專利名稱：預(yù)防和治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物。
根據(jù)其病因和疾病的發(fā)作方式的不同，視網(wǎng)膜疾病是各種各樣的。視網(wǎng)膜疾病的實(shí)例是由全身性疾病例如糖尿病、高血壓、動脈硬化、貧血、白血病、結(jié)締組織疾病(例如全身性紅斑狼瘡、硬皮病等)、先天性代謝異常疾病(例如家族黑蒙性白癡、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的視網(wǎng)膜血管疾病和炎性損害或變性性損害，以及視網(wǎng)膜局部疾病例如視網(wǎng)膜血管疾病(例如早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動脈梗阻、視網(wǎng)膜靜脈周炎等)、由視網(wǎng)膜脫離或創(chuàng)傷引起的視網(wǎng)膜炎癥或變性、伴隨老化的視網(wǎng)膜變性性疾病例如老年性盤狀斑變性、先天性視網(wǎng)膜變性性疾病等。
下文進(jìn)一步描述了具有代表性的這些視網(wǎng)膜疾病。
在由全身性疾病引起的視網(wǎng)膜疾病中，糖尿病源性視網(wǎng)膜病被認(rèn)為是一種糖尿病源性微血管病，其為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。在初期，觀察到毛細(xì)管微觀動脈瘤和點(diǎn)狀出血。此后觀察到由微血管梗阻引起的棉絮斑以及由血管滲透性過高引起的視網(wǎng)膜水腫、硬滲出物或類似物。作為癥狀出現(xiàn)伴隨新血管形成的病變過度。在最后階段，在玻璃體中生長的結(jié)締組織的牽引作用引起視網(wǎng)膜脫離。另外還可引起虹膜發(fā)紅和新血管性青光眼，而導(dǎo)致失明。
高血壓患者的視網(wǎng)膜出現(xiàn)高血壓病變例如小動脈狹窄或出血、滲出性斑、視網(wǎng)膜水腫以及視乳頭盤水腫等；鞏膜病變例如小動脈硬化、動靜脈交叉現(xiàn)象、動脈狹窄、管徑不均等。
白血病引起的視網(wǎng)膜損害包括視網(wǎng)膜靜脈的顯著擴(kuò)張、靜脈周組織中出現(xiàn)滲出物以及后極周圍各種大小和形狀的出血。另外還可觀察到模的(modular)滲出物、由微血管梗阻引起的棉絮斑，以及視網(wǎng)膜水腫。
全身性紅斑狼瘡是一種自身免疫性疾病，其表現(xiàn)出全身性損害例如發(fā)疹、急性腎炎或類似疾病。具有這種疾病的患者的視網(wǎng)膜出現(xiàn)棉絮斑及后極周圍的散發(fā)性視網(wǎng)膜出血。另外，有時還觀察到視乳頭盤水腫和末梢血管炎癥。
先天性代謝異常疾病例如家族黑蒙性白癡、Vogt-Spielmeyer疾病有時顯示出眼病以及全身性癥狀。典型的視網(wǎng)膜癥狀為桃紅色斑或色素?fù)p害，并且有時并發(fā)視神經(jīng)萎縮。
在視網(wǎng)膜局部疾病中，視網(wǎng)膜靜脈梗阻可根據(jù)梗阻的位置劃分成視網(wǎng)膜中央靜脈梗阻和視網(wǎng)膜分支靜脈梗阻，視網(wǎng)膜中央靜脈梗阻引起視乳頭盤充血和水腫，在視乳頭盤表面經(jīng)常會觀察到血斑，視網(wǎng)膜變得水腫并且不久出現(xiàn)棉絮斑。在視網(wǎng)膜分支靜脈梗阻中，在該區(qū)域內(nèi)會見到輻射狀出血并出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫和棉絮斑。
在視網(wǎng)膜動脈梗阻中還有視網(wǎng)膜中央動脈梗阻與視網(wǎng)膜分支動脈梗阻。在動脈梗阻發(fā)生后不久，視網(wǎng)膜變得輕微的不透明，數(shù)小時后觀察到乳白色和水腫的視網(wǎng)膜濁斑并于梗阻后20-30分鐘內(nèi)變?yōu)椴豢赡娴?。?shù)周后上述濁斑消失，并且視網(wǎng)膜的內(nèi)層被透明的神經(jīng)膠質(zhì)組織取代。作為全身性疾病的高血壓或動脈硬化有時會引起視網(wǎng)膜動脈或靜脈梗阻的形成。
視網(wǎng)膜靜脈周炎是于視網(wǎng)膜靜脈的末梢分支上產(chǎn)生的一種炎癥。可以觀察到例如靜脈擴(kuò)張、彎曲、管徑不均，血管末梢滲出性斑、出血、新血管形成等結(jié)果。
早熟視網(wǎng)膜病是一種在將作為早產(chǎn)嬰兒出生的嬰兒置于密封的早產(chǎn)嬰兒保育箱中并暴露于高濃度的氧中所引起的一種疾病。其結(jié)果產(chǎn)生伴隨血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的不可逆梗阻，隨后導(dǎo)致玻璃體內(nèi)新血管形成和視網(wǎng)膜脫離。
視網(wǎng)膜脫離是一種感覺視網(wǎng)膜與視網(wǎng)膜色素上皮分離的疾病。包括有由視網(wǎng)膜裂縫引起的裂源性視網(wǎng)膜脫離以及在其它疾病過程中產(chǎn)生的或由其他疾病引起的繼發(fā)性視網(wǎng)膜脫離。除非立即施行手術(shù)治療例如光致凝固法治療，否則這些視網(wǎng)膜脫離會導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，以至失明。
對于老年性盤狀斑變性，由脈絡(luò)膜經(jīng)脈絡(luò)膜基底層直至視網(wǎng)膜色素上皮下面的黃斑上會產(chǎn)生新血管形成。新生血管生長并且還會透過視網(wǎng)膜下腔。來自血管的血清滲出物會導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮脫離和盤狀斑脫離。主要在含有新生血管的病灶中重復(fù)出血并導(dǎo)致病灶產(chǎn)生傷疤。
視網(wǎng)膜先天性色素變性發(fā)生于兒童中?？捎^察到夜盲，并逐漸發(fā)生視野狹窄和視力下降。眼底病變的特點(diǎn)是色素?fù)p害、視乳頭盤黃色萎縮、視網(wǎng)膜血管狹窄，特別是視網(wǎng)膜動脈狹窄。
作為治療上述各種疾病的方法，對于由全身性疾病引起的視網(wǎng)膜疾病可使用全身病因療法。其實(shí)例為給藥抗高血壓的低血壓劑、給藥抗糖尿病等的低血糖劑。但是僅使用這些療法總是不能緩解視網(wǎng)膜損害。另外，對于自身免疫性疾病和先天性代謝異常疾病，病因療法有時是非常困難或不可能的。因此需要對視網(wǎng)膜局部損害進(jìn)行治療。在這種情況下，可對糖尿病、高血壓或視網(wǎng)膜動脈或靜脈梗阻引起的視網(wǎng)膜血管損害施用血管舒張藥、血管壁穩(wěn)定劑或碎裂血栓劑進(jìn)行藥物治療。但是，這些藥物治療只能根據(jù)癥狀進(jìn)行并且是非決定性的，而目前對這些疾病的治療經(jīng)常依賴于手術(shù)治療。
如上所述，對于預(yù)防和治療上述視網(wǎng)膜疾病目前仍無決定性藥劑，在這些情況下，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過專心研究得到了一種可預(yù)防或治療上述視網(wǎng)膜疾病的藥劑。
如上所述，視網(wǎng)膜疾病表現(xiàn)出各種癥狀，包括炎癥例如視網(wǎng)膜血管疾病、血管形成、視網(wǎng)膜水腫以及原發(fā)性或繼發(fā)性視網(wǎng)膜變性等。每一種疾病或多或少地導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能障礙。因此，本發(fā)明的發(fā)明人從下列兩種觀點(diǎn)進(jìn)行了研究。第一種觀點(diǎn)是，上述視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生和發(fā)展可能基于或者與下列狀態(tài)有關(guān)局部缺血或缺氧狀態(tài)以及由這些狀態(tài)誘導(dǎo)的過氧化作用。第二種觀點(diǎn)是，考慮到視網(wǎng)膜功能的具體特點(diǎn)，即視力是通過接受光表現(xiàn)出的，光過度可能是引起這些視網(wǎng)膜疾病的一種危險因素。
關(guān)于第一種觀點(diǎn)，糖尿病視網(wǎng)膜病中的血管損害是對組織缺氧或局部缺血狀態(tài)的反應(yīng)這一理論最近已變得具有權(quán)威性。另外，已有報道表明，被認(rèn)為是由于局部缺血而誘導(dǎo)的過氧化作用會提高患者血清中脂類過氧化物水平(KiyoshiIshikawa,MasayukiOshitari等人，Lipidperoxidesandretinalischemiaindiabeticretinopathy(Ⅰ),FoliaOphthalmologicaJaponica28321-325(1977))。而且，導(dǎo)致局部缺血和過氧化作用的視網(wǎng)膜動靜脈梗阻也被認(rèn)為與這種情況有關(guān)。
關(guān)于第二種觀點(diǎn)，已有報道表明，當(dāng)在無光條件下喂養(yǎng)先天性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的大鼠時，則可阻滯視網(wǎng)膜變性的發(fā)展(Dowling,J.E.和Sidman,R.L.:Inheritedretinaldystrophyintherat;J.CellBiol.14:73-109(1962)。對于這些大鼠，視網(wǎng)膜變性是由具有視覺能力的視網(wǎng)膜視細(xì)胞外段新生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的吞噬作用失調(diào)造成的。在失去代謝平衡的狀態(tài)中，已證明光本身促進(jìn)了視細(xì)胞的破壞。已有報道表明，正常狀態(tài)下的動物因過度暴露于光下則引起視網(wǎng)膜變性(Shahinfar,S.,Edward,D.P.和Tso,M.O.M.:Apathologicstudyofphotoreceptorcelldeathinretinalphoticinjury;Cuur.EyeRes.10:47-59(1991))。也可以說過度的光是引起視網(wǎng)膜疾病的一個危險因素。
另外，最近已有下列報道。這些報道涉及具有2-位取代基的抗壞血酸衍生物的合成及它們的抗氧化活性(見EP-A-0146121)；利用抗壞血酸衍生物的清除游離基活性改善循環(huán)系統(tǒng)作用例如抗心律失常活性、抗心肌梗塞形成活性、抗大腦梗塞形成活性、對于老年性癡呆的預(yù)防作用(EP-A-0202589)；還涉及部分上述抗壞血酸衍生物對白內(nèi)障的治療作用以及它們的生物利用度和制劑(見JP-A63-301818)。
由上述兩點(diǎn)可以看出，本發(fā)明發(fā)明人已研究得到的化合物可抑制視網(wǎng)膜的過氧化作用或由光引起的視網(wǎng)膜疾病。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上面EP-A-0146121和EP-A-0202589中所述化合物包括具有上述兩種驚人的優(yōu)良作用的化合物。因而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的主要目的是提供一種用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述藥物組合物的方法。
由下列說明以及參考附圖，本發(fā)明的這些目的和其它目的以及優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。


圖1的圖解表明在實(shí)驗(yàn)1(B-2)中在玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠的ERG的a-波幅度。橫座標(biāo)為時間(小時)，縱座標(biāo)為相對于起始幅度的百分比(%)。在圖1至5中，化合物(Ⅰ)是2-0-十八烷基抗壞血酸。
圖2的圖解表明在實(shí)驗(yàn)1(B-2)中在玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠的ERG的b-波潛伏期(latency)。橫座標(biāo)為時間(小時)，縱座標(biāo)為相對于起始幅度的百分比(%)。
圖3的圖解表明在實(shí)驗(yàn)1(B-2)中在玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠的ERG的b-波幅度。橫座標(biāo)為時間(小時)，縱座標(biāo)為相對于起始幅度的百分比(%)。
圖4的圖解表明在實(shí)驗(yàn)2[B-2][方法1]中光照射3天后大鼠的ERG的b-波幅度。橫座標(biāo)為光照射后的時間(天)，縱座標(biāo)為b-波幅度(mV)。
圖5的圖解表明在實(shí)驗(yàn)2[B-2][方法2]中光照射20小時后大鼠的ERG的a-波潛伏期。橫座標(biāo)為光照射后的時間(天)，縱座標(biāo)為a-波潛伏期(毫秒)。
本發(fā)明提供了一種治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含式(Ⅰ)化合物
其中n為8-20的整數(shù)。下文中式(Ⅰ)化合物有時稱為化合物(Ⅰ)。
在上述式(Ⅰ)化合物中，n所表示的整數(shù)優(yōu)選為9-17的整數(shù)，特別優(yōu)選17。這些化合物可任意的是D-異構(gòu)體、L-異構(gòu)體和這些異構(gòu)體的混合物，特別優(yōu)選的是L-異構(gòu)體。
EP-A-0146121中描述了式(Ⅰ)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)及其制備方法。如下文實(shí)驗(yàn)3中所示式(Ⅰ)化合物具有非常低的毒性，因而可安全地給藥本發(fā)明用于治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物。
當(dāng)式(Ⅰ)化合物用作治療視網(wǎng)膜疾病的藥物時，其通?？砂凑毡旧硪阎姆椒ɡ缈诜?如片劑、膠囊劑、粒劑等)或非腸道方法(如滴眼劑、眼軟膏、注射液等)，并以根據(jù)本身已知的方法通過將其與本身已知的可藥用添加劑如載體、賦形劑或稀釋劑混合制備的藥物組合物形式給藥。
對于口服給藥時，成人的日劑量通常為10mg-500mg，優(yōu)選50mg-250mg。例如片劑通常通過下述方法制備。首先將與稀釋劑(如乳糖等)、粘合劑(如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解劑(如馬鈴薯淀粉等)和其它適宜添加劑均勻或非均勻混合的化合物(Ⅰ)制成顆粒。將所得顆粒與添加劑如潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、硅石等)混合并壓制成所期望的形狀與大小。
這些顆粒劑通常通過將化合物(Ⅰ)或上述混合物壓制并碾碎成顆粒，或者通過向化合物(Ⅰ)或上述混合物中加入潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉等)，制粒并干燥來制備。在每一劑型中，本發(fā)明組合物可以含有任意其它的藥物活性成分，除非它們與本發(fā)明的目的不適宜。
對于滴眼劑，可向基質(zhì)中加入約0.001-3%(w/v)，優(yōu)選約0.01-1%(w/v)的化合物(Ⅰ)以制得水溶液或懸浮液。本發(fā)明滴眼劑的pH值應(yīng)調(diào)至約4-10，優(yōu)選約5-9。
本發(fā)明滴眼劑可進(jìn)行滅菌處理以制得無菌的最終產(chǎn)物。滅菌過程可在制備滴眼劑的任一步驟進(jìn)行。給藥時，根據(jù)患者的病情以每日約1-4次的頻率向眼中滴注，每一劑量一至數(shù)滴。
這種滴眼劑還含有可藥用添加劑例如緩沖劑(如磷酸鹽緩沖劑、硼酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、氨基酸等)、等滲劑(如糖類例如山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等；多羥基醇例如甘油、聚乙二醇、丙二醇等；鹽例如氯化鈉等)、防腐劑(如氯芐烷銨；氯化芐乙氧銨；對羥基苯甲酸酯如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯等；芐醇；苯乙醇；山梨酸；山梨酸鹽；乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉；氯丁醇等)、pH調(diào)節(jié)劑(如鹽酸、乙酸、磷酸、氫氧化鈉等)，增稠劑(如羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素及其鹽等)、螯合劑(如乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸鈉、縮聚磷酸鈉等)、增溶劑(如乙醇、聚氯乙烯氫化蓖麻油、吐溫80、聚乙二醇4000等)。
眼軟膏可通過將活性成分以約0.001-3%(w/w)，優(yōu)選0.01-1%(w/w)的濃度與常規(guī)眼軟膏基質(zhì)混合制備。當(dāng)制備本發(fā)明眼軟膏時，優(yōu)選采用將化合物(Ⅰ)粉碎并將組合物滅菌處理的方法。根據(jù)患者病情的不同每日可給藥1-約4次眼軟膏。
作為眼軟膏基質(zhì)可以提及的有凡士林，聚乙二醇和羧甲基纖維素等。
除化合物(Ⅰ)外，本發(fā)明藥物組合物還可進(jìn)一步含有至少一種抗視網(wǎng)膜疾病的治療活性成分，除非其與本發(fā)明目的不適宜。
另外，本發(fā)明組合物可含有任意其它藥理學(xué)活性成分，除非它們與本發(fā)明目的不適宜。
正如下述實(shí)驗(yàn)清楚地說明，本發(fā)明用于預(yù)防和治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物具有優(yōu)良的抗氧化活性(游離基清除活性)以及由光引起的視網(wǎng)膜疾病的抑制活性。因此該組合物可作為藥物用于預(yù)防或治療各種視網(wǎng)膜疾病，這些疾病包括由全身性疾病如糖尿病、高血壓、動脈硬化、貧血、白血病、結(jié)締組織疾病(例如全身性紅狼瘡、硬皮病等)、先天性代謝異常疾病(例如家族黑蒙性白癡、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的視網(wǎng)膜血管疾病和炎性損害或變性性損害，以及視網(wǎng)膜局部疾病例如視網(wǎng)膜血管疾病(例如早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動脈梗阻、視網(wǎng)膜靜脈周炎等)、由視網(wǎng)膜脫離或創(chuàng)傷引起的視網(wǎng)膜炎癥或變性、伴隨老化的視網(wǎng)膜變性性疾病例如老年性盤狀斑變性、先天性視網(wǎng)膜變性性疾病等。
下列實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步詳細(xì)地說明了本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的范圍的限定。
實(shí)施例1片劑2-0-十八烷基抗壞血酸50g玉米淀粉90g乳糖25g羥基丙基纖維素25g硬脂酸鎂5g共195g首先將50g2-0-十八烷基抗壞血酸與90g玉米淀粉、25g乳糖和25g羥基丙基纖維素制成顆粒。將所得顆粒與5g硬脂酸鎂混合，并壓制成片劑。
成人每日服用1-3片。
實(shí)施例2眼用溶液(滴眼劑)(w/v)%2-0-十八烷基抗壞血酸0.1硼酸1.7硼酸鈉0.4乙二胺四乙酸鈉0.02氯芐烷銨0.005無菌純化水加至100.0將17g硼酸、4g硼酸鈉、0.2g乙二胺四乙酸鈉和0.05g氯芐烷銨溶于800ml無菌純化的水中。向如此獲得的溶液中加入1g2-0-十八烷基抗壞血酸以制成水溶液。然后向此溶液中再加入無菌純化水直至總體積為1000ml。過濾滅菌后，將溶液裝入滴眼瓶中以得到眼用溶液。
實(shí)施例3眼用懸浮液(滴眼劑)(w/v)%2-0-十八烷基抗壞血酸1.0聚乙烯醇0.5磷酸氫二鈉(十二水合物)0.5磷酸二氫鈉(二水合物)0.2乙二胺四乙酸二鈉0.02氯化鈉0.7氯芐烷銨0.007無菌純化水加至100.0將5g聚乙烯醇、5g磷酸氫二鈉、0.2g乙二胺四乙酸二鈉和7g氯化鈉溶于約800ml無菌純化水中。將溶液通過過濾滅菌后，在無菌條件下向上述所得溶液中加入10g2-0-十八烷基抗壞血酸和0.07g氯芐烷銨。攪拌下加入無菌純化水直至總體積為1000ml。將如此得到的懸浮液裝入滴眼瓶中以制得眼用懸浮液。
實(shí)施例4眼軟膏(w/v)%2-0-十八烷基抗壞血酸0.5液體石蠟1.0白凡士林加至100.0
在無菌條件下，將1g無菌液體石蠟和0.5g2-0-十八烷基抗壞血酸傾入到研缽中并接著進(jìn)行充分研磨(粉碎)。在研磨條件下向混合物中逐漸加入白凡士林直至總重量達(dá)到100g。將如此得到的產(chǎn)物加到眼用藥管中以得到眼軟膏。
實(shí)驗(yàn)12-0-十八烷基抗壞血酸對亞鐵離子誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜過氧化作用的作用(A)用牛視網(wǎng)膜勻漿進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)檢查2-0-十八烷基抗壞血酸對通過向牛視網(wǎng)膜勻漿中加入氯化亞鐵誘導(dǎo)的過氧化作用的作用。
方法(1)由牛眼球(1/2眼)中分離出視網(wǎng)膜。向視網(wǎng)膜中加入生理鹽水以制備牛視網(wǎng)膜勻漿。
(2)向每份如上所得視網(wǎng)膜勻漿中加入氯化亞鐵(0.5mM，溶于蒸餾水中)。再分別向所得勻漿中加入2-0-十八烷基抗壞血酸和α-生育酚直至反應(yīng)混合物的最終濃度達(dá)到10-4M。然后向每份勻漿中加入蒸餾水以調(diào)節(jié)總體積至1ml。將2-0-十八烷基抗壞血酸和α-生育酚溶解并用乙醇稀釋。這樣將所有反應(yīng)混合物中乙醇的最終濃度調(diào)至1%。然后將混合物于37℃反應(yīng)1小時。
(3)向上述(2)中所得的反應(yīng)混合物或視網(wǎng)膜勻漿標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入0.35%硫巴比土酸(下文稱作TBA)試劑(50%乙酸水溶液)(1ml)。將混合物于100℃于沸水中反應(yīng)1小時。水冷卻后加入正丁醇(2ml)并將混合物振搖5分鐘，并于3000rpm下離心10分鐘。測定正丁醇層的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長515nm，發(fā)射波長553nm)。用Bio-RadProteinAssayKit(商品名稱)檢測蛋白質(zhì)。
結(jié)果結(jié)果列于表1中。
表1視網(wǎng)膜:TBA值抑制率(nM丙二醛/mg蛋白質(zhì))(%)空白(1%乙醇)0.34±0.01(2)100氯化亞鐵(對照)5.65±0.13(3)02-0-十八烷基抗 10-4M 0.61±0.04(3)* 94.9壞血酸α-生育酚 10-4M 2.38±0.12(3)* 61.6注在上表中每一“視網(wǎng)膜TBA值”的數(shù)值是指平均值±S.D.。數(shù)值后面圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。符號“＊”表明與對照實(shí)驗(yàn)比較有顯著區(qū)別。P＜0.001。
由表1中的結(jié)果可清楚地看出，與空白樣相比向牛視網(wǎng)膜勻漿中加入氯化亞鐵導(dǎo)致TBA值提高約17倍。當(dāng)反應(yīng)在2-0-十八烷基抗壞血酸存在下進(jìn)行時，既使在10-4M的低濃度下得到的對視網(wǎng)膜勻漿的過氧化作用的抑制作用比在α-生育酚存在下更好。
(B)通過給大鼠玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(B-1)用視網(wǎng)膜TBA值評估檢查口服2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液(30mg/kg)對通過給大鼠玻璃體內(nèi)注射硫酸亞鐵誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜過氧化作用的抗氧化作用。
方法將前一天開始禁食的7周大的SD大鼠分成兩組。分3次給一組口服5%阿拉伯膠溶液(對照)(2ml/kg)。分3次給另一組口服1.5%2-0-十八烷基抗壞血酸(30mg/kg)懸浮液(2ml/kg)。首次給藥后2小時，用克他命鹽酸鹽將大鼠全身麻醉。向每只大鼠左眼玻璃體內(nèi)注射5mM硫酸亞鐵溶液(5μl)，并向每只大鼠右眼玻璃體內(nèi)注射生理鹽水(5μl)。每次注射均采用微量調(diào)節(jié)注射器。注射后1和4小時，再次給藥2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液或5%阿拉伯膠溶液。第三次給藥后2小時(即注射亞鐵離子后6小時)，將大鼠處死。分出眼球，由此制得視網(wǎng)膜勻漿，并測定TBA值及蛋白質(zhì)。
結(jié)果結(jié)果列于表2中。
表2視網(wǎng)膜:TBA值(nM丙二醛/mg蛋白質(zhì))右眼左眼阿拉伯膠溶液0.48±0.14(5)0.65±0.06(5)(對照)1.5%2-0-十八烷0.36±0.06(6)0.47±0.11(6)*基抗壞血酸懸浮液注在上表中每一“視網(wǎng)膜TBA值”的數(shù)值是指平均值±S.D.。數(shù)值后面圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。符號“＊”表示與對照實(shí)驗(yàn)比較有顯著區(qū)別。P＜0.01。
由表2中的結(jié)果可清楚地看出，口服1.5%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液(30mg/kg)可顯蒸地抑制由向玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜的TBA值的提高。在給藥5%阿拉伯膠組中，在注射生理鹽水的5只眼中的2只中，可觀察到可能是在注射期間發(fā)生的玻璃體大量出血。它們的TBA值比其它注射生理鹽水的眼的TBA值高。
(B-2)通過視網(wǎng)膜電圖(下文稱作ERG)測定評估口服2-0-十八烷基抗壞血酸(30mg/kg)，檢查其對通過給大鼠玻璃體內(nèi)注射硫酸亞鐵誘導(dǎo)的ERG變化的作用。
方法將12只SD大鼠(7周大)于前一天開始禁食。給每只大鼠左眼玻璃體內(nèi)注射7.5mM硫酸亞鐵溶液(5μl)。在注射亞鐵離子之前2小時先口服1.5%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液(30mg/kg)或5%阿拉伯膠溶液(對照)，此后每3小時給藥3次，然后每5小時給藥3次。在注射亞鐵離子后6、9和24小時測定ERG并評估a-波和b-波的潛伏期和幅度。
結(jié)果在向玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠的ERG測定結(jié)果如圖1(向玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠ERG的a-波幅度)、圖2(向玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠ERG的b-波潛伏期)和圖3(向玻璃體內(nèi)注射亞鐵離子后大鼠ERG的b-波幅度)所示。
結(jié)果，注射亞鐵離子后6小時在兩組中可觀察到a-波和b-波潛伏期的延遲和幅度降低十分明顯。既使在24小時后檢測發(fā)現(xiàn)幅度仍未復(fù)原。在注射亞鐵離子后9小時檢測可觀察到給藥2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組比對照組抑制a-波和b-波幅度降低的趨勢更為顯著，并可顯著地抑制b-波潛伏期的延遲(參見圖1至3)。
討論上述結(jié)果表明，由于對由亞鐵離子引起的視網(wǎng)膜過氧化作用和ERG變化有抑制活性，2-0-十八烷基抗壞血酸可用于預(yù)防和治療因視網(wǎng)膜過氧化作用引起的各種視網(wǎng)膜疾病，這些疾病包括由全身性疾病如糖尿病、高血壓、動脈硬化、貧血、白血病、結(jié)締組織疾病(例如全身性紅斑狼瘡硬皮病等)、先天性代謝異常疾病(例如家族黑蒙性白癡、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的視網(wǎng)膜血管疾病和炎性損害或變性性損害，以及視網(wǎng)膜局部疾病例如視網(wǎng)膜血管疾病(例如早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動脈梗阻、視網(wǎng)膜靜脈周炎等)、由視網(wǎng)膜脫離或創(chuàng)傷引起的視網(wǎng)膜炎癥或變性、伴隨老化的視網(wǎng)膜變性性疾病例如老年性盤狀斑變性、先天性視網(wǎng)膜變性性疾病等。
實(shí)驗(yàn)2檢查2-0-十八烷基抗壞血酸對光引起的視網(wǎng)膜疾病的作用(A)用牛視網(wǎng)膜勻漿進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)檢測在血卟啉(下文稱作HPP)存在下2-0-十八烷基抗壞血酸對由光照射牛視網(wǎng)膜勻漿引起的過氧化作用的抗氧化作用。
方法(1)將HPP(100μM，溶于乙醇中)、2-0-十八烷基抗壞血酸(10-4M)和水加到以與上述實(shí)驗(yàn)1(A)方法(1)相同的方法制備的視網(wǎng)膜勻漿中?；旌衔镉脽晒鉄?日光燈，15W，3000勒克司)從20cm上方照射1小時。將反應(yīng)混合物中乙醇的最終濃度調(diào)至2%。
(2)光照射后1小時，按照與上述實(shí)驗(yàn)1(A)方法(3)所述相同的方法，通過TBA反應(yīng)測定脂類過氧化物并用Bio-RadProteinAssayKit(商品名稱)測定蛋白質(zhì)。
結(jié)果結(jié)果列于表3中。
表3視網(wǎng)膜:TBA值抑制率(nM丙二醛/mg蛋白質(zhì))(%)空白(HPP,1%乙醇)0.59±0.10(3)100HPP,光(對照)2.22±0.06(3)02-0-十八烷基抗1.31±0.21(3)*55.8壞血酸(10-4M)注在上表中每一“視網(wǎng)膜TBA值”的數(shù)值是指平均值±S.D.。數(shù)值后面圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。符號“＊”表示與對照實(shí)驗(yàn)比較有顯著區(qū)別。P＜0.001。
由表3中的結(jié)果可以清楚地看出，向牛視網(wǎng)膜勻漿中加入HPP并隨后用光照射導(dǎo)致與空白實(shí)驗(yàn)相比其TBA值提高約4倍。當(dāng)反應(yīng)在2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液存在下，于10-4M濃度下進(jìn)行時可觀察到顯著的抑制作用(抑制率約56%)。
(B)光照射大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(B-1)由視網(wǎng)膜病理組織及視紫質(zhì)的量評估方法將大鼠進(jìn)行暗適應(yīng)72小時。然后用綠色熒光燈(10W，490-580nm)(其照明強(qiáng)度被調(diào)節(jié)至2000-2400勒克司)，將大鼠連續(xù)照射12小時。在光照射當(dāng)天一天口服3次(90，300mg/kg/天)并在此后每天口服1次(30，100mg/kg/天)1.5%或5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液。按照相同方式給對照組給藥5.0%阿拉伯膠溶液(對照實(shí)驗(yàn))。光照射完成后，將大鼠于暗室中喂養(yǎng)并于第5天將其處死。將右眼用墨水在上部標(biāo)記并用2%多聚甲醛和2%戊二醛溶液固定。用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)評估并測定視網(wǎng)膜(整個視網(wǎng)膜層和核外層)的厚度。將左眼于-20℃冷凍條件下貯存，以用于在除去角膜、晶狀體和玻璃體后測定視紫質(zhì)。
視紫質(zhì)如下述方法測定。首先，于暗室中在紅燈下將視杯切片，并用0.1M磷酸鹽緩沖劑(pH7.2)制備視網(wǎng)膜勻漿。于15，000rpm離心15分鐘后，將沉淀用4%鉀明礬溶液處理。洗滌后，用1%EmulphogenBC-720(商品名稱)萃取視紫質(zhì)。用離心了的上清液作樣品測定在500nm的吸收率。樣品用黃色燈進(jìn)行光照射5分鐘漂白，再次測定在500nm的吸收率。由漂白前后吸收率的差值計算得視紫質(zhì)的量(摩爾吸收系數(shù)42，000)。
結(jié)果用光學(xué)顯微鏡得到的病理組織學(xué)評估結(jié)果列于表4(5.0%阿拉伯膠溶液)、表5(1.5%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液)和表6(5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液)中。在表4-6中的符號具有下列意義。
-未觀察到，±略微觀察到+可觀察到，++明顯觀察到表45.0%阿拉伯膠溶液(對照)動物編號12345視網(wǎng)膜色素上皮的+++++空泡形成視細(xì)胞內(nèi)外段的紊+++++++++亂或空泡形成巨噬細(xì)胞滲入物+++++++++核外層細(xì)胞致密變+++++++++化和核消失整個視網(wǎng)膜層變薄-++++++++
表51.5%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液動物編號12345視網(wǎng)膜色素上皮的+++++空泡形成視細(xì)胞內(nèi)外段的紊+++++++++亂或空泡形成巨噬細(xì)胞滲入物++++-++++核外層細(xì)胞致密變++++±++++化和核消失整個視網(wǎng)膜層變薄++++-++++
表65.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液動物編號123視網(wǎng)膜色素上皮的-++空泡形成視細(xì)胞內(nèi)外段的紊±+++亂或空泡形成巨噬細(xì)胞滲入物--++核外層細(xì)胞致密變±+++化和核消失整個視網(wǎng)膜層變薄-+++由表4-6中所示結(jié)果可以清楚地看出，在由光照射所引起的視網(wǎng)膜損害中，在每一對照組和給藥1.5%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中5個實(shí)施例中的4個中以及在給藥5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中3個實(shí)施例中的1個中可以明顯地觀察到核外層細(xì)胞致密變化和核消失、視細(xì)胞內(nèi)外段的紊亂和空泡形成、進(jìn)入外段的巨噬細(xì)胞滲入物以及整個視網(wǎng)膜層變薄。也就是說，在給藥5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中的損害不如對照組中的嚴(yán)重。
表7和表8分別表示整個視網(wǎng)膜層和核外層的厚度的測定結(jié)果。
表7整個視網(wǎng)膜層的厚度損害在視乳頭盤附近阿拉伯膠溶液81.5±6.5(5)121.0±15.9(5)(對照)1.5%2-0-十八烷88.5±22.3(5)135.5±27.9(5)基抗壞血酸懸浮液5.0%2-0-十八烷84.2±16.3(3)161.7±3.8(3)*基抗壞血酸懸浮液注在上表中每一“整個視網(wǎng)膜層厚度”的數(shù)值為平均值±S.D.。數(shù)值后圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。符號“＊”表示與對照實(shí)驗(yàn)相比有顯著區(qū)別。P＜0.05。
表8核外層的厚度損害在視乳頭盤附近阿拉伯膠溶液17.0±5.1(5)25.5±11.5(5)(對照)1.5%2-0-十八烷16.0±7.2(5)39.0±8.8(5)基抗壞血酸懸浮液5.0%2-0-十八烷19.2±11.3(3)48.3±1.4(3)基抗壞血酸懸浮液注在上表中每一“核外層厚度”的數(shù)值為平均值±S.D.。數(shù)值后圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。
由表7中所示結(jié)果可以清楚地看出，在給藥5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中在視乳頭盤附近的整個視網(wǎng)膜層的厚度明顯比對照組的大。由表8中所示結(jié)果可以清楚地看出，在給藥2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中在視乳頭盤附近的核外層的厚度也明顯比對照組的大。
表9列出了視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的測定結(jié)果。
表9視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的量(nM/眼)阿拉伯膠溶液0.43±0.19(5)(對照)1.5%2-0-十八烷0.51±0.20(5)基抗壞血酸懸浮液5.0%2-0-十八烷0.69±0.14(3)基抗壞血酸懸浮液注在上表中每一“視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的量”的數(shù)值為平均值±S.D.。數(shù)值后圓括號內(nèi)的數(shù)字表示樣品編號。
由表9中可清楚地看出，在給藥2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的測定中可觀察到對光照射引起的視紫質(zhì)的量降低的抑制趨勢。
(B-2)由ERG測定評估(方法1)將大鼠進(jìn)行暗適應(yīng)24小時。用綠色熒光燈(490-580nm)(將其照明強(qiáng)度調(diào)節(jié)至600-700勒克司)，連續(xù)3天重復(fù)照射，每日連續(xù)照射20小時。每日光照射完成后暗適應(yīng)2小時后連續(xù)3天測定ERG。此后，將大鼠于暗室中喂養(yǎng)，并于光照射后第7天測定ERG，并評估a-波和b-波的幅度及a-波潛伏期。從光照射前一天起，在光照射當(dāng)天每日口服2次(200mg/kg/天)而在其余各天每日口服1次(100mg/kg/天)5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液或5.0%阿拉伯膠溶液(對照實(shí)驗(yàn))。
結(jié)果光照射3天后大鼠ERG的測定結(jié)果為圖4(b-波幅度)所示。
結(jié)果，在第一天測定ERG時可觀察到a-波潛伏期的延遲和a-波幅度的降低。第2天，a-波的畸形進(jìn)一步發(fā)展，而新近觀察到b-波幅度降低。在給藥5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組中，可觀察到抑制b-波幅度降低的趨勢(參見圖4)，在連續(xù)光照射3天過程中ERG的每一波都逐漸減弱。在光照射后第7天，a-波潛伏期已經(jīng)復(fù)原。
(B-2)ERG測定的評估(方法2)將大鼠進(jìn)行暗適應(yīng)12小時并在與(方法1)所述相同的條件下用光連續(xù)照射20小時。將大鼠進(jìn)行暗適應(yīng)2小時后測定ERG。在光照射之前7天起每天口服1次(100mg/kg/天)而僅在光明照射當(dāng)天每天口服2次(200mg/kg/天)5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液或5.0%阿拉伯膠溶液(對照試驗(yàn))。
結(jié)果光照射20小時后大鼠ERG的測定結(jié)果如圖5(a-波潛伏期)所示。
在兩組中a-波和b-波的幅度均有所降低，而給藥5.0%2-0-十八烷基抗壞血酸懸浮液組明顯抑制了a-波潛伏期的延遲(參見圖5)。
討論上述結(jié)果表明2-0-十八烷基抗壞血酸可抑制由光照射所引起的大鼠視網(wǎng)膜組織及功能性疾病。在這些試驗(yàn)中由光引起的視網(wǎng)膜疾病是較為嚴(yán)重的實(shí)例，但是，光是導(dǎo)致各種視網(wǎng)膜代謝和功能性疾病的危險因素之一，所以2-0-十八烷基抗壞血酸可用于預(yù)防和治療各種視網(wǎng)膜疾病，該視網(wǎng)膜疾病包括由全身性疾病如糖尿病，高血壓、動脈硬化，貧血、白血病，結(jié)締組織疾病(例如全身性紅狼瘡、硬皮病等)、先天性代謝異常疾病(例如家族黑蒙性白癡、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的視網(wǎng)膜血管疾病和炎性損害或變性性損害，以及視網(wǎng)膜局部疾病例如視網(wǎng)膜血管疾病(例如早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動脈梗阻、視網(wǎng)膜靜脈周炎等)、由視網(wǎng)膜脫離或創(chuàng)傷引起的視網(wǎng)膜炎癥或變性、伴隨老化的視網(wǎng)膜變性性疾病例如老年性盤狀斑變性、先天性視網(wǎng)膜變性性疾病等。
實(shí)驗(yàn)32-0-十八烷基抗壞血酸的急性毒性試驗(yàn)于小鼠身上進(jìn)行2-0-十八烷基抗環(huán)血酸的急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果，既使口服1000mg/kg也未有小鼠死亡。因此該化合物具有低毒性。
權(quán)利要求
1.一種治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含式(Ⅰ)化合物 其中n為8-20的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其為口服給藥劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其為片劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其為滴眼劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其為眼軟膏。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中n為17。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中視網(wǎng)膜疾病是由全身性疾病所引起的視網(wǎng)膜疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其中全身性疾病選自糖尿病、高血壓、貧血、白血病、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、家族黑蒙性白癡以及Vogt-Spielmeyer疾病。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中視網(wǎng)膜疾病為視網(wǎng)膜局部疾病。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其中視網(wǎng)膜局部疾病選自早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈梗阻、視網(wǎng)膜動脈梗阻、視網(wǎng)膜靜脈周炎、視網(wǎng)膜脫離以及老年性盤狀斑變性。
11.一種制備用于治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物的方法，該方法包含將式(Ⅰ)化合物與可藥用添加劑混合 其中n為8-20的整數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中將式(Ⅰ)化合物與可藥用添加劑混合，并將所得溶液或懸浮液的pH值調(diào)至4-10并滅菌以得到滴眼劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中將式(Ⅰ)化合物與眼軟膏基質(zhì)混合并粉碎，滅菌得到眼軟膏。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中將式(Ⅰ)化合物與稀釋劑、粘合劑和崩解劑一起制粒，向所得顆粒中加入潤滑劑，并壓制成所期望的形狀和大小從而得到片劑。
15.一種治療視網(wǎng)膜疾病的方法，該方法包含給需要此種治療的受治療者給藥有效量的式(Ⅰ)化合物 其中n為8-20的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預(yù)防或治療視網(wǎng)膜疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含式(I)化合物，其中n為8—20的整數(shù)。
文檔編號A61K31/365GK1099611SQ94101050
公開日1995年3月8日 申請日期1994年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月2日
發(fā)明者加藤金芳, 栗山裕, 中裕亮 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社, 千壽制藥株式會社