專利名稱：熊果酸的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熊果酸的新用途，具體地說(shuō)明就是熊果酸作為有效成份用于制備口腔衛(wèi)生用品、口腔保健品及制備治療口腔疾病的藥物。
二.
背景技術(shù)：
熊果酸是一種三萜類(lèi)化合物，分子式為C30H18O3，化學(xué)名稱為3β-羥基-熊果烷-12-烯-28-羧酸，為無(wú)色晶體，熔點(diǎn)289～292℃。熊果酸廣泛分布于多種植物中，具有多種生物活性，但是經(jīng)美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館Medline檢索，未見(jiàn)熊果酸有抑制口腔各種類(lèi)型變形鏈球菌及牙周病原菌的報(bào)道。同時(shí)也未見(jiàn)有抑制口腔舌鱗癌細(xì)胞株的報(bào)道。
口腔齲病和牙周病是人群中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織將齲病列為重點(diǎn)防治的三大疾病之一，僅次于癌癥和心血管疾病之后。我國(guó)在近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)在中國(guó)青少年和成人中，每?jī)扇司陀幸蝗嗽?jīng)或正在患有齲病。目前齲病的嚴(yán)重程度不容忽視。近幾十年的研究已經(jīng)證實(shí)，齲病為細(xì)菌感染性疾病，主要致齲菌是變形鏈球菌；根據(jù)變形鏈球菌細(xì)胞壁抗原成分的差異，可將其分為a-h8個(gè)血清型，各型鏈球菌之間具有同源性，因此可將變形鏈球菌視為變形鏈球菌組。
牙周病是另一種口腔常見(jiàn)病，隨著病變進(jìn)展，逐漸發(fā)生牙齦出血，牙周袋形成，牙齒松動(dòng)甚至脫落，對(duì)人們的生活質(zhì)量影響極大。牙周病也是細(xì)菌感染性疾病，牙周病的發(fā)生發(fā)展主要是微生物與宿主相互作用的結(jié)果，菌斑細(xì)菌是牙周病的始動(dòng)因子，對(duì)微生物的有效控制是控制牙周疾病進(jìn)展的最有效方式。特異性菌斑假說(shuō)認(rèn)為牙菌斑并不是均質(zhì)的細(xì)菌團(tuán)塊。某些優(yōu)勢(shì)菌群及毒素常常與疾病的破壞程度有密切關(guān)系。Papapanou等利用“棋盤(pán)法”DNA雜交技術(shù)對(duì)部分中國(guó)人群進(jìn)行微生物流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌斑內(nèi)牙齦卟啉菌(P.gingivalis)、福賽氏類(lèi)桿菌(B.forsythus)等細(xì)菌的量超過(guò)某個(gè)閾值的人群易患進(jìn)展性牙周炎和具有深牙周袋。1996年召開(kāi)的世界牙周病研討會(huì)上，認(rèn)為證據(jù)充分的牙周病原菌包括牙齦卟啉菌和福賽類(lèi)桿菌等；中等證據(jù)的牙周病原菌包括中間普氏菌等。
如何找到一種良好的預(yù)防這兩種疾病的途徑，一直是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。
三.

發(fā)明內(nèi)容
我們?cè)谔剿鲗⑴懹糜谥委熆谇谎缀脱乐苎椎难芯恐?，發(fā)現(xiàn)其中主要起作用的成分是熊果酸。這一結(jié)果為開(kāi)發(fā)女貞，特別是其主要成份-熊果酸在醫(yī)學(xué)上的新用途提供了可能。
在此基礎(chǔ)上，對(duì)熊果酸的藥理作用作了進(jìn)一步研究1.熊果酸對(duì)變形鏈球菌組及牙周病原菌作用試驗(yàn)，該試驗(yàn)以目前效果最為肯定的牙膏抗菌劑Triclosan(2，2，4’-三氯-2’羥二苯醚)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。結(jié)果見(jiàn)表1、2。
表1熊果酸對(duì)部分牙周菌的最小抑菌濃度(MIC)菌株 熊果酸 TriclosanMIC MICP.gingivalis 73.75μg/l 50P.intemedia73.75μg/l 10B.forsythus73.75μg/l表2熊果酸對(duì)變形鏈球菌組的抑菌效果菌株 血清型熊果酸的MIC Triclosan(μg/ml) 的MIC(μg/ml)倉(cāng)鼠鏈球菌AHT a9.7654.88鼠鏈球菌BHT b19 2.44變形鏈球菌MT8148c39 4.88變形鏈球菌OMZ65 g39 2.44變形鏈球菌OMZ175f19 4.88變形鏈球菌OMZ176d9.7659.765變形鏈球菌G8-5M0e9.7 4.88茸毛鏈球菌6715 g19.534.88道勒鏈球菌Mfe28 h19.532.14格登氏鏈球菌 19.534.88
熊果酸對(duì)部分牙周菌的MIC結(jié)果表明熊果酸對(duì)牙齦卟啉菌、中間型普氏菌、福賽氏類(lèi)桿菌的MIC為73.75μg/l，最小殺菌濃度為295μg/l。
2.抗口腔舌癌細(xì)胞株TSCCa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)噻唑藍(lán)比色法(MTT)結(jié)果熊果酸作用于TSCCa細(xì)胞株24小時(shí)，半致死量IC50為8μmol/l。25μmol/l和12.5μmol/l的熊果酸與TSCCa細(xì)胞株共同孵育24小時(shí)，與正常對(duì)照組相比，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，而6.25μmol/l的熊果酸則未見(jiàn)明顯改變。
熊果酸與TSCCa細(xì)胞作用48小時(shí)的IC50值為8μmol/l。
(2)電鏡結(jié)果透射電鏡下可見(jiàn)未處理TSCCa細(xì)胞(Control)表面微絨毛豐富，細(xì)胞連接明顯，微管微絲清晰可見(jiàn)，核染色質(zhì)均勻；12.5μmol/l的熊果酸處理24小時(shí)后，可見(jiàn)核染色質(zhì)邊集；25μmol/l熊果酸處理24小時(shí)后，在未處理的TSCCa細(xì)胞中可見(jiàn)散在細(xì)胞壞死，壞死細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞。
上述藥理試驗(yàn)結(jié)果表明熊果酸對(duì)殺滅和抑制變形鏈球菌組及牙周病原菌、口腔舌癌細(xì)胞(TSCCa株)具有明顯的效果，因此，可作為有效成份用于制備口腔衛(wèi)生用品、口腔保健品及制備治療口腔疾病的藥物。
熊果酸的這種新用途不僅充分利用了豐富的植物資源、開(kāi)拓了利用這些植物資源藥用價(jià)值的新領(lǐng)域，也為口腔保健和口腔疾病的治療提供了新途徑，因此，具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
熊果酸對(duì)變形鏈球菌組及牙周病原菌作用試驗(yàn)(1)材料與方法1)菌株福賽氏類(lèi)桿菌(B.forsythus Bf)ATCC43037牙齦卟啉菌(P.gingivalis pg)ATCC33277中間型普氏菌(P.intermedia Pi)ATCC25611倉(cāng)鼠鏈球菌AHT血清型a鼠鏈球菌BHT血清型b變形鏈球菌MT8148血清型c變形鏈球菌OMZ65血清型g
變形鏈球菌OMZl75血清型f變形鏈球菌OMZ176血清型d變形鏈球菌G8-5M0血清型e茸毛鏈球菌6715血清型g道勒鏈球菌Mfe28血清型h格登氏鏈球菌2、試劑和儀器氯化血紅素Haenatin hydrochloride中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所維生素K1注射劑江蘇泗陽(yáng)制藥廠96孔培養(yǎng)板8道移液器胰酪大豆液體培養(yǎng)基Trypticase-soy broth(TSB)中國(guó)藥品生物制品檢定所胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基Trypticase-soy agar(TSA)中國(guó)藥品生物制品檢定所酶標(biāo)免疫分析儀ELX 808 Ultra Microplate Reader Bio-Tek instruments，inc3、試劑的配制氯化血紅素(0.5％)50mg氯化血紅素溶解于1ml 1mol/l NaOH中，然后加蒸餾水100ml，121℃15min滅菌。
氯化血紅素-維生素K1溶液0.5％氯化血紅素溶液100ml中加入一支維生素K1注射液(10mg/ml)，4℃保存。
TS血平皿的制備稱取4.4gTSA培養(yǎng)基，溶于100ml蒸餾水中，121℃15min滅菌，待冷卻至50℃左右，加入無(wú)菌脫纖維羊血5ml，混合后傾注于平皿備用。
TSAHK血平皿的制備稱取4.4gTSA培養(yǎng)基，溶于100ml蒸餾水中，121℃15min滅菌，待冷卻至50℃左右，加入氯化血紅素-維生素K1溶液1ml，無(wú)菌脫纖維羊血5ml，混勻后傾注平皿備用。
TS肉湯的制備稱取3gTSB培養(yǎng)基，溶于100ml蒸餾水中，121℃15min滅菌。
TSHK肉湯的制備稱取3gTSB培養(yǎng)基，溶于100ml蒸餾水中，121℃15min滅菌，待冷卻至50℃左右，加入氯化血紅素-維生素K1溶液1ml，混勻后分裝保存。
以上血平皿及肉湯需在使用前新鮮配制或預(yù)還原過(guò)夜后使用。
1、細(xì)菌懸液的制備1)將Bf劃線培養(yǎng)于TSA平皿上，Pg、Pi劃線培養(yǎng)于TSAHK平皿上，37℃80％N210％H210％CO2培養(yǎng)24h。。
2)挑取4-5個(gè)菌落(1mm左右)，分別培養(yǎng)于3.5mlTSB(Bf)或TSBHK(Pg、Pi)中，37℃ 80％N210％H210％CO2培養(yǎng)8h，將變形鏈球菌組的各菌培養(yǎng)于TS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，用無(wú)菌TSB(Bf)或TSBHK(Pg、Pi)分別調(diào)整各菌菌液濃度至0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁埽陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艽淼木簼舛燃s為106CFU/ml。
藥液的制備精密稱取熊果酸10mg，溶于10ml無(wú)水乙醇中，用濾器過(guò)濾，-20℃分裝保存。臨用前加入等量2xTSB(Bf)或2xTSBHK(Pg、Pi)。精密稱取Triclosan 10mg，溶于10ml無(wú)水乙醇中，用濾器過(guò)濾，-20℃分裝保存。臨用前加入等量2xTSB(Bf和變形鏈球菌組)或2xTSBHK(Pg、Pi)。
2、最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration MIC)的測(cè)定在96孔板第一列加入待測(cè)藥物肉湯100μl，然后加入100μl TSB(Bf和變形鏈球菌組)或TSBHK(Pg、Pi)到所有各孔，8道移液器倍比稀釋至第11列，第12列為空白對(duì)照；同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照藥Triclosan對(duì)照，重復(fù)兩行，加入已調(diào)整好的菌液，37℃ 80％N210％H210％CO2培養(yǎng)48h。
3、酶標(biāo)免疫分析儀在OD630處讀數(shù)，MIC值為OD值突然升高前的臨界值。
試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。
抗口腔舌癌細(xì)胞株TSCCa株的實(shí)驗(yàn)1材料(1)試劑1、RPMI-1640(Gibco USA)2、胰蛋白酶(Gibco USA)3、小牛血清(Gibco USA)4、青霉素(華北制藥廠)5、鏈霉素(華北制藥廠)6、噻唑藍(lán)(MTT)7、二甲基亞砜(DMSO)(2)儀器1、二氧化碳培養(yǎng)箱(Precision，USA)
2、倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，Japan)3、YJ-87.5s超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)4、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀5、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(costar)6、8道可調(diào)移液器7、一次性濾器8、細(xì)胞記數(shù)板9、Hitachi H-600透射電鏡日本東京(3)細(xì)胞株人舌鱗癌細(xì)胞系TSCCa由武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科金輝喜博士建立(4)藥物的配制將藥品融于DMSO中，過(guò)濾除菌-20℃保存。2實(shí)驗(yàn)方法(1)、TSCCa細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640+10％小牛血清培養(yǎng)液中，于37℃，5％CO2下培養(yǎng)(2)、細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合后，0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，用RPMI 1640+10％小牛血清培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以103-104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl，接種三塊。
(3)、將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)至80％融合。
(4)、取出培養(yǎng)板，吸出舊培養(yǎng)液加入RPMI 1640+10％小牛血清培養(yǎng)液200μl/孔，第一列加入含有藥物的RPMI 1640+10％小牛血清培養(yǎng)液100μl，倍比稀釋至第11列，棄去100μl培養(yǎng)液，第12列為空白對(duì)照以含DMSO的RPMI 1640+10％小牛血清培養(yǎng)液為溶劑對(duì)照，平行3次。
(5)、將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，分別于24h、48h取出培養(yǎng)液，用RPMI1640+10％小牛血清洗滌二遍，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150ml DMSO，振蕩10min。
(6)、比色在490nm波長(zhǎng)下，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。結(jié)果以抑制率表示 (7)、透射電鏡觀察取三瓶融合期的TSCCa細(xì)胞，分別加入25μmol/l、12.5μmol/l的熊果酸溶液，設(shè)立空白對(duì)照。藥物作用24h后，傾出培養(yǎng)液，0.01MPBS洗滌三次；用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，混懸于0.01MPBS，離心2000rpm×15min；小心吸出上清，加入預(yù)冷的2.5％的戊二醛溶液4ml，1000rpm×10min，4℃保存。0.1mol/l磷酸緩沖液洗一次，1％鋨酸后固定60min，常規(guī)電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色；H-600電鏡觀察。
抗口腔舌癌細(xì)胞株TSCCa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、MTT結(jié)果24h MTT結(jié)果可見(jiàn)熊果酸作用于TSCCa細(xì)胞株24小時(shí)，IC50為8μmol/l。25μmol/l和12.5μmol/l的熊果酸與TSCCa細(xì)胞株共同孵育24小時(shí)，與正常對(duì)照組相比，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，而6.25μmol/l的熊果酸則未見(jiàn)明顯改變。
48h MTT結(jié)果可見(jiàn)熊果酸與TSCCa細(xì)胞作用48小時(shí)的IC50值為8μmol/l。
2、電鏡結(jié)果透射電鏡下可見(jiàn)未處理TSCCa細(xì)胞(Control)表面微絨毛豐富，細(xì)胞連接明顯，微管微絲清晰可見(jiàn)，核染色質(zhì)均勻；12.5μmol/l熊果酸處理24小時(shí)后，可見(jiàn)核染色質(zhì)邊集；25μmol/l熊果酸處理24小時(shí)后，在未處理的TSCCa細(xì)胞中可見(jiàn)散在細(xì)胞壞死，壞死細(xì)胞外形發(fā)生不規(guī)則變化，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞。
上述試驗(yàn)結(jié)果表明熊果酸對(duì)殺死和抑制對(duì)變形鏈球菌組及牙周病原菌、口腔舌癌細(xì)胞具有明顯的效果，因此，可作為有效成份用于制備口腔衛(wèi)生用品、口腔保健品及制備治療口腔疾病的藥物。
權(quán)利要求
1.熊果酸作為有效成份用于制備口腔衛(wèi)生用品、口腔保健品及制備用于治療口腔疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了熊果酸在醫(yī)學(xué)上的一種新用途。熊果酸廣泛分布于植物界中,來(lái)源豐富,具有多種生物活性,對(duì)殺滅和抑制變形鏈球菌組及牙周病原菌、口腔舌癌細(xì)胞具有明顯的效果,因此,可作為有效成份用于制備口腔衛(wèi)生用品、口腔保健品及制備治療口腔疾病的藥物。熊果酸的這種新用途不僅充分利用了豐富的植物資源、開(kāi)拓了利用這些植物資源藥用價(jià)值的新領(lǐng)域,也為口腔保健和口腔疾病的治療提供了新途徑,因此,具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61P1/02GK1357311SQ0113833
公開(kāi)日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
發(fā)明者樊明文, 邊專, 王茜 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)