專利名稱：視網(wǎng)膜機能改善藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥或試劑在臨床上或研究上有用的、以具有視網(wǎng)膜電位圖(ERG)改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機能改善約。
背景技術(shù)：
視覺是感覺機能中最重要的，外界信息的80％是通過視覺系統(tǒng)輸入的。因此，視力下降或失明等視機能障礙可以列為重大身體障礙之一。特別是若考慮在信息化社會中向高齡化推進的現(xiàn)狀，則防止視機能障礙可以說是現(xiàn)在醫(yī)療的重要課題之一。實際上，最近提倡在引起日常生活障礙的疾病的治療時提高患者生活質(zhì)量(QOL)的重要性，但在眼科疾病方面，尤其對于包括視機能的改善和維持在內(nèi)的QOLV(生活質(zhì)量與視覺)的提高來說成為必須要件的、能達到這一點的治療法的確立，更是當務(wù)之急。
重度視力下降或失明可能是由于種種原因引起的，但日本成年人中每年約16000人中途失明，其原因包括糖尿病視網(wǎng)膜癥、綠內(nèi)障、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜色素變性癥、高度近視等。作為采用手術(shù)的治療法，對糖尿病視網(wǎng)膜癥可以實施采用激光器的光凝固術(shù)、玻璃體手術(shù)，對綠內(nèi)障可以實施小梁切除術(shù)，對白內(nèi)障可以實施眼內(nèi)透鏡插入術(shù)。對綠內(nèi)障也開發(fā)了能使眼壓降低的各種點眼藥，然而，對這些疾病的藥物療法尚未達到能十分令人滿意的水平。與伴隨著侵襲的手術(shù)相比，藥物療法有侵襲少、簡便這樣的大優(yōu)點，而且對日益增加的種種眼科疾病的治療的期待很大，因而人們迫切希望采用有用性高的藥劑的藥物療法的開發(fā)。
另一方面，近年來基礎(chǔ)研究和臨床研究的進展，也推進了眼科疾病中病理學的闡明。即，已經(jīng)變得清楚的是，視力障礙不僅是狹義的感覺器視網(wǎng)膜上視細胞的病變，而且與視細胞的代謝關(guān)系密切的視網(wǎng)膜色素上皮的病變、神經(jīng)纖維的障礙或視網(wǎng)膜的循環(huán)障礙、進而脈絡(luò)膜的循環(huán)障礙也會引起視力障礙。
其中，尤其已經(jīng)判明視網(wǎng)膜色素上皮(RPEretinal pigmentepithelial)細胞在視細胞維持方面發(fā)揮重要作用。即，RPE細胞在視網(wǎng)膜最下位層的布魯赫膜上排列成一層，除吸收到達視網(wǎng)膜的光以防止反射外，還與布魯赫膜一起構(gòu)筑能使視細胞與脈絡(luò)膜血管板分開的血液-視網(wǎng)膜關(guān)(blood-retinal barrier)，而且還與各種細胞因子的產(chǎn)生有關(guān)等，因而具有視細胞的維持或再生等物理上和生理上重要的機能。視細胞受到這些RPE細胞和繆勒細胞的保護。
此外，作為眼組織中重要的神經(jīng)傳遞因子，有谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺等，另一方面，據(jù)報告，作為與RPE細胞有關(guān)的、涉及眼內(nèi)恒常性的細胞因子，有白細胞介素類、TGFβ(轉(zhuǎn)化生長因子-β)總科、bFGF(基礎(chǔ)成纖維細胞生長因子)、VEGF(血管內(nèi)皮細胞生長因子)等(玉井信，日本眼科學會雜志，101，889-890，1997)。然而，這些因子能否積極地應(yīng)用于治療，還是未知數(shù)。此外，本發(fā)明者等人已經(jīng)確認，以TFPI-2或PP-5為有效成分在視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜癥、黃斑疾病、視網(wǎng)膜剝離等眼科疾病治療中是有效的(特愿平7-203304和WO97-05893)。
已知TFPI-2(Sprecher等人，Proc.Natl.Acad.USA，91，3353-3357，1994)有VIIa凝血因子抑制活性。此外，這是作為T98G神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制劑發(fā)現(xiàn)的，進而，據(jù)報告，這和與血液凝固有關(guān)的PP5(Miyake等人，J.Biochem.，116，939-942，1994)有相同的氨基酸序列。然而，迄今為止尚無報告指出這些蛋白質(zhì)有視網(wǎng)膜機能改善活性。
如上所述，會引起重大視機能下降或失明的眼科疾病預(yù)料今后還會增加，而且尚未確立令人滿意的藥物療法，況且眼組織的細胞生物學研究好不容易才剛開始著手進行。
如上所述，對于尚無有力藥物療法的眼科疾病來說，可以把能改善視網(wǎng)膜變性的因子作為治療藥的開發(fā)列為課題。在會引起重大視力障礙的眼科疾病中，例如，對綠內(nèi)障首先進行能使眼壓降低的手術(shù)或者藥劑的給藥，雖然取得了一定成果，但已經(jīng)清楚的是，下降視力的恢復(fù)是有極限的，或者說對于正常眼壓綠內(nèi)障這樣的疾病不能只采用降低眼壓療法治療。進而，在視網(wǎng)膜中心動靜脈的閉塞方面，即使循環(huán)障礙恢復(fù)后視力也不能充分恢復(fù)，或者有發(fā)生繼發(fā)性綠內(nèi)障的問題。
對于如上所述的眼科疾病，全都是視網(wǎng)膜機能有高度障礙，從而引起視力下降或視野缺損、失明等重大視機能障礙。顯然，只要有能適用這些疾病的有效藥劑，就會對實際醫(yī)療做出很大貢獻。本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥或試劑在臨床上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機能改善藥。
發(fā)明公開本發(fā)明是作為醫(yī)藥或試劑在臨尿上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白質(zhì)、尤其組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)為有效成分的視網(wǎng)膜機能改善藥。
附圖簡單說明

圖1顯示TFPI-2對使用SI障礙兔模型的ERGc波改善效果。
發(fā)明實施的最佳形態(tài)本因子是通過從人體培養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清液中精制分離、或從采用本因子的cDNA并借助于所謂基因重組技術(shù)制作的細胞的提取液或細胞培養(yǎng)上清液中精制分離、進而從本因子的cDNA以適當載體系注入胎兒胚中得到的所謂轉(zhuǎn)基因動物的乳等體液成分中精制分離而得到的。人體培養(yǎng)細胞是以源于有產(chǎn)生本增殖因子的能力的各種正常組織的細胞或株化細胞中任何一種為對象的，但較好是上皮系細胞、基質(zhì)細胞或成纖維細胞。在利用基因重組技術(shù)制備本因子的情況下，可以采用CHO(中國倉鼠卵巢)細胞、小鼠C127細胞等哺乳動物細胞、蠶、夜盜蛾等昆蟲細胞，大腸菌、枯草菌、酵母等微生物等。進而，在以轉(zhuǎn)基因動物為宿主的情況下，可以采用小鼠、大鼠、倉鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛等。
這樣制備的本因子可以借助于種種色譜法從作為原料的細胞培養(yǎng)上清液、蟲體提取液、菌提取液、生物體提取液中精制分離。采用的色譜法只要是對本增殖因子有親和性的，任何一種均可，例如，以二氧化硅(硅石)或磷酸鈣為吸附材料的柱、以肝素或色素或疏水基為配體的柱、金屬螯合柱、離子交換柱、凝膠過濾柱等。
此次采用的ERG(視網(wǎng)膜電位圖)已知能反映視網(wǎng)膜中存在的視細胞的生存所必須的視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能，而且已知在引起視網(wǎng)膜變性或視機能障礙的眼科疾病、具體地說、綠內(nèi)障(原發(fā)性綠內(nèi)障、繼發(fā)性綠內(nèi)障)、視網(wǎng)膜血管閉塞癥(細動脈硬化癥、視網(wǎng)膜中心動脈閉塞癥、視網(wǎng)膜中心靜脈閉塞癥、視網(wǎng)膜靜脈分枝閉塞癥)等疾病中，當視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能下降即視網(wǎng)膜機能下降時，ERG的振幅減少或消失(Brown，K.T.等人，J.Physiol.158，257-280，1961)。對于以上所示伴隨著視網(wǎng)膜變性的疾病來說，尚未發(fā)現(xiàn)顯示出ERG改善即視網(wǎng)膜機能改善效果的藥物。
本發(fā)明者等人，在如實施例中所示的藥物誘導(dǎo)視網(wǎng)膜障礙模型中，確認了組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)能恢復(fù)ERG的c波振幅，改善視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能、防止視細胞障礙。
從以上所述，發(fā)現(xiàn)了本因子即組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)是作為視網(wǎng)膜機能改善藥或作為試劑在臨床上或研究上有用的，對于廣泛引起視網(wǎng)膜變性或視機能障礙的眼科疾病來說，適合用來作為視機能改善用治療藥。
本因子可以以其原樣或作為與本身已知的藥理學上可接受載體、賦形劑等混合的醫(yī)藥組合物經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。
作為經(jīng)口給藥用劑型，具體地說，可以列舉片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑等。這樣的劑型可以用本身已知的方法制造，而且是含有制劑領(lǐng)域通常使用的載體或賦形劑的。例如，作為片劑用載體、賦形劑，可以列舉乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、硬脂酸鎂等。
作為非經(jīng)口給藥用劑型，可以列舉諸如軟膏劑、霜劑、注射劑、泥罨劑、涂布劑、栓劑、點眼劑、經(jīng)鼻吸收劑、經(jīng)肺吸收劑、經(jīng)皮吸收劑等，對于眼科局部給藥用途來說，特別好的是注射劑(全身給藥、玻璃體內(nèi)給藥、視網(wǎng)膜下給藥、眼球囊給藥、結(jié)膜下給藥等)、經(jīng)角結(jié)膜劑、點眼劑、眼軟膏等。溶液制劑是用本身已知的方法，例如將本因子溶解于通常用于注射劑的無菌水溶液中、或懸浮于提取液中、進而乳化以呈包埋于脂質(zhì)體中的狀態(tài)制備得到的。作為制劑處方，可以將等張化劑(氯化鈉、氯化鉀、硼酸、甘油等)或緩沖劑(硼酸緩中液、磷酸緩中液、乙酸緩沖液等)、增溶劑(表面活性劑、環(huán)糊精類等)、穩(wěn)定劑(檸檬酸、乙二胺四乙酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉等)、粘稠劑(合成高分子、纖維素類、多元醇類等)調(diào)合制作。進而，還可以配制成高分子聚合物劑、微球制劑、溶膠、凝膠、軟膏等劑型。
作為固體制劑，可以用本身已知的方法，例如向本因子中添加甘露糖醇、繭蜜糖、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖等作為賦形劑，制成冷凍干燥物。進而，還可以將其制成粉末使用。作為凝膠化劑，可以用本身已知的方法，例如，將本因子制備成溶解于甘油、聚乙二醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等增粘劑或多糖中的狀態(tài)。
即使在任何一種制劑中，也可以添加人血清清蛋白、人免疫球蛋白、α2巨球蛋白、氨基酸等作為穩(wěn)定劑，而且在不損害本因子的生理活性的范圍內(nèi)還可以添加醇、糖醇、離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑等作為分散劑或吸收促進劑。此外，必要時還可以添加微量金屬或有機酸鹽。
本發(fā)明的視網(wǎng)膜機能改善藥的給藥可以以全身給藥或局部給藥方式進行，有效給藥量和給藥次數(shù)因給藥劑型、給藥途徑、患者的年齡、體重、治療對象疾病、癥狀或嚴重程度而異，但通?？梢允浅扇嗣咳?.001～100mg、較好0.01～10mg每日一次或分數(shù)次給藥。
實施例以下顯示實施例，以期更詳細地說明本發(fā)明。
實施例1使用RCS大鼠的藥理試驗作為遺傳性視網(wǎng)膜障礙動物，使用已知從出生后25天左右開始發(fā)生視網(wǎng)膜組織變性的RCS大鼠(Ella，G等人，Nature 34783-86，1990)，考察TFPI-2的視網(wǎng)膜障礙保護效果。TFPI-2是用“以TFPI-2或PP-5為有效成分的視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜a疾病治療劑的發(fā)明”(特愿平7-203304和WO97-05893)中所示工藝產(chǎn)生的。雄性RCS(皇家外科醫(yī)生學院)大鼠在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下(氯胺酮∶甲苯噻嗪∶生理食鹽水＝10∶1∶1)用30號針向玻璃體內(nèi)給藥。TFPI-2給藥在3周齡和4周齡共進行2次。一次給藥容量是10μl，給藥總蛋白量7μg。對照組給藥PBS(磷酸鹽緩沖劑食鹽水)。第5周齡時摘出眼球，按常法進行戊二醛/福爾馬林固定后，制作病理切片。染色用蘇木精-曙紅法進行。表1中列出其結(jié)果?！脖?〕TFPI-2對RCS大鼠的視網(wǎng)膜變性抑制效果

PBS給藥組觀察到構(gòu)成視細胞的外顆粒層減少，和桿體錐體細胞萎縮空泡化。TFPI-2給藥組抑制了外顆粒層的減少，也抑制了桿體錐體細胞的萎縮空泡化。另一方面，視網(wǎng)膜色素上皮細胞，與PBS給藥組比較，尤其未觀察到增殖。這個結(jié)果表明TFPI-2沒有促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增殖，而且保護了視細胞，因而預(yù)料TFPI-2給藥對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能有改善效果。
實施例2使用碘酸鈉(以下簡稱SI)障礙兔模型的藥理試驗作為代表性藥物誘導(dǎo)視網(wǎng)膜障礙模型，使用SI障礙兔模型(Heike，M.等人，Documenta Ophthalmologica 7515-22，1990)，驗證TFPI-2的視網(wǎng)膜色素上皮細胞機能改善效果。對有色兔(Dutchrabbits)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥SI 15mg/kg，次日向玻璃體內(nèi)給藥TFPI-2。TFPI-2的一次給藥容量是100μl。給藥總蛋白量79μg。對照組采用同蛋白量的bFGF。然后，測定ERG的c波隨時間的變化。兔子在暗室中放置1.5小時以上，適應(yīng)黑暗之后用氯胺酮/甲苯噻嗪(5∶3)麻醉。將兔子俯伏固定，用散瞳藥散瞳之后，安裝接觸眼鏡型電極。借助于連接在電極上的白色LED電極發(fā)光裝置，進行1000勒克司5.5秒鐘的光刺激。因刺激而發(fā)生的ERG的c波用直流增幅器增幅，并記錄在記憶示波器上。測定以5分鐘的間隔測定數(shù)次，對波形作加和平均，求出振幅。各時點的振幅與SI給藥前正常時的振幅比較，求出c波振幅的恢復(fù)率。據(jù)報告，視網(wǎng)膜電位圖的c波反映出視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能(Steinbarg，R.H.等人，Nature 227，728-730，1970)。本實施例的結(jié)果顯示在圖1中。TFPI-2給藥組與bFGF給藥組相比顯示出明顯的c波恢復(fù)效果。SI給藥28日后，bFGF給藥組只恢復(fù)到正常時的2成，但TFPI-2給藥組恢復(fù)到8成。
從以上實施例1和2可以看出，TFPI-2明顯地改善視網(wǎng)膜色素上皮細胞的機能，并防止視細胞的障礙。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的有ERG(視網(wǎng)膜電位圖)改善作用的蛋白質(zhì)，作為視網(wǎng)膜機能障礙、具體地說、綠內(nèi)障、視網(wǎng)膜血管閉塞癥等眼科疾病的治療劑是有效的。
權(quán)利要求
1.視網(wǎng)膜機能改善藥，包含有視網(wǎng)膜電位圖改善作用的蛋白質(zhì)作為有效成分。
2.權(quán)利要求1記載的視網(wǎng)膜機能改善藥，其中，有視網(wǎng)膜電位圖改善作用的蛋白質(zhì)是組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)。
3.權(quán)利要求1或2記載的視網(wǎng)膜機能改善藥，是以綠內(nèi)障或視網(wǎng)膜血管閉塞癥為對象的。
全文摘要
本發(fā)明是以具有ERG(視網(wǎng)膜電位圖)改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機能改善藥。特別是以組織因子途徑抑制劑－2或胎盤蛋白5為有效成分者，可以在綠內(nèi)障、視網(wǎng)膜血管閉塞癥、視網(wǎng)膜機能障礙等眼科疾病中用來作為視網(wǎng)膜機能改善藥。
文檔編號A61K38/57GK1406134SQ01805844
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者武藤昌圖, 穗積香織, 須藤哲央, 內(nèi)海潤 申請人:東麗株式會社