劑盒包含本文所述的一種或多種單克隆抗體及其使用說明。該試劑盒可以含有選自胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤和急性T細胞白血病的腫瘤細胞。本發(fā)明還包括一種腫瘤細胞導向劑，它包含本文所述的一種或多種單克隆抗體，該抗體可與一種成分綴合以將該成分傳遞至腫瘤細胞。該成分的例子包括抗腫瘤劑、細胞毒素、細胞因子或信息組(reporter group)。
本發(fā)明的另一個實施方式是選擇性地將一種成分傳送至哺乳動物腫瘤細胞的方法。該方法包括對哺乳動物給予本文所述的與一種成分連接的導向劑，和給予充分的時間以使導向劑到達腫瘤細胞、其中導向劑中的抗體與腫瘤細胞結合，由此選擇性地將該成分傳遞至哺乳動物腫瘤細胞。該成分的例子包括抗腫瘤劑、細胞毒素、細胞因子和信息組。
本發(fā)明還包括一種分離本文所述40kDa蛋白質的方法。該方法包括將含該蛋白質的樣品與本文所述的單克隆抗體結合一定時間、并且該結合是在足以形成單克隆抗體/蛋白質復合物的條件下進行的，如果需要，則從該樣品中取出一種或多種復合物，從該復合物中取出蛋白質，由此分離該蛋白質。
“分離的核酸序列”是實質上沒有與自然產生的生物體基因組中的核酸序列側面相接基因的核酸序列。因此該術語包括摻入載體、摻入自主復制的質?；虿《尽⒒驌饺朐松锘蛘婧松锏幕蚪M核酸序列的重組核酸序列。也包括單獨的分子，例如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈反應(PCR)產生的片段或限制片段。
與蛋白質“特異性結合”的抗體是一種與蛋白質結合的抗體，但不識別和結合樣品(例如生物學樣品)中的其它分子，所述樣品自然包括蛋白質，如40kDa蛋白質。
“保存性”氨基酸置換是指其中一種氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一種氨基酸殘基代替的替換。本領域中已經對具有相似側鏈的氨基酸殘基家族進行了規(guī)定。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天門冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。在保存性置換中，氨基酸家族中的任何一個都可用于代替該家族的任何其它成員。
本文可互換使用的術語“多肽、肽和蛋白質”是指氨基酸殘基的鏈。
抗體的“抗原結合片段”是能與抗原上的表位結合的抗體部分，例如40kDa蛋白質，它被全部抗體結合。
“表位”是抗原的特殊區(qū)域，例如，一種與抗體結合并能引起免疫應答的蛋白質。
“實質上純的”40kDa蛋白質是指至少為60重量％的40kDa蛋白質，不含與其天然相隨的蛋白質和天然存在的有機分子。該制劑較佳為至少75重量％、更優(yōu)選至少90重量％、最優(yōu)選至少99重量％的40kDa蛋白質。例如，可通過使用本文所述的抗體或單克隆抗體的親和層析和/或通過物理學純化技術獲得實質上純的40kDa蛋白質。
“分離的”抗體是指實質上不含與其天然相隨的其它天然存在的有機分子的一種抗體。
阻斷細胞增殖的抗體或其它分子是指抑制細胞循環(huán)、分裂或抑制兩者的抗體或分子。
“同型聚集”是指生物活性過程，由此刺激同型細胞相互粘附。
“信息組”是一種具有諸如發(fā)光、熒光、酶活性、電子密度或放射性之類的物理或化學特性的分子或化合物，這些特性可通過適合的檢測器系統(tǒng)或方法很容易測定或檢測。
除非另有定義，所有本文使用的技術和科學術語均具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等同的方法和原料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但適合的方法和原料如下所述。本文所述的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文獻全部引作參考。在出現(xiàn)沖突的情況下，本說明書、包括定義將進行控制。另外，原料、方法和實施例僅僅是舉例說明而不是為了限定。
本發(fā)明描述了識別在腫瘤細胞上表達的40kDa蛋白質的抗體。這些抗體可用于抑制腫瘤細胞增殖和誘導與其特異性結合的腫瘤細胞的編程性細胞死亡。在診斷上可使用這些單克隆抗體(例如，測定惡性細胞的存在)、或治療上可以將其本身或通過它們傳遞所附著的抗腫瘤劑來用于治療腫瘤細胞。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢從下列詳細的說明書和權利要求書中是顯而易見的。
圖2A-D是表示以DMF 10.62.3檢測的14天胎兒胸腺(圖2A)、成人全脾A20(圖2B)、成人全胸腺(圖2C)和成人全部骨髓(圖2D)上40kDa蛋白質表達的四個流動細胞計數(shù)圖。
圖3A-G是表示以DMF 10.62.3檢測的未刺激的新鮮收集的T和B細胞(圖3A)、24小時時激活的T細胞(圖3B)、48小時時激活的T細胞(圖3C)、72小時時激活的T細胞(圖3D)、24小時時激活的脾臟B細胞(圖3E)、48小時時激活的脾臟B細胞(圖3F)和72小時時激活的脾臟B細胞(圖3G)上40kDa蛋白質表達的七個流動細胞計數(shù)圖。
圖4A-C是表示單克隆抗體DMF10.62.3抑制E710.2.3細胞(圖4A)、RMA-S細胞(圖4B)或RF33.70細胞(圖4C)自發(fā)增殖的三個線性圖。
圖5A-I是表示用1μg/ml DMF10.62.3處理1小時的E710.2.3細胞(圖5A)、用1μg/ml DMF10.62.3處理2小時的E710.2.3細胞(圖5B)、用1μg/mlDMF10.62.3處理3小時的E710.2.3細胞(圖5C)、用倉鼠IgG處理3小時的E710.2.3細胞(圖5D)、用15μg/ml DMF10.62.3處理1小時的E710.2.3細胞(圖5E)、用15μg/ml DMF10.62.3處理2小時的E710.2.3細胞(圖5F)、用15μg/ml DMF10.62.3處理3小時的E710.2.3細胞(圖5G)、用倉鼠IgG處理3小時的E710.2.3細胞(圖5H)、和無抗體的E710.2.3細胞(圖5I)中編程性細胞死亡的誘導的九個流動細胞計數(shù)圖。
詳細描述本發(fā)明描述了抗體，例如單克隆抗體，該抗體與40kDa蛋白質特異性結合。該40kDa蛋白質是一種在各種腫瘤細胞上和在包括人、猴和小鼠的各種不同種中表達的新的細胞表面蛋白質，該腫瘤細胞包括胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤、或急性T細胞白血病細胞。這些抗體對正常成人造血細胞無反應性。當將本發(fā)明的抗體與一種表達40kDa蛋白質的細胞結合時，該細胞停止增殖并進行編程性細胞死亡。根據(jù)當單克隆抗體與細胞上的這種蛋白質結合時細胞進行編程性細胞死亡這一觀察，可見該40kDa蛋白質是一種誘導死亡的新蛋白質。
與40kDa蛋白質特異性結合并產生單克隆抗體的三種雜交瘤細胞系已經由ATCC以登記號PTA-377(DMF10.62.3)、登記號PTA-405(DMF10.167.4)、或登記號PTA-404(DMF10.34.36)進行了保藏。
本文所述的抗體有各種用途。這些抗體可用于體外診斷檢測以確定哺乳動物如人、組織中的惡性細胞的存在。通過給患者使用用信息組標記的本文所述的分離抗體也可將這些抗體用于局限體內的腫瘤。這些抗體也具有治療學應用。另外，這些抗體可用于治療腫瘤或傳送抗腫瘤劑。制備抗體的方法抗體是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性蛋白質。免疫球蛋白分子片段的例子包括抗體的片段，例如F(ab)和F(ab′)2部分，它們可與40kDa蛋白質特異性結合。通過用諸如胃蛋白酶的酶處理抗體可產生這些片段。術語單克隆抗體或單克隆抗體組合物是指僅含一種能與多肽或蛋白質的特殊表位產生免疫反應抗原結合位點的一群抗體分子。因此單克隆抗體組合物對與其特異性結合的蛋白質尤其具有單一的結合親和力。免疫通過用含適當免疫原的免疫原性制劑免疫適合的受試者(例如，家兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)，可產生抗40kDa蛋白質的多克隆或單克隆抗體。免疫原包括以下細胞，例如來自無限增殖化細胞系E710.2.3、RMA-S、CTLL、LB17.4、A20、WEHI-231、PBK101A2、C2.3、B16、MC57、WOP-3027、293T、143Btk、Jurkat或Cos的細胞，已證實它們均表達新的40kDa蛋白質。
或者，免疫原可以是純化的或分離的40kDa蛋白質自身。例如，采用親和層析、免疫沉淀或本領域眾所周知的其它技術，由以ATCC No.PTA-377、PTA-405或PTA-404保藏的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體可用于從產生該蛋白質的細胞，例如E710.2.3、RMA-S、CTLL、LB17.4、A20、WEHI-231、PBKlOlA2、C2.3、B16、MC57、WOP-3027、293T、143Btk、Jurkat或Cos中分離該蛋白質。
然后可以篩選受試者體內產生的抗體以確定這些抗體是否與胎兒胸腺細胞結合而不與成人胸腺細胞結合。在本文所述的測定中可對這些抗體進一步篩選。例如，可將這些抗體用于確定它們是否抑制與它們結合的細胞的細胞增殖；是否誘導細胞的同型聚集；和/或誘導與它們結合的細胞的編程性細胞死亡。確定具有所需特性的抗體的適合方法在本文進行了描述。例如，用購自R & D(Minneapolis，MN)或Pharmingen(San Diego，CA)的試劑盒可以測定一種抗體與細胞結合時的誘導細胞死亡的能力。
免疫原(例如，純化蛋白質，表達該蛋白質的腫瘤細胞，或重組表達的40kDa蛋白質)的單位劑量和免疫方案將根據(jù)要進行免疫的受試者、其免疫情況、和受試者的體重而決定。為了增強受試者的免疫應答，可以將免疫原與佐劑例如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑一同給藥。上面所述的用免疫原免疫受試者誘導了多克隆抗體應答。采用諸如ELISA的標準技術，用固定化抗原如本文所述的40kDa蛋白質，可以對所免疫的受試者的抗體滴度作經時性監(jiān)測。
產生抗40kDa蛋白質的抗體的其它方法包括使用表達人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠(參見例如，Wood等，PCT公開文本WO 91/00906，Kucherlapati等，PCT公開文本WO 91/10741；或Lonberg等，PCT公開文本WO 92/03918)。或者，通過將一種抗原導入免疫缺陷小鼠可產生人單克隆抗體，該小鼠已移植了人的產抗體細胞或組織(例如，人骨髓細胞、外周血淋巴細胞(PBL)、人胎兒淋巴節(jié)組織、或造血干細胞)。這些方法包括在SCID-hu小鼠(參見Duchosal等，PCT公開文本WO 93/05796；美國專利No.5,411,749；或McCune等(1988)《科學》2411632-1639))或Rag-1/Rag-2缺陷小鼠中產生抗體。人抗體-免疫缺陷性小鼠也是市售可獲得的。例如，Rag-2缺陷性小鼠可從Taconic Farms(Germantown，NY)獲得。雜交瘤通過用免疫原免疫受試者可產生單克隆抗體。在免疫后的適當時間，例如，當抗體滴度水平足夠高時，可從免疫動物收獲產生抗體的細胞，并用標準技術制備單克隆抗體。例如，通過標準的體細胞融合方法、用無限增殖細胞如骨髓瘤細胞以得到雜交瘤細胞，可融合產生抗體的細胞。這些技術均是本領域眾所周知的，包括，例如開發(fā)的最初雜交瘤技術(Kohler和Milstein(1975)自然，256495-497)、人B細胞雜交瘤技術(Kozbar等，(1983)今日免疫學(Immunology Today)，472)、和用于產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等，(1985)單克隆抗體和癌治療，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。產生單克隆抗體雜交瘤的技術是眾所周知的。
也可通過從已用40kDa蛋白質免疫的表達人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠收獲產生抗體的細胞例如脾細胞來制備單克隆抗體。通過與人骨髓瘤的融合或通過用Epstein-Barr病毒(EBV)的轉化可使脾細胞無限增殖化。用本領域所述的人B細胞或EBV-雜交瘤技術可制備這些雜交瘤(參見，例如，Boyle等，歐洲專利出版物No.0 614 984)。
通過篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液、例如篩選選擇與固定化40kDa蛋白質特異性結合的抗體，或通過測試本文所述的抗體以確定抗體是否具有所需的特性，例如抑制細胞增殖的能力，可檢測產生與40kDa蛋白質特異性結合的單克隆抗體的雜交瘤細胞?？梢詫⒃诒疚乃龅暮Y選測定中測試陽性的產生單克隆抗體的雜交瘤細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行條件培養(yǎng)、并培養(yǎng)一定時間以使雜交瘤細胞分泌單克隆抗體至培養(yǎng)基中，由此產生全部抗體。適合雜交瘤細胞的組織培養(yǎng)技術和培養(yǎng)基一般是本領域所述的(參見，例如，R.H.Kenneth，單克隆抗體生物學分析中的新標準(MonoclonalAntibodiesA New Dimension In Biological Analyses)，Plenum出版公司，New York，New York(1980)。然后可收集含抗體的雜交瘤條件雜交瘤培養(yǎng)物上清液。重組組合的抗體庫通過構建重組組合的免疫球蛋白文庫和用40kDa蛋白質篩選該文庫可改造單克隆抗體。用于產生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒可以從市售獲得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Recombinant Phage AntibodySystem)，Catalog No.27-9400-01；和Stratagene SurfZAP噬菌體展示試劑盒(Phage Display Kit)，Catalog No.240612)。簡言之，篩選抗體文庫以確定和分離表達與40kDa蛋白質特異性結合的抗體的噬菌體。在一個優(yōu)選的實施方式中，文庫的初期篩選包括用固定化40kDa蛋白質的篩選。
篩選后，分離展示噬菌體、并可從展示噬菌體(例如，從噬菌體基因組)回收編碼所選擇的抗體的核酸、并通過眾所周知的重組DNA技術將該核酸亞克隆至其它表達載體中?？蓪⒋撕怂徇M一步處理(例如，與編碼另外的免疫球蛋白結構域如另外的恒定區(qū)的核酸連接)和/或在宿主細胞中表達。嵌合抗體和人源化抗體也可制備重組形式抗體例如嵌合抗體和人源化抗體以使病人對抗體的應答最小。當治療上將非人被試者所產生的抗體或來源于非人抗體基因表達的抗體用于人時，它們在不同程度上被識別為外來抗體，患者體內可能產生免疫應答。使這種免疫反應最小化或消除這種免疫反應的一種方法是產生嵌合抗體衍生物，即聯(lián)合非人的動物可變區(qū)和人的恒定區(qū)的抗體分子。這些抗體保留有原始的單克隆抗體的表位結合特異性，但當對人給藥時可能較少致免疫性，因此更可能為患者所忍受。
可以用本領域已知的重組DNA技術制備嵌合單克隆抗體。例如，用編碼人恒定區(qū)的基因置換編碼非人抗體分子恒定區(qū)的基因(參見，Robinson等，PCT專利公開文本PCT/US86/02269；Akira，等，歐洲專利申請184,187；或Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496)?？梢酝ㄟ^用人的可變區(qū)的等同部分代替不涉及結合抗原的可變區(qū)部分來進一步使嵌合抗體“人源化”?！叭嗽椿鼻逗峡贵w的總的評述由Morrison，S.L.(1985)《科學》，2291202-1207和Oi等(1986)《生物技術》，4214提供。這些方法包括，從至少一個重鏈或輕鏈分離、處理和表達編碼全部或部分免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列。然后可將編碼人源化嵌合抗體或其片段的cDNA克隆入適當?shù)谋磉_載體中?；蛘呖赏ㄟ^互補性決定區(qū)(CDR)置換來生產適合的“人源化”抗體(參見美國專利5,225,539；Jones等(1986)《自然》321552-525；Verhoeyan等(1988)科學2391534；和Beidler等(1988)免疫學雜志1414053-4060)。
表位印記也可用于生產“人”抗體多肽二聚物，該二聚物保留有對40kDa蛋白質專一的倉鼠抗體的結合特異性，其中40kDa蛋白質是由以ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA405、或ATCC No.PTA-404保藏的雜交瘤制備的。簡言之，使編碼與抗原和人恒定區(qū)(CH1)特異性結合的非人可變 區(qū)(VH)的基因在大腸桿菌中表達、并用人類VλCλ基因的噬菌體文庫感染。然后篩選噬菌體展示抗體片段以結合40kDa蛋白質。對所選擇的人類Vλ基因再克隆以表達VλCλ鏈，用人類VHCH1基因的噬菌體文庫感染保護這些鏈的大腸桿菌，并將該文庫進行采用涂布抗原的試管的篩選循環(huán)。參見Hoogenboom等，PCT公開文本WO 93/06213?？贵w片段本發(fā)明包括新的抗腫瘤抗體和含該抗體的活性結合區(qū)的任何片段，例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2和Fv片段。可使用本領域已經建立的技術從該抗體中制備這些片段(參見，例如，Rousseaux等，<免疫學方法>，121663-69，Academic出版社，(1986))。例如，通過胃蛋白酶消化該抗體分子可產生F(ab’)2片段，通過減少F(ab’)2的二硫鍵可產生Fab片段?？贵w的利用本文所述的抗體具有各種用途。這些抗體可用于體外診斷以確定人組織中的惡性細胞的存在。該方法包括檢測組織樣品中40kDa蛋白質的存在。例如，可將組織樣品與單克隆抗體結合，該單克隆抗體由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA-405或ATCC No.PTA-404，產生，并檢測組織樣品中抗體與該細胞特異性結合的能力。結合表示腫瘤細胞存在?；蛘?，也可將該抗體用于篩選血液樣品的釋放性抗原。
通過給患者使用以具有可監(jiān)測信號的信息組標記的本發(fā)明的分離抗體也可將這些抗體用于局限體內的腫瘤。然后用外閃爍顯像術、發(fā)射斷層成像術、或放射性核素掃描檢測結合抗體。該方法可用于根據(jù)疾病的程度對患者的癌癥分級，并監(jiān)測對治療的反應變化。
這些抗體也具有治療學應用。新抗體可用于治療腫瘤，因為抗體與腫瘤細胞的特異性結合可導致細胞停止增殖并死亡。
治療上抗體也可用作例如導向劑以將抗腫瘤劑傳遞至腫瘤。這些抗腫瘤劑包括化療藥物、毒素、免疫應答調節(jié)劑、酶和放射性同位素?？蓹z測的標記物診斷上與40kDa蛋白質反應的抗體可用于例如檢測患者體內腫瘤的存在。通過將抗體與可檢測的標記物結合可有利于檢測?？蓹z測的標記物包括各種酶、輔基、熒光物質、發(fā)光物質、生物發(fā)光物質、電子密度標記物、MRI的標記物和放射性物質。適合的酶包括例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適合的輔基復合體包括例如鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適合的熒光物質包括例如傘形酮、熒光黃、熒光黃異硫氰酸酯、若丹明、二氯三吖嗪基胺熒光黃、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光物質包括例如魯米諾；生物發(fā)光物質包括例如熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白；適合的放射性物質包括例如125I、131I、35S或3H。作為導向劑的抗體可以將本文所述的抗體和抗體片段與一種成分接合、并且可以將該抗體用于指示該成分到達表達40kDa蛋白質的腫瘤細胞部位。這些成分包括例如毒素、放射性核素，或可用于殺死腫瘤細胞的化學治療劑，或可用于使表達40kDa蛋白質的腫瘤定位和定大小的顯象劑。用于指示所述成分到達人的腫瘤的抗體優(yōu)選單克隆抗體，例如人源化單克隆抗體。
可以將抗體融合于該成分，例如毒素，借助該成分和被編碼雜交蛋白質分子的融合基因所編碼的抗體，或者通過接合作用，例如非肽共價鍵，如非酰胺鍵，它用于單獨連接所產生的抗體和該成分。
也可將此處所述的抗體與另一種抗體融合，該抗體對免疫細胞具有專一性并刺激免疫細胞以殺死腫瘤。毒素有用的毒素分子包括肽毒素，當存在于細胞內時它是重要的細胞毒素。毒素的例子包括細胞毒素、破壞酶活性的代謝破壞劑(抑制劑和活化劑)，由此殺死腫瘤細胞，以及在效應物部分的規(guī)定半徑內殺死所有細胞的放射性分子。代謝破壞劑是一種諸如酶或細胞因子的分子，它們改變細胞的代謝以致于改變其正常功能。廣義上，術語毒素包括引起腫瘤細胞死亡的任何效應物。
許多肽毒素具有一般化真核受體結合區(qū)域；在這些情況下，必須使毒素改性以阻止殺死細胞而不產生導向蛋白質(例如，阻止殺死不載有40kDa蛋白而具有未改性毒素受體的細胞)。必須以保持分子的細胞毒素功能的方式進行這些改性。可能有用的毒素包括但不限于白喉毒素、霍亂毒素、篦麻毒蛋白、0-志賀樣毒素(SLT-I，SLT-II，SLT-IIv)，、LT毒素、C3毒素、志賀菌毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、假單胞桿菌屬外毒素、alorin、皂苷、modeccin，、和gelanin。其它毒素包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗腫瘤活性的另一種毒素是刺孢霉素γ1，一種具有相當強度抗腫瘤能力的含二炔-烯抗腫瘤抗生素(Zein，N.，等，《科學》，2401198-201(1988))。
例如，可將白喉毒素與本文所述的抗體接合。在Murphy的美國專利No.4,675,382中詳細描述了白喉毒素，其序列是已知的，該文獻在此引作參考。天然白喉毒素分子隱藏在白喉棒桿菌中，該桿菌含可被鑒定的7個功能區(qū)域，起始于分子的氨基末端，作為酶催化活性片段A(氨基酸Gly1-Arg193)和片段B(氨基酸Ser194-Ser535)，它包括易位區(qū)域和非特異性細胞結合區(qū)域(氨基酸殘基475-535)。毒素與抗體的連接可以以幾種方式的中任何一種連接抗體和毒素成分。如果化合物是通過融合基因的表達制備的，則肽鍵作為細胞毒素和抗體之間的連接?；蛘?，可以分別制備毒素和抗體、隨后用非肽共價鍵的方式接合。例如，共價連接可采取二硫鍵的形式。在此情況下，通過常規(guī)方法可以改造編碼這種抗體的DNA、以含有特殊的半胱氨酸密碼子。
對于二硫鍵連接，用巰基基團與改性抗體的半胱氨酸反應也可以得到毒素分子。在肽毒素的情況下，可以通過在編碼該毒素的DNA序列中插入半胱氨酸密碼子來完成這種連接?；蛘撸捎霉滔喽嚯募夹g可以導入巰基(其本身或作為半胱氨酸殘基的一部分)。例如，Hiskey，《多肽》，3137(1981)描述了將巰基導入多肽中。
也可根據(jù)Bacha等的美國專利No.4,468,382中所述的肽激素的衍生方法進行衍生。Maasen等，<歐洲生化雜志>13432(1983)中描述了將巰基導入蛋白質中。一旦存在所需的巰基，則純化細胞毒素和抗體，減少兩種硫基團，混合細胞毒素和抗體(按大約1∶5-1∶20的比例)，在室溫下完成使二硫鍵形成(通常20-30分鐘)。然后以磷酸緩沖鹽水透析該混合物以除去未反應的抗體和毒素分子。將SephadexR層析法或類似方法用于根據(jù)分子大小將所需的毒素-抗體綴合化合物與毒素-毒素和抗體-抗體綴合物分離。免疫應答調節(jié)劑抗腫瘤成分也可以是免疫系統(tǒng)調節(jié)劑，其在局部水平激活或者抑制機體的免疫系統(tǒng)。例如，細胞因子，如，被釋放至腫瘤的淋巴因子如IL-2可以引起腫瘤附近的細胞毒性T淋巴細胞或自然殺傷細胞的增殖。放射性分子組成成分或信息組也可以是放射性分子，例如放射性核苷酸，或所謂的光敏劑，如前體分子，它們在特定情況下變成具有放射性，例如，在所謂的“硼中子截留療法”(BNCT)中、當暴露于低能量中子束時的硼。Barth等，Scientific American，October 1990100-107(1990)。含這種放射性效應子部分的化合物可用于抑制腫瘤細胞增殖和用于顯象目的的標記腫瘤細胞。
放射性核素是可以發(fā)射α、β或γ粒子的單原子放射性分子。α粒子發(fā)射體優(yōu)于β或γ粒子發(fā)射體，因為它們釋放短距離的很高能量發(fā)射，因此有效而不顯著穿透和損害正常組織。適合的發(fā)射α粒子的放射性核素包括211At、212Pb和212Bi。
放射性分子必須與抗體直接或通過雙功能螯合緊緊地連接。這種螯合不允許洗脫和由此而產生的體內放射性分子的過早釋放。Waldmann，<科學>，2521657-62(1991)。為了使BNCT適于本發(fā)明，選擇硼的穩(wěn)定同位素如硼10作為化合物的抗腫瘤成分或效應子部分。通過抗體與腫瘤細胞的特異性結合將硼傳送并濃集在腫瘤細胞中或其上。在允許足夠量硼積聚的一段時間后，腫瘤成像并用低能量中子束照射，該中子束具有約0.025eV的能量。當該中子照射時，其本身對腫瘤周圍的健康組織、或腫瘤本身極少引起損傷，硼10(例如，在腫瘤細胞表面)截留中子，從而形成一種不穩(wěn)定的同位素硼11。硼11立即分裂，產生鋰7核和有能量的α粒子，大約2.79百萬Ev。這種大能量的粒子是高度致死的、但非常局限的放射形式，因為粒子僅有約一個細胞直徑(10微米)的路徑長度。
計算表明，為了消滅腫瘤細胞，每平方厘米約需要1百萬硼原子和1012-1013個中子的熱中子流，因此由α粒子產生的照射超過了氮和氫中子截留反應產生的背景照射。顯像成分本文的抗體可與40kDa蛋白質特異性結合、因此也可用于檢測人的腫瘤。一種方法是通過使用以適合的成分或信息組(例如產生可檢測信號的顯象試劑)標記的抗體進行腫瘤顯像的技術來檢測體內的腫瘤。顯象試劑和用這些試劑標記抗體的方法是眾所周知的(參見，例如，Wensel和Meares，<放射免疫成像和放射免疫治療> Elsevier，New York(1983)；Colcher等，<酶學方法>(Meth.Enzymol.)，121802-16(1986))。通過諸如放射性核素掃描的技術可以檢測被標記的抗體(參見，例如，Bradwell等，<用于癌癥檢測和治療的單克隆抗體>，Baldwin等(編輯)，pp.65-85，Academic出版社(1985))。給藥可以將本文所述的抗體對受治療者如動物或人給藥、以使腫瘤顯象或治療腫瘤。該抗體可以單獨給藥、或以混合物的形式給藥，例如，在藥學上可接受的賦形劑或載體(例如，生理鹽水)存在下給藥。根據(jù)給藥方式和途徑選擇賦形劑或載體。在本領域眾所周知的參考教科書<Remington的藥物科學>(E.W.Martin)和USP/NF(United States Pharmacopeia和the NationalFormularly)中描述了適合的藥學載體。
將藥物組合物配制成適合于所需的給藥途徑。給藥途徑例如包括非腸道的，如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如，吸入)、經皮(局部)、經粘膜和直腸給藥。用于非腸道、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包括下列組分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、固定油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螫合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和滲透壓調節(jié)劑，例如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A調節(jié)pH，例如鹽酸或氫氧化鈉?？梢詫⒎悄c道制劑裝在安瓿、一次性注射器、或多劑量玻璃或塑料小瓶中。
本發(fā)明組合物的最有效的給藥方式和劑量方案根據(jù)疾病的嚴重程度和病程、患者的健康和對治療的反應、以及治療醫(yī)師的判斷來決定。因此，該組合物的劑量應個體化。本發(fā)明抗體組合物的有效量是約1μg-約5000mg，優(yōu)選約1-500mg、或優(yōu)選約100-200mg。診斷試劑盒本發(fā)明還包括實施上面所公開的方法的診斷試劑盒。該診斷試劑盒包括(a)本文所述的單克隆抗體、和(b)抗體特異性結合配偶體與檢測結合抗體的標記物的結合體。該試劑盒也可包括輔助劑，例如緩沖劑和蛋白質穩(wěn)定劑，例如多糖等。如需要，該診斷試劑盒還可包括信號產生系統(tǒng)的其它成分，該系統(tǒng)包括減少背景干擾的試劑、控制試劑、和進行測試的裝置。在另一個實施方式中，該診斷試劑盒包括本發(fā)明的單克隆抗體和能產生可檢測信號的標記物的結合體。上述輔助劑也可以存在。通常還包括如何使用診斷試劑盒的說明。多肽本文所述的單克隆抗體可用于分離和鑒定與其結合的40kDa蛋白質。被單克隆抗體識別的蛋白質是一種在各種腫瘤細胞上發(fā)現(xiàn)的新的細胞表面蛋白質，該腫瘤細胞包括胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤、或急性T細胞白血病細胞。根據(jù)觀察，當單克隆抗體與這種蛋白質結合時，有該蛋白質表達的細胞即死亡，表明這種蛋白質是一種誘導死亡的分子。
可以從該表達蛋白質的細胞(例如，E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat，或Cos)中分離被本發(fā)明的單克隆抗體識別的蛋白質。例如，本文所述的單克隆抗體可用于免疫沉淀該蛋白質。為了測定該蛋白質的序列，可以用SDS-PAGE純化該蛋白質、電印記在Immobilon膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)上、并用考馬斯亮藍使此膜染色。然后可用剃刀切下被染色的蛋白質帶(Mr＝40kDa)、以用于隨后的氨基末端序列分析。氨基末端序列分析是本領域眾所周知的，例如自動埃德曼降解法。
本發(fā)明還描述了融合蛋白質，該蛋白質包括與不相關的蛋白質融合的40kDa蛋白質?？梢赃x擇這種不相關蛋白質以有利于純化、檢測、增溶、或提供一些其它作用?？梢院铣芍苽淙诤系鞍踪|、或用適當?shù)呐悸?lián)試劑如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)將該蛋白質與不相關蛋白質連接?；蛘撸梢酝ㄟ^將表達融合蛋白質的核苷酸序列克隆至適當?shù)谋磉_載體中來重組制備融合蛋白質。然后可以從培養(yǎng)基或從細胞的溶解產物中純化該重組融合多肽。
40kDa蛋白質是有用的，例如作為對某些腫瘤致免疫的疫苗。制備這些疫苗的方法在本領域是已知的(參見，Estin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)，851052(1988))。簡言之，構建重組病毒以表達克隆的腫瘤相關蛋白質。以重組病毒感染的細胞將在細胞表面表達該蛋白質及宿主的組織相容性抗原和免疫原性病毒蛋白質。這有利于誘導細胞的免疫性，它在腫瘤排斥中起關鍵作用。
本發(fā)明還提供了鑒定調節(jié)劑，即與40kDa蛋白質結合或對40kDa蛋白質的表達或活性具有刺激或抑制作用的試驗化合物或試劑(例如，肽、肽類似物、小分子或藥物的方法。例如，40kDa蛋白質的拮抗劑將用于抑制細胞的編程性細胞死亡。這種拮抗劑在抑制患者不利的編程性細胞死亡中起一定作用。
免疫熒光分析揭示DMF10.62.3與大量的鼠細胞系(表I)反應，但其它一些細胞系未見這種反應(表II)。陽性細胞系包括一些T細胞系(例如，RMA-S)，幾種B細胞淋巴瘤(例如A20和WEHI-231)，和巨噬細胞細胞系(C2.3)。DMF10.62.3也特異性地結合于幾種非生血源的無限增殖化細胞，誘導基質細胞系(PBK101A2)、黑瘤(B16)、肉瘤(MC57)和多瘤轉化的成纖維細胞(WOP-3027)。幾種其它的未成熟的(例如，G58.2)和成熟的T細胞(例如，EL4)、巨噬細胞(例如，A3.1)、樹狀細胞(DC2.4)、和成纖維細胞細胞系(LADp3 1)對于DMF10.62.3是陰性的。有趣的是，mAb亦與幾種人無限增殖化細胞系反應，包括Jurkat、293T和143Btk-以及猴SV40-轉化腎細胞系，Cos7。DMF10.62.3不能結合某些人細胞系，例如B成淋巴樣細胞(lymphoblastoid cell)721，和子宮頸癌HeLa細胞。代表性細胞系的染色方式如

圖1所示，DMF10.62.3-陽性細胞E710.2.3(圖1A)，A20(圖1B)和Jurkat(圖1C)以及DMF10.62.3-陰性細胞，RF33.70(圖1D)表I細胞系 描述E710.2.3 鼠胸腺淋巴瘤RMA-S鼠T細胞瘤CTLL 鼠IL-2依賴性T細胞系LB27.4 鼠B細胞雜交瘤
A20 鼠B細胞淋巴瘤WEHI-231 鼠B細胞淋巴瘤PBK101A2 鼠胸腺基質細胞系C2.3 鼠無限增殖化骨髓巨噬細胞B16 鼠黑瘤MC57 鼠甲基膽蒽誘導瘤WOP-3027 鼠多瘤轉化成纖維細胞293T 人轉化原發(fā)胚胎腎143Btk- 人骨肉瘤以上數(shù)據(jù)表明新抗體特異性地結合于許多但并非全部無限增殖化細胞系，這種結合不是種或細胞譜系限制的。
表II細胞系描述RF33.70 鼠T-T雜交體DO11.10 鼠T-T雜交體13G7.3.2 鼠T-T雜交體HT-2 鼠IL-2依賴性T細胞系EL-4 鼠T細胞淋巴瘤
G58.2 鼠胸腺淋巴瘤NFC105鼠胸腺淋巴瘤P815 鼠肥大細胞瘤P388D1鼠單核細胞/巨噬細胞瘤LADP31 小鼠L細胞系鼠無限增殖化骨髓衍生巨噬A3.1細胞DC2.4 鼠無限增殖化樹狀細胞系721 人B細胞系HeLa 人上皮子宮頸癌E36 倉鼠肺癌BHK-21倉鼠腎細胞系CHO 中國倉鼠卵巢實施例2DMF10.62.3識別的分子的表達在胚胎胸腺細胞中如下檢測DMF10.62.3識別的分子的表達。將確定妊娠時間的產生胚胎的C57B1/10小鼠在胎兒期14天處死。在PBS中采用Eppendorf管玻璃活塞收獲胎鼠胸腺。在冰上以抗-Fcγ受體II/III(Pharmingen)培養(yǎng)單細胞懸液20分鐘，以阻斷Fc受體。隨后將細胞以DMF10.62.3或倉鼠IgG染色30分鐘，接著將FITC接合山羊抗-倉鼠，及別藻藍蛋白(allophycoyanin(APC))-接合抗-Thy1.2(Pharmingen)。在一些實驗中，亦包括抗-CD25接合于PE和抗-CD44接合于Cy-鉻(Pharmingen)。染色細胞在1％低聚甲醛中固定過夜，隨后通過流式細胞術分析。
結果顯示以DMF10.62.3染色的14天胎鼠胸腺細胞對40kDa蛋白陽性，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白位于Thy1.2陽性細胞上(圖2A)。有趣的是，該蛋白位于CD25+CD44+胎胸腺細胞及CD44+CD25-胎胸腺細胞。然而，成熟胸腺(圖2C)，成熟脾(圖2B)和成熟骨髓細胞(圖2D)的染色顯示由DMF10.62.3識別的蛋白在超過以對照倉鼠IgG觀察的水平上并不存在于任何這些細胞。此外，多參數(shù)分析中在閘門控制CD4-CD8-細胞之后，通過流式細胞術或來自RAG-/-小鼠群體的分析，在成熟CD4-CD8-胸腺細胞不能檢測到這種蛋白。14天胎肝細胞亦不與DMF10.62.3反應。
為了測定由DMF10.62.3識別的蛋白是否存在于正常的活化細胞中，將脾T細胞以T細胞促細胞分裂劑ConA活化和作如下DMF10.62.3識別蛋白表達染色。從成年(4-6月齡)Balb/c或C57B1/6小鼠制備脾、胸腺和骨髓細胞。采用三氯化銨裂解從脾細胞清除紅血細胞。立即染色未刺激細胞。在培養(yǎng)物中以1μg/ml ConA或10μg/ml LPS刺激成淋巴細胞。培養(yǎng)1-3天之后，將細胞作DMF10.62.3.表達染色。在未刺激細胞(圖3A)或者以ConA刺激、活化24(圖3B)，48(圖3C)或72(圖3D)小時的細胞中，未觀察到超過背景的顯著染色(FAC圖譜無變化)。作為陽性對照，將ConA刺激的細胞以CD25染色。如預期的那樣，ConA處理引起CD25在這些細胞上的表達，與未刺激的細胞相比顯著升高(CD25結合于細胞引起FAC圖譜的變化)。類似地，當脾B細胞以脂多糖(LPS)活化時，在24(圖3E)，48(圖3F)和72(圖3G)小時時未觀察到DMF10.62.3染色(FAC圖譜無變化)，然而這些細胞表達CD25(FAC′s圖譜變化)。DMF10.62.3識別的蛋白并不存在于成熟骨髓細胞(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明，DMF10.62.3識別的蛋白存在于一些胎胸腺細胞，但不存在于成熟動物生血源的普通靜息或活化細胞上。實施例3DMF10.62.3抑制腫瘤細胞增殖低密度生長并且保持于缺乏PMA時，E170.2.3細胞緩慢或根本不增殖。然而當與胸腺細胞共同培養(yǎng)時它們增殖。最初通過阻滯這種胸腺細胞-誘導的增殖的能力鑒別DMF10.62.3。如表III所示，DMF10.62.3完全抑制這種反應(圖4A)。如下進行增殖實驗。洗滌E10.2.3細胞不含PMA，在完全RPMI中低密度(＜105/ml)培養(yǎng)48小時，以減少背景增殖。隨后，在平底微量滴定板中，以25ng/ml PMA或5×105胸腺細胞在含或不含抗體的情形下培養(yǎng)5×103細胞72小時。在檢測抗體對細胞自發(fā)增殖的影響的實驗中，E710.2.3(＞105/ml的高密度生長)或RMA-S細胞在含或不含各種濃度抗體下培養(yǎng)36小時。最后5小時加入3H-胸苷(1TCi/孔)并以J-閃爍計數(shù)器(Wallac，Gaithersburg，MD)測量摻入DNA的標記。
表III培養(yǎng)基 胸腺細胞 PMA對照(無抗體) 8,699 33,802 54,271DMF10.62.3938 750 450DMF10.132 6,646 27,156 25,216
也研究DMF10.62.3抑制E710.2.3對其它刺激物反應的能力。如表III所示，該抗體也阻滯PMA-誘導的E710.2.3增殖。此外，高密度生長時E710.2.3自發(fā)增殖，DMF10.62.3抑制這種反應(圖4A)。在3μg/ml明顯抑制增殖，在12.5μg/ml觀察到完全抑制。相反地，倉鼠IgG對于E710.2.3對任何這些刺激物的反應無影響(圖4A)。同樣地，源自最初融合體的許多mAbs與E710.2.3結合，但并不抑制其增殖(例如DMF10.132)(表III)。因此，無論用于誘導增殖的刺激物是什么，DMF10.62.3特異性地抑制E710.2.3增殖。
由DMF10.62.3識別的蛋白存在于大量的其它細胞系。因此，測定該抗體對它們的自發(fā)增殖是否具有同樣的作用是有趣的。DMF10.62.3抑制RMA-S(圖4B)以及大量其它受試細胞系的增殖。相反地，該抗體對于RF33.70的自發(fā)增殖無影響，這種自發(fā)增殖對DMF10.62.3蛋白的存在無反應(圖4C)。實施例4DMF10.62.3通過編程性細胞死亡誘導細胞死亡采用來自R & D(Minneapolis，MN)和Pharmingen(San Diego，CA)的試劑盒試驗編程性細胞死亡。簡言之，2×105細胞以各種濃度的抗體在200il培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)末期，用PBS洗滌細胞兩次，以PI和FITC膜聯(lián)蛋白處理15分鐘，接著通過流式細胞術分析。用瓊脂糖凝膠電泳在2％瓊脂糖凝膠上評定DNA的斷裂，如Schattner等人((1995)J.Exp.Med.1821557)介紹。
肉眼檢查抗體DMF10.62.3處理細胞的培養(yǎng)物，注意到完整細胞的數(shù)量減少。此外，細胞不再排斥活體染料臺盼藍。此項觀察，以及增殖的抑制，顯示抗體對于細胞具有細胞毒性。因此，進行研究以確定DMF10.62.3誘導細胞死亡的機理。
細胞死亡可以通過編程性細胞死亡或壞死。在經歷編程性細胞死亡的細胞中觀察到的一項早期變化是質膜上磷脂酰絲氨酸的外表化，它可以通過FITC-膜聯(lián)蛋白染色檢測到。該過程的早期，編程性細胞死亡細胞排斥活體染料，例如碘化丙錠，因此可以鑒定為FITC-膜聯(lián)蛋白陽性和PI-陰性。編程性細胞死亡過程的后期，喪失了膜的完整性，F(xiàn)ITC-膜聯(lián)蛋白陽性細胞變成PI-陽性。相反，壞死時細胞失去膜的完整性，同時變成PI-陽性和FITC-膜聯(lián)蛋白陽性，而無FITC-膜聯(lián)蛋白陽性和PI-陰性階段。
在圖5A至5I的FAC圖譜中，在左下象限的細胞是活細胞，右下象限的細胞正經受編程性細胞死亡(FITC-膜聯(lián)蛋白陽性)，右上象限的細胞是經編程性細胞死亡和/或壞死而死亡的細胞(PI-陽性和FITC-膜聯(lián)蛋白陽性)。亦顯示了每個象限的細胞百分比。本研究中，一定百分比的E710.2.3細胞在培養(yǎng)物中經受自發(fā)的編程性細胞死亡(10.9-15％膜聯(lián)蛋白+，PI-；)。然而，僅僅1μg/ml的DMF10.62.3在1小時內引起編程性細胞死亡的顯著增加(28.9％膜聯(lián)蛋白+，PI-；圖5A)，并且這種編程性細胞死亡隨著時間過去而增加(3小時，48.6％膜聯(lián)蛋白+，PI-陽性)(圖5C)。較高數(shù)量的DMF10.62.3(15μg/ml)時間上更快地(1小時，37.1％膜聯(lián)蛋白+，PI-陽性)并在更多細胞中刺激編程性細胞死亡(圖5E-G)。相反地，以類似量的倉鼠IgG處理不比單獨培養(yǎng)基的作用顯著(圖5D，5H，51)。通過瓊脂糖凝膠電泳目測檢驗DNA斷裂亦可檢驗編程性細胞死亡。
由于DMF10.62.3識別的蛋白在其它細胞上表達，并且這種抗體抑制它們的增殖(試驗處)，因此進一步研究DMF10.62.3是否亦刺激它們經歷編程性細胞死亡。DMF10.62.3引起鼠細胞系RMA-S、CTLL、LB27.4和A20以及人細胞系Jurkat和143BTK-顯著的編程性細胞死亡(表IV)。采用15μg/ml的DMF10.62.3誘導編程性細胞死亡，抗體濃度增加作用也增加。相反地，在對該蛋白陰性的RF33.70中DMF10.62.3不引起編程性細胞死亡。DMF10.62.3誘導的編程性細胞死亡的水平在各種細胞系之間是不同的，并且顯示依賴于表面表達的水平以及表達該蛋白質的細胞群內的細胞百分比(表IV)。例如，最多的E710.2.3和RMA細胞，以高水平表達該蛋白，在這些細胞系中，DMF10.62.3誘導高水平的編程性細胞死亡。相反地，少量的A20和LB27.4細胞低水平表達40kDa蛋白，在這些細胞中DMF10.62.3誘導較低水平的編程性細胞死亡(表IV)。由DMF10.62.3刺激的編程性細胞死亡顯示不依賴于fas，由于E710.2.3和RMA-S細胞不表達fas(表IV)。
表IV
實施例5在E710.2.3和其它細胞系中DMF10.62.3引起同型聚集同型聚集是刺激細胞彼此粘附的生物活性過程。如下設置聚集試驗。在有各種濃度DMF10.62.3或倉鼠IgG或不含抗體的200il完全RPMI中培養(yǎng)105細胞。為了測試抑制劑的作用，將105個細胞與抑制劑預培養(yǎng)30分鐘，然后在持續(xù)存在抑制劑的情形下加入DMF10.62.3mAb(10μg/ml)6小時。為了試驗低聚甲醛對聚集的作用，將細胞固定于低聚甲醛中10分鐘，清洗，然后加入DMF10.62.3 6小時。肉眼評估聚集。采用熱電冷卻充電-偶聯(lián)裝置(CCD)照相機(Princeton Instruments，Trenton，NJ)進行6小時顯微照相。發(fā)現(xiàn)DMF10.62.3在培養(yǎng)物中誘導E710.2.3的同型聚集。6小時中，以5μg/ml或更多抗體處理的細胞觀察到顯著的聚集。相反地，在以倉鼠IgG或培養(yǎng)基處理的培養(yǎng)物中未觀察到聚集。這種聚集被各種物質處理所阻滯，這些物質包括細胞松弛素B(斷裂肌動蛋白微絲)，三氟拉嗪(抑制鈣調蛋白依賴性過程)，疊氮化鈉+2-去氧葡萄糖(抑制ATP合成)，以及EDTA(螯合Ca2+和Mg2+)。相反地，聚集不受秋水仙堿(抑制微管形成)影響。通過4℃培養(yǎng)和通過低聚甲醛處理也可抑制聚集(表V)。這些結果表明聚集是一種活動過程，并不僅是凝集。
表V
DMF10.62.3也引起表達DMF10.62.3結合蛋白的一些其它細胞系(例如RMA-S，CTLL)的同型聚集。然而，對于一些其它DMF10.62.3陽性細胞系(例如Jurkat，LB27.4，A20，143Btk-)幾乎未觀察到超出背景的聚集。DMF10.62.3并不結合的RF33.70，未觀察到聚集。
聚集試驗可以用于幫助測定一種新型抗體是否是本發(fā)明的一種新型抗腫瘤抗體。實施例6DMF10.62.3免疫沉淀非GPI-連接的40kDa蛋白為了表征DMF10.62.3結合的蛋白，如下進行35S標記和免疫沉淀反應。5×106個E710.2.3細胞在不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基中饑鋨1小時，接著以0.5mCi/ml的35S甲硫氨酸培養(yǎng)2小時。如Townsend等人((1990)J.Immunol1462235所述，將標記細胞在免疫沉淀緩沖液中溶解。將澄清的溶解產物以倉鼠IgG預澄清，與結合于蛋白-A-瓊脂糖的DMF10.62.3進行沉淀反應，并在14％凝膠上進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。為了測定DMF10.62.3結合蛋白的分子量，以35S甲硫氨酸標記E170.2.3細胞2小時。用SDS-PAGE在還原條件下分析標記細胞的免疫沉淀物。
還原條件下mAb DMF10.62.3免疫沉淀來自E710.2.3的約40kDa的蛋白。這種蛋白的電泳移動性在非還原條件下不改變。在普通倉鼠IgG的免疫沉淀物或者抗-MHC I類抗體Y-3的免疫沉淀物中未觀察到該帶。在表面標記的E710.2.3和RMA-S細胞的溶解產物中也鑒別出40kDa蛋白。
幾種細胞表面分子例如Thy-1和Ly-6A/E經糖基磷脂酰肌醇(GPI)固著連接于細胞表面。這種表面連接對PI-PLC處理敏感。為了確定DMF10.62.3識別的蛋白是否為GPI-連接，用PI-PLC處理在細胞表面表達該蛋白的RMA-S細胞。PI-PLC處理并不減少DMF10.62.3染色，但是減少GPI-連接分子Thy-1的染色；提示DMF10.62.3識別的40kDa蛋白不是通過GPI固著于細胞表面。實施例7DMF62.3抗體的體內作用AKR小鼠IV或IP注射5×106同系E710.2.3腫瘤細胞并在開始一天和10天以后各接受一次鹽水或0.5mg對照抗體或DMF62.3抗體IP注射。允許動物生存50天(表VI)。
表VI
保藏聲明產生單克隆抗體DMF10.62.3的雜交瘤細胞系，由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA)于1999年7月20日接受，產生單克隆抗體DMF10.167.4和DMF10.34.36的雜交瘤細胞系由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA)于1999年7月22日接受。這些雜交瘤業(yè)已有條件地保藏，即保證按照37CFR 1.14和35USC122，在本專利申請待批期間向專利和商標官員確定給以權利的人公開并提供這些雜交瘤。在提交主題申請或其后續(xù)的副本的國家中，根據(jù)外國專利法的需要，可得到保藏物。然而應理解，保藏物的得到并不構成許可損害政府行為授予的權利實施該主題發(fā)明。
進一步地，按照微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定，主題培養(yǎng)保藏物應該保藏并對于公眾是可得到的，即它們應該以一切必需的管理保藏，以使它們在最近的提供保藏樣品的要求之后的至少五年的時期內保持活力并沒有被污染，并且無論如何，在保藏日之后至少保藏30(三十)年時期，或者可能發(fā)布公開該培養(yǎng)物的任何專利的有效期限加上由該保藏品最近的樣品要求之后的五年。如果因保藏條件保藏者不能在有人索取時提供樣品，保藏者確認有歸還保藏物的責任。關于公眾得到這種主題培養(yǎng)保藏物的所有限制在公開這些保藏物的專利授權后將會不可改變地撤消。其它的實施方案應當理解，當結合其詳細說明描述本發(fā)明時，前面的描述旨在舉例說明，而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求的范圍來確定。其它的方面、優(yōu)點和修改也在以下權利要求范圍之內。
權利要求
1.一種單克隆抗體、或其抗原結合片段，其中該單克隆抗體(a)與胎兒胸腺細胞結合；(b)與該細胞結合抑制時細胞的增殖；并(c)不與成年胸腺細胞結合。
2.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該抗體與細胞結合時誘導同型聚集。
3.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該抗體誘導與其結合細胞的編程性細胞死亡。
4.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該抗體與E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos中的一種或多種腫瘤細胞系特異性結合。
5.權利要求4所述的單克隆抗體，其中該抗體與E710.2.3細胞特異性結合。
6.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377產生的DMF10.62.3。
7.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-405產生的DMF10.167.4。
8.權利要求1所述的單克隆抗體，其中該單克隆抗體是由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-404產生的DMF10.34.36。
9.一種單克隆抗體、或其抗原結合片段，它與結合有一種單克隆抗體的蛋白質結合，該單克隆抗體由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404、或PTA-405產生。
10.權利要求9所述的單克隆抗體，其中該抗體是人源化抗體。
11.權利要求9所述的單克隆抗體，其中該抗體是包括非人可變區(qū)和人的輕鏈和重鏈恒定區(qū)的一種嵌合單克隆抗體。
12.一種單克隆抗體、或其抗原結合片段，它與結合有一種單克隆抗體的表位結合，該單克隆抗體由雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404或PTA-405產生。
13.一種單克隆抗體、或其抗原結合片段，它與具有下列特征的蛋白質特異性結合(i)分子量為40kDa；(ii)在胎兒胸腺細胞表面表達；(iii)在成年胸腺細胞表面無表達；(iv)與該抗體結合時能阻斷細胞增殖；和(v)與該抗體結合時能誘導同型聚集。
14.權利要求13所述的單克隆抗體，其中該蛋白質的特征還在于(vi)與該抗體結合時能誘導細胞的編程性細胞死亡。
15.權利要求13所述的單克隆抗體，其中該蛋白質的特征還在于(vii)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一種或多種腫瘤細胞系的細胞表面表達。
16.一種權利要求1所述的單克隆抗體的抗原結合片段。
17.權利要求1所述的一種單克隆抗體，還包括可檢測的標記物。
18.一種雜交瘤細胞系，它產生權利要求1所述的單克隆抗體。
19.權利要求18所述的雜交瘤細胞系，其中該雜交瘤細胞系是細胞系ATCC No.PTA-377、ATCC No.PTA-404或ATCC No.PTA-405。
20.一種實質上純的蛋白質，其特征在于(i)分子量為40kDa；(ii)在胎兒胸腺細胞表面表達；(iii)在成年胸腺細胞表面無表達；(iv)與權利要求1的抗體結合時能阻斷細胞增殖；和(v)與權利要求1的抗體結合時能誘導同型聚集。
21.權利要求20所述的蛋白質，其中該蛋白質的特征還在于(vi)在包含E710.2.3，RMA-S，CTLL，LB17.4，A20，WEHI-231，PBK101A2，C2.3，B16，MC57，WOP-3027，293T，143Btk，Jurkat和Cos的一種或多種腫瘤細胞系上表達。
22.權利要求20所述的蛋白質，其中該蛋白質的特征還在于(vii)與權利要求1的抗體結合時能誘導細胞的編程性細胞死亡。
23.權利要求20所述的蛋白質，它與雜交瘤細胞系ATCC No.PTA-377、PTA-404或PTA-405產生的單克隆抗體結合。
24.一種藥物組合物，它包括權利要求1的單克隆抗體和藥學上可接受的載體。
25.一種檢測受檢者體內腫瘤細胞的方法，該方法包括將來源于受檢者體內的細胞樣品在足以產生特異結合的條件下與權利要求1的單克隆抗體結合；并且檢測該抗體與樣品中的一個或多個細胞的任何特異性結合，其中結合表示受檢者體內有腫瘤細胞存在。
26.權利要求25所述的方法，其中該腫瘤細胞是胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T細胞白血病細胞。
27.權利要求25所述的方法，其中該腫瘤細胞在患者體內。
28.一種抑制腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將該腫瘤細胞與一定量的權利要求1的單克隆抗體結合，該數(shù)量足以抑制腫瘤細胞的增殖。
29.一種誘導細胞中的編程性細胞死亡的方法，該方法包括將該細胞與一定量的權利要求1的單克隆抗體結合，該數(shù)量足以誘導細胞中的編程性細胞死亡。
30.權利要求29所述的方法，其中該細胞是選自胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T細胞白血病細胞的腫瘤細胞。
31.權利要求29所述的方法，其中該細胞為體外或體內的細胞。
32.一種腫瘤診斷試劑盒，包括權利要求1的單克隆抗體、和其使用說明。
33.權利要求32所述的試劑盒，其中將被診斷的腫瘤選自胸腺淋巴瘤、T細胞瘤、B細胞淋巴瘤、黑素瘤、骨肉瘤或急性T細胞白血病。
34.一種腫瘤細胞導向劑，它包括與一種成分綴合的權利要求1的單克隆抗體。
35.選擇性地將一種成分傳送至哺乳動物腫瘤細胞的方法，該方法包括對哺乳動物給予權利要求34的導向劑；和給予充分的時間以使復合物到達腫瘤細胞和使抗體與腫瘤細胞結合，由此選擇性地將一種成分傳送至哺乳動物的腫瘤細胞。
36.一種分離蛋白質的方法，該方法包括將含蛋白質的樣品與權利要求1的單克隆抗體接觸一定時間、并且該結合是在足以形成抗體蛋白質復合體的條件下進行的；如果需要，從該樣品中取出該復合物；并且從該復合物中取出該蛋白質，由此分離該蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明公開了與40kDa蛋白質結合的抗體,該蛋白質在腫瘤上表達、但不在正常成人造血細胞上表達。還公開了這些抗體的生產方法和應用。
文檔編號A61P35/00GK1390233SQ00813253
公開日2003年1月8日 申請日期2000年7月18日 優(yōu)先權日1999年7月23日
發(fā)明者肯尼思·L·洛克, 丹塞拉·弗爾南德斯 申請人:馬薩諸塞州大學