專利名稱：一種治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的療效來自其原料所含的各種有效成分，這些有效成分已為西方尖端醫(yī)學、生理學的實驗研究所證實，下面就本藥物中的各種有效成分作詳細說明。
1神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)的生理和保健作用神經(jīng)細胞的生長、分化過程有三個階段，先是由特定神經(jīng)母細胞分裂增殖，然后向特定部移行、伸展，最后形成互相聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。NGF在促進神經(jīng)細胞分裂增殖，誘導軸突生長，形成突觸網(wǎng)絡(luò)這三個階段中都發(fā)揮著重要作用。NGF對交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元的生存和生長是不可缺少的。給發(fā)育期動物注射抗NGF血清，除去體內(nèi)天然的NGF后，動物的交感神經(jīng)鏈便不發(fā)育。實驗證明，NGF能促進多胺合成酶和鳥氨酸脫羧酶(ODC)活性增強，交感神經(jīng)節(jié)細胞在發(fā)生期對這類酶的依賴性很強，越是幼稚期對酶的促進作用越強。攝入神經(jīng)細胞內(nèi)的NGF能加速神經(jīng)遞質(zhì)的合成。在交感神經(jīng)細胞內(nèi)能增加酪氨酸羥化酶活性，使兒茶酚胺類遞質(zhì)合成加快。這一過程并非通過第二信使cAMP起作用，而是酶蛋白合成增加。NGF也能促進感覺神經(jīng)元P物質(zhì)的合成。
2腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可從豬等哺乳動物腦中分離出來，是一種堿性蛋白，等電點10，分子量12.3kD。腦內(nèi)主要分布在海馬部位，每克豬腦能提取BDNF5ng。BDNF的生理和保健作用；能促進胚胎視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的生長和存活，對脊髓背根節(jié)細胞和顱神經(jīng)感覺神經(jīng)元也有營養(yǎng)作用，促進其軸突生長，延長體外培養(yǎng)的存活時間。
3神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3,NT-3)是NGF家族中的第三成員，又稱NGF-2或海馬衍生NTF。成熟NT-3是119個氨基酸組成的多肽，等電點9.5。NT-3能促進背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元的軸突生長和延長存活時間，能加速結(jié)狀節(jié)和交感神經(jīng)節(jié)細胞軸突的生長。
4成纖維細胞生長在子(fibroblast growth factor,FGF).FGF是一種蛋白分裂原，在這一家族中已先后發(fā)現(xiàn)有7種結(jié)構(gòu)相似的生長因子，其中FGF-1和FGF-2(或稱aFGF和bFGF)這兩種因子的受體，與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育關(guān)系密切。FGF能刺激大多數(shù)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細胞的分裂增殖，如血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成骨骼肌細胞、晶體上皮細胞、虹膜細胞等。在早期胚胎發(fā)育期，F(xiàn)GF能誘導中胚層的形成，使一些胚胎細胞向著中胚層細胞模式分化。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF是具有明顯神經(jīng)營養(yǎng)活性的細胞生長因子。小量FGF-2就能使培養(yǎng)中的海馬神經(jīng)細胞存活時間延長，突起增多。FGF-2對許多中樞神經(jīng)元都有這種類似的作用。FGF-1對維持視網(wǎng)膜節(jié)細胞的生存明顯高于FGF-2。FGF-2可增加膽堿能中隔神經(jīng)細胞的存活，挽救受到損傷的神經(jīng)元。FGF-2對星形膠質(zhì)細胞也具有營養(yǎng)活性；能促進肉芽組織(主要是小血管和纖維細胞)新生，加速創(chuàng)口的愈合。
5上皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是由53個氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽。分子量6045，等電點4.6，耐熱，100℃水中30分鐘仍不失活。人EGF(hEGF)與小鼠EGF(mEGF)結(jié)構(gòu)很相似，在53個氨基酸中37個相同，雙硫鍵的位置也相同。EGF的作用主要是刺激皮膚和中胚層細胞生長。對乳腺上皮細胞、皮纖維細胞、呼吸道與胃腸道上皮細胞、平滑肌細胞、肝細胞、血管內(nèi)皮細胞以及卵巢顆粒細胞等均有促生長和增殖活性。EGF能增加神經(jīng)細胞的存活時間，促進軸突生長，加速膠質(zhì)細胞的增殖。在EGF的作用下，K+和葡萄糖等小分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)速度加快，并加速糖的分解，使乳酸增加。EGF還能促進RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成。
6、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)。Ach對神經(jīng)組織的生物效應相當廣泛，包括對神經(jīng)——肌肉的接頭處、自主神經(jīng)節(jié)、膽堿能神經(jīng)元和神經(jīng)元通路(外圍及中樞)都有廣泛的生物效應。由于膽堿能神經(jīng)元在中樞分布很廣，有證實的是上行網(wǎng)狀系統(tǒng)、邊緣系統(tǒng)、運動系統(tǒng)、感覺系統(tǒng)等，Ach效應有的是興奮性，有的是抑制性，一般說以興奮性為主，此外Ach對攝食、飲水、體溫、血壓等調(diào)節(jié)中樞都有特定的效應，具體的生物效應，有以下幾方面①促進磷酯酸及磷脂酰肌醇類的合成。②促進生物胺的釋放；Ach促進嗜鉻細胞釋放兒茶酚胺，促使肥大細胞釋放組胺。③促進神經(jīng)組織釋放硫胺近年發(fā)現(xiàn)，Ach灌注神經(jīng)組織試驗中，發(fā)現(xiàn)促進硫胺類物質(zhì)的釋放。臨床上已證實Ach對治療老年性癡呆癥有療效，能改善患者的記憶力和認知能力。
7、組胺(histamine,HA)，它的療效除了具有擴張血管增加毛細血管通透性外，還有①邊緣系統(tǒng)的功能組胺能神經(jīng)元投射至許多邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如海馬、杏仁核、伏隔核等結(jié)構(gòu)，因而以為其與情感的控制，記憶功能和植物性功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。②對神經(jīng)系統(tǒng)的作用可引起逆向性的血管擴張和軸索反射，與周圍神經(jīng)感覺的起始和傳遞有關(guān)。
8、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide-,CGRP)、CGRP前體由128個氨基酸殘基組成，分子量為16KD，含有一個與CT前體相同的76個氨基酸的N端序列。CGRP有強大的擴血管作用，使腦血流量明顯增加。
9、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)。NPY可增加交感神經(jīng)支配的平滑肌對去甲腎上腺素的敏感性，可降低血壓、減慢心率。
11環(huán)核苷酸。它是重要的細胞內(nèi)信使；在許多細胞系統(tǒng)中，細胞對各種調(diào)節(jié)訊號的應答是由3＇,5＇一環(huán)腺苷酸(cAMP)介導的。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)遞質(zhì)、激素和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑對細胞cAMP含量或(和)3＇,5＇一環(huán)鳥苷酸(cGMP)有重要的調(diào)節(jié)作用，cAMP和cGMP是介導一些神經(jīng)活動的細胞重要的調(diào)節(jié)作用，cAMP和cGMP是介導一些神經(jīng)活動的細胞內(nèi)信使。鳥苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G蛋白)在受體信號的跨膜傳遞中起重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，許多效應蛋白質(zhì)，如腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2和磷酸二酯酶等的活性受G蛋白的調(diào)節(jié)。在信息的跨膜傳遞中，G蛋白是聯(lián)系受體和效應蛋白質(zhì)的“中繼站”。
12、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)節(jié)苷脂具有許多重要的功能。它是膜相關(guān)活性物質(zhì)，特別濃集于神經(jīng)元的突觸部位。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的各個階段，隨著細胞分化，突觸建立和髓鞘形成，神經(jīng)節(jié)苷脂的含量和成分往往發(fā)生特殊的變化。神經(jīng)節(jié)苷脂參與神經(jīng)系統(tǒng)與環(huán)境的相互作用和信息傳遞過程，也與神經(jīng)的可塑性以及學習記憶等高級活動有關(guān)。此外，神經(jīng)節(jié)苷脂還具有促進神經(jīng)元損傷后的再生作用。
13、利鈉多肽家族包括心鈉素、腦鈉素、C型利鈉肽，具有利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓的作用。
上述多肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子在制備中經(jīng)控制性酶解，如用CNBr處理后的蛋白酶消化NGF，在得到的11個多肽中，由雙硫鍵結(jié)合的10-25肽和75-88肽具有100倍的NGF活性，這些小肽鏈能通過血腦屏障，作用于大腦?；蛘哂梦傅鞍酌负褪葻峋鞍酌?thermoly-sin)消化得到三個小肽鏈。以上為注射用凍干粉劑和注射劑，至于口服制劑如膠囊劑，片劑、滴丸劑等，無需經(jīng)基因工程蛋白酶控制性酶解，而是空腹服用，同時喝入300-500毫升白開水，使藥物在胃內(nèi)酶解的時間較短，是一種自然控制性酶解，使進入小腸的藥物中多肽類成分，分解成有活性的小肽鏈，這些小肽鏈能通過血腦屏障。
試驗中選擇89例老年性癡呆癥患者，每天注射本藥物5μg，對照組55例，每天服用安慰劑。經(jīng)4個月試驗，結(jié)果本藥物有效率81％。試驗組患者病情轉(zhuǎn)好，表現(xiàn)為記憶增強，定向力障礙減輕，CT檢查大腦皮層停止萎縮。
試驗中選擇50例帕金森病患者，每天注射本藥物5μg；對照組50例每天服用安慰劑。經(jīng)4個月試驗，結(jié)果本藥物有效率74％，試驗組患者的病情減輕，如震顫減少，或從packinson癡呆漸具語言、思維能力。
本藥物用于腦血管病的預防和治療。
試驗中在腦血管病高危人群中選擇100人，其中50人列為試驗組，每天注射本藥物3μg；對照組50人每天服用安慰劑，經(jīng)4個月試驗，試驗組無1例發(fā)生出血性或缺血性腦血管病，對照組中有2例發(fā)??；試驗后一年內(nèi)，試驗組無1例發(fā)病，對照組有7例發(fā)病。
試驗中選擇64例腦血管病患者，其中試驗Ⅰ組30例為出血性腦血管病患者，試驗Ⅱ組34例為缺血性腦血管病患者，Ⅰ組患者每天注射本藥物5μg和需時用高滲性脫水劑(20％甘露醇、甘油鹽水)或利尿藥。Ⅱ組患者每天注射本藥物4μg和需時用腦嗌嗪。對照組50例腦血管病患者，其中對照Ⅰ組25例為出血性腦血管病患者，每天服用安慰劑和需時用高滲性脫水劑和利尿劑，對照Ⅱ組25例為缺血性腦血管病患者，每天服用安慰劑和腦嗌嗪。經(jīng)6個月試驗，結(jié)果顯示本藥物對出血性腦血管病有效率為68％，對缺血性腦血管病有效率為76％。
試驗中選擇100例冠心病患者，每天注射本藥物5μg和需時用硝酸甘油；對照組80例，每天服用安慰劑和需時用硝酸甘油；經(jīng)5個月試驗，試驗組患者心絞痛或心肌梗塞發(fā)生次數(shù)比試驗前減少85％，對照組未見減少。
試驗中選擇90例高血壓患者，每天注射本藥物4μg和服用異搏定(維拉帕米verapamil)，試驗前試驗組患者平均血壓SBP179mmHg和DBP109mmHg；對照組90例，每天服用安慰劑和異搏定。經(jīng)6個月試驗，結(jié)果顯示本藥物有效率92％，試驗組患者平均血壓SBP136mmHg,DBP93mmHg。對照組平均血壓比試驗前只降低3-5mmHg。
試驗中選擇70例動脈粥樣硬化患者，每天注射本藥物3μg，對照組70例，每天服用安慰劑，經(jīng)6個月試驗，結(jié)果顯示本藥物有效率87％。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明是以神經(jīng)生長因子(NGF)，腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4)，神經(jīng)營養(yǎng)因子-5(NT-5)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，表皮生長因子(EGF)，神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)，乙酰膽堿(Ach)，組胺(HA)，降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)，神經(jīng)肽Y(NPY)，環(huán)核苷酸(cAMP)，心鈉素(atrialnatriuretic peptide.ANP)，腦鈉素(brain natriuretic peptide-.BNP),C型利鈉肽(c-type Natriuetic peptide.CNP)，前列環(huán)素(PGI2)，內(nèi)皮細胞舒張因子(EDRF)為原料，上述原料可單獨或混合制成治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化的藥劑。上述原料都可從動物器官中提取，或用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)，原料的制取為現(xiàn)有技術(shù)，以下是用基因工程技術(shù)制取原料的幾個實例A、表皮生長因子(EGF)。
一、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)hEGF的基因定位于人第4號染色體的q24～q26帶。hEGF是53個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量約6200；等電點為4.7；分子內(nèi)不帶糖基，N端為天冬酰胺，C端為精氨酸；有三個鏈內(nèi)二硫鍵，分布在Cys6-Cys20,Cys14-Cys31以及Cys33-Cys12之間，在分子的二級結(jié)構(gòu)中形成三個二硫化物環(huán)，對維持其生物活性所需的穩(wěn)定空間構(gòu)型十分重要。
hEGF具有熱隱定性；容易放蛋白酶水解；它的三個二硫鍵難以正確配對，錯配后，造成蛋白質(zhì)分子重折疊而使生物活性降低或消失。因此，利用工程菌表達hEGF，保持這三個二硫鍵的正確性至關(guān)重要。通常采用分泌型表達有利于形成正確的空間結(jié)構(gòu)。
二、生產(chǎn)工藝hEGF的成熟肽不含糖基化位點，活性與糖基無關(guān)，故適于在E.coli中表達。國內(nèi)外已有多家實驗室和公司在E.coli中成功表達了hEGF，所采用的啟動子包括Ecoli堿性磷酸酯酶啟動子(phoA)，外膜蛋白啟動子(omp),Trp啟動子和pk啟動子等。由于hEGF是小分子多肽，在細菌細胞中不易形成包涵體，且在胞內(nèi)聚集會招致蛋白酶攻擊而降解。因此，表達的最佳策略是采用分泌型表達。目前最成功的是采用E.coli堿性磷酸酯酶基因(phoA)啟動子和信號肽的分泌型表達。E.coli phoA啟動子受phoA,phoM和phoR基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，在低磷酸鹽條件下被誘導合成大量堿性磷酸酯酶(APase)。在細菌細胞內(nèi)，Apase是以帶有信號肽的前體合成，然后由信號肽介導成熟的APase穿過細胞膜進入周質(zhì)。如果將真核蛋白基因與phoA信號肽基因連接，二者之間不保留任何多余氨基酸，phoA信號肽就會得到加工，并將真核成熟肽轉(zhuǎn)運到細菌膜外周質(zhì)中。表達的外源蛋白可用滲透休克的方法純化而無需破裂細菌。
首次構(gòu)建了編碼phoA啟動子和信號肽的分泌型載體。其中之一是pTA1529。這個載體在phoA信號肽的3＇端有單一HindⅢ限制酶切點，可以容易地在這個位置插入外源結(jié)構(gòu)基因，phoA信號肽和插入體之間無任何堿基插入或缺失。用HindⅢ切開pTA1529 DNA，用T4DNA聚合酶修復粘性末端，并用SalⅠ限制酶消化，回收SalⅠ-HindⅢ大片段。以同樣方式從克隆質(zhì)粒載體pTA1002中切出人工合成的hEGF結(jié)構(gòu)基因，用T4DNA連接酶使之與pTA1529的SalⅠ-HindⅢ片段連接，構(gòu)建成hEGF分泌型表達載體pTA1522。用pTA1522轉(zhuǎn)化E.coli APase缺失突變株YK537，轉(zhuǎn)化菌株于低磷酸鹽條件下，30℃誘導培養(yǎng)9h，收集菌體，滲透休克處理，凍干。產(chǎn)物經(jīng)SephadexG-50柱凝膠過濾，收集hEGF洗脫峰，凍干，干物質(zhì)溶于水中，再經(jīng)μbond pakc18柱層析，可得高純度的重組hEGF，產(chǎn)量為2413μg/L培養(yǎng)物，或每個細胞1.8×105分子。
由于Apase和表達的hEGF的分泌使用相同的信號肽，所以E.coli內(nèi)源APase可能會與hEGF的分泌發(fā)生競爭，抑制hEGF的分泌。使用Apase缺陷株YK537可避免這個問題的出現(xiàn)，使重組hEGF的回收量比在非APase缺陷株(如C600等)中提高5倍。另外試驗結(jié)果表明，在30℃誘導9h比在37℃誘導6h產(chǎn)量提高2倍。
國內(nèi)重組hEGF的生產(chǎn)亦采用類似的工藝路線。人工合成的hEGF結(jié)構(gòu)基因由6個合成片段組成，共159個堿基對，在基因5＇端添加EcoRⅠ切點，3＇端添加。HindⅢ切點。將合成的hEGF基因與多拷貝質(zhì)粒pI218R同樣用EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切，并重組連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM103菌株，分析篩選出重組質(zhì)粒pEG14。利用合成的E.coli phoA基因啟動子、信號肽編碼序列和上述hEGF基因構(gòu)建表達質(zhì)粒p-AE-8。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YK537，篩選出hEGF表達最高的菌株EE-86做為工程菌株。將工程菌株37℃發(fā)酵培養(yǎng)，使細菌生長至A660nm=1以上，在含低濃度磷酸鹽培養(yǎng)基中開始誘導其高效表達。誘導10h后，表達的hEGF90％以上分泌到培養(yǎng)基中，最高可達30mg/L培養(yǎng)基。取發(fā)酵液上清，經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、凝膠過濾層析、離子交換層析和反相HPLC，純度可達98％以上。
利用補料分批培養(yǎng)(Fed-Batch culture)，在E.coli中大量生產(chǎn)了hEGF。他們構(gòu)建的表達質(zhì)粒載體是pTRLBT1，這個質(zhì)粒含有trp啟動子、trpL基因N-末端6個氨基酸的編碼序列及融接在其下游的合成hEGF結(jié)構(gòu)基因。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)比E.coliHB101，篩選出工程菌株。因為hEGF生產(chǎn)抑制細菌生長和細菌的乙酸鹽同化作用，所以工程菌發(fā)酵采用補料分批培養(yǎng)方式，將細胞培養(yǎng)分為兩個步驟。第一步，加色氨酸抑制trp啟動子表達hEGF基因，使細胞生長；第二步，從培養(yǎng)基中撤除色氨酸，誘導trp啟動子表達hEGF基因，生產(chǎn)hEGF。工程菌在5升發(fā)酵罐中培養(yǎng)，起始工作體積為2L，包括0.2L過夜菌種，1g/L葡萄糖和0.2ml抗泡沫劑。pH保持7，溫度37℃，氣體流速2L/min，攪拌速度400～1000r/min。用氨水(6mol/L)調(diào)pH。通過改變攪拌速度將溶解氧水平控制在1～3ppm。當攪拌速度達到最高1000r/min時，向發(fā)酵罐補充50％氧氣以代替空氣。通過檢測乙酸鹽濃度控制進料速度，以便使乙酸鹽濃度維持在33mmol/L以下。飼養(yǎng)培養(yǎng)基(feeding medium)由200g/L葡萄糖，1000g/L酪蛋白水解物，60g/L酵母提取物，0.8g/L色氨酸和0.1g/L氨芐青霉素組成，pH7.0。在誘導hEGF基因表達時，從飼養(yǎng)培養(yǎng)基中排除酵母提取物和色氨酸。細菌培養(yǎng)8h改變培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一改變hEGF即刻開始產(chǎn)生，培養(yǎng)結(jié)束時，產(chǎn)量達到60mg/L。重組hEGF以N-末端融接TrpL蛋白的6個氨基酸殘基的融合蛋白形式產(chǎn)生，并以包涵體的形式存在于細胞內(nèi)。
三、檢驗方法1．質(zhì)量檢測重組hEGF產(chǎn)品為透明澄清液體；SDS-PAGE測定分子量6045；等電聚焦電泳測定等電點為4.55～5.20；反相HPLC分析肽圖與標準品一致；氨基酸序列分析儀測定N-端氨基酸序列與文獻一致；HPLC測定純度＞95％。
2．生物活性測定用MTT A431細胞抑制法測定生物效價為標示量80％～120％。
B、成纖維細胞生長因子(FGF)。
一、bFGF的基因人bFGF基因位于第4號染色體，是單拷貝基因，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，長度大于38kb。第一個內(nèi)含子位于第60和61位密碼子之間，第2個內(nèi)含子位于第94和95位密碼子之間。bFGF mRNA有兩種形式，分別為4.6kb和2.2kb。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA序列分析表明，在bFGF cDNA的可讀框架中，有一個常見的AUG起始密碼子和UGA終止密碼子。這個讀框編碼的氨基酸序列與從組織中提純的bFGF氨基酸序列一致。此外，在常見的起始密碼子前面三個不同位置上有三個不常見的起始密碼子CUG。已證實這些CUG密碼子分別啟動三種末端延長形式的bFGF(分子量分別為24、23.1和22kD)的合成。
二、bFGF的結(jié)構(gòu)bFGF是單鏈多肽。由cDNA推斷的初級轉(zhuǎn)錄物編碼155個氨基酸組成的前體分子，分子量約為18kD，其中不含信號肽。從不同組織中提純的bFGF肽鏈長短不一。最早從牛腦和垂體分離提純的bFGF由146個氨基酸組成，而黃體bFGF僅由130個氨基酸組成。少于155個氨基酸的bFGF為氨基末端截短形式。已證實bFGF氨基末端縮短少于25個氨基酸不影響其活性，說明N-端氨基酸不參與生物活性或bFGF與細胞表而受體的結(jié)合。
bFGF分子內(nèi)部有兩個潛在的肝素結(jié)合區(qū)，一個位于氨基端的第18～22位殘基，另一個位于羧基端的第107～110位殘基，因此對肝素有很高的親合力。二級結(jié)構(gòu)分析表明，第37～40和第78～81位殘基恰好是纖連素(fibronectin)的精-甘-天冬-X序列的顛倒，可能存在于蛋白質(zhì)的外部，這些殘基可以使bFGF附著到細胞表面的識別部位。
bFGF有四個半胱氨酸，形成兩個二硫鍵。bFGF在進化過程中極其保守，如人和牛的bFGF,146個氨基酸中只有兩個不同，同源性達98.7％，鳥bFGF與牛bFGF氮基酸組成相同。
bFGF的結(jié)構(gòu)和功能與aFGF相似，但bFGF的活性比aFGF大10倍～100倍，且aFGF的細胞分布比較有限，主要在腦組織、視網(wǎng)膜、腎臟和骨組織中，而bFGF則分布在腦、垂體、視網(wǎng)膜、腎、腎上腺、胎盤、前列腺、胸腺、骨、免疫系統(tǒng)和各種腫瘤中。基本上所有的細胞都有bFGF的特異性、高親和性受體。因此，bFGF是一種基本調(diào)節(jié)因子，通過自分泌和旁分泌兩種機制起作用。
三、bFGF的理化性質(zhì)bFGF的等電點為9.6對熱不穩(wěn)定，易被蛋白酶降解；對肝素有很強的親和力，與肝素結(jié)合后，生物活性不變，但對溫度和酸的穩(wěn)定性增強，不易被蛋白酶降解。
四、重組人bFGF生產(chǎn)工藝利用T7啟動子表達系統(tǒng)在E.coli中表達了人bFGF，并利用肝素-Sepharose親和柱層析實現(xiàn)了重組bFGF的一步純化。
1．表達質(zhì)粒pJU1005的構(gòu)建構(gòu)建bFGF表達載體的基礎(chǔ)是質(zhì)粒pET-3b。這個質(zhì)粒是pBR322的衍生物，含T7噬菌體的φ10基因啟動子、翻譯起始部位和前11個密碼子以及Tφ-T7RNA聚合酶識別的轉(zhuǎn)錄終止信號。這些序列在pBR322的BamHⅠ位點插入，使轉(zhuǎn)錄以逆時針方向進行。用EcoRⅠ-EcoRv雙酶消化，除去pET-3b中的一個含內(nèi)源EcoRⅠ、ClaⅠ和HindⅢ切點的185bp片段。在BamHⅠ切點插入一個合成的多聚接頭(Polylinker)，其中，靠近T7啟動子的是BamHⅠ切點，最遠端的是XhoⅡ切點。用同源的tet基因的一個650bp EcoRⅠ-Sall片段(已用亞硫酸氫鹽誘變消除了內(nèi)部的BamHⅠ和HindⅢ切點)置換pET-3b中的BglⅡ-Sall片段，恢復了該質(zhì)粒的tet基因，使其同時具有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性。此質(zhì)粒命名為pJU1003。用一個合成的兩端分別為BamHⅠ和NcoⅠ切點的接頭，將bFGF cDNA序列與pJU1003中的T7噬菌體基因10直接銜接，得到表達質(zhì)粒pJU10052．bFGF的表達和純化用質(zhì)粒pJU1005轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株，篩選出陽性轉(zhuǎn)化菌。將轉(zhuǎn)化菌于30℃在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)后期，加入0.1mmol/L IPTG誘導bFGF表達。2h后收獲菌體，快速冰浴冷卻。于4℃離心，每克細胞沉淀重懸于4ml緩沖液A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5)中，用弗氏細胞壓碎器破碎細胞。將細胞裂解液調(diào)至0.5mol/L氯化鈉濃度，于4℃離心，去除細胞碎片。含重組bFGF的懸液成分用含0.5mol/L氯化鈉的緩沖液A，進一步稀釋至相應于5ml/g細胞濕重的體積，直接加到預先用同樣緩沖液平衡的肝素-Sepharose親和柱上層析。用二倍體積的平衡緩沖液洗柱，然后，再用含1mol/L氯化鈉的緩沖液A洗住，直至流出物的A280nm達到基線值。用含2mol/L氯化鈉的緩沖液A從柱上洗脫bFGF，得到高純度的bFGF。
這個表達系統(tǒng)產(chǎn)生的重組bFGF占菌體總蛋白的10％以上，產(chǎn)量達40mg/L培養(yǎng)物/A260nm單位。
五、重組bFGF的活性測定通過3H-TdR摻入法，用小鼠3T3成纖維細胞測定其絲裂原活性。
C、神經(jīng)生長因子(NGF)。
NGF最早是由蛇毒腺提取，后來又由小鼠下頜腺分離提純的。從小鼠下頜腺中提純的NGF是一種沉降系數(shù)為7S的復合物，含α、β和γ三種蛋白質(zhì)亞基，組成為α2βγ2，分子量130kD。γ亞基是一種精氨酸特異性的酯肽酶，參與β-NGF前體的加工。α亞基與γ亞基有80％以上的同源性，但沒有酯肽酶活性。只有β亞基具有NGF活性。
7SNGF的α、β和γ亞基通過弱的非共價鍵結(jié)合，只有在pH5～8時穩(wěn)定。當pH＞8或pH＜5時，或者簡單稀降。7SNGF可解離為α、β和γ亞基。在生理條件下，NGF以7S復合體形式存在。7SNGF各亞基等電點不同，可通過離子交換層析完全分離(見表利用羧甲基纖維素柱層析得到了NGF的活性單位β-NGF，它具有NGF的全部生理效應。沉降系數(shù)為2.5，分子量26kD，等電點為9.3，由二條相同的單鏈非共價連接成二聚體，每條鏈由118個氨基酸組成。N-末端為Ser.C-末端為Arg，含三個分子內(nèi)二硫鍵。
(二)人NGF(hNGF)及其基因由于人體組織中合成的NGF量極低，所以hNGF的研究非常困難。
利用小鼠β-NGF克隆cDNA的665bpHgaⅠ-HincⅡ片段做為探針，從人基因組文庫中篩選出3.9kb的hβ-NGF基因DNA序列。這個序列含有兩個分別為124bp和738bp的區(qū)域，與mNGF的前肽原(prepropeptide)基因高度同源，是hNGF基因的兩個外顯子，其中738bp的較大外顯子含成熟hβ-NGF編碼序列。這兩個外顯子之間有一個6.6kb的間隔序列，在-126位和-125位之間。在-187,-121和-119位有三個ATG三聯(lián)體，其中-121位的ATG可能是hβ-NGF的前肽原基因起始密碼子。-121位的上游，包括124bp的小外顯子可能是5＇非翻譯序列。β-NGF的信號肽(-121位-104位)和成熟β-NGF在人與小鼠之間高度保守，同源性分別為94.5％和90％。成熟hβ-NGF的N-末端氨基酸為Ser，與mNGF相同，C-末端比mNGF多出兩個氨基酸Arg和Ala。因此，hβ-NGF為120個氨基酸，其中的第45位Asn可能是N-糖基化位點。
(三)hNGF的性質(zhì)hNGF的前肽原含241個氨基酸，信號肽為18個氨基酸，成熟β-NGF為120個氨基酸。分子量13000，有一個N-糖基化位點，六個Cys殘基，形成三個鏈內(nèi)二硫鍵。等電點為8.86。在體內(nèi)以二聚體存在。
(四)重組hNGF生產(chǎn)工藝目前，重組hNGF已在E.coli、酵母和動物細胞中獲得表達。不過，根據(jù)已公布的試驗報道，重組hNGF的表達量一般都比較低，E.coli和酵母表達的NGF活性只相當于小鼠下頜腺mNGF的1/200～1/1000，而用動物細胞表達的NGF與mNGF活性相等。
利用構(gòu)建的表達質(zhì)粒pTB1058在CHO細胞中表達了hNGF。
1．表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建以人工合成的0.38kb hNGF編碼序列做為探針，從人白血細胞基因組λEBL3文庫中篩選出一個具有15kb插入體的陽性克隆。這個插入體中的一個開放讀框的核苷酸序列與報道的編碼prepro-NGF(由Met-121至Ala120)的開放讀框相同。從這個插入體DNA中分離出一個0.8kb的BclⅠ-ApaⅠ片段，編碼信號肽的C-端部分。肽原(propeptide)和成熟NGF。將這個片段與編碼信號肽N-端部分的合成DNA連接，得到完整的hNGF基因，插入到質(zhì)粒pTB399(已除去其中的II-2cDNA)中的鼠白血病毒(MuLV)長末端重復序列(LTR)的下游，得到質(zhì)粒pTB1054。從pTB1054中分離出含MuLV LTR和hNGF基因的2kb ClaⅠ片段，插入含二氫葉酸還原酶(DHFR)cDNA的質(zhì)粒pTB348的(ClaⅠ切點，得到表達質(zhì)粒pTB1058
(五)重組hNGF的檢驗通過SDS-PAGE電泳測定的重組hNGF分子量為13000；等電點為9～10；N-端氨基酸序列與從hNGF基因核苷酸序列推斷的相同；根據(jù)肼解作用確定的羧基末端氨基酸是Ala，與Ullrich等推斷的成熟hNGF的羧基端比mNGF多兩個氨基酸即Arg119和Ala120的結(jié)論相符；依次用胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)消化得到三個片段，每個片段的氨基酸序列分析確定三個二硫鍵位于Cys15-Cys80,Cys58-Cys108和Cys68-Cys110，與mNGF相同。
根據(jù)刺激PC12細胞軸突生長和支持雞胚背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元存活測定的重組hNGF的特異生物學活性與2.5SmNGF相匹配。D、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
(一)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)BDNF是由119個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為13500；分子內(nèi)有三個二硫鍵和一個糖基化位點；等電點為9.99。在體內(nèi)以二聚體存在，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對多種神經(jīng)元如運動神經(jīng)元、神經(jīng)脊及基板起源的感覺神經(jīng)元、黑質(zhì)的多巴胺神經(jīng)元、基底前腦的膽堿能神經(jīng)元以及海馬、皮層、視神經(jīng)節(jié)等處的神經(jīng)元的生長、分化以及損傷后修復有促進作用。最近發(fā)現(xiàn)，BDNF還具有促進學習和記憶的功能。
(二)重組BDNF的生產(chǎn)工藝BDNF(還有NT3,NT4/5)的基因結(jié)構(gòu)與NGF相似，成熟蛋白的編碼序列位于單一外顯子內(nèi)，沒有內(nèi)含子間隔。因此，可以利用PCR方法直接以人基因組DNA為模板擴增出來。何曉龍等(1995)利用這種方法制備了BDNF的編碼基因，并在E.coli中獲得較高表達。
首先設(shè)計兩種PCR引物引物I含成熟BDNF的N-端部分編碼序列和NdeⅠ酶切位點，引物2含成熟BDNF C-端部分編碼序列的互補序列，并在終止密碼子后加BamHⅠ酶切位點。將PCR擴增出的BDNF基因插入質(zhì)粒pET-3a和pET-16a的NdeⅠ和BamHⅠ位點之間，轉(zhuǎn)化E.coli JM109株，經(jīng)篩選鑒定，分別得到含BDNF基因的重組質(zhì)粒pET-3B和pET-16B。這兩個質(zhì)粒都由T7啟動子控制BDNF的表達。
將重組質(zhì)粒pET-3B和pET-16B重新轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)株，用IPTG誘導表達(37℃,3h)。菌體裂解液的SDS-PAGE電泳表明，pET-3B工程菌表達了分子量約15kD的蛋白質(zhì)，為非融合的BDNF，占菌體總蛋白的15.4％。N-端前15個氨基酸序列分析結(jié)果除起始端多了一個Met以外，與文獻報道完全一致，但SDS-PAGE顯示的分子量與理論值有一定差異，原因不清。pET-16B工程菌表達了分子量為16.5kD的蛋白質(zhì)，N-端融合了21肽的BDNF，占菌體總蛋白的47.2％。其中的21肽含10個連續(xù)的組氨酸和凝血因子Xa特異性識別位點。因此，可以用特殊的組氨酸結(jié)合樹酯(Novage公司產(chǎn)品)純化，然后用凝血因子Xa切除N-端融合的21肽，得到成熟BDNF。
E、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。
(一)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)CNTF由200個氨基酸組成，分子量為24kD,N-端不帶信號肽，不是典型的分泌因子。分子內(nèi)只在第17位有一個Cys殘基，不含二硫鍵，也不含糖基化位點。等電點為5.78，是酸性蛋白質(zhì)。CNTF對感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元、海馬膽堿能神經(jīng)元、黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元等均有促進存活和損傷保護作用。
(二)生產(chǎn)工藝用EooRⅠ從人CNTF cDNA克隆載體pKSH CNTF質(zhì)粒中切出CNTF基因片段，定向插入到含PL啟動子的載體pBPL的EcoRⅠ切點，轉(zhuǎn)化E.coliJM83，經(jīng)篩選鑒定得到表達載本pBLHc，轉(zhuǎn)化E.coliHB101得到CNTF表達菌株。該菌株經(jīng)培養(yǎng)和熱誘導，表達了分子量為24kD的蛋白質(zhì)，占菌體總蛋白的25％。
收集菌體，超聲裂解，離心取上清。上清用硫酸銨沉淀，收集30％～60％飽和度的沉淀組分，用TE緩沖液(50mmol/L Tris-HCl、5mmol/LEDTA,pH7.5)溶解后，對TE透析。然后上DEAE-A50離子交換-交聯(lián)葡聚糖凝膠柱層析。用TE和TE加0.5mol/L氯化鈉(pH7.5)進行線性梯度洗脫，收集CNTF富集組分，對TE透析，再上Sephacryl S-200柱，用TE洗脫，得純化CNTF，純度95％以上，得率25.4％。
用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定重組CNTF的活性為1.3TU/ng。此處ITU(活性單位)表示在1ml培養(yǎng)液中能使神經(jīng)細胞達到最大存活數(shù)一半時所需樣品的質(zhì)量數(shù)。
原料中的多肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子需經(jīng)CNBr處理后的蛋白酶消化，得到活性小肽鏈后，制成注射用凍干粉劑或注射劑。
口服制劑無需經(jīng)蛋白酶消化，而是將原料制成冷干粉后，直接制成膠囊劑、片劑、滴丸劑或其它口服制劑。
權(quán)利要求
1.一種治療老年性癡呆癥、帕金森癥、心腦血管病的藥物，其特征在于它是以神經(jīng)生長因子(nerve growth factor、NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)、、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(NT-4)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-5(NT-5)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic fa-ctor,CNTF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)、乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)、組胺(his-tamine,HA)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related pep-tide,CGRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、環(huán)核苷酸(cAMP)、心鈉素(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉素(brain natriuretic peptide,BNP)、C型利鈉肽(C-typeNatriuretic peptide,CNP)、前列環(huán)素(PGI2)、內(nèi)皮細胞舒張因子(EDRF)為原料，上述原料可單獨或混合制成治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化的藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學上所說的劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，用于治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子－3、4、5(NT－3、NT－4、NT－5)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)節(jié)苷脂(ganlioside)、乙酰膽堿(Ach)、組胺(HA)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY),環(huán)核苷酸(cAMP)為原料制成的治療老年性癡呆癥、帕金森癥、腦血管病、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化的藥劑,劑型包括注射用凍干粉劑、注射劑和口服用膠囊劑、片劑、滴丸劑。該藥物經(jīng)控制性酶解,得到的小肽鏈能通過血腦屏障,作用于大腦。上述病癥嚴重危害人類的生命健康,它的市場需求是巨大的。
文檔編號A61K38/17GK1228995SQ9911343
公開日1999年9月22日 申請日期1999年1月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月26日
發(fā)明者盧杲 申請人:盧杲