專利名稱：二苯乙烯甙在治療癡呆癥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物和藥用鹽的用途，具體說(shuō)是在制備治療癡呆癥的藥物中的用途。
發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯甙化合物能夠抵抗β-淀粉樣蛋白致腦細(xì)胞損傷的作用，能夠抵抗過(guò)氧化氫致腦細(xì)胞損傷作用，提高東莨菪堿致癡呆小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶功能，提高Aβ致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力，提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力，抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性和減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而表明了該化合物對(duì)癡呆，尤其Alzheimer病、血管性癡呆具有較好的治療作用，另外，對(duì)屬于癡呆早期表現(xiàn)的輕度認(rèn)知損害(Mild cognitive impairment)、記憶力減退和健忘等也具有相同的治療作用，如此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述化合物、其衍生物或藥用鹽的藥物組合物作為癡呆的治療藥物的應(yīng)用。在該組合物中還可以含有載體和其它任選成分。在該組合物中，本發(fā)明的二苯乙烯甙占10-90wt％，優(yōu)選占50-90wt％。載體例如包括羧甲基淀粉、纖維素、明膠、碳酸氫鈉等。任選成分例如是著色劑、甜味劑等。
本發(fā)明的化合物、其衍生物或藥用鹽可以制成任何一種適合于臨床上應(yīng)用的劑型，包括固體制劑，如膠囊、片劑、顆粒制劑等，液體制劑如口服液等，或者注射劑。本發(fā)明化合物、其衍生物或藥用鹽的日劑量例如可以是5-50mg/kg體重，可以分一次或多次使用。
上式化合物可以從中藥何首烏中提取。例如可以用何首烏根通過(guò)普通高壓液相色譜法制備。在LIQ.CHROM.&TECHNOL，21(18)，2897-2904(1998)(Xueli Cao等人)中也公開(kāi)了它的制備方法。上式化合物可以進(jìn)行衍生化，例如用酸，使上述結(jié)構(gòu)式的化合物上的3-、5-和4’-位上的羥基的氫被酰基，如乙?；?、丙?；?、丁酰基等所取代，或與鹵代烴反應(yīng)，使3-、5-和4’-位上的羥基的氫用烴基取代，如用C1-6烴基取代。上式化合物也可以藥學(xué)可接受的鹽的形式使用。
實(shí)施例1 二苯乙烯甙(TSG)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抵抗β-淀粉樣蛋白致細(xì)胞損傷作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦夏晷园V呆(Alzheimer disease，AD)的特征性病理變化是大腦出現(xiàn)老年斑，而β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積構(gòu)成老年斑的核心。近年的研究表明，Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有毒性，可能通過(guò)自由基增高、鈣離子超載等介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察TSG對(duì)Aβ致神經(jīng)細(xì)胞損傷的防治作用。
2.實(shí)驗(yàn)方法使用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞系(形態(tài)與功能與神經(jīng)元相似)，傳代培養(yǎng)。TSG與神經(jīng)細(xì)胞預(yù)孵育12小時(shí)或24小時(shí)，換培養(yǎng)液，加β-淀粉樣蛋白(Aβ)活性片段25-35與細(xì)胞孵育6小時(shí)。取上清液測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活性，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果在Aβ25-35致神經(jīng)細(xì)胞損傷模型上，發(fā)現(xiàn)TSG可明顯拮抗Aβ引起的細(xì)胞存活率下降及LDH漏出增多，減低Aβ的神經(jīng)毒性，并且呈劑量依賴關(guān)系，提示TSG對(duì)老年性癡呆可能具有防治作用(表1，表2)。
表1. TSG預(yù)孵育12小時(shí)對(duì)Aβ25-35致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響組別 NLDH漏出率(％) MTT(OD 550nm)正常對(duì)照組618.28±2.74*0.5117±0.0538*Aβ25-35模型組(25μM) 328.65±6.83 0.3133±0.0709TSG 25μM+Aβ25-35325.52±3.52 0.4433±0.0689*50μM+Aβ25-35323.96±7.25 0.4833±0.0153*100μM+Aβ25-35321.48±3.87 0.5667±0.0321*200μM+Aβ25-35314.84±0.78*0.6133±0.0603*400μM+Aβ25-35310.16±0.78*0.7433±0.1097*LDH乳酸脫氫酶，為細(xì)胞內(nèi)酶，如果細(xì)胞膜損傷，則漏出率增高。MTT代表細(xì)胞存活率，如果細(xì)胞受損傷，存活率降低，則MTT的OD值下降。M±SD；*p＜0.05，與Aβ25-35模型組相比。
表2. TSG預(yù)孵育24小時(shí)對(duì)Aβ25-35致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響組別 NLDH漏出率(％)MTT(OD 550nm)正常對(duì)照組618.28±2.74* 0.5117±0.0538*Aβ25-35模型組(25μM) 328.65±6.83 0.3133±0.0709TSG 25μM+Aβ25-35325.00±3.58 0.5633±0.0473*50μM+Aβ25-35322.13±5.65 0.5933±0.0231*200μM+Aβ25-35316.67±5.08* 0.6233±0.0757*400μM+Aβ25-35322.39±2.51 0.4100±0.0917M±SD；*p＜0.05，與Aβ25-35模型組相比實(shí)施例2 TSG保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抵抗過(guò)氧化氫致細(xì)胞損傷作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑诶夏晷园V呆和血管性癡呆的發(fā)病過(guò)程中，自由基及活性氧起著相當(dāng)大的促進(jìn)作用。Aβ首先引起自由基及活性氧增高，進(jìn)而自由基及活性氧攻擊神經(jīng)細(xì)胞，造成細(xì)胞死亡。腦缺血也可引起自由基及活性氧增高，造成一系列病變，長(zhǎng)期損傷在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床上可能影響認(rèn)知功能，發(fā)展為癡呆。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察二苯乙烯甙(TSG)對(duì)活性氧過(guò)氧化氫(H2O2)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。
2.實(shí)驗(yàn)方法使用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞系(形態(tài)與功能與神經(jīng)元相似)，傳代培養(yǎng)。TSG與神經(jīng)細(xì)胞預(yù)孵育12小時(shí)或24小時(shí)，換培養(yǎng)液，加過(guò)氧化氫(H2O2)與細(xì)胞孵育2小時(shí)。取上清液測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活性，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果在過(guò)氧化氫(H2O2)致神經(jīng)細(xì)胞損傷模型上，發(fā)現(xiàn)TSG可明顯拮抗H2O2引起的細(xì)胞存活率下降及LDH漏出增多，減低H2O2的神經(jīng)毒性，并且呈劑量依賴關(guān)系，提示TSG對(duì)老年性癡呆和血管性癡呆可能具有防治作用(表3，表4)。
表3. TSG預(yù)孵育6小時(shí)對(duì)H2O2致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響組別 NLDH漏出率(％)MTT(OD 550nm)正常對(duì)照組62.54±0.40* 0.5835±0.0206*H2O2模型組(500μM) 381.66±2.09 0.0403±0.0080TSG 5μM+H2O2362.47±2.43* 0.1093±0.0074*25μM+H2O2361.93±2.42* 0.1317±0.0315*50μM+H2O2352.38±6.24* 0.1427±0.0178*100μM+H2O2351.29±6.75* 0.2027±0.0252*200μM+H2O2346.10±2.10* 0.2487±0.0283*400μM+H2O2353.76±1.84* 0.2163±0.0205*M±SD；*p＜0.05，與H2O2模型組相比表4. TSG預(yù)孵育24小時(shí)對(duì)H2O2致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響組別 NLDH漏出率(％)MTT(OD 550nm)正常對(duì)照組 63.18±0.45* 0.8733±0.0418*H2O2模型組(500μM)377.49±6.39 0.1433±0.0472TSG 5μM+H2O2358.99±5.96* 0.0733±0.020825μM+H2O2333.40±0.75* 0.1500±0.017350μM+H2O2318.67±4.14* 0.2300±0.0200*100μM+H2O238.51±1.98* 0.5233±0.0208*200μM+H2O236.09±1.02* 0.6800±0.0436*400μM+H2O2361.88±4.89* 0.2067±0.0379*M±SD；*p＜0.05，與H2O2模型組相比實(shí)施例3 TSG提高東莨菪堿致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦夏晷园V呆以基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失最為嚴(yán)重，造成乙酰膽堿分泌不足。東莨菪堿為M膽堿受體阻斷劑，能阻斷乙酰膽堿對(duì)M受體的激動(dòng)作用，因此模仿了乙酰膽堿分泌不足的結(jié)果，是老年性癡呆的動(dòng)物模型之一。
2.實(shí)驗(yàn)方法(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)給小鼠灌服不同劑量的TSG 7天后造模。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天給藥1小時(shí)后，腹腔注射氫溴酸東莨菪堿注射液1mg/kg，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。15分鐘后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)定，一天兩次，連續(xù)三天。數(shù)據(jù)采集和處理均由圖象自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
(2)避暗實(shí)驗(yàn)小鼠給藥與注射東莨菪堿方法同上，東莨菪堿劑量為20mg/kg。注射15分鐘后進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)。本方法為被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)，小鼠有喜歡黑暗的習(xí)性，進(jìn)入暗室后即遭受電擊。第2、3、4天進(jìn)入暗室前的潛伏期越長(zhǎng)、進(jìn)入暗室的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))越少，表明學(xué)習(xí)記憶功能越好。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSG中劑量可明顯縮短小鼠游出時(shí)間和游泳距離(表5)，表明該藥可以改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。避暗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSG中劑量可以明顯延長(zhǎng)潛伏期，減少進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)(表6)，表明該藥可改善小鼠被動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶功能。其機(jī)理與乙酰膽堿能神經(jīng)功能增強(qiáng)有關(guān)。
表5. TSG對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠模型水迷宮游出時(shí)間及游泳距離的影響組別 n游出時(shí)間(秒)游泳距離(厘米)正常對(duì)照組767.9±47.5* 1146±836*模型組799.3±38.1 1809±869TSG(30mg/kg) 884.5±46.5 1489±1027TSG(100mg/kg) 877.8±46.5* 1371±917*TSG(300mg/kg) 883.4±48.1 1547±989M±SD；*P＜0.05與模型組比較表6. TSG對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠模型避暗實(shí)驗(yàn)潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)的影響組別 n潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)正常對(duì)照組7300.0±0.0 0.00±0.00*模型組7264.8±78.6 0.71±1.68TSG(30mg/kg) 8286.9±52.5 0.25±1.00TSG(100mg/kg) 8300.0±0.0 0.00±0.00*TSG(300mg/kg) 8282.8±68.8 0.19±0.75M±SD；*P＜0.05與模型組比較實(shí)施例4 TSG提高Aβ致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦夏晷园V呆(Aβ)的特征性病理變化是大腦出現(xiàn)老年斑，而β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積構(gòu)成老年斑的核心。近年的研究表明，Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有毒性，可能通過(guò)炎性反應(yīng)、自由基增高、鈣離子超載等介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察TSG灌胃口服對(duì)Aβ致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，麻醉后在前囟處皮膚開(kāi)一小口，暴露出顱骨，將老化的Aβ25-354nmol注入側(cè)腦室，對(duì)照組注入生理鹽水。次日起給藥組灌服TSG，10天后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)定，一天兩次，連續(xù)三天。數(shù)據(jù)采集和處理均由圖象自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSG可縮短Aβ模型小鼠游出時(shí)間和游泳距離(表7)，表明該藥可以改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
表7. TSG對(duì)Aβ致癡呆小鼠模型水迷宮游出時(shí)間及游泳距離的影響組別 n游出時(shí)間(秒)游泳距離(厘米)正常對(duì)照組860.43±42.28* 986±719*模型組891.38±34.911559±724TSG(30mg/kg) 975.21±39.391330±840TSG(100mg/kg) 973.23±40.811271±886TSG(300mg/kg) 869.24±41.25* 1175±769*M±SD；*P＜0.05與模型組比較實(shí)施例5、TSG提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康难苄园V呆是由腦血管疾病所致的認(rèn)知功能障礙，主要原因是腦缺血。近年的研究表明，老年性癡呆也有血管因素參與，腦灌流量不足是重要的危險(xiǎn)因素。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察TSG對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法沙土鼠連續(xù)灌胃給TSG7天。.第7天后行雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉10分鐘，再灌注5天后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力。
Morris水迷宮測(cè)定主要由由圓形水池和自動(dòng)錄象及分析系統(tǒng)兩部分組成。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天各組給藥60分鐘后，每只動(dòng)物第一天訓(xùn)練4次，入池位置為站臺(tái)所隊(duì)象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動(dòng)物頭朝池壁入水，120S未找到站臺(tái)者，將其引致站臺(tái)，放置30S引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。第2、3和4天重復(fù)測(cè)試，數(shù)據(jù)采集和處理均由有圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG給藥組水迷宮游出時(shí)間和游泳距離與模型組相比明顯縮短(表8)。表明該藥能提高腦缺血沙土鼠學(xué)習(xí)記憶能力，有利于對(duì)血管性癡呆和老年性癡呆的防治。
表8. TSG對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠Morris水迷宮游出時(shí)間和距離的影響組別 N 游出時(shí)間(秒) 游泳距離(厘米)對(duì)照組(假手術(shù)組) 5 18.28±15.38* 377.4±354.7*模型組(缺血再灌) 4 36.45±36.91 687.5±610.3TSG 38mg/kg+缺血再灌 3 37.10±41.11 593.5±41.1TSG 114mg/kg+缺血再灌 5 25.57±22.75 508.6±422.6TSG 342mg/kg+缺血再灌 4 12.04±9.89** 311.4±319.6*M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較。
實(shí)施例6 TSG抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖杂苫龈?、氧化?yīng)激是老年性癡呆和血管性癡呆發(fā)病機(jī)理中共同的重要環(huán)節(jié)。腦缺血后產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化增高，過(guò)氧化脂質(zhì)增多。過(guò)氧化脂質(zhì)是生物膜和細(xì)胞中磷質(zhì)所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化而成的過(guò)氧化產(chǎn)物。它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量增高的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩沖液勻漿，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清0.5ml，用硫代巴比妥酸(TAB)法測(cè)定腦組織中MDA含量。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌服可降低急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量(表9)，表明該藥可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，其機(jī)理可能為減少自由基生成或增強(qiáng)自由基清除。TSG的抗氧化作用有利于防治老年性癡呆和血管性癡呆。
表9. TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響組別 N MDA(nmol/mg蛋白)對(duì)照組(假手術(shù)組) 101.093±0.151*模型組(缺血再灌) 9 1.180±0.190海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 101.111±0.116TSG 38mg/kg+缺血再灌 101.158±0.150TSG 114mg/kg+缺血再灌 101.002±0.147**TSG 342mg/kg+缺血再灌 101.030±0.131**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01與缺血模型組比較實(shí)施例7 TSG增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康某趸锲缁?SOD)對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基(O-2)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織SOD活性降低的影響，探討TSG抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的機(jī)理。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩沖液勻漿，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清0.1ml，用亞硝酸鹽法測(cè)定腦組織中SOD活性。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌胃口服可增高急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性(表10)，表明該藥具有增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的作用，這可能是其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的機(jī)理。TSG促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化酶活性的作用有利于防治老年性癡呆和血管性癡呆。
表10. TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性的影響組別 N SOD(NU/mg蛋白)對(duì)照組(假手術(shù)組) 105.219±0.051*模型組(缺血再灌) 9 4.913±0.051海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 104.779±0.034TSG 38mg/kg+缺血再灌 105.152±0.049TSG 114mg/kg+缺血再灌 105.111±0.074TSG 342mg/kg+缺血再灌 105.317±0.060**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較實(shí)施例8 TSG減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳窠?jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高、鈣超載在老年性癡呆和血管性癡呆的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。腦缺血再灌注后，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、鈣超載，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)模型動(dòng)物腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取出全腦，放入通有95％的CO2和5％O2的預(yù)冷的人工腦脊液中，在振動(dòng)切片機(jī)上切出400um的腦片，放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育30min，加入5uM的Fluo-3AM 500ul，在CO2培養(yǎng)箱中負(fù)載1h后，沖洗數(shù)次，在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)上進(jìn)行光學(xué)切片，觀察熒光強(qiáng)度。
光學(xué)切片(光切)是激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的特色之一，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)離體活腦片進(jìn)行連續(xù)無(wú)損切割，又稱為“顯微CT”，光切可以獲得樣品表面的和深層的信息，通過(guò)三維重建技術(shù)，可以獲得三維圖象和立體結(jié)構(gòu)信息。鈣熒光指示劑Fluo-3AM是一種脂溶性試劑，本身無(wú)熒光，穿過(guò)細(xì)胞膜后，在膜內(nèi)酶的作用下，脫去酯基(AM)，與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，出現(xiàn)熒光，利用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定熒光強(qiáng)度，可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平。
圖象處理利用LaserSharp圖象處理系統(tǒng)，測(cè)定左右海馬區(qū)、皮層區(qū)的面積或體積和總的熒光強(qiáng)度，以單位面積或單位體積熒光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度分布中值(即Mean，系統(tǒng)給出)為指標(biāo)，觀察海馬、皮層的細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平。
統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間差異的顯著性用t檢驗(yàn)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌胃口服可降低腦缺血再灌注小鼠模型大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(表11)，這對(duì)于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、防治老年性癡呆和血管性癡呆具有重要意義。
表11. TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響組別 N 細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光值皮層(Pix/um2) 海馬(Pix/um2)對(duì)照(假手術(shù)組)3 0.6039±0.6350*0.4718±0.4104*模型(缺血再灌組) 3 1.0439±0.2636 0.8385±0.2849海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 3 0.3719±0.1379*0.4406±0.2073*TSG 38mg/kg+缺血再灌 3 0.4476±0.1095** 0.4371±0.1013*TSG 114mg/kg+缺血再灌 3 0.4735±0.2651** 0.6536±0.3179TSG 342mg/kg+缺血再灌 3 0.5927±0.3140*0.6607±0.3926M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較實(shí)施例9 化合物的制備在超聲破碎下，何首烏根的干燥粉末用氯仿萃取三次，除去蒽醌，然后殘留物以類似方式用乙醇萃取3次。合并乙醇萃取物并濃縮干燥。干燥的萃取物溶解在HSCCC(高速逆流液相色譜法)分離的流動(dòng)相中。HSCCC用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所制造的GS10A2多層盤(pán)旋行星式離心機(jī)進(jìn)行。
在各分離中，盤(pán)旋柱首先完全填充上層有機(jī)固定相。然后儀器在800rpm下旋轉(zhuǎn)，同時(shí)下層含水流動(dòng)相泵入到柱中。在流動(dòng)相前面出現(xiàn)和體系建立穩(wěn)定狀態(tài)的流體動(dòng)力平衡之后，樣品溶液經(jīng)注射閥注入。來(lái)自柱的出口的流出物用在254nm的UV檢測(cè)器連續(xù)監(jiān)控。峰級(jí)分根據(jù)色譜圖收集，獲得了96％的高純度。
上述化合物125mg，乳糖82mg，羧甲基淀粉40mg和硬脂酸鎂3mg，按常規(guī)方法壓片制成片劑。
權(quán)利要求
1.下式的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備治療癡呆的藥物中的用途 其中R為-O-β-D-葡萄糖。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述癡呆包括Alzheimer病。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述癡呆包括血管性癡呆。
4.下式的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備治療輕度認(rèn)知損害、記憶力減退或健忘的藥物中的用途 其中R為-O-β-D-葡萄糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4的用途，其中所述藥物可以是固體制劑，如膠囊、顆粒制劑、片劑，液體制劑如口服液，或者注射劑。
6.一種用于治療癡呆的藥物組合物，其特征在于包括權(quán)利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽以及載體。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述癡呆是A1zheimer病。
8.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述癡呆是血管性癡呆。
9.權(quán)利要求6的組合物，其中在所述組合物中，二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽的含量為10-90wt％。
10.權(quán)利要求6的組合物，其中在所述組合物中，二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽的含量為50-90wt％。
11.權(quán)利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備預(yù)防癡呆的藥物中的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述癡呆包括Alzheimer病和血管性癡呆。
全文摘要
本發(fā)明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備治療癡呆,尤其Alzheimer病、血管性癡呆的藥物中的用途。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí),二苯乙烯甙化合物能夠抵抗β－淀粉樣蛋白致腦細(xì)胞損傷的作用,能夠抵抗過(guò)氧化氫致腦細(xì)胞損傷作用,提高東茛菪堿致癡呆小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶功能,提高Aβ致癡呆小鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力,提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力,抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化,增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性和減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1347699SQ0113428
公開(kāi)日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者李林 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院